JP3841309B2 - 流動床乾燥工程を含んでなるミクロスフェアの製造方法 - Google Patents
流動床乾燥工程を含んでなるミクロスフェアの製造方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP3841309B2 JP3841309B2 JP51207695A JP51207695A JP3841309B2 JP 3841309 B2 JP3841309 B2 JP 3841309B2 JP 51207695 A JP51207695 A JP 51207695A JP 51207695 A JP51207695 A JP 51207695A JP 3841309 B2 JP3841309 B2 JP 3841309B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- microspheres
- active substance
- solution
- emulsion
- polymer
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
- A61K9/14—Particulate form, e.g. powders, Processes for size reducing of pure drugs or the resulting products, Pure drug nanoparticles
- A61K9/16—Agglomerates; Granulates; Microbeadlets ; Microspheres; Pellets; Solid products obtained by spray drying, spray freeze drying, spray congealing,(multiple) emulsion solvent evaporation or extraction
- A61K9/1605—Excipients; Inactive ingredients
- A61K9/1629—Organic macromolecular compounds
- A61K9/1641—Organic macromolecular compounds obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyethylene glycol, poloxamers
- A61K9/1647—Polyesters, e.g. poly(lactide-co-glycolide)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- A61K38/22—Hormones
- A61K38/27—Growth hormone [GH] (Somatotropin)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/12—Viral antigens
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/12—Viral antigens
- A61K39/21—Retroviridae, e.g. equine infectious anemia virus
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/39—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the immunostimulating additives, e.g. chemical adjuvants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
- A61K9/14—Particulate form, e.g. powders, Processes for size reducing of pure drugs or the resulting products, Pure drug nanoparticles
- A61K9/16—Agglomerates; Granulates; Microbeadlets ; Microspheres; Pellets; Solid products obtained by spray drying, spray freeze drying, spray congealing,(multiple) emulsion solvent evaporation or extraction
- A61K9/1682—Processes
- A61K9/1694—Processes resulting in granules or microspheres of the matrix type containing more than 5% of excipient
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
- A61K2039/55511—Organic adjuvants
- A61K2039/55555—Liposomes; Vesicles, e.g. nanoparticles; Spheres, e.g. nanospheres; Polymers
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
- A61K2039/55511—Organic adjuvants
- A61K2039/55566—Emulsions, e.g. Freund's adjuvant, MF59
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
- A61K2039/55511—Organic adjuvants
- A61K2039/55577—Saponins; Quil A; QS21; ISCOMS
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
- C12N2740/00011—Details
- C12N2740/10011—Retroviridae
- C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
- C12N2740/16111—Human Immunodeficiency Virus, HIV concerning HIV env
- C12N2740/16134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
Description
発明の背景
発明の分野
本発明は、流動床乾燥を含む、ミクロスフェアの製造方法に関する。
背景および関連技術の説明
本発明は、ミクロスフェアの製造方法を提供し、該方法ではミクロスフェアを流動床中で乾燥する。本発明のミクロスフェアは、抗原、アジュバント、ペプチド、ポリペプチド、ホルモン、抗生物質等といったような、あらゆる種類の活性物質を封入することができる。
ミクロスフェアを形成するためのポリマーマトリックスは、文献に記載されている。米国特許第４，９１７，８９３号および同第４，６５２，４４１号は、水溶性薬剤、薬剤を保持する物質を含む内部水相、およびポリマー物質を含む油相を含んでなる油中水型エマルションを製造することにより製造したマイクロカプセルを開示している；内部または水相を増粘するか、または凝固して、粘度を約５０００センチポアズ以上とする。その結果得られるエマルションを水中乾燥する。米国特許第４，９５４，２９８号は、内部水相として水溶性薬剤を含む溶液、および油相としてポリマーを含む溶液からなる油中水型エマルションを製造し、そのエマルションを水相中に分散させて、その結果得られる水中油中水型エマルションを水中乾燥することによるマイクロカプセルの製造を開示しており、ここでは、水中油中水型エマルションを製造する際に使用する油中水型エマルションの粘度を約１５０〜約１０，０００センチポアズに調節する。
当業界のミクロスフェアは一般に、減圧乾燥または凍結乾燥により乾燥されている。これらの方法は時間がかかって、結果的には、そのように乾燥したミクロスフェアの分解または「クラッキング」を起こすことが多い。
従って、本発明の目的は、ミクロスフェアを乾燥するための方法を提供することである。
他の目的は、乾燥するための時間量およびミクロスフェアの分解量を減らす、ミクロスフェアの乾燥方法を提供することである。
これらの目的および他の目的は、当業者に明白であろう。
発明の要約
従って、本発明は、ミクロスフェアの製造方法を提供し、該方法ではミクロスフェアを流動床中で乾燥する。本発明のミクロスフェアは、抗原、アジュバント、ペプチド、ポリペプチド、ホルモン、抗生物質といったような、あらゆる種類の活性物質を封入することができる。本発明のミクロスフェアの形成に好ましいポリマーマトリックスは、あらゆるポリエステルを使用することができるが、ポリ(Ｄ−Ｌ−ラクチド−コ−グリコリド)である。本発明のミクロスフェアは、水中油中水型エマルション法により形成するのが好ましい。本発明の乾燥工程は、より従来的な乾燥方法に必要とされる長い時間を短縮して、ミクロスフェアの分解量を減らす。
本発明の一態様は、活性物質をミクロスフェアに封入するための方法であって、
（ａ）ポリマーを有機溶媒に溶解して、溶液を製造し；
（ｂ）活性物質を（ａ）の溶液に加えて、第一エマルションまたはサスペンションを含んでなるポリマー−活性物質混合物を製造し；
（ｃ）工程（ｂ）の混合物を乳化浴に加えて、第二エマルションを含んでなるミクロスフェアを製造し；
（ｄ）工程（ｃ）のミクロスフェアを硬化して、封入された活性物質を含んでなる硬化ミクロスフェアを製造し；
（ｅ）工程（ｄ）のミクロスフェアを流動床中で乾燥する
ことを含んでなる方法である。
本発明の他の態様は、活性物質を封入するミクロスフェアを含んでなる組成物であり、ミクロスフェアは流動床中で乾燥する。
本発明の他の態様は、ミクロスフェアを流動床中で乾燥することを含んでなるポリラクチドミクロスフェアを製造するための方法である。
【図面の簡単な説明】
第１図は、ポリラクチド(ＰＬＧＡ)ミクロスフェアのバルク侵食(erosin)過程を示す図である。ＰＬＧＡミクロスフェアは一般に、投与前に水和している。挿入図に示すように、水がＰＬＧＡ主鎖中のエステル結合を加水分解する結果、経時的にポリマーのバルク侵食を起こす。加水分解速度は、ミクロスフェアの含水量、溶媒環境(例えば、ｐＨ)、および温度に左右される。ミクロスフェアのフラグメンテーションを引き起こすのに必要とされるポリマー主鎖中の切断数は、ポリマー分子量に左右される。
第２図は、Ｍillerら［Ｊ.Ｂiomed.Ｍater.Ｒes.１１：７１１−７１９，１９７７］を手本として改質したＰＬＧＡポリマーのインビボにおける分解速度を示す図である。Ｘ軸は、各々のＰＬＧＡについてのラクチドまたはグリコリドの相対比を表す。与えられたポリマー分子量に対して最も遅い分解速度は、ポリ乳酸(ＰＬＡ)およびポリグリコール酸(ＰＧＡ)システムに生ずる。最も速い分解速度は、等モル比のラクチドおよびグリコリドを含むＰＬＧＡで得られた。分解が完了するまでのインビボにおけるハーフタイムをラットにおける組織学試験により測定した。
第３図は、ダブルエマルション法を用いてのミクロスフェア製造法を示す図である。様々な分子量のＰＬＧＡポリマーを塩化メチレンに加えて、溶解した。次いで、その塩化メチレンにＭＮ rgp１２０またはrhＧＨ(ヒト成長ホルモン)の溶液をホモジナイズしながら注入した。そのホモジナイズした溶液をポリビニルアルコール(ＰＶＡ)溶液に加えた。幾つかの実験に関しては、そのＰＶＡ溶液を塩化メチレン(１.５％ ｖ／ｖ)で飽和した。そのＰＶＡおよびポリマー溶液を１リットルの発酵槽内で混合して、水中油中水型最終エマルションを形成した。次いで、その結果得られたミクロスフェアを、過剰の水を含む硬化浴に移して、残留する塩化メチレンを抽出した。次いで、その硬化ミクロスフェアを洗浄し、凍結乾燥または低温(５℃)窒素(流動床）または減圧乾燥により乾燥して、インビボおよびインビトロ分析用の最終ミクロスフェアを製造した。イタリック体で記載した項目は、各々の工程段階についての変数である。
第４図は、ＰＬＧＡミクロスフェアの窒素乾燥用のエアリフト(流動床)乾燥システムを示す図である。（ａ）ダイアフィルトレーション装置からのスラリーを、上部ピストン（ｂ）が入口より上にあるチャンバー内へポンプ送入する。次いで、その上部ピストンを下に動かし、上部入口（Ｃ）を通して窒素を加えることにより、過剰の液体を圧出する。次いで、下部入口（ｄ）を通して窒素でパージし、また上部入口（ｃ）を通して窒素を放出することにより、ミクロスフェアを懸濁するために再び送風する。乾燥が完了した後(１〜２日)、出口に補集容器(枝付きフラスコ、図示せず)を置き、その補集容器を減圧にしながら、出口より上に上部ピストン（ｂ）を動かして、下部入口（ｄ）で窒素圧を加えることにより、乾燥粉末を除去する。あるいはまた、両方のピストンが適切な位置に溶接され、かつ上部ピストンがスラリーの入口より上に位置する乾燥装置を設計することができる。スラリーにポンプ送入した後、乾燥中にスラリー出口の側枝をバルブによりシールする。
好ましい態様の詳細な説明
Ａ．定義
本明細書中で使用する「ポリラクチド」および「ＰＬＧＡ」という用語は、区別なく使用され、また乳酸単独のポリマー、グリコール酸単独のポリマー、そのようなポリマーの混合物、グリコール酸および乳酸のコポリマー、そのようなコポリマーの混合物、またはそのようなポリマーおよびコポリマーの混合物を示すことを意図する。本発明のミクロスフェアの形成に好ましいポリマーマトリックスは、ポリ(Ｄ−Ｌ−ラクチド−コ−グリコリド)である。
本明細書中で使用する「活性物質」という用語は、治療学的または生物学的活性化合物といったような、本発明のミクロスフェアに封入される重要な化合物を示す。例として挙げられる活性物質には、これらに制限されるものではないが、リガンド、抗原、アジュバント、ホルモン、抗生物質、酵素等が含まれる。「活性物質」とは、単一の薬剤に制限されるものではなく、抗原の組み合わせ、抗原およびアジュバントの組み合わせ等といったような、複数の活性物質が含まれることを意図する。
本明細書中で使用する「封入」という用語は、活性物質を、活性物質の放出を調節するのに有用な組成物へと製剤化するための方法を示す。本発明において有用な封入用物質の例には、あらゆる封入用物質が含まれ、好ましくはポリエステル、また特に本明細書中で「ポリラクチド」または「ＰＬＧＡ」と呼ばれるポリマーが含まれる。
本明細書中で使用する「流動床」とは、通例、ガスの流れがそれを通して徐々に上方へ流れている顆粒状粒子の床を示し、その結果、ガス速度がさらに増加すると、気孔および流路が拡大し、粒子がより広く分離するようになる。この定義には、これらに制限されるものではないが、スラリーおよび灌液充填塔式反応装置システムを含め、流動床または固定床の形態が含まれる。流動床中で使用するガスは、水および／または他の溶媒の除去を促進する、あらゆる乾燥ガスを使用することができるが、窒素、酸素、および二酸化炭素であるのが好ましい。本発明を実施する際に有用な流動床システムの例と同様、流動床または固定床システムを設計するための方法は、当業界で広く知られている［例えば、Ｐerry ＆ Ｃhilton(Ｃhemical Ｅngineers's Ｈandbook,Ｒ.Ｈ.Ｐerry ＆ Ｃ.Ｈ.Ｃhilton編，第５版，４〜２０−５〜５２−５〜５５頁，１９７３)を参照］。
本明細書中で使用する「賦形剤」という用語は、医薬的に許容し得る、すなわち、使用する用量および濃度でレシピエントに無毒である、医薬組成物に加える非治療用担体を示す。適当な賦形剤およびそれらの処方は、Ｒemington's Ｐharmaceutical Ｓciences，第１６版，１９８０，Ｍack Ｐublishing Ｃo., Ｏsloら編に記載されている。
本明細書中で使用する「有機溶媒」という用語は、炭素化合物を含む、あらゆる溶媒を意味することを意図する。例として挙げられる有機溶媒には、例えば、塩化メチレン、酢酸エチル、酢酸エチル並びにベンジルアルコールまたはアセトンの混合物、ジメチルスルホキシド、テトラヒドロフラン、ジメチルホルムアミド、およびエタノールといったような、ハロゲン化炭化水素、エーテル、エステル、アルコールおよびケトンが含まれる。
本明細書中で使用する「ポリペプチド」とは、通例、少なくとも約２個のアミノ酸を有するペプチドおよびタンパク質を示す。
本明細書中で使用する「乾燥」または「乾燥する」という用語は、最終生成物を残留水分２０％(ｗ／ｗ)未満で得るのに十分な水の除去を示す。
ミクロスフェアに関して本明細書中で使用する「硬化」という用語は、ポリマー相からの過剰な有機溶媒の抽出を示す。
Ｂ．一般的方法
一般的に、抗原またはアジュバントの微量封入は、第３図に簡単に概要を示すプロトコルにより行われる。要約すると、まず最初に、ラクチド：グリコリドの望ましい比率(約１００：０〜０：１００重量％、さらに好ましくは約６５：３５〜３５：６５、最も好ましくは約５０：５０)および固有粘度(通例、約０.１〜１.２dl／ｇ、好ましくは約０.２〜０.８dl／ｇ)を有するＰＬＧＡを、塩化メチレン、またはベンジルアルコールもしくはアセトンを含む、もしくは含まない酢酸エチルといったような有機溶媒に溶解して、望ましい濃度(通例、約０.０５〜１.０ｇ／ml、好ましくは約０.３〜０.６ｇ／ml)とする。次いで、そのポリマー溶液に、濃縮された抗原またはアジュバント溶液(例えば、一般に、ポリペプチドについて少なくとも０.１mg／ml、好ましくは約１００mg／ml以上、例えば、ポリペプチドの種類および望ましいコア充填に左右される)を約１５,０００〜２５,０００rpmでホモジナイズしながら(例えば、２５ゲージ針で)適当に注入する。乾燥抗原またはアジュバントを抗原またはアジュバント水溶液の代わりに使用することができる。ホモジナイズした後(通例、約０.５〜５分、さらに好ましくは１分間)、そのエマルションを反応がま(乳化浴)または静電ミキサー(図示せず)に加えて、第二エマルションを形成する。乳化浴は一般に、場合により酢酸エチルを含むポリビニルアルコール溶液である。その反応がまを高速(通例、約１７００〜２５００rpm)で混合して、小さなミクロスフェア(半径約２０〜１００mm)を生成した。十分な時間、通例、約０.５〜１０分、好ましくは約１分経過した後、その第二エマルションを硬化浴に移して、適当な時間、通例、約１〜２４時間、好ましくは約１時間穏やかに混合する。硬化が完了したら、ミクロスフェアを(例えば、１５０mmのメッシュで)あらかじめ濾過しておき、濃縮して、ダイアフィルトレーションする。ダイアフィルトレーションは、好ましくは約１６または２０μmのフィルターを用い、Ａmiconの撹拌セル(２５００ml)内で適当に成される。そのミクロスフェアは一般に、あらかじめ濾過しておいた水 約１〜１００Ｌ、好ましくは約１５Ｌで、また一般に、０.１％ Ｔween(商標)２０ 約１〜１００Ｌ、さらに好ましくは１５Ｌで洗浄する。最終ミクロスフェアをフィルターから除去し、水に再び懸濁させて、好ましくは３ccのバイアル中、約５００ml／バイアルの割合でバイアルに充填する。次いで、そのミクロスフェアを乾燥することができる。乾燥には、凍結乾燥、減圧乾燥、および流動床乾燥といったような方法が含まれる。
ミクロスフェアを製造するために、他の例として挙げられる３つの方法を利用することができる。第一の方法は、溶媒蒸発技術を利用する。固体または液体の活性物質を、ポリマーを含む有機溶媒に加える。次いで、その活性物質を有機溶媒中で乳化させる。次いで、このエマルションをある表面上に噴霧して、ミクロスフェアを形成させ、残留有機溶媒を減圧下に除去する。第二の方法は、コアセルベーションと呼ばれることの多い、相分離法を伴う。ポリマーを含む有機溶媒中に分散させた水性または固体の活性物質よりなる第一エマルションを非溶媒の溶液、通常、シリコーン油に加える。次いで、ポリマーは溶解しない(非溶媒)が、ポリマーを溶解するために使用する有機溶媒(例えば、塩化メチレンまたは酢酸エチル)を抽出する溶媒を使用することによって、本工程を混合しながら行うなら、ポリマーが溶液から沈殿して、ミクロスフェアを形成するであろう。第三の方法は、コーティング技術を利用する。ポリマーを含む有機溶媒中に分散させた活性物質を含んでなる第一エマルションを、空気−懸濁液被覆装置を通して処理する結果、最終ミクロスフェアが生ずる。
本発明のミクロスフェアについての分解速度は、ポリマー中のラクチド：グリコリドの比率およびポリマーの分子量により部分的には決定される。様々な分子量(または固有粘度)のポリマーを混合して、望ましい分解プロフィールを得ることができる。
本発明のミクロスフェアは、撹拌速度、第二エマルション工程で使用する溶媒の体積、温度、ポリマーの濃度、およびポリマーの固有粘度といったような、工程パラメーターを変化させることにより、直径約０.１〜約１００mm以上の範囲の、任意の望ましい大きさで製造することができる。
本発明の製剤は、防腐剤、緩衝液、トレハロースまたはマンニトールに加えポリエチレングリコール(ＰＥＧ)といったような、多様な賦形剤、またはＴween(商標)界面活性剤のような非イオン性界面活性剤を含み得る。非イオン性界面活性剤には、ポリソルベート２０または８０といったようなポリソルベート、およびポロキサマー１８４または１８８といったようなポロキサマー、Ｐluronic(商標)ポリオール、および他のエチレンオキシド／プロピレンオキシドブロックコポリマー等が含まれる。安定な水性製剤を得るのに有効な量は、通常、約０.１％(ｗ／ｖ)〜約３０％(ｗ／ｖ)の範囲内で使用されるであろう。
本発明の製剤のpＨは、通例、約５〜８、好ましくは約６.５〜７.５である。このpＨを得るのに適当な緩衝液には、例えば、リン酸塩、Ｔris、クエン酸塩、コハク酸塩、酢酸塩、またはヒスチジン緩衝液が含まれ、望まれるpＨに左右される。好ましくは、該緩衝液は約２mＭ〜約１００mＭの範囲内である。
該製剤に適当な防腐剤の例には、フェノール、ベンジルアルコール、メタクレゾール、メチルパラベン、プロピルパラベン、塩化ベンザルコニウム、および塩化ベンゼトニウムが含まれる。防腐剤の種類およびその濃度範囲は重要ではないが、好ましい防腐剤には、約０.２〜０.４％(ｗ／ｖ)フェノールおよび約０.７〜１％(ｗ／ｖ)ベンジルアルコールが含まれる。
一般的に、本発明の製剤は、安定な形の製剤を損なわない量で、また有効で安全な医薬品投与に適当な量で他の成分を含み得る。例えば、当業者に周知の、他の医薬的に許容し得る賦形剤は、本発明の組成物の一部をなし得る。これらには、例えば、塩、様々な充填剤、さらなる緩衝剤、キレート化剤、抗酸化剤、補助溶剤等が含まれる。これらの具体的な例には、トリス−(ヒドロキシメチル)アミノメタン塩(「Ｔris緩衝液」)、およびエデト酸二ナトリウムが含まれる。
ミクロスフェアは、必要とされる、あらゆる補助因子と共に、医薬的に許容し得る無菌の等張製剤中に入れ、また所望により、当分野において周知の標準的な方法により投与する。ミクロスフェア製剤は一般に、乾燥粉末として保存する。
さらに本発明の詳細を以下の実施例に見い出すことができ、これがさらに本発明を説明する。本明細書中に引用する文献は全て、そのまま本発明の一部をなす。
実施例
１．材料および方法
ａ．材料
ポリ(Ｄ−Ｌ−ラクチド−コ−グリコリド)（ＰＬＧＡ）をＢoehringer Ｉngelheim(ＢＩ)およびＭedisorb Ｔechnologies Ｉnternational Ｌ.Ｐ.(ＭＴＩ)の両社から購入した。１２kＤおよび１００kＤのＰＬＧＡをＢＩから入手し、また１８kＤおよび１００kＤのＰＬＧＡをＭＴＩから入手した。ポリマー組成は、ラクチド：グリコリドが５０：５０、６５：３５、または７５：２５のいずれかであった。固体のＰＶＡを温水(約８０℃)に溶解することにより、１０％ポリビニルアルコール溶液(ＰＶＡ Ａirvol ２０５、Ａir Ｐroducts)を製造した。最終ＰＶＡ溶液を、Ｍilliporeから得た０.２２μmのＭillipakフィルターで濾過した。塩化メチレン(工業用)をＢaxter Ｓ／Ｐから購入した。
ＭＮ rgp１２０(ロット番号Ｙ１６５３１／Ｇ９０５５７)を、２０mＭ Ｔris、０.１２０Ｍ ＮaＣl(pＨ７.４)中、２.３mg／mlタンパク質でのバルクでＧenentech, Ｉnc.から得た。それを、ＹＭ３０,０００ＭＷカットオフ膜を備えたＡmiconの撹拌セル濃縮器を用いて４℃で濃縮し、最終濃度を１５４mg／mlとして、２〜８℃で保存した。
凍結乾燥されたＱＳ２１(純度約８０％、ロット番号Ｄ１９４９)をＣambridge Ｂiotech(Ｃambridge、ＭＡ)から得た。凍結乾燥されたＱＳ２１の粉末を５０％エタノール／水に溶解することにより、ＱＳ２１を２００mg／mlで製造した。封入効率および放出率が増加する試みで、ＱＳ２１をまた２０％ Ｔween(商標)２０を含む５０％エタノールにも溶解した。ＱＳ２１溶液を製造して、封入と同日に使用した。
rhＧＨを、１０mＭの重炭酸ナトリウム(pＨ ７)中、５−１０mg／mlタンパク質でのバルクでＧenentech,Inc.から得た。そのタンパク質を０.２２μmのフィルターで濾過し、２０mlを１００ccのバイアルに充填し、凍結乾燥して、乾燥粉末を製造した。凍結乾燥されたタンパク質を、５mＭリン酸カリウム緩衝液、２.５mg／mlトレハロース(pＨ ８)を含む１０mg／mlタンパク質に再び構成した。次いで、そのタンパク質を０.２２μmのフィルターで濾過し、２０mlを１００ccのバイアルに充填し、再び凍結乾燥して、乾燥粉末を製造した。この最終粉末を、５mＭリン酸カリウム緩衝液(pＨ ８)を含む４００mg／ml rhＧＨに再び構成した。このrhＧＨ溶液は、１００mg／mlトレハロースおよび約１００mＭリン酸カリウム(pＨ ８)を含んでいた。
ｂ．微量封入
rgp１２０ミクロスフェアの製造は、先の一般用語で論じた水中油中水型(ＷＯＷ)ダブルエマルション法により行った。より具体的には、塩化メチレン中のＰＬＧＡ濃度は０.３または０.６ｇ／mlであり、また水浴中、第一エマルションを１５,０００rpmおよび０〜１℃でホモジナイズした。１分ホモジナイズした後、第一エマルション(１０ml)を、１.５％塩化メチレンを含む１０％ ＰＶＡ溶液９００mlに加えて、反応がま(２〜８℃)中、高速(８００〜２５００rpm)で１分間乳化した。封入効率を改善するために、第二エマルションをまた、塩化メチレンを含んでいない１０％ ＰＶＡでも行い、またその第二エマルションの温度を０〜３℃で維持した。低温とするために、反応がまの冷却ジャケット内のエチレングリコールを−１５℃に保った。次いで、その第二エマルションを、あらかじめ濾過しておいた水(ＭilliＱ水システム、Ｍillipore Ｃorp.)１２リットルを含む２〜８℃の硬化浴に移した。ミクロスフェアを１時間硬化した。硬化ミクロスフェアを約１.５Ｌまで濃縮して、あらかじめ濾過しておいた水１５Ｌに対してダイアフィルトレーションした後、０.１％ Ｔween(商標)２０ １５Ｌに対してダイアフィルトレーションした。望ましい粒子経により、Ａmiconの撹拌セル(２.５Ｌ)を様々なフィルターシステムで操作した。洗浄した後、そのミクロスフェアを乾燥状態となるまで濃縮した。セルスクレーパーを使用することにより、濃縮されたミクロスフェアをフィルターから除去して、あらかじめ濾過しておいた水に再び懸濁させて、約０.３gm／mlとした。
Ｑ２１を、先に記載したＴween(商標)２０を含む、または含まない５０％エタノールに溶解した。rgp１２０溶液の場合と同様に、ＱＳ２１溶液をポリマー相に注入した。rgp１２０およびＱＳ２１の両方を含むミクロスフェア製剤の場合には、ＱＳ２１溶液を注入した後、rgp１２０溶液をポリマー相に注入して、ＱＳ２１溶液中のrgp１２０およびエタノールの間の相互作用の可能性を減じた。ＱＳ２１の微量封入は、rgp１２０に関して先に記載した条件と類似の条件で行った。
ＰＬＧＡにおけるrhＧＨの微量封入は、第３図で説明した水中油中水型(Ｗ／Ｏ／Ｗ)ダブルエマルションシステムを利用することにより行った。ポリマーを有機溶媒(塩化メチレンまたは酢酸エチル)に加えた後、その溶液を１℃まで冷却した。その溶液を１℃で維持しながら７０００rpmでホモジナイズした。次いで、そのタンパク質溶液(水相)を、７０００rpmで操作するホモジナイザーのチップ付近でポリマー相に３０−６０秒で注入した。さらに１分間ホモジナイズし続けて、第一エマルションを生成した。(塩化メチレンを含む、または含まない)６％ ＰＶＡ溶液を０〜３℃まで冷却し、一定速度(１８００−２５００rpm)で撹拌した。次いで、その第一エマルションを、(金属インジェクター、窒素加圧またはペリスタポンプにより)下部羽根車付近でＰＶＡ溶液に注入して、第二エマルションを製造した。さらに１分間乳化し続けた。次いで、ダブルエマルションを硬化浴に移し、これを一定速度で撹拌して、２〜８℃で維持した。ミクロスフェアを一定に撹拌しながら１〜５℃で１時間硬化した。硬化浴の内容物を、１５０μmのメッシュを通して保持タンクにサイフォンで吸い上げた。次いで、そのミクロスフェアを濃縮して、(２５μmのメッシュが取り付けられた)２.５リットルのＡmiconの撹拌セル内で洗浄した。撹拌セル中、低(low)体積および高(high)体積の洗浄溶液で数サイクル行って、２５μmより小さいミクロスフェアを有効に除去した。２５μmのフィルターを０.１％ Ｔween ２０約１００mlで洗浄することにより、洗浄したミクロスフェアを収集し、２５０mlのビーカーに集めて、５℃で約１時間沈降させた。沈降しなかった小さいミクロスフェアを含む上清を吸引により除去して、残留するミクロスフェアを乾燥用に準備した。幾つかの実験では、硬化浴および洗浄工程を渦流濾過システムで代替した。ダブルエマルションを、ＭilliＱ水６リットルを含む硬化浴に注ぎ入れて、渦流濾過システムに送り出した。内容物を供給入口を通してポンプ送入して、回転する２５μmのカートリッジ膜を通過させた。２５μmより小さいミクロスフェアがその膜を通過し(透過し)、一方残りのミクロスフェアをさらに硬化して濾過するために、硬化浴に再び循環して戻した。フレッシュな水(または０.１％ Ｔween ２０)を硬化浴に一定供給して、液体レベルを維持した。この工程の最後には、ミクロスフェアを集め、１５０μmのメッシュを通して濾過し、沈降させて、上清を除去した。次いで、最終ミクロスフェアを乾燥した。
ｃ．乾燥方法
ミクロスフェアを乾燥するために、３つの違う乾燥方法を利用した：凍結乾燥、減圧乾燥、および第４図で示すシステムまたは５mlのＡmiconの撹拌セルを使用することによる流動床乾燥。ミクロスフェアの水性懸濁液を、ベント式栓を備えた３mlのバイアルに入れることにより、凍結乾燥および減圧乾燥を行った。凍結乾燥の場合には、その懸濁液を−５５℃で４.７５時間凍結させた後、−２０℃まで温めた。−２０℃での間は、２５０mＴorrの減圧を１２時間適用した。バルク水除去段階(第一乾燥)が完了した後、試料を２０℃まで温めて、２５０mＴorrの減圧下に６時間保持した。そのバイアルをシールしたデシケーター内に２−８℃で置き、１週間減圧とすることにより、減圧乾燥を行って、残留水分を＜２０％とした。流動床乾燥の場合には、最終ミクロスフェアの懸濁液をエアリフト乾燥装置(第４図)または撹拌セルに加えて、僅かな(約２psi)窒素圧をカラム(下方窒素流れ)に加えることにより、残留液体を除去した。残留液体を除去した後、窒素の流れを、エアリフト乾燥装置またはＡmiconの撹拌セルを通して上方に向けて、ミクロスフェアを懸濁させた。窒素ラインを、撹拌セル用のプレフィルター(０.２２μm)およびエアリフト乾燥装置用のプレフィルターを備えた乾燥カラムに接続した。水浴をエアリフト乾燥装置のジャケットに接続して、そのシステムを５℃で維持した。Ａmiconの撹拌セル乾燥を２〜８℃の冷室内で行った。
ｄ．ミクロスフェア充填
ＭＮ rgp１２０−ＰＬＧＡおよびrhＧＨ−ＰＬＧＡミクロスフェアのタンパク質含量を以下のように測定した。乾燥ミクロスフェア(１０〜２０mg)を１Ｎ ＮaＯＨ １mlに加えて、室温で２〜１６時間振盪することにより溶解した。５Ｎ ＮaＯＨを各々のタンパク質保存溶液(１.５mg／ml ＭＮ rgp１２０；５mg／ml rhＧＨ)に加えることにより、ＭＮ rgp１２０またはrhＧＨの標準を製造して、１Ｎ ＮaＯＨ溶液を得た。１Ｎ ＮaＯＨ中、チロシンを脱プロトンすると、最大吸収の有意なシフトが起こることから、１Ｎ ＮaＯＨに溶解したタンパク質は、中性pＨの緩衝液中の天然のタンパク質とは違う吸収スペクトルを有するであろう。１Ｎ ＮaＯＨ中、様々な濃度のＭＮ rgp１２０またはrhＧＨを含む標準溶液を使用して、この波長でシフトしたタンパク質の最大吸収および吸光係数を測定した。１Ｎ ＮaＯＨ中、ＭＮ rgp１２０の吸光係数は、２８４nmで１.３９cm-1(mg／ml)-1であった。１Ｎ ＮaＯＨ中、rhＧＨの吸光係数は、２９４nmで１.１１４cm-1(mg／ml)-1であった。
ミクロスフェアから放出されたタンパク質の量をＰierce Ｃhemical Ｃo.のＢＣＡ Ｐrotein Ａssayにより測定した。凍結乾燥したミクロスフェアおよび「湿った」ミクロスフェアの両方を分析した。「湿った」ミクロスフェアは、ダイアフィルトレーションセルから除去して、さらに処理することなく放出媒体に懸濁したミクロスフェアと定義した。次いで、放出されたタンパク質の量を利用して、放出装置内のミクロスフェアの質量、ミクロスフェアのタンパク質充填、および放出媒体の体積(１０mＭ Ｈepes、１００mＭ ＮaＣl、０.０２％（ｗ／ｗ）Ｔween (商標)２０、０.０２％ ＮaＮ3(pＨ ７.４)３００μl中、ミクロスフェア２０mg)に基づき、ミクロスフェアから放出されたＭＮ rgp１２０またはrhＧＨの％(全体の％)を計算した。
ミクロスフェアを１Ｎ ＮaＯＨに室温で一晩溶解することにより、ＰＬＧＡミクロスフェアに封入されたＱＳ２１の量を測定した。完全に溶解した溶液を６Ｎ ＨＣlで中和した。次いで、試料を、０.４Ｍ ＫＰＯ4(pＨ ７.０)中で平衡としたＳＥＣカラム、ＴＳＫ Ｇ３０００ＳＷ ＸＬ(０.７８×３０cm)に注入した。カラム操作条件は、rgp１２０のＳＥＣ分析に利用した条件と同じであった。ＱＳ２１は１Ｎ ＮaＯＨ中で分解するので、ＳＥＣ分析から得られるクロマトグラフは幾つかのピークを含んでいた。ＱＳ２１の全体量を定量するために、ＱＳ２１およびその分解生成物に対応するピーク面積をコア充填の測定に利用した。標準として、既知量のＱＳ２１をプラセボのミクロスフェアに加えた後、１Ｎ ＮaＯＨで処理した。ＳＥＣ分析を標準に関して行って、標準から得られたピーク面積を利用して、各々の試料中のＱＳ２１の量を計算した。
１ml／分の流量および２１４nmでの検出を用いる５μmのＹＭＣ Ｃ４(０.４６×２５cm)ＲＰ−ＨＰＬＣにより、ミクロスフェアから放出されたＱＳ２１を定量した。リニアグラジエントを溶液Ｂの２５から７５％まで１５分行った(溶液Ａ：水中、０.１％ ＴＦＡ；溶液Ｂ：９０％アセトニトリル中、０.１％ ＴＦＡ)。ＱＳ２１のコントロールもまた同様に行った。ＲＰ−ＨＰＬＣ分析では、rgp１２０のピークがＱＳ２１のピークより前に溶出することから、この方法は、ミクロスフェアから放出されたＱＳ２１およびrgp１２０の同時定量を提供する。
２．結果
ａ．初期バーストおよびミクロスフェアの量に対する乾燥の影響
初期バースト、ポリマー、および乾燥技術の間の相関関係を調査するために、乾燥実験を幾つかのミクロスフェア製剤に対して行った。これらの研究で利用した乾燥技術は、凍結乾燥、減圧乾燥、および流動床乾燥であった。これらの技術各々で乾燥したミクロスフェアから放出された初期タンパク質の量(１時間インキュベーション)を、製造直後に分析した(湿った)ミクロスフェアから得られた初期バースト(１時間)と比較した。
ミクロスフェアの乾燥時間を減らすために利用する１つの方法は凍結乾燥であり、これは通常、１〜２日しか必要としない。低分子量のＰＬＧＡ製剤の凍結乾燥および減圧乾燥が結果的には、初期バーストの１.５〜８倍の増加を起こす。ミクロスフェアの表面またはその付近に封入されたタンパク質水性小滴は恐らく、これらのミクロスフェアから初期バーストを引き起こすであろう。第一エマルションの粘度が増加するなら、ホモジナイズする間に形成される水性小滴は、ほとんど癒着しないらしい。従って、表面またはその付近の小滴は、同じ全体水量を含むミクロスフェアのタンパク質全体をほとんど放出しないであろう。第一エマルションの粘度を増加するために、塩化メチレン中のＰＬＧＡの濃度を上昇させることができる。ＰＬＧＡ(１２kＤ)の濃度を０.３から０.６ｇ／mlまで増加することにより、凍結乾燥したミクロスフェアまたは減圧乾燥したミクロスフェアから得られる初期バーストは、５０％以上から３０〜５０％まで減少した。第一エマルション中、０.３ｇ／ml １２kＤ(５０：５０ ラクチド：グリコリド)ＰＬＧＡで製造した初期ミクロスフェアもまた、凍結乾燥後に分解して、破壊した。凍結乾燥する間、そのミクロスフェアを凍結して、過剰の水を昇華により除去する。ミクロスフェア内での氷の結晶の形成は、ミクロスフェアのクラッキングおよび完全な破壊の原因となり得る。温度の低下を介して第一エマルションの粘度を増加することにより、また第二エマルションから過剰の塩化メチレンを除去することにより、水性小滴の安定性を増大して、ミクロスフェアのより迅速な形成を引き起こすことができる。工程条件を変更して、これらの変化が両方とも含まれるようにした場合、ミクロスフェアは凍結乾燥または減圧乾燥後に破壊または分解されなかったが、大きな初期バーストを有していた(６５％以上)。大きな初期バーストは、ミクロスフェア内に封入された第一エマルションの不安定性の結果であるらしい。ポリマーを２以上〜８℃まで温めると、より水性の小滴が表面に蓄積され、完全なミクロスフェアで観察された大きな初期バーストを提供する。
これとは対照的に、第二エマルション中、過剰の塩化メチレンなしに低温で製造した場合、凍結乾燥は、等質量比混合の高分子量および低分子量のＰＬＧＡ、または高分子量のＰＬＧＡ単独で製造したミクロスフェアのクラッキングまたは破壊を引き起こさなかった。これらのミクロスフェア製剤はまた、大きな初期バーストも有していなかった(３０％未満、表１)。さらに、高分子量のＰＬＧＡで製造したミクロスフェアは、凍結乾燥または減圧乾燥後、ずっと低い初期バーストを有していた(表１)。等質量比混合の高分子量並びに低分子量のポリマー、および高分子量のポリマー製剤は両方とも、１.８〜３.９％ ｗ／ｗの範囲の充填に関してタンパク質充填および初期バーストの間に相関関係を示さなかった。しかし、非常に低いタンパク質充填(０.５％ ｗ／ｗ)では、同じ条件で製造したミクロスフェアが大変低い初期バーストを有していた。タンパク質がミクロスフェアの外へ拡散することにより初期バーストが調節されるので、放出率(初期バースト)は、バルク溶液および水和された影響を受けやすいタンパク質(表面タンパク質)の間の濃度差に左右されるであろう。水性小滴中のタンパク質濃度が減少するので、その表面のタンパク質の量もまた減少するであろう。
ｂ．乾燥方法の比較
各々の実験では、ミクロスフェアを様々な工程条件下に製造して、初期バーストに対する乾燥条件の影響に関して分析した。表２の結果は、凍結乾燥したミクロスフェアまたは減圧乾燥したミクロスフェアを、流動床中、窒素で乾燥したミクロスフェアと比較した場合の、初期バーストの一貫した減少を実証する。表３には、表２で使用した工程条件を記載する。これらの実験では、該工程を低温(第一エマルションに関しては１℃；第二エマルションに関しては３℃)で操作し、またタンパク質製剤は、４００mg／ml rhＧＨ、１００mg／mlトレハロース、１００mＭリン酸カリウム(pＨ ８)であった。
表４は、固体のヒト成長ホルモンに関する同様のデータを提供する。出発原料である凍結乾燥されたタンパク質製剤(トレハロース、rhＧＨ、およびリン酸塩)を迅速凍結法により製造した結果、小さな固体粒子の形成が起こった。ＰＬＧＡ(０.２１dl／ｇ)４ｇを酢酸エチル１０mlに溶解して、凍結乾燥されたrhＧＨ５００mg(ｅ)または７５０mg(ｆ)を加えることにより、ミクロスフェアを製造した。次いで、その混合物を１℃、７０００rpmで９０秒間ホモジナイズした。次いで、ＰＬＧＡ相を静電ミキサーの入口に１５ml／分の割合でポンプ送入すると同時に、１０％酢酸エチルを含む９％ ＰＶＡ溶液を同じ入口に２Ｌ／分の割合でポンプ送入した。静電ミキサーの出口を、あらかじめ濾過しておいた水１２Ｌを含む撹拌タンク(硬化浴)に取り付けた。硬化浴中で１時間経過した後、ミクロスフェアを１５０μmのメッシュで濾過し、次いで、２０μmのメッシュおよび０.１％ Ｔween ６０Ｌを用い、２−８℃でダイアフィルトレーションした。次いで、最終ミクロスフェアを表に示すように乾燥した。
表５は、ダブルエマルション法により封入されたＭＮ rgp１２０に関する同様のデータを提供する。ＰＬＧＡ ３ｇを塩化メチレン１０mlに溶解することにより、ミクロスフェアを製造した。１５,０００rpmでホモジナイズしながら、ＭＮ rgp１２０ １mlをＰＬＧＡ溶液に注入した。注入した後、エマルションを１分間ホモジナイズした。ＰＬＧＡは、質量比５０：５０の、ＢＩから得た０.２１dl／ｇ(４８：５２ラクチド：グリコリド)および０.７６dl／ｇ(４８：５２ラクチド：グリコリド)(ｅ)、またはＭＴＩから得た０.２４dl／ｇ(５０：５０ラクチド：グリコリド)および０.７５dl／ｇ(５１：４９ラクチド：グリコリド)(ｆ)よりなっていた。第一エマルションは１℃で行った。その第一エマルションを、９％ ＰＶＡ溶液９００mlを含む、十分混合した発酵槽に３℃で加えた。１分間混合した後、第二エマルションを、あらかじめ濾過しておいた水１２Ｌに２−８℃で加えて、１時間硬化した。次いで、ミクロスフェアを１５０μmのメッシュで濾過した後、２０μmのメッシュおよび０.１％ Ｔween ３０Ｌを用い、２−８℃でダイアフィルトレーションした。次いで、最終ミクロスフェアを表に示すように乾燥した。
表６は、アジュバントＱＳ２１およびＭＮ gp１２０を封入するミクロスフェアに関する同様のデータを提供する。ＰＬＧＡ ３ｇを塩化メチレン１０mlに溶解することにより、ミクロスフェアを製造した。１５,０００rpmでホモジナイズしながら、ＭＮ rgp１２０ ０.５ml(バッチ１：７６mg；バッチ２：５６mg)およびＱＳ２１ ０.５ml(バッチ１：９４mg；バッチ２：１０５mg)をＰＬＧＡ溶液に注入した。注入した後、エマルションを１分間ホモジナイズした。ＰＬＧＡは、質量比５０：５０の、ＢＩから得た１２kＤ(７５：２５ラクチド：グリコリド)および１００kＤ(８５：２５ラクチド：グリコリド)、またはＢＩから得た１２kＤ(０.２１dl／ｇ；４８：５２ラクチド：グリコリド)および１００kＤ(０.７６dl／ｇ；４８：５２ラクチド：グリコリド)よりなっていた。第一エマルションは１℃で行った。その第一エマルションを、９％ ＰＶＡ溶液９００mlを含む、十分混合した発酵槽に３℃で加えた。１分間混合した後、第二エマルションを、あらかじめ濾過しておいた水１２Ｌに２−８℃で加えて、１時間硬化した。次いで、ミクロスフェアを１５０μmのメッシュで濾過した後、２０μmのメッシュおよび０.１％ Ｔween ３０Ｌを用い、２−８℃でダイアフィルトレーションした。次いで、最終ミクロスフェアを表に示すように乾燥した。
表７は、アジュバントＱＳ２１を封入するミクロスフェアに関する同様のデータを提供する。ＰＬＧＡ ３ｇ(０.５３dl／ｇ；５０：５０ラクチド：グリコリド；ＭＴＩ)を塩化メチレン１０mlに溶解することにより、ミクロスフェアを製造した。１５,０００rpmでホモジナイズしながら、ＱＳ２１ ６００μl(５０％エタノール中、２００mg／ml)をＰＬＧＡ溶液に注入した。注入した後、エマルションを１分間ホモジナイズした。この第一エマルションは１℃で行った。次いで、その第一エマルションを静電ミキサーの入口に５ml／分の割合でポンプ送入すると同時に、１０％酢酸エチルを含む９％ ＰＶＡ溶液(３℃)を同じ入口に１.５Ｌ／分の割合でポンプ送入した。静電ミキサーの出口を、あらかじめ濾過しておいた水１２Ｌを含む撹拌タンク(硬化浴)に取り付けた。硬化浴中で１時間経過した後、ミクロスフェアを１５０μmのメッシュで濾過した後、２０μmのメッシュおよび０.１％ Ｔween ３０Ｌを用い、２−８℃でダイアフィルトレーションした。次いで、最終ミクロスフェアを表に示すように乾燥した。
発明の分野
本発明は、流動床乾燥を含む、ミクロスフェアの製造方法に関する。
背景および関連技術の説明
本発明は、ミクロスフェアの製造方法を提供し、該方法ではミクロスフェアを流動床中で乾燥する。本発明のミクロスフェアは、抗原、アジュバント、ペプチド、ポリペプチド、ホルモン、抗生物質等といったような、あらゆる種類の活性物質を封入することができる。
ミクロスフェアを形成するためのポリマーマトリックスは、文献に記載されている。米国特許第４，９１７，８９３号および同第４，６５２，４４１号は、水溶性薬剤、薬剤を保持する物質を含む内部水相、およびポリマー物質を含む油相を含んでなる油中水型エマルションを製造することにより製造したマイクロカプセルを開示している；内部または水相を増粘するか、または凝固して、粘度を約５０００センチポアズ以上とする。その結果得られるエマルションを水中乾燥する。米国特許第４，９５４，２９８号は、内部水相として水溶性薬剤を含む溶液、および油相としてポリマーを含む溶液からなる油中水型エマルションを製造し、そのエマルションを水相中に分散させて、その結果得られる水中油中水型エマルションを水中乾燥することによるマイクロカプセルの製造を開示しており、ここでは、水中油中水型エマルションを製造する際に使用する油中水型エマルションの粘度を約１５０〜約１０，０００センチポアズに調節する。
当業界のミクロスフェアは一般に、減圧乾燥または凍結乾燥により乾燥されている。これらの方法は時間がかかって、結果的には、そのように乾燥したミクロスフェアの分解または「クラッキング」を起こすことが多い。
従って、本発明の目的は、ミクロスフェアを乾燥するための方法を提供することである。
他の目的は、乾燥するための時間量およびミクロスフェアの分解量を減らす、ミクロスフェアの乾燥方法を提供することである。
これらの目的および他の目的は、当業者に明白であろう。
発明の要約
従って、本発明は、ミクロスフェアの製造方法を提供し、該方法ではミクロスフェアを流動床中で乾燥する。本発明のミクロスフェアは、抗原、アジュバント、ペプチド、ポリペプチド、ホルモン、抗生物質といったような、あらゆる種類の活性物質を封入することができる。本発明のミクロスフェアの形成に好ましいポリマーマトリックスは、あらゆるポリエステルを使用することができるが、ポリ(Ｄ−Ｌ−ラクチド−コ−グリコリド)である。本発明のミクロスフェアは、水中油中水型エマルション法により形成するのが好ましい。本発明の乾燥工程は、より従来的な乾燥方法に必要とされる長い時間を短縮して、ミクロスフェアの分解量を減らす。
本発明の一態様は、活性物質をミクロスフェアに封入するための方法であって、
（ａ）ポリマーを有機溶媒に溶解して、溶液を製造し；
（ｂ）活性物質を（ａ）の溶液に加えて、第一エマルションまたはサスペンションを含んでなるポリマー−活性物質混合物を製造し；
（ｃ）工程（ｂ）の混合物を乳化浴に加えて、第二エマルションを含んでなるミクロスフェアを製造し；
（ｄ）工程（ｃ）のミクロスフェアを硬化して、封入された活性物質を含んでなる硬化ミクロスフェアを製造し；
（ｅ）工程（ｄ）のミクロスフェアを流動床中で乾燥する
ことを含んでなる方法である。
本発明の他の態様は、活性物質を封入するミクロスフェアを含んでなる組成物であり、ミクロスフェアは流動床中で乾燥する。
本発明の他の態様は、ミクロスフェアを流動床中で乾燥することを含んでなるポリラクチドミクロスフェアを製造するための方法である。
【図面の簡単な説明】
第１図は、ポリラクチド(ＰＬＧＡ)ミクロスフェアのバルク侵食(erosin)過程を示す図である。ＰＬＧＡミクロスフェアは一般に、投与前に水和している。挿入図に示すように、水がＰＬＧＡ主鎖中のエステル結合を加水分解する結果、経時的にポリマーのバルク侵食を起こす。加水分解速度は、ミクロスフェアの含水量、溶媒環境(例えば、ｐＨ)、および温度に左右される。ミクロスフェアのフラグメンテーションを引き起こすのに必要とされるポリマー主鎖中の切断数は、ポリマー分子量に左右される。
第２図は、Ｍillerら［Ｊ.Ｂiomed.Ｍater.Ｒes.１１：７１１−７１９，１９７７］を手本として改質したＰＬＧＡポリマーのインビボにおける分解速度を示す図である。Ｘ軸は、各々のＰＬＧＡについてのラクチドまたはグリコリドの相対比を表す。与えられたポリマー分子量に対して最も遅い分解速度は、ポリ乳酸(ＰＬＡ)およびポリグリコール酸(ＰＧＡ)システムに生ずる。最も速い分解速度は、等モル比のラクチドおよびグリコリドを含むＰＬＧＡで得られた。分解が完了するまでのインビボにおけるハーフタイムをラットにおける組織学試験により測定した。
第３図は、ダブルエマルション法を用いてのミクロスフェア製造法を示す図である。様々な分子量のＰＬＧＡポリマーを塩化メチレンに加えて、溶解した。次いで、その塩化メチレンにＭＮ rgp１２０またはrhＧＨ(ヒト成長ホルモン)の溶液をホモジナイズしながら注入した。そのホモジナイズした溶液をポリビニルアルコール(ＰＶＡ)溶液に加えた。幾つかの実験に関しては、そのＰＶＡ溶液を塩化メチレン(１.５％ ｖ／ｖ)で飽和した。そのＰＶＡおよびポリマー溶液を１リットルの発酵槽内で混合して、水中油中水型最終エマルションを形成した。次いで、その結果得られたミクロスフェアを、過剰の水を含む硬化浴に移して、残留する塩化メチレンを抽出した。次いで、その硬化ミクロスフェアを洗浄し、凍結乾燥または低温(５℃)窒素(流動床）または減圧乾燥により乾燥して、インビボおよびインビトロ分析用の最終ミクロスフェアを製造した。イタリック体で記載した項目は、各々の工程段階についての変数である。
第４図は、ＰＬＧＡミクロスフェアの窒素乾燥用のエアリフト(流動床)乾燥システムを示す図である。（ａ）ダイアフィルトレーション装置からのスラリーを、上部ピストン（ｂ）が入口より上にあるチャンバー内へポンプ送入する。次いで、その上部ピストンを下に動かし、上部入口（Ｃ）を通して窒素を加えることにより、過剰の液体を圧出する。次いで、下部入口（ｄ）を通して窒素でパージし、また上部入口（ｃ）を通して窒素を放出することにより、ミクロスフェアを懸濁するために再び送風する。乾燥が完了した後(１〜２日)、出口に補集容器(枝付きフラスコ、図示せず)を置き、その補集容器を減圧にしながら、出口より上に上部ピストン（ｂ）を動かして、下部入口（ｄ）で窒素圧を加えることにより、乾燥粉末を除去する。あるいはまた、両方のピストンが適切な位置に溶接され、かつ上部ピストンがスラリーの入口より上に位置する乾燥装置を設計することができる。スラリーにポンプ送入した後、乾燥中にスラリー出口の側枝をバルブによりシールする。
好ましい態様の詳細な説明
Ａ．定義
本明細書中で使用する「ポリラクチド」および「ＰＬＧＡ」という用語は、区別なく使用され、また乳酸単独のポリマー、グリコール酸単独のポリマー、そのようなポリマーの混合物、グリコール酸および乳酸のコポリマー、そのようなコポリマーの混合物、またはそのようなポリマーおよびコポリマーの混合物を示すことを意図する。本発明のミクロスフェアの形成に好ましいポリマーマトリックスは、ポリ(Ｄ−Ｌ−ラクチド−コ−グリコリド)である。
本明細書中で使用する「活性物質」という用語は、治療学的または生物学的活性化合物といったような、本発明のミクロスフェアに封入される重要な化合物を示す。例として挙げられる活性物質には、これらに制限されるものではないが、リガンド、抗原、アジュバント、ホルモン、抗生物質、酵素等が含まれる。「活性物質」とは、単一の薬剤に制限されるものではなく、抗原の組み合わせ、抗原およびアジュバントの組み合わせ等といったような、複数の活性物質が含まれることを意図する。
本明細書中で使用する「封入」という用語は、活性物質を、活性物質の放出を調節するのに有用な組成物へと製剤化するための方法を示す。本発明において有用な封入用物質の例には、あらゆる封入用物質が含まれ、好ましくはポリエステル、また特に本明細書中で「ポリラクチド」または「ＰＬＧＡ」と呼ばれるポリマーが含まれる。
本明細書中で使用する「流動床」とは、通例、ガスの流れがそれを通して徐々に上方へ流れている顆粒状粒子の床を示し、その結果、ガス速度がさらに増加すると、気孔および流路が拡大し、粒子がより広く分離するようになる。この定義には、これらに制限されるものではないが、スラリーおよび灌液充填塔式反応装置システムを含め、流動床または固定床の形態が含まれる。流動床中で使用するガスは、水および／または他の溶媒の除去を促進する、あらゆる乾燥ガスを使用することができるが、窒素、酸素、および二酸化炭素であるのが好ましい。本発明を実施する際に有用な流動床システムの例と同様、流動床または固定床システムを設計するための方法は、当業界で広く知られている［例えば、Ｐerry ＆ Ｃhilton(Ｃhemical Ｅngineers's Ｈandbook,Ｒ.Ｈ.Ｐerry ＆ Ｃ.Ｈ.Ｃhilton編，第５版，４〜２０−５〜５２−５〜５５頁，１９７３)を参照］。
本明細書中で使用する「賦形剤」という用語は、医薬的に許容し得る、すなわち、使用する用量および濃度でレシピエントに無毒である、医薬組成物に加える非治療用担体を示す。適当な賦形剤およびそれらの処方は、Ｒemington's Ｐharmaceutical Ｓciences，第１６版，１９８０，Ｍack Ｐublishing Ｃo., Ｏsloら編に記載されている。
本明細書中で使用する「有機溶媒」という用語は、炭素化合物を含む、あらゆる溶媒を意味することを意図する。例として挙げられる有機溶媒には、例えば、塩化メチレン、酢酸エチル、酢酸エチル並びにベンジルアルコールまたはアセトンの混合物、ジメチルスルホキシド、テトラヒドロフラン、ジメチルホルムアミド、およびエタノールといったような、ハロゲン化炭化水素、エーテル、エステル、アルコールおよびケトンが含まれる。
本明細書中で使用する「ポリペプチド」とは、通例、少なくとも約２個のアミノ酸を有するペプチドおよびタンパク質を示す。
本明細書中で使用する「乾燥」または「乾燥する」という用語は、最終生成物を残留水分２０％(ｗ／ｗ)未満で得るのに十分な水の除去を示す。
ミクロスフェアに関して本明細書中で使用する「硬化」という用語は、ポリマー相からの過剰な有機溶媒の抽出を示す。
Ｂ．一般的方法
一般的に、抗原またはアジュバントの微量封入は、第３図に簡単に概要を示すプロトコルにより行われる。要約すると、まず最初に、ラクチド：グリコリドの望ましい比率(約１００：０〜０：１００重量％、さらに好ましくは約６５：３５〜３５：６５、最も好ましくは約５０：５０)および固有粘度(通例、約０.１〜１.２dl／ｇ、好ましくは約０.２〜０.８dl／ｇ)を有するＰＬＧＡを、塩化メチレン、またはベンジルアルコールもしくはアセトンを含む、もしくは含まない酢酸エチルといったような有機溶媒に溶解して、望ましい濃度(通例、約０.０５〜１.０ｇ／ml、好ましくは約０.３〜０.６ｇ／ml)とする。次いで、そのポリマー溶液に、濃縮された抗原またはアジュバント溶液(例えば、一般に、ポリペプチドについて少なくとも０.１mg／ml、好ましくは約１００mg／ml以上、例えば、ポリペプチドの種類および望ましいコア充填に左右される)を約１５,０００〜２５,０００rpmでホモジナイズしながら(例えば、２５ゲージ針で)適当に注入する。乾燥抗原またはアジュバントを抗原またはアジュバント水溶液の代わりに使用することができる。ホモジナイズした後(通例、約０.５〜５分、さらに好ましくは１分間)、そのエマルションを反応がま(乳化浴)または静電ミキサー(図示せず)に加えて、第二エマルションを形成する。乳化浴は一般に、場合により酢酸エチルを含むポリビニルアルコール溶液である。その反応がまを高速(通例、約１７００〜２５００rpm)で混合して、小さなミクロスフェア(半径約２０〜１００mm)を生成した。十分な時間、通例、約０.５〜１０分、好ましくは約１分経過した後、その第二エマルションを硬化浴に移して、適当な時間、通例、約１〜２４時間、好ましくは約１時間穏やかに混合する。硬化が完了したら、ミクロスフェアを(例えば、１５０mmのメッシュで)あらかじめ濾過しておき、濃縮して、ダイアフィルトレーションする。ダイアフィルトレーションは、好ましくは約１６または２０μmのフィルターを用い、Ａmiconの撹拌セル(２５００ml)内で適当に成される。そのミクロスフェアは一般に、あらかじめ濾過しておいた水 約１〜１００Ｌ、好ましくは約１５Ｌで、また一般に、０.１％ Ｔween(商標)２０ 約１〜１００Ｌ、さらに好ましくは１５Ｌで洗浄する。最終ミクロスフェアをフィルターから除去し、水に再び懸濁させて、好ましくは３ccのバイアル中、約５００ml／バイアルの割合でバイアルに充填する。次いで、そのミクロスフェアを乾燥することができる。乾燥には、凍結乾燥、減圧乾燥、および流動床乾燥といったような方法が含まれる。
ミクロスフェアを製造するために、他の例として挙げられる３つの方法を利用することができる。第一の方法は、溶媒蒸発技術を利用する。固体または液体の活性物質を、ポリマーを含む有機溶媒に加える。次いで、その活性物質を有機溶媒中で乳化させる。次いで、このエマルションをある表面上に噴霧して、ミクロスフェアを形成させ、残留有機溶媒を減圧下に除去する。第二の方法は、コアセルベーションと呼ばれることの多い、相分離法を伴う。ポリマーを含む有機溶媒中に分散させた水性または固体の活性物質よりなる第一エマルションを非溶媒の溶液、通常、シリコーン油に加える。次いで、ポリマーは溶解しない(非溶媒)が、ポリマーを溶解するために使用する有機溶媒(例えば、塩化メチレンまたは酢酸エチル)を抽出する溶媒を使用することによって、本工程を混合しながら行うなら、ポリマーが溶液から沈殿して、ミクロスフェアを形成するであろう。第三の方法は、コーティング技術を利用する。ポリマーを含む有機溶媒中に分散させた活性物質を含んでなる第一エマルションを、空気−懸濁液被覆装置を通して処理する結果、最終ミクロスフェアが生ずる。
本発明のミクロスフェアについての分解速度は、ポリマー中のラクチド：グリコリドの比率およびポリマーの分子量により部分的には決定される。様々な分子量(または固有粘度)のポリマーを混合して、望ましい分解プロフィールを得ることができる。
本発明のミクロスフェアは、撹拌速度、第二エマルション工程で使用する溶媒の体積、温度、ポリマーの濃度、およびポリマーの固有粘度といったような、工程パラメーターを変化させることにより、直径約０.１〜約１００mm以上の範囲の、任意の望ましい大きさで製造することができる。
本発明の製剤は、防腐剤、緩衝液、トレハロースまたはマンニトールに加えポリエチレングリコール(ＰＥＧ)といったような、多様な賦形剤、またはＴween(商標)界面活性剤のような非イオン性界面活性剤を含み得る。非イオン性界面活性剤には、ポリソルベート２０または８０といったようなポリソルベート、およびポロキサマー１８４または１８８といったようなポロキサマー、Ｐluronic(商標)ポリオール、および他のエチレンオキシド／プロピレンオキシドブロックコポリマー等が含まれる。安定な水性製剤を得るのに有効な量は、通常、約０.１％(ｗ／ｖ)〜約３０％(ｗ／ｖ)の範囲内で使用されるであろう。
本発明の製剤のpＨは、通例、約５〜８、好ましくは約６.５〜７.５である。このpＨを得るのに適当な緩衝液には、例えば、リン酸塩、Ｔris、クエン酸塩、コハク酸塩、酢酸塩、またはヒスチジン緩衝液が含まれ、望まれるpＨに左右される。好ましくは、該緩衝液は約２mＭ〜約１００mＭの範囲内である。
該製剤に適当な防腐剤の例には、フェノール、ベンジルアルコール、メタクレゾール、メチルパラベン、プロピルパラベン、塩化ベンザルコニウム、および塩化ベンゼトニウムが含まれる。防腐剤の種類およびその濃度範囲は重要ではないが、好ましい防腐剤には、約０.２〜０.４％(ｗ／ｖ)フェノールおよび約０.７〜１％(ｗ／ｖ)ベンジルアルコールが含まれる。
一般的に、本発明の製剤は、安定な形の製剤を損なわない量で、また有効で安全な医薬品投与に適当な量で他の成分を含み得る。例えば、当業者に周知の、他の医薬的に許容し得る賦形剤は、本発明の組成物の一部をなし得る。これらには、例えば、塩、様々な充填剤、さらなる緩衝剤、キレート化剤、抗酸化剤、補助溶剤等が含まれる。これらの具体的な例には、トリス−(ヒドロキシメチル)アミノメタン塩(「Ｔris緩衝液」)、およびエデト酸二ナトリウムが含まれる。
ミクロスフェアは、必要とされる、あらゆる補助因子と共に、医薬的に許容し得る無菌の等張製剤中に入れ、また所望により、当分野において周知の標準的な方法により投与する。ミクロスフェア製剤は一般に、乾燥粉末として保存する。
さらに本発明の詳細を以下の実施例に見い出すことができ、これがさらに本発明を説明する。本明細書中に引用する文献は全て、そのまま本発明の一部をなす。
実施例
１．材料および方法
ａ．材料
ポリ(Ｄ−Ｌ−ラクチド−コ−グリコリド)（ＰＬＧＡ）をＢoehringer Ｉngelheim(ＢＩ)およびＭedisorb Ｔechnologies Ｉnternational Ｌ.Ｐ.(ＭＴＩ)の両社から購入した。１２kＤおよび１００kＤのＰＬＧＡをＢＩから入手し、また１８kＤおよび１００kＤのＰＬＧＡをＭＴＩから入手した。ポリマー組成は、ラクチド：グリコリドが５０：５０、６５：３５、または７５：２５のいずれかであった。固体のＰＶＡを温水(約８０℃)に溶解することにより、１０％ポリビニルアルコール溶液(ＰＶＡ Ａirvol ２０５、Ａir Ｐroducts)を製造した。最終ＰＶＡ溶液を、Ｍilliporeから得た０.２２μmのＭillipakフィルターで濾過した。塩化メチレン(工業用)をＢaxter Ｓ／Ｐから購入した。
ＭＮ rgp１２０(ロット番号Ｙ１６５３１／Ｇ９０５５７)を、２０mＭ Ｔris、０.１２０Ｍ ＮaＣl(pＨ７.４)中、２.３mg／mlタンパク質でのバルクでＧenentech, Ｉnc.から得た。それを、ＹＭ３０,０００ＭＷカットオフ膜を備えたＡmiconの撹拌セル濃縮器を用いて４℃で濃縮し、最終濃度を１５４mg／mlとして、２〜８℃で保存した。
凍結乾燥されたＱＳ２１(純度約８０％、ロット番号Ｄ１９４９)をＣambridge Ｂiotech(Ｃambridge、ＭＡ)から得た。凍結乾燥されたＱＳ２１の粉末を５０％エタノール／水に溶解することにより、ＱＳ２１を２００mg／mlで製造した。封入効率および放出率が増加する試みで、ＱＳ２１をまた２０％ Ｔween(商標)２０を含む５０％エタノールにも溶解した。ＱＳ２１溶液を製造して、封入と同日に使用した。
rhＧＨを、１０mＭの重炭酸ナトリウム(pＨ ７)中、５−１０mg／mlタンパク質でのバルクでＧenentech,Inc.から得た。そのタンパク質を０.２２μmのフィルターで濾過し、２０mlを１００ccのバイアルに充填し、凍結乾燥して、乾燥粉末を製造した。凍結乾燥されたタンパク質を、５mＭリン酸カリウム緩衝液、２.５mg／mlトレハロース(pＨ ８)を含む１０mg／mlタンパク質に再び構成した。次いで、そのタンパク質を０.２２μmのフィルターで濾過し、２０mlを１００ccのバイアルに充填し、再び凍結乾燥して、乾燥粉末を製造した。この最終粉末を、５mＭリン酸カリウム緩衝液(pＨ ８)を含む４００mg／ml rhＧＨに再び構成した。このrhＧＨ溶液は、１００mg／mlトレハロースおよび約１００mＭリン酸カリウム(pＨ ８)を含んでいた。
ｂ．微量封入
rgp１２０ミクロスフェアの製造は、先の一般用語で論じた水中油中水型(ＷＯＷ)ダブルエマルション法により行った。より具体的には、塩化メチレン中のＰＬＧＡ濃度は０.３または０.６ｇ／mlであり、また水浴中、第一エマルションを１５,０００rpmおよび０〜１℃でホモジナイズした。１分ホモジナイズした後、第一エマルション(１０ml)を、１.５％塩化メチレンを含む１０％ ＰＶＡ溶液９００mlに加えて、反応がま(２〜８℃)中、高速(８００〜２５００rpm)で１分間乳化した。封入効率を改善するために、第二エマルションをまた、塩化メチレンを含んでいない１０％ ＰＶＡでも行い、またその第二エマルションの温度を０〜３℃で維持した。低温とするために、反応がまの冷却ジャケット内のエチレングリコールを−１５℃に保った。次いで、その第二エマルションを、あらかじめ濾過しておいた水(ＭilliＱ水システム、Ｍillipore Ｃorp.)１２リットルを含む２〜８℃の硬化浴に移した。ミクロスフェアを１時間硬化した。硬化ミクロスフェアを約１.５Ｌまで濃縮して、あらかじめ濾過しておいた水１５Ｌに対してダイアフィルトレーションした後、０.１％ Ｔween(商標)２０ １５Ｌに対してダイアフィルトレーションした。望ましい粒子経により、Ａmiconの撹拌セル(２.５Ｌ)を様々なフィルターシステムで操作した。洗浄した後、そのミクロスフェアを乾燥状態となるまで濃縮した。セルスクレーパーを使用することにより、濃縮されたミクロスフェアをフィルターから除去して、あらかじめ濾過しておいた水に再び懸濁させて、約０.３gm／mlとした。
Ｑ２１を、先に記載したＴween(商標)２０を含む、または含まない５０％エタノールに溶解した。rgp１２０溶液の場合と同様に、ＱＳ２１溶液をポリマー相に注入した。rgp１２０およびＱＳ２１の両方を含むミクロスフェア製剤の場合には、ＱＳ２１溶液を注入した後、rgp１２０溶液をポリマー相に注入して、ＱＳ２１溶液中のrgp１２０およびエタノールの間の相互作用の可能性を減じた。ＱＳ２１の微量封入は、rgp１２０に関して先に記載した条件と類似の条件で行った。
ＰＬＧＡにおけるrhＧＨの微量封入は、第３図で説明した水中油中水型(Ｗ／Ｏ／Ｗ)ダブルエマルションシステムを利用することにより行った。ポリマーを有機溶媒(塩化メチレンまたは酢酸エチル)に加えた後、その溶液を１℃まで冷却した。その溶液を１℃で維持しながら７０００rpmでホモジナイズした。次いで、そのタンパク質溶液(水相)を、７０００rpmで操作するホモジナイザーのチップ付近でポリマー相に３０−６０秒で注入した。さらに１分間ホモジナイズし続けて、第一エマルションを生成した。(塩化メチレンを含む、または含まない)６％ ＰＶＡ溶液を０〜３℃まで冷却し、一定速度(１８００−２５００rpm)で撹拌した。次いで、その第一エマルションを、(金属インジェクター、窒素加圧またはペリスタポンプにより)下部羽根車付近でＰＶＡ溶液に注入して、第二エマルションを製造した。さらに１分間乳化し続けた。次いで、ダブルエマルションを硬化浴に移し、これを一定速度で撹拌して、２〜８℃で維持した。ミクロスフェアを一定に撹拌しながら１〜５℃で１時間硬化した。硬化浴の内容物を、１５０μmのメッシュを通して保持タンクにサイフォンで吸い上げた。次いで、そのミクロスフェアを濃縮して、(２５μmのメッシュが取り付けられた)２.５リットルのＡmiconの撹拌セル内で洗浄した。撹拌セル中、低(low)体積および高(high)体積の洗浄溶液で数サイクル行って、２５μmより小さいミクロスフェアを有効に除去した。２５μmのフィルターを０.１％ Ｔween ２０約１００mlで洗浄することにより、洗浄したミクロスフェアを収集し、２５０mlのビーカーに集めて、５℃で約１時間沈降させた。沈降しなかった小さいミクロスフェアを含む上清を吸引により除去して、残留するミクロスフェアを乾燥用に準備した。幾つかの実験では、硬化浴および洗浄工程を渦流濾過システムで代替した。ダブルエマルションを、ＭilliＱ水６リットルを含む硬化浴に注ぎ入れて、渦流濾過システムに送り出した。内容物を供給入口を通してポンプ送入して、回転する２５μmのカートリッジ膜を通過させた。２５μmより小さいミクロスフェアがその膜を通過し(透過し)、一方残りのミクロスフェアをさらに硬化して濾過するために、硬化浴に再び循環して戻した。フレッシュな水(または０.１％ Ｔween ２０)を硬化浴に一定供給して、液体レベルを維持した。この工程の最後には、ミクロスフェアを集め、１５０μmのメッシュを通して濾過し、沈降させて、上清を除去した。次いで、最終ミクロスフェアを乾燥した。
ｃ．乾燥方法
ミクロスフェアを乾燥するために、３つの違う乾燥方法を利用した：凍結乾燥、減圧乾燥、および第４図で示すシステムまたは５mlのＡmiconの撹拌セルを使用することによる流動床乾燥。ミクロスフェアの水性懸濁液を、ベント式栓を備えた３mlのバイアルに入れることにより、凍結乾燥および減圧乾燥を行った。凍結乾燥の場合には、その懸濁液を−５５℃で４.７５時間凍結させた後、−２０℃まで温めた。−２０℃での間は、２５０mＴorrの減圧を１２時間適用した。バルク水除去段階(第一乾燥)が完了した後、試料を２０℃まで温めて、２５０mＴorrの減圧下に６時間保持した。そのバイアルをシールしたデシケーター内に２−８℃で置き、１週間減圧とすることにより、減圧乾燥を行って、残留水分を＜２０％とした。流動床乾燥の場合には、最終ミクロスフェアの懸濁液をエアリフト乾燥装置(第４図)または撹拌セルに加えて、僅かな(約２psi)窒素圧をカラム(下方窒素流れ)に加えることにより、残留液体を除去した。残留液体を除去した後、窒素の流れを、エアリフト乾燥装置またはＡmiconの撹拌セルを通して上方に向けて、ミクロスフェアを懸濁させた。窒素ラインを、撹拌セル用のプレフィルター(０.２２μm)およびエアリフト乾燥装置用のプレフィルターを備えた乾燥カラムに接続した。水浴をエアリフト乾燥装置のジャケットに接続して、そのシステムを５℃で維持した。Ａmiconの撹拌セル乾燥を２〜８℃の冷室内で行った。
ｄ．ミクロスフェア充填
ＭＮ rgp１２０−ＰＬＧＡおよびrhＧＨ−ＰＬＧＡミクロスフェアのタンパク質含量を以下のように測定した。乾燥ミクロスフェア(１０〜２０mg)を１Ｎ ＮaＯＨ １mlに加えて、室温で２〜１６時間振盪することにより溶解した。５Ｎ ＮaＯＨを各々のタンパク質保存溶液(１.５mg／ml ＭＮ rgp１２０；５mg／ml rhＧＨ)に加えることにより、ＭＮ rgp１２０またはrhＧＨの標準を製造して、１Ｎ ＮaＯＨ溶液を得た。１Ｎ ＮaＯＨ中、チロシンを脱プロトンすると、最大吸収の有意なシフトが起こることから、１Ｎ ＮaＯＨに溶解したタンパク質は、中性pＨの緩衝液中の天然のタンパク質とは違う吸収スペクトルを有するであろう。１Ｎ ＮaＯＨ中、様々な濃度のＭＮ rgp１２０またはrhＧＨを含む標準溶液を使用して、この波長でシフトしたタンパク質の最大吸収および吸光係数を測定した。１Ｎ ＮaＯＨ中、ＭＮ rgp１２０の吸光係数は、２８４nmで１.３９cm-1(mg／ml)-1であった。１Ｎ ＮaＯＨ中、rhＧＨの吸光係数は、２９４nmで１.１１４cm-1(mg／ml)-1であった。
ミクロスフェアから放出されたタンパク質の量をＰierce Ｃhemical Ｃo.のＢＣＡ Ｐrotein Ａssayにより測定した。凍結乾燥したミクロスフェアおよび「湿った」ミクロスフェアの両方を分析した。「湿った」ミクロスフェアは、ダイアフィルトレーションセルから除去して、さらに処理することなく放出媒体に懸濁したミクロスフェアと定義した。次いで、放出されたタンパク質の量を利用して、放出装置内のミクロスフェアの質量、ミクロスフェアのタンパク質充填、および放出媒体の体積(１０mＭ Ｈepes、１００mＭ ＮaＣl、０.０２％（ｗ／ｗ）Ｔween (商標)２０、０.０２％ ＮaＮ3(pＨ ７.４)３００μl中、ミクロスフェア２０mg)に基づき、ミクロスフェアから放出されたＭＮ rgp１２０またはrhＧＨの％(全体の％)を計算した。
ミクロスフェアを１Ｎ ＮaＯＨに室温で一晩溶解することにより、ＰＬＧＡミクロスフェアに封入されたＱＳ２１の量を測定した。完全に溶解した溶液を６Ｎ ＨＣlで中和した。次いで、試料を、０.４Ｍ ＫＰＯ4(pＨ ７.０)中で平衡としたＳＥＣカラム、ＴＳＫ Ｇ３０００ＳＷ ＸＬ(０.７８×３０cm)に注入した。カラム操作条件は、rgp１２０のＳＥＣ分析に利用した条件と同じであった。ＱＳ２１は１Ｎ ＮaＯＨ中で分解するので、ＳＥＣ分析から得られるクロマトグラフは幾つかのピークを含んでいた。ＱＳ２１の全体量を定量するために、ＱＳ２１およびその分解生成物に対応するピーク面積をコア充填の測定に利用した。標準として、既知量のＱＳ２１をプラセボのミクロスフェアに加えた後、１Ｎ ＮaＯＨで処理した。ＳＥＣ分析を標準に関して行って、標準から得られたピーク面積を利用して、各々の試料中のＱＳ２１の量を計算した。
１ml／分の流量および２１４nmでの検出を用いる５μmのＹＭＣ Ｃ４(０.４６×２５cm)ＲＰ−ＨＰＬＣにより、ミクロスフェアから放出されたＱＳ２１を定量した。リニアグラジエントを溶液Ｂの２５から７５％まで１５分行った(溶液Ａ：水中、０.１％ ＴＦＡ；溶液Ｂ：９０％アセトニトリル中、０.１％ ＴＦＡ)。ＱＳ２１のコントロールもまた同様に行った。ＲＰ−ＨＰＬＣ分析では、rgp１２０のピークがＱＳ２１のピークより前に溶出することから、この方法は、ミクロスフェアから放出されたＱＳ２１およびrgp１２０の同時定量を提供する。
２．結果
ａ．初期バーストおよびミクロスフェアの量に対する乾燥の影響
初期バースト、ポリマー、および乾燥技術の間の相関関係を調査するために、乾燥実験を幾つかのミクロスフェア製剤に対して行った。これらの研究で利用した乾燥技術は、凍結乾燥、減圧乾燥、および流動床乾燥であった。これらの技術各々で乾燥したミクロスフェアから放出された初期タンパク質の量(１時間インキュベーション)を、製造直後に分析した(湿った)ミクロスフェアから得られた初期バースト(１時間)と比較した。
ミクロスフェアの乾燥時間を減らすために利用する１つの方法は凍結乾燥であり、これは通常、１〜２日しか必要としない。低分子量のＰＬＧＡ製剤の凍結乾燥および減圧乾燥が結果的には、初期バーストの１.５〜８倍の増加を起こす。ミクロスフェアの表面またはその付近に封入されたタンパク質水性小滴は恐らく、これらのミクロスフェアから初期バーストを引き起こすであろう。第一エマルションの粘度が増加するなら、ホモジナイズする間に形成される水性小滴は、ほとんど癒着しないらしい。従って、表面またはその付近の小滴は、同じ全体水量を含むミクロスフェアのタンパク質全体をほとんど放出しないであろう。第一エマルションの粘度を増加するために、塩化メチレン中のＰＬＧＡの濃度を上昇させることができる。ＰＬＧＡ(１２kＤ)の濃度を０.３から０.６ｇ／mlまで増加することにより、凍結乾燥したミクロスフェアまたは減圧乾燥したミクロスフェアから得られる初期バーストは、５０％以上から３０〜５０％まで減少した。第一エマルション中、０.３ｇ／ml １２kＤ(５０：５０ ラクチド：グリコリド)ＰＬＧＡで製造した初期ミクロスフェアもまた、凍結乾燥後に分解して、破壊した。凍結乾燥する間、そのミクロスフェアを凍結して、過剰の水を昇華により除去する。ミクロスフェア内での氷の結晶の形成は、ミクロスフェアのクラッキングおよび完全な破壊の原因となり得る。温度の低下を介して第一エマルションの粘度を増加することにより、また第二エマルションから過剰の塩化メチレンを除去することにより、水性小滴の安定性を増大して、ミクロスフェアのより迅速な形成を引き起こすことができる。工程条件を変更して、これらの変化が両方とも含まれるようにした場合、ミクロスフェアは凍結乾燥または減圧乾燥後に破壊または分解されなかったが、大きな初期バーストを有していた(６５％以上)。大きな初期バーストは、ミクロスフェア内に封入された第一エマルションの不安定性の結果であるらしい。ポリマーを２以上〜８℃まで温めると、より水性の小滴が表面に蓄積され、完全なミクロスフェアで観察された大きな初期バーストを提供する。
これとは対照的に、第二エマルション中、過剰の塩化メチレンなしに低温で製造した場合、凍結乾燥は、等質量比混合の高分子量および低分子量のＰＬＧＡ、または高分子量のＰＬＧＡ単独で製造したミクロスフェアのクラッキングまたは破壊を引き起こさなかった。これらのミクロスフェア製剤はまた、大きな初期バーストも有していなかった(３０％未満、表１)。さらに、高分子量のＰＬＧＡで製造したミクロスフェアは、凍結乾燥または減圧乾燥後、ずっと低い初期バーストを有していた(表１)。等質量比混合の高分子量並びに低分子量のポリマー、および高分子量のポリマー製剤は両方とも、１.８〜３.９％ ｗ／ｗの範囲の充填に関してタンパク質充填および初期バーストの間に相関関係を示さなかった。しかし、非常に低いタンパク質充填(０.５％ ｗ／ｗ)では、同じ条件で製造したミクロスフェアが大変低い初期バーストを有していた。タンパク質がミクロスフェアの外へ拡散することにより初期バーストが調節されるので、放出率(初期バースト)は、バルク溶液および水和された影響を受けやすいタンパク質(表面タンパク質)の間の濃度差に左右されるであろう。水性小滴中のタンパク質濃度が減少するので、その表面のタンパク質の量もまた減少するであろう。
各々の実験では、ミクロスフェアを様々な工程条件下に製造して、初期バーストに対する乾燥条件の影響に関して分析した。表２の結果は、凍結乾燥したミクロスフェアまたは減圧乾燥したミクロスフェアを、流動床中、窒素で乾燥したミクロスフェアと比較した場合の、初期バーストの一貫した減少を実証する。表３には、表２で使用した工程条件を記載する。これらの実験では、該工程を低温(第一エマルションに関しては１℃；第二エマルションに関しては３℃)で操作し、またタンパク質製剤は、４００mg／ml rhＧＨ、１００mg／mlトレハロース、１００mＭリン酸カリウム(pＨ ８)であった。
Claims (21)
- 活性物質を油中水型または油中固体型エマルション法によりポリマーマトリックス中に分散して、活性物質をミクロスフェアに封入する、ミクロスフェアの製造方法であって、
（ａ）ポリラクチドまたはポリ（Ｄ−Ｌ−ラクチド−コ−グリコリド）を含むポリマーを有機溶媒に溶解して、溶液を製造し；
（ｂ）活性物質またはその水溶液を工程（ａ）の溶液に加えて、ポリマー−活性物質油中固体型または油中水型エマルションまたはサスペンションを製造し；
（ｃ）ポリビニルアルコールを含む水溶液により該エマルションまたはサスペンションから過剰の有機溶媒を抽出して、ミクロスフェアを製造し；
（ｄ）直径２０μｍ〜１５０μｍのミクロスフェアを回収し；
（ｅ）工程（ｄ）のミクロスフェアを流動床中で乾燥することにより、残存水分が２０％未満の最終生成物を得るのに十分な水溶液を除去し；次いで
（ｆ）ミクロスフェアを回収する
ことを含んでなる方法。 - 有機溶媒が塩化メチレンである、請求項１に記載の方法。
- 有機溶媒が酢酸エチルである、請求項１に記載の方法。
- 有機溶媒が酢酸エチルおよびベンジルアルコールまたはアセトンとの混合物である、請求項１に記載の方法。
- ポリビニルアルコール含有水溶液が酢酸エチルも含む、請求項１に記載の方法。
- 活性物質が乾燥固体である、請求項１に記載の方法。
- 活性物質の水溶液が工程（ａ）の溶液に添加される請求項１に記載の方法。
- 活性物質が抗原である、請求項１に記載の方法。
- 活性物質がアジュバントである、請求項１に記載の方法。
- 流動床が、乾燥ガスが湿ったミクロスフェアを通過するというシステムを含んでなる、請求項１に記載の方法。
- 活性物質がポリペプチドである、請求項１に記載の方法。
- ポリペプチドがヒト成長ホルモンである、請求項１１に記載の方法。
- ポリペプチドがｇｐ１２０である、請求項１１に記載の方法。
- 請求項１の方法により製造された、活性物質を封入するミクロスフェアを含んでなる組成物。
- 活性物質が乾燥固体である、請求項１４に記載の組成物。
- 活性物質の水溶液が工程（ａ）の溶液に添加される請求項１４に記載の組成物。
- 活性物質が抗原である、請求項１４に記載の組成物。
- 活性物質がアジュバントである、請求項１４に記載の組成物。
- 活性物質がポリペプチドである、請求項１４に記載の組成物。
- ポリペプチドが成長ホルモンである、請求項１９に記載の組成物。
- ポリペプチドがｇｐ１２０ある、請求項１９に記載の組成物。
Applications Claiming Priority (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US14225793A | 1993-10-22 | 1993-10-22 | |
| US08/142,257 | 1993-10-22 | ||
| US14331393A | 1993-10-25 | 1993-10-25 | |
| US08/143,313 | 1993-10-25 | ||
| PCT/US1994/011678 WO1995011009A1 (en) | 1993-10-22 | 1994-10-13 | Method for preparing microspheres comprising a fluidized bed drying step |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH09504026A JPH09504026A (ja) | 1997-04-22 |
| JP3841309B2 true JP3841309B2 (ja) | 2006-11-01 |
Family
ID=26839915
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP51207695A Expired - Lifetime JP3841309B2 (ja) | 1993-10-22 | 1994-10-13 | 流動床乾燥工程を含んでなるミクロスフェアの製造方法 |
Country Status (9)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0724433B1 (ja) |
| JP (1) | JP3841309B2 (ja) |
| AT (1) | ATE175110T1 (ja) |
| AU (1) | AU8017494A (ja) |
| CA (1) | CA2172508C (ja) |
| DE (1) | DE69415684T2 (ja) |
| DK (1) | DK0724433T3 (ja) |
| UY (1) | UY23846A1 (ja) |
| WO (1) | WO1995011009A1 (ja) |
Families Citing this family (23)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP3698721B2 (ja) * | 1993-02-23 | 2005-09-21 | ジェネンテク・インコーポレイテッド | 有機溶媒を用いて処理したポリペプチドの賦形剤安定化 |
| ES2236700T3 (es) | 1993-11-19 | 2005-07-16 | Janssen Pharmaceutica N.V. | 1,2-benzazoles microencapsulados. |
| US6117455A (en) * | 1994-09-30 | 2000-09-12 | Takeda Chemical Industries, Ltd. | Sustained-release microcapsule of amorphous water-soluble pharmaceutical active agent |
| US6267958B1 (en) | 1995-07-27 | 2001-07-31 | Genentech, Inc. | Protein formulation |
| EP0765660A3 (en) * | 1995-09-28 | 1998-09-23 | Takeda Chemical Industries, Ltd. | Microcapsules comprising 2-piperazinone-1-acetic acid compounds |
| EP0965336A1 (en) | 1995-11-09 | 1999-12-22 | Microbiological Research Authority | Microencapsulated DNA for gene therapy |
| US6270795B1 (en) | 1995-11-09 | 2001-08-07 | Microbiological Research Authority | Method of making microencapsulated DNA for vaccination and gene therapy |
| DE19545257A1 (de) * | 1995-11-24 | 1997-06-19 | Schering Ag | Verfahren zur Herstellung von morphologisch einheitlichen Mikrokapseln sowie nach diesem Verfahren hergestellte Mikrokapseln |
| GB2310801A (en) * | 1996-03-04 | 1997-09-10 | Merck & Co Inc | Process for removing an organic solvent from lactide-glycoside copolymer microspheres |
| CA2241322C (en) * | 1996-03-28 | 2009-01-13 | Takeda Chemical Industries, Ltd. | Sustained-release preparation and its production |
| ATE223206T1 (de) * | 1996-05-07 | 2002-09-15 | Alkermes Inc | Verfahren zur herstellung von mikropartikeln |
| ES2327693T3 (es) * | 1997-08-29 | 2009-11-02 | Antigenics Inc. | Composiciones que comprenden el adyvante qs-21 y polisorbato o ciclodextrina excipiente. |
| JP2001522812A (ja) * | 1997-11-07 | 2001-11-20 | カイロン コーポレイション | Ｉｇｆ−１持続放出性処方物の作製方法 |
| SE9801288D0 (sv) | 1998-04-14 | 1998-04-14 | Astra Ab | Vaccine delivery system and metod of production |
| GB9810236D0 (en) * | 1998-05-13 | 1998-07-08 | Microbiological Res Authority | Improvements relating to encapsulation of bioactive agents |
| WO2001030320A1 (en) * | 1999-10-22 | 2001-05-03 | Amgen Inc. | Biodegradable microparticles with novel erythropoietin stimulating protein |
| WO2006123359A2 (en) * | 2005-03-01 | 2006-11-23 | Sun Pharmaceutical Industries Limited | A process of making microspheres |
| CN102985175B (zh) | 2009-12-22 | 2016-03-09 | 赢创有限公司 | 用于制备微粒的基于乳液的工艺以及供所述工艺使用的工作头组件 |
| UA111162C2 (uk) | 2010-08-04 | 2016-04-11 | Флекшен Терап'Ютікс, Інк. | Ін'єкційна композиція ацетоніду триамцинолону для лікування болю |
| CA2843139C (en) * | 2011-08-04 | 2019-09-24 | Flexion Therapeutics, Inc. | Corticosteroids for the treatment of joint pain |
| ES2900426T3 (es) | 2013-12-31 | 2022-03-16 | Rapamycin Holdings Llc | Preparaciones orales y uso de nanopartículas de rapamicina |
| CA2968049A1 (en) | 2014-04-16 | 2015-10-22 | Rapamycin Holdings, Llc | Oral rapamycin preparation and use for stomatitis |
| WO2023277051A1 (ja) * | 2021-06-30 | 2023-01-05 | 国立大学法人大阪大学 | 免疫賦活剤 |
Family Cites Families (16)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US3773919A (en) * | 1969-10-23 | 1973-11-20 | Du Pont | Polylactide-drug mixtures |
| IT1214629B (it) * | 1985-08-29 | 1990-01-18 | Formenti Farmaceutici Spa | Procedimento di microincapsulazione di un medicamento,medicamento cosi'preparato,e composizioni farmaceutiche che lo comprendono |
| IL84167A (en) * | 1986-10-24 | 1991-04-15 | Southern Res Inst | Oral delivery of bioactive agents to and through the peyer's patch by use of microencapsulation |
| US5075109A (en) * | 1986-10-24 | 1991-12-24 | Southern Research Institute | Method of potentiating an immune response |
| EP0279688B1 (en) * | 1987-02-20 | 1997-04-16 | Genentech, Inc. | Methods and compositions for the use of HIV env polypeptides and antibodies thereto |
| JP2813630B2 (ja) * | 1987-02-20 | 1998-10-22 | ジェネンテク，インコーポレイテッド | ヒト免疫不全ウイルスのエンベロープポリペプチドおよびその抗体 |
| NO176278C (no) * | 1988-08-24 | 1995-03-08 | Allied Colloids Ltd | Fremgangsmåte for fremstilling av en partikkelformig blanding av aktiv bestanddel i et polymert materiale |
| US5008116A (en) * | 1988-11-14 | 1991-04-16 | Frederick Cahn | Immunostimulatory microsphere |
| US4990336A (en) * | 1989-02-08 | 1991-02-05 | Biosearch, Inc. | Sustained release dosage form |
| US5126147A (en) * | 1990-02-08 | 1992-06-30 | Biosearch, Inc. | Sustained release dosage form |
| FR2658432B1 (fr) * | 1990-02-22 | 1994-07-01 | Medgenix Group Sa | Microspheres pour la liberation controlee des substances hydrosolubles et procede de preparation. |
| AU8303691A (en) * | 1991-04-24 | 1992-12-21 | United States Of America, As Represented By The Secretary Of The Army, The | Oral-intestinal vaccines against diseases caused by enteropathogenic organisms using antigens encapsulated within biodegradable-biocompatible microspheres |
| US5429822A (en) * | 1992-03-13 | 1995-07-04 | Cambridge Scientific, Inc. | Biodegradable bursting release system |
| FR2703927B1 (fr) * | 1993-04-13 | 1995-07-13 | Coletica | Utilisation d'une réaction de transacylation entre un polysaccharide estérifié et une polyamine pour former en milieu aqueux une membrane au moins en surface de particules gélifiées. |
| DK0724432T3 (da) * | 1993-10-22 | 2003-01-27 | Genentech Inc | Fremgangsmåder og præparater til mikroindkapsling af antigener til brug som vacciner |
| WO1995011008A2 (en) * | 1993-10-22 | 1995-04-27 | Genentech, Inc. | Methods and compositions for microencapsulation of adjuvants |
-
1994
- 1994-10-13 DE DE69415684T patent/DE69415684T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1994-10-13 AT AT94931369T patent/ATE175110T1/de active
- 1994-10-13 JP JP51207695A patent/JP3841309B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1994-10-13 AU AU80174/94A patent/AU8017494A/en not_active Abandoned
- 1994-10-13 WO PCT/US1994/011678 patent/WO1995011009A1/en active IP Right Grant
- 1994-10-13 CA CA002172508A patent/CA2172508C/en not_active Expired - Lifetime
- 1994-10-13 DK DK94931369T patent/DK0724433T3/da active
- 1994-10-13 EP EP94931369A patent/EP0724433B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1994-10-21 UY UY23846A patent/UY23846A1/es not_active IP Right Cessation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CA2172508C (en) | 2005-08-23 |
| JPH09504026A (ja) | 1997-04-22 |
| DE69415684D1 (de) | 1999-02-11 |
| UY23846A1 (es) | 1995-03-28 |
| WO1995011009A1 (en) | 1995-04-27 |
| DK0724433T3 (da) | 1999-08-30 |
| EP0724433B1 (en) | 1998-12-30 |
| ATE175110T1 (de) | 1999-01-15 |
| EP0724433A1 (en) | 1996-08-07 |
| DE69415684T2 (de) | 1999-06-10 |
| AU8017494A (en) | 1995-05-08 |
| CA2172508A1 (en) | 1995-04-27 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP3841309B2 (ja) | 流動床乾燥工程を含んでなるミクロスフェアの製造方法 | |
| US6080429A (en) | Method for drying microspheres | |
| Yeo et al. | Control of encapsulation efficiency and initial burst in polymeric microparticle systems | |
| JP3698721B2 (ja) | 有機溶媒を用いて処理したポリペプチドの賦形剤安定化 | |
| EP1343480B2 (en) | Induced phase transition method for the production of microparticles containing hydrophobic active agents | |
| NL195056C (nl) | Werkwijze voor het bereiden van preparaten die zouten van peptiden met op carboxy eindigende polyesters bevatten. | |
| AU2011200966B2 (en) | Pharmaceutical composition comprising octreotide microparticles | |
| EP0737472A1 (en) | Single-shot vaccine formulation | |
| IL163218A (en) | Polymer-based preparations for prolonged release of the hormone FSH | |
| KR19990071595A (ko) | 형태학적으로 균일한 마이크로 캡슐의 제조 방법 및 이 방법에의해 제조된 마이크로 캡슐 | |
| SK14112000A3 (sk) | Začlenenie účinných látok do matríc nosiča | |
| WO2017186077A1 (zh) | 一种缓释微粒的制备方法 | |
| CA2435415A1 (en) | Microparticles of biodegradable polymer encapsulating a biologically active substance | |
| US6616949B2 (en) | Process for producing microparticles | |
| US20040052855A1 (en) | Microparticles of biodegradable polymer encapsulating a biologically active substance and sustained release pharmaceutical formulations containing same | |
| ZA200502748B (en) | Pharmaceutical composition comprising octreotide microparticles. | |
| CA2429103A1 (en) | Process for producing microparticles | |
| AU2002224721A1 (en) | Microparticles of biodegradable polymer encapsulating a biologically active substance |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20040525 |
|
| A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20040824 |
|
| A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20041004 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20041124 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20051122 |
|
| A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20060221 |
|
| A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20060424 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20060522 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20060725 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20060804 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| R154 | Certificate of patent or utility model (reissue) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R154 |
|
| R154 | Certificate of patent or utility model (reissue) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R154 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20090818 Year of fee payment: 3 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20100818 Year of fee payment: 4 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20110818 Year of fee payment: 5 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20110818 Year of fee payment: 5 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20120818 Year of fee payment: 6 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20130818 Year of fee payment: 7 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| EXPY | Cancellation because of completion of term |