JP3863711B2 - Dna複合体による遺伝子発現制御方法 - Google Patents
Dna複合体による遺伝子発現制御方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP3863711B2 JP3863711B2 JP2000272151A JP2000272151A JP3863711B2 JP 3863711 B2 JP3863711 B2 JP 3863711B2 JP 2000272151 A JP2000272151 A JP 2000272151A JP 2000272151 A JP2000272151 A JP 2000272151A JP 3863711 B2 JP3863711 B2 JP 3863711B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- stranded dna
- gene expression
- complex
- control method
- expression control
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Images
Landscapes
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Description
【発明の属する技術分野】
この出願の発明は、遺伝子発現制御方法に関するものである。さらに詳しくは、この出願の発明は、遺伝子にDNA複合体を結合させ、DNA複合体の遺伝子翻訳抑制機能を外的刺激により制御することによって遺伝子発現を制御する遺伝子発現制御方法に関するものである。
【0002】
【従来の技術とその課題】
遺伝子の変異による疾患は、およそ5000種類あるといわれており、いわゆるヒトゲノムプロジェクトにより、約1000種類について原因遺伝子が判明したといわれている。なかでも、アルツハイマー病等の神経疾患、癌、血友病、あるいはHIV等のウィルス性疾病については研究が進んでおり、その原因遺伝子や変異の形態に関する様々な知見が得られている。そして、このような知見を元に、これらの疾患に対する様々な治療法が研究、報告されている。
【0003】
とくに注目される遺伝子変異性疾患の治療法の一つにアンチセンス法がある。アンチセンス法は、遺伝子(mRNA)上の特定領域に対して相補的な塩基配列を有する一本鎖DNA(例えばODN:オリゴデオキシリボヌクレオチド)を結合させることによって、その遺伝子の転写や翻訳を阻害し、結果的に有害なタンパク質の発現を抑える手法である。つまり、アンチセンス法は、特定の遺伝子配列に結合する物質により、疾患の原因遺伝子を無力化する方法であるといえ、一般に標的mRNAに対する相補的遺伝子(一本鎖DNA)もしくはその類縁体を用いて、疾患の原因となる遺伝子の発現を抑えるものである。
【0004】
しかし、従来のアンチセンス法では、遺伝子やその類縁体を用いることにより、遺伝子の発現を抑制することはできるものの、発現をON−OFF的に自在に制御することはできなかったのが実情である。
【0005】
また、このようなアンチセンス法が実用化されるためには、一本鎖DNAが生体内でヌクレアーゼによって分解されやすいという問題が残されていたのである。
【0006】
そこで、この出願の発明は、以上のとおりの事情に鑑みてなされたものであり、従来技術の問題点を解消し、標的遺伝子の発現をON−OFF制御できる遺伝子発現制御方法と、この方法において用いられる生体内においても高い安定性を有するアンチセンス試薬を提供することを課題としている。
【0007】
【課題を解決するための手段】
発明者らは、これまでに、一本鎖DNAと刺激応答性物質の複合体が、特定の条件下において可逆的にコンホメーションの変化を起こすことを発見した。そして、このような知見を元にさらなる鋭意研究を重ね、この出願の発明を完成した。
【0008】
この出願の発明は、以上のとおりの経緯によりなされたものであって、上記の課題を解決するものとして、まず第1には、遺伝子の目的部位に結合する一本鎖DNAと刺激応答性ポリマーが連結されてなるDNA複合体の遺伝子への結合を、外的刺激により制御し、該DNA複合体の遺伝子翻訳抑制機能を制御する遺伝子発現制御方法を提供する。
【0009】
この出願の発明は、第2には、刺激応答性ポリマーが温度応答性ポリマーである遺伝子発現制御方法を、また、第3には、このような温度応答性ポリマーがポリ(N−イソプロピルアクリルアミド)である遺伝子発現制御方法を提供する。
【0010】
この出願の発明は、第4には、上記の遺伝子発現制御方法において、DNA複合体が、末端アミノ化一本鎖DNAとメタクリロイルオキシスクシンイミドとのカップリング反応により得られる末端ビニル化一本鎖DNAとN−イソプロピルアクリルアミドモノマーをラジカル重合して製造されることを、第5には、末端アミノ化一本鎖DNAが、3’末端アミノ化一本鎖DNAであることを前記遺伝子発現制御方法の好ましい態様として提供する。
【0011】
さらに、第6には、この出願の発明は、以上の遺伝子発現制御方法において、一本鎖DNAが、オリゴデオキシリボヌクレオチドである遺伝子発現制御方法を提供する。
【0012】
この出願の発明は、第7には、上記第1〜第6の発明のいずれかの遺伝子発現制御方法を用いて遺伝子の翻訳抑制機能を制御するアンチセンスドラッグをも提供する。
【0013】
また、第8には、この出願の発明は、末端アミノ化一本鎖DNAとメタクリロイルオキシスクシンイミドとのカップリング反応により得られる末端ビニル化一本鎖DNAとN−イソプロピルアクリルアミドモノマーをラジカル重合することを特徴とするDNA複合体の製造方法を提供する。
【0014】
そして、この出願の発明は、第9には、末端アミノ化一本鎖DNAが、3’末端アミノ化一本鎖DNAであるDNA複合体の製造方法を提供する。
【0015】
また、第10には、この出願の発明は、前記DNA複合体の製造方法において、末端アミノ化一本鎖DNAが末端アミノ化オリゴデオキシリボヌクレオチドであるDNA複合体の製造方法をも提供する。
【0016】
【発明の実施の形態】
この出願の発明の遺伝子発現制御方法は、DNA複合体におけるDNA部分の標的遺伝子への結合形態が、DNA複合体における刺激応答性ポリマー部分の外部刺激による構造変化に伴って変化するという機構に基づくものである。
【0017】
図1にこの出願の発明の遺伝子発現抑制方法の概略摸式図を示した。
【0018】
この出願の発明の遺伝子発現制御方法では、ある条件(A)下では、遺伝子(1)の目的部位(2)に結合する一本鎖DNA(3)と刺激応答性ポリマー(4)が連結されてなるDNA複合体(5)が、遺伝子(1)の目的部位(2)に結合するため、遺伝子上に相補鎖(2’)が形成し、遺伝子の発現が抑制される。一方、条件(B)下では、DNA複合体(5)の刺激応答性ポリマー(4)部分の構造変化により、一本鎖DNA(3)部分が目的部位(2)に結合できなくなり、目的部位(2)における翻訳が開始される。つまり、遺伝子発現は抑制されない。
【0019】
このとき、DNA複合体(5)を構成する刺激応答性ポリマー(4)を選択することにより、通常DNA分解酵素(ヌクレアーゼ)によって分解されやすい一本鎖DNA(3)部分にヌクレアーゼ耐性を付与することができる。
【0020】
この出願の発明の遺伝子発現抑制方法においては、上記の刺激応答性ポリマー(4)は、温度、光、酸、塩基、pH、電気等の様々な物理的、あるいは化学的信号に応答して構造変化を起こすものであればどのようなものであってもよい。中でも温度応答性ポリマーは、生体中でも比較的容易に刺激を与えることができ、好ましい。当然ながら、温度応答性ポリマーを結合させたDNA複合体では、外部刺激として、温度(加熱/冷却)を用いる。また、光応答性ポリマーでは光を、pH応答性ポリマーでは、緩衝剤(酸性、塩基性)などによるpH変化を、電気応答性ポリマーでは電気信号を用いて刺激を与えればよい。
【0021】
このようなポリマーとしては、公知、新規の各種のものが考慮される。例えば、温度応答性ポリマーとしては、ポリ(N−イソプロピルアクリルアミド)(PNIPAAm)、光応答性ポリマーとしては、ポリ(スチレン−コ−p−フェニルアゾメタクリルアニリド)、pH応答性ポリマーとしては、ポリ(アクリル酸)などが挙げられる。温度応答性ポリマーであるPNIPAAmは、その温度応答挙動もよく知られており(Schild, H.G., Prog.Polym.Sci. 17, 163-249, (1992))、一本鎖DNAと複合体を形成した際には、応答温度範囲が比較的低く、扱いやすい上、ヌクレアーゼ耐性も高くなるため、好ましい。もちろん、この出願の発明の遺伝子発現制御方法では、DNA複合体(5)において用いられる刺激応答性ポリマー(4)はこれらに限定されない。
【0022】
この出願の発明の遺伝子発現制御方法において、刺激応答性ポリマー(4)をPNIPAAmとした場合には、DNA複合体(5)は、一本鎖DNA−PNIPAAmとなる。このような一本鎖DNA−PNIPAAmの製造方法としては、種々の方法が適用されるが、好ましくは、末端アミノ化一本鎖DNAとメタクリロイルオキシスクシンイミド(MOSu)をカップリングさせ、末端ビニル化一本鎖DNAとした後、これをN−イソプロピルアクリルアミド(NIPAAm)モノマーとラジカル共重合させて得る方法が挙げられる。このとき、カップリング反応や共重合の触媒はどのようなものであってもよく、反応条件もとくに限定されない。例えば、末端アミノ化一本鎖DNAとMOSuをNa2CO3−Na2HCO3下でpHを調整した反応系でカップリングし、生成物とNIPAAmをTris−HCl下でpHを調整し、N,N,N’N’−テトラメチルエチレンジアミン(TEMED)を開始剤としてラジカル重合させてもよい。もちろん、これら以外の触媒を用いたり、助触媒や添加剤を用いてもよい。また、溶媒、緩衝液、反応温度等も限定されない。さらに、末端アミノ化一本鎖DNAは、3’末端アミノ化DNAであることが好ましい。
【0023】
この出願の発明は、以上のとおりのDNA複合体(5)の製造方法をも提供する。
【0024】
さらに、この出願の発明は、前記の遺伝子発現制御方法を用いて遺伝子の翻訳抑制機能を制御するアンチセンス試薬をも提供する。このようなアンチセンス試薬は、前記のとおりに、一本鎖DNA(3)部分の標的遺伝子(1)への結合形態が、この一本鎖DNA(3)部分に連結した刺激応答性ポリマー(4)部分の外部刺激による構造変化に伴って変化するものであれば、どのようなものであってもよい。
【0025】
そして、以上のとおりの遺伝子発現制御方法、DNA複合体(5)、およびその製造方法において、一本鎖DNA(3)は、遺伝子(1)の目的部位(例えば、具体的には、mRNA上のリポソーム結合部位(Shine-Dalgarno配列))に結合でき、遺伝子(1)の転写や翻訳を阻害できるものであればどのようなものであってもよく、分子量や重合度はとくに限定されない。とくに好ましいものとしては、オリゴデオキシリボヌクレオチド(ODN)が例示される。
【0026】
以下、添付した図面に沿って実施例を示し、この発明の実施の形態についてさらに詳しく説明する。もちろん、この発明は以下の例に限定されるものではなく、細部については様々な態様が可能であることは言うまでもない。
【0027】
【実施例】
<実施例1> DNA複合体の合成
以下の化学式(I)にしたがって、DNA複合体を合成した。
【0028】
【化1】
【0029】
配列表1〜4に示した各種3’末端C7アミノ化ODN(mRNA上のリボソーム結合部位(Shine-Dalgarno配列)を標的配列とした相補的ODN;15アミノ酸配列、20アミノ酸配列、20アミノ酸のMismatch配列、20アミノ酸のScramble配列)とメタクリロイルオキシスクシンイミド(MOSu)をNa2CO3−Na2HCO3下(pH7.9)で各々カップリングし、各ODNの末端にビニル基を導入した。得られた末端ビニル化ODNとN−イソプロピルアクリルアミド(NIPAAm)をTEMEDを開始剤としてラジカル共重合させ、ODN−PNIPAAm複合体(A15複合体、A20複合体、Mismatch複合体、Scramble複合体)を合成した。
【0030】
反応物を精製した後、逆相HPLCによって未反応物を除去した。
<実施例2> 遺伝子発現の制御
オワンクラゲ(Aequorea victoria)由来の蛍光タンパク質(GFP:Green Fluorescent Protein)をレポーター遺伝子とするin vitro転写/翻訳システムを用いた。
【0031】
制限酵素BamHI、BglIIにてGFPのcDNAを切断、回収し、これを大腸菌発現用ベクターであるpET−16bのT7プロモーターの制御下へクローニングすることによって、GFP発現用ベクター(pET−GFP)を構築した。
【0032】
PNIPAAmのみ、A15複合体、A20複合体、Mismatch複合体、およびScramble複合体の各試料の相転移温度(Tc)を生理条件下(100mM NaCl、10mM Tris−HCl pH7.4)にて測定した。
【0033】
結果を表1に示した。
【0034】
【表1】
【0035】
表1より、各ODN複合体の相転移温度が32〜34℃であることが分かった。したがって、in vitro転写/翻訳実験におけるスイッチング温度を、これらの相転移温度を挟む27℃と37℃に設定した。
【0036】
コントロール発現系(TemplateDNAのみ)での509nmにおける蛍光強度を100%とし、各試料のGFP発現率を27℃、および37℃でインキュベートした場合について求めた。
【0037】
結果をそれぞれ図2(a)および(b)に示した。
【0038】
PNIPAAmのみを用いた場合には、GFP発現率がいずれの温度においてもほぼ100%であった。したがって、PNIPAAmは、GFPの発現に対して阻害効果を有さないことが示された。つまり、ODN複合体によるGFPの発現抑制効果は、ODN部位のアンチセンス効果によるものであることが示唆された。(図2(a)、(b))
また、27℃では、A15、A20のネイティブODNおよびこれらのPNIPAAm複合体(A15複合体、A20複合体)は、高いGFP発現抑制効果を示した。さらに、そのGFP発現抑制効果は、mRNAに対してより安定な相補鎖を形成できるA20の方が高かった。(図2(a))
一方、37℃では、A15複合体とA20複合体によるGFP発現の抑制効果が、ネイティブODNと比べて低かった。(図2(b))
これは、温度上昇による相補鎖の不安定化によるものではなく、ODN末端に連結されたPNIPAAmが相転移することによってODNとmRNAとの相補鎖形成が阻害され、結果としてアンチセンス効果が低下したためと考えられる。
【0039】
以上より、各ODN複合体を用いれば、相転移温度を挟んで温度を上下させることにより、GFP遺伝子の発現をON−OFF制御できることが確認された。
【0040】
さらに、A20とそのMismatch配列およびScramble配列の各複合体による発現抑制効果を比較したところ、Mismatch複合体とScramble複合体の発現抑制効果は、ネイティブA15やネイティブA20よりも低かった。これより、ODN複合体による遺伝子発現抑制効果は、ODNが特異的にmRNAに作用することによって起こることが示された。
<実施例3> ODN複合体のヌクレアーゼ耐性
実施例1で合成された各ODN複合体のヌクレアーゼ耐性を評価するために、一本鎖DNAを特異的に分解するS1 ヌクレアーゼを添加した。
【0041】
ODNがモノヌクレオチドに分解されると吸光度が上昇することから、S1ヌクレアーゼ添加後、260nm(DNA由来のピーク波長)における吸光度を追跡した。
【0042】
結果を図3に示した。
【0043】
A20複合体における吸光度の上昇が、ネイティブA20の場合よりも遅く、かつ、より低い吸光度で飽和に達したことから、複合体はネイティブODNに比べて分解されにくいことが確認された。
【0044】
【発明の効果】
以上詳しく説明したとおり、この発明によって、標的遺伝子の発現をON−OFF制御できる遺伝子発現制御方法と、この方法において用いられる生体内での安定性の高いアンチセンス試薬が提供される。
【0045】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図1】この発明の遺伝子発現制御方法を説明する概略摸式図である。
【図2】この発明の実施例において、各ODN複合体によるGFPタンパク質の発現率を示した図である。(a)27℃、(b)37℃
【図3】この発明の実施例において、S1ヌクレアーゼの存在下におけるODNとODN複合体の分解挙動を260nmでの吸光度の経時変化より示した図である。
【符号の説明】
1 遺伝子
2 目的部位
2’ 相補鎖
3 一本鎖DNA
4 刺激応答性ポリマー
5 DNA複合体
Claims (7)
- 一本鎖DNAと刺激応答性ポリマーが連結されてなるDNA複合体の一本鎖DNAを標的mRNAに結合させて標的mRNAの転写翻訳を阻害させる方法において、外的刺激により刺激応答性ポリマーの構造を変化させることによって、一本鎖DNAと標的mRNAとの結合をON-OFF制御することを特徴とする遺伝子発現制御方法。
- 刺激応答性ポリマーが、温度応答性ポリマーである請求項1の遺伝子発現制御方法。
- 温度応答性ポリマーがポリ(N−イソプロピルアクリルアミド)である請求項2の遺伝子発現制御方法。
- 請求項3の遺伝子発現制御方法において、DNA複合体が、末端アミノ化一本鎖DNAとメタクリロイルオキシスクシンイミドとのカップリング反応により得られる末端ビニル化一本鎖DNAとN−イソプロピルアクリルアミドモノマーをラジカル重合して製造される請求項3の遺伝子発現制御方法。
- 末端アミノ化一本鎖DNAが、3’末端アミノ化一本鎖DNAである請求項4の遺伝子発現制御方法。
- 一本鎖DNAがオリゴデオキシリボヌクレオチドである請求項1ないし5のいずれかの遺伝子発現制御方法。
- 標的 mRNA と結合する一本鎖 DNA に刺激応答性ポリマーが連結されており、外的刺激による刺激応答性ポリマーの構造変化によって、標的 mRNA への一本鎖 DNA の結合が ON-OFF 制御される DNA 複合体を含むことを特徴とするアンチセンス試薬。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2000272151A JP3863711B2 (ja) | 2000-09-07 | 2000-09-07 | Dna複合体による遺伝子発現制御方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2000272151A JP3863711B2 (ja) | 2000-09-07 | 2000-09-07 | Dna複合体による遺伝子発現制御方法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2002085065A JP2002085065A (ja) | 2002-03-26 |
JP3863711B2 true JP3863711B2 (ja) | 2006-12-27 |
Family
ID=18758317
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2000272151A Expired - Fee Related JP3863711B2 (ja) | 2000-09-07 | 2000-09-07 | Dna複合体による遺伝子発現制御方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JP3863711B2 (ja) |
Families Citing this family (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2004096892A1 (ja) * | 2003-04-25 | 2004-11-11 | Japan Science And Technology Agency | 物質を捕捉する機能を有する機能性ポリマー、当該ポリマーを含む物質捕捉用試薬キット、および当該ポリマーを利用した物質の回収方法 |
CN111620985B (zh) * | 2019-02-28 | 2023-08-08 | 康码(上海)生物科技有限公司 | 共价固定dna的水凝胶及其应用 |
-
2000
- 2000-09-07 JP JP2000272151A patent/JP3863711B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JP2002085065A (ja) | 2002-03-26 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP6239565B2 (ja) | 細胞内に送達するためのジブロックコポリマーおよびそのポリヌクレオチド複合体 | |
Kaur et al. | Perspectives on chemistry and therapeutic applications of Locked Nucleic Acid (LNA) | |
US8962582B2 (en) | PKR activation via hybridization chain reaction | |
JP5755563B2 (ja) | ミセル集合体 | |
JP2013531981A (ja) | 選択的オリゴヌクレオチド修飾の方法 | |
TW201540724A (zh) | 反義核酸 | |
CA2745926A1 (en) | Omega-functionalized polymers, junction-functionalized block copolymers, polymer bioconjugates, and radical chain extension polymerization | |
KR101788383B1 (ko) | 핵산 나노구조체의 대량생산방법 및 이의 약물전달체로서의 활용 | |
EP2747753A1 (en) | Atom transfer radical polymerization under biologically compatible conditions | |
CN117858948A (zh) | 新的治疗剂递送部分及其用途 | |
TW202006138A (zh) | Fubp1抑制劑用於治療b型肝炎病毒感染之用途 | |
JP2018531046A5 (ja) | ||
KR20190134506A (ko) | 엠피레귤린 유전자 특이적 이중가닥 올리고뉴클레오티드 및 이를 포함하는 섬유증 관련 질환 및 호흡기 관련 질환 예방 및 치료용 조성물 | |
CN107635550A (zh) | 改良的含二硫化物的炔烃交联剂 | |
JP3863711B2 (ja) | Dna複合体による遺伝子発現制御方法 | |
Jeong et al. | Expanding the architectural horizon of nucleic-acid-polymer biohybrids by site-controlled incorporation of ATRP initiators in DNA and RNA | |
EP3947677A1 (en) | Oligonucleotides for modulating atxn2 expression | |
WO2014172557A1 (en) | Functionalized polymer hybrids | |
Murata et al. | Thermo responsive DNA/polymer conjugate for intelligent antisense strategy | |
KR102556015B1 (ko) | Ctgf 발현 억제용 조성물 | |
JP2008167739A (ja) | Rna干渉効果が高い修飾型二本鎖rna | |
Haley et al. | Effect of clustered peptide binding on DNA condensation | |
Campbell et al. | Synthesis of a new disulfide Fmoc monomer for creating biologically susceptible linkages in peptide nucleic acid oligomers | |
JP7464709B2 (ja) | Ctgf遺伝子特異的二重鎖オリゴヌクレオチド及びこれを含む線維症関連疾患及び呼吸器関連疾患の予防及び治療用組成物 | |
WO2023286836A1 (ja) | 人工核酸コンジュゲート |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20060502 |
|
A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20060703 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20060809 |
|
A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20060810 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20060905 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20060929 |
|
R150 | Certificate of patent (=grant) or registration of utility model |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
FPAY | Renewal fee payment (prs date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20101006 Year of fee payment: 4 |
|
LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |