JP3839842B2 - 四倍体貝類 - Google Patents
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Description
技術分野
本発明は、カキを含む貝類の生育可能な四倍体の製造に関する。前記四倍体は、染色体組操作技術(chromosome set manipulation techniques)を用いて製造される。
発明の背景
ほとんどの有性生殖動物は、２組の染色体を持ち、従って二倍体と呼ばれている。減数分裂は、染色体数を１／２にし、各世代が倍数化(doubling)しても染色体数を一定に保つ過程である。これは、２段階過程であり、それによって１個の二倍体細胞が４個の一倍体細胞を生じ、この一倍体細胞は各々１組の染色体を有している。これらの一倍体細胞の１つまたは４つ全部が、機能卵または精細胞に成熟され、これは配偶子としても知られている。
動物における四倍体（即ち、４組の染色体を有しているもの）は、一般に、三倍体の生成、ハイブリダイゼーション、及び他の交配プログラムを含む種々の目的にとって重要である。しかしながら、カキを含む軟体動物の生育可能な四倍体を製造する従来の研究は満足のゆくものではなかった。二倍体卵に含まれる四倍体が生育できない理由の一部は、大きな四倍体核による正常な二倍体卵細胞の開裂から生ずる細胞数欠失である可能性があると推測されている。軟体類において、通常の孵化過程を通して生育可能であり、完全成長した軟体類に成熟する四倍体接合子を製造して、軟体類四倍体の供給を確実にしたり、例えば三倍体軟体類の商業規模の製造に用いられるような方法を開発することが強く望まれている。
本発明を、太平洋カキ、クラソストレア・ギガス・ツンベルグ(Crassostrea gigas Thunberg)を用いて以下に説明する。
太平洋カキの場合、有糸分裂Ｉのブロック（Guo、1991）、極体Ｉのブロック（Guo等、1992a、b）、割球融合（Guo、1991）及び雌性発性（Guo等、1993）を含むいくつかの方法によって四倍体胚が製造されているが、これらは全て二倍体からの卵におけるものであり、製造された胚は変態を経て生存することができなかった。上記したように、誘導された四倍体が生育できないのは、大きな四倍体核による正常卵の開裂によって生ずる細胞数欠失によるものであるとされている。一方、三倍体カキからの卵は、通常の二倍体カキからのものよりかなり大きい（Stephens及びDowning、1989）。
三倍体太平洋カキは現在でも入手可能である（Allen、1988）。そのような三倍体太平洋カキは、好ましい味を持つ通常の二倍体カキよりも商業的に有利な点を有している。特に、生殖期間が通常と同じで成長速度が向上していることである（Allen、1988）。現在、このような商業的三倍体太平洋カキは、通常の二倍体カキから、ある種の染色体組操作技術を用いて製造され、この技術によって、卵母細胞の減数分裂が、第２極体を保持するように操作されるが、それ自身は第２の減数分裂の間にそれを放出する（Allen、1988）。よって、このような三倍体カキは、「誘導(induced)三倍体」と呼ばれることもある。これに対して、本発明によって直接的に得られる利点は、「かけ合わせ(mated)三倍体」が、成熟した四倍体と通常の二倍体とを単にかけ合わせることによって製造できることである。
発明の要旨
本発明によると、三倍体軟体類の卵における第１の極体が、生育可能な四倍体軟体類（貝類）を生成するように操作される。典型的には、卵は三倍体雌の解体によって得られ、その後、濾過した海水で洗浄される。卵を、通常の二倍体雄から得た精子で受精させる。卵の受精後の適当な時間（例えば、受精５分後）において、卵からの極体Ｉの放出をブロックする過程が、適当な長さの時間行なわれる。引き続き、卵は通常の孵化条件でインキュベートされる。本発明の好ましい実施態様では、前記極体Ｉ（ＰＢＩ）をブロックする過程は、受精した卵を、濾過海水に適当な濃度で溶解させたサイトカラシンＢまたは他のブロック剤で処理することによって行われるが、この過程は、受精した卵に熱的または流体静力学的ショックを与えることによって行ってもよい。本発明によって、成長して成熟することのできる生育可能な四倍体貝類が製造される。
発明の詳細な説明
本発明は、軟体類一般に適用できる。しかし、発明の詳細な説明は、二枚貝の太平洋カキ、クラソストレア・ギガス・ツンベルグ(Crassostrea gigas Thunberg)を用いて例示する。二枚貝とは、弾性を持つ靱帯で蝶着された２つの部材または貝殻(valve)からなる殻を有する任意の軟体類である。
本発明を理解するために、数種の技術用語の定義を、この明細書の最後に与える。しかし、この定義は、当業者によって一般に認められている定義を限定するものでもそれを越えるものでもない。
太平洋カキは、日本、韓国、及び中国の海域に自然に分布するベントイック(benthic)な海洋二枚貝である。太平洋カキは、微小藻類や小さな有機砕片を主に食するフィルター・フィーダー(filter feeder)である。これは雌雄異体であり、それらの間に受精が起こる。第二次性徴は観察されず、性別は生殖組織の検査によってのみ同定される。卵塊季節の間、この太平洋カキは、その体重の半分以上を配偶子の生成に捧げることもある（Perdue、1983）。平均的な商業サイズの雌太平洋カキは、５千万から１憶の卵を産生する（Quayle、1988）。新たに放出された太平洋カキの卵は、西洋ナシ型をしているが、受精すると球状になり、その直径は約５０μｍである。受精卵は、迅速な変化を経て、２５℃において受精後６−７時間で泳動性トロコフォア(trochophores)として孵化する。受精後約２４時間では、このトロコフォアは、２つの殻を形成し、「Ｄ」型の幼生が出現する。自由泳動性の幼生段階は約３−５週間続き、その間に潮流によって広範に広がることができる。自由泳働段階の終わりに、約０．３ｍｍの大きさに達すると、幼生変態して硬い表皮に結合する。温度及び入手できる餌に応じて、１−２年齢で性的成熟に到達する。
太平洋カキは、クラソストレア(Crassostea)属の全ての種と同様に、２０染色体数の二倍体を有する。太平洋カキの成熟卵は、第１の減数分裂前記において阻止される（Lu、1986）。顕微鏡観察によって、新たに受精した卵の中に１０本のシナプス化した四分染色体が見られた。受精または活性化の後、１０本の四分染色体は、通常２つの減数分裂を経て２つの極体、即ち、２０の二分染色体を含む極体Ｉと、１０染色分体を含む極体ＩＩを放出する。卵母細胞に残った１０染色分体は、精細胞からの１０染色分体と合体して、二倍体接合子を形成する。通常のカキに観察される上述した減数分裂及び受精の通常の過程を図１に示した。
図１を参照すると、そこには（ａ）から（ｈ）の素過程が含まれるが、それらは、（ａ）減数分裂以前に、２組の染色体が倍数化して２組の複製染色体を形成する；複製染色体は動原体内に一緒に保持される、（ｂ）受精が卵を活性化して減数分裂を再開する、（ｃ）第１の減数分裂によって第１の極体内の複製された染色体の組の全部が脱離される、（ｄ）第２の減数分裂で動原体に一緒に保持された残りの染色体が分割される、（ｅ）第２の極体内で１組が脱離される、（ｆ）卵からの残りの四倍体組と精細胞のそれとが配偶子接合と呼ばれる過程で合体して細胞の二倍体性が回復される、（ｇ）染色体の二倍体組を複製し、（ｈ）分裂して二倍体胚を形成する。
本発明によると、四倍体カキは三倍体雌と二倍体雄とから、染色体組操作を用いて製造される。最後に、三倍体雌を、高温及び豊富な食料の環境におくことよって調節する。調節は、冬眠に続いて、配偶子形成の早い段階で始めるのが好ましい。前に述べたように、三倍体カキは今日商業規模で入手できる。それらは典型的には二倍体カキから、減数分裂の間の受精卵からの極体ＩＩの放出をブロックすることによって製造されている。（本発明によって、三倍体カキの製造の新たなルートが開かれ、この新たなルートは従来のものよりかなりの利点がある。しかし、従来技術を出発点としてそれに基づいて本発明を達成することを目的として、従来技術の雌の三倍体カキを出発材料として用いる。後に明らかになるが、新規なタイプの三倍体カキが、本発明の四倍体カキ（雌）と通常の二倍体雄カキとをかけ合わせることによって得られる。このような新たなタイプの三倍体カキは、通常のかけ合わせによって製造され、受精過程においても人工的な操作を含まないが、極体ＩＩのブロックを含む人工授精によって製造される従来技術の三倍体カキよりもかなりの利点を有している。さらなる議論は以下を参照。）三倍体動物は、その倍数性を確認するために、産卵に先だってフローサイトメトリーで検査した（Guo、1991）。
次の段階において、三倍体雌から解剖によって卵を回収した（卵塊剥離）。卵は、濾過した海水で洗浄し、２５μｍのスクリーンといった適当なスクリーン上に保持した。
次いで、卵を通常の雄から得た精細胞で受精した。受精に用いる精細胞の量は、典型的には、卵細胞１個に対して精細胞約１０個である。
受精卵からの極体Ｉの放出の抑制は、受精後適当な時点で開始しなければならない。極体Ｉ（ＰＢ１）の抑制は、熱的または流体静力学的ショックを与えたり、サイトカラシンＢや６−ジメチルアミノプリンといった化学試薬を用いて行うことができる。本発明では、サイトカラシンＢ（ＣＢ）を用いて前記ＰＢ１抑制を行うのが好ましい。受精卵の化学処理を行う時間は、最適な結果が得られるように調製しなければならない。典型的には、ＣＢ処理の時間は、未処理の三倍体卵の半分が、化学試薬の無い同条件下で極体Ｉを放出するのに要する時間の統計的平均時間とする。ほとんどの場合、前記統計的平均時間は顕微鏡試験によって決定でき、２５℃では太平洋カキについて約２５分である。よって、ＣＢ処理は、典型的には２５℃で１５−２０分間とする。ＣＢ処理を開始する時間も、最適な結果が得られるように調製する必要がある。典型的にはＣＢ処理の開始時間は受精後約５分である。
ＰＢ１ブロック過程が行われた後、卵はその過程の影響から取り出し、通常の貝類孵化工業の標準的な工程に移す。
以下に、実施例を用いて本発明を例示する。
実施例
この実験で用いた三倍体太平洋カキは、２年齢であり、ＰＢ２放出をブロックすることによって製造した。三倍体動物は、産卵に先立って個々にフローサイトメトリーで確認した。配偶子は卵塊剥離によって得た。卵は、８５μｍのスクリーンを通して大きな組織砕片を取り除き、２５μｍスクリーン上で洗浄した。全ての受精及び処理は、２５−２８℃において、濾過（２μｍ）した海水を用いて行った。この実験で用いた海水の塩分は、約２０−２２ｐｐｔであった。
三倍体からの卵は二倍体からの一倍体精細胞で受精した。受精後、卵を２つのグループ（ＴＤ及びＴＤＣＢグループ）に分けた。ＴＤグループにおいては、受精卵をいかなる化学試薬でも処理せず、対照グループとして培養した。ＴＤＣＢグループでは、受精卵をサイトカラシンＢ（ＣＢ）で処理して、ＰＢ１の放出をブロックした。ＣＢは、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中で調製し、最終濃度０．５ｍｇ／（リットル、０．５％ＤＭＳＯ）で受精卵に添加した。ＣＢ処理は、受精後（ＰＦ）５分に開始して１５分間継続した。ＣＢ処理の後、卵をＤＭＳＯ−海水（１％）で洗浄し、６５卵／ｍｌの密度で培養した。３対のカキを親として３つの複製を作成した。三倍体雌の生産性の低さ、及びそれに先立つ実験グループの生存の低さから、全ての入手可能な卵を使用し、３つの複製の卵の数は規格化しなかった。また、四倍体の生存を確実にするために、さらなる卵をＴＤＣＢグループに割り当てたが、培養密度はほぼ同じに維持した。
ＴＤ及びＴＤＣＢグループの分裂割合を、ＰＦ９０−１２０分に決定した。両方のグループにつき、Ｄ−段階（１日）、７日及び産卵（３５日）まで、分裂した胚の生存を記録した。また、これらのサンプリング日には、生存している幼生の倍数性組成をフローサイトメトリーで決定した。
ＰＦ３ヶ月で、生存しているカキをサンプリングして体重と染色体数を測定した。染色体分析では、カキをまずコルヒチン（０．００５％）の１２時間に渡る集中的供与で処理した。カキの内蔵部分を殻から分離して重さを測定した。次いで全体を刻んで、酢酸／メタノール（１：３）中に固定した。適当な量の固定サンプルをスライド上に取り、空気乾燥させた。スライドをライシュマン（Leishman）の染色法で染色した。各カキについて、明らかな染色体欠損のサインを示さない１０の中期の最小値を数えた。染色体数を確実に同定した個体のみを分析に取り入れた。２０、３０、及び４０の染色体を持つカキを、各々二倍体、三倍体、及び四倍体に分類した。
平均すると、三倍体からの卵は、二倍体からの卵より直径で１５％大きく、これは、容量で５４％の増加に相当する。三倍体から得た卵の数は、３つの複製間で変化していた。即ち、３つの三倍体雌は、各々８２０万、４０万、及び７０万の卵を産生した。ＣＢ処理は、初期の有糸分裂にはあまり影響を与えず、分裂割合は、ＴＤ及びＴＤＣＢグループでほぼ同じであった。表１参照。
分裂した卵のＤ−段階（２４時間）間での生存比率は、３つの複製間で異なっていた（表１）。複製１では、ＴＤＣＢグループの生存割合はＴＤグループより低かった。複製２では、両グループはほぼ同じであった。しかし複製３では、ＴＤＣＢグループの生存割合はＴＤグループより高かった。後の段階を比較すると、ＴＤＣＢグループの方が、対応するＴＤグループよりも圧倒的に生存比率が高いことがわかった。複製２及び３において、７日目では、ＴＤＣＢグループはＴＤグループより生存割合が高かったが、いずれの複製においても、ＴＤ及びＴＤＣＢグループにおいて３５日に生存しているものは無かった。複製１では、７日目に、ＴＤＣＢグループはＴＤグループより低い生存率を示した。しかし、変態及び定着の後、ＴＤＣＢ１グループ（即ち、複製１からのＴＤＣＢグループ）は、ＴＤ１グループ（即ち、複製１からのＴＤグループ）よりも、かなり多く産卵をした。０．０７３８％の分割した卵を示すＴＤＣＢ１から合計２，５００の産卵を収集したが、０．０００３％の分割した卵を示すＴＤ１からは、わずか２産卵しか得られなかった。
ＰＦ２４時間後、ＴＤグループの分裂した胚は、フローサイトメトリーで分析したところ、主に２．５ｎ異数体細胞（ｎは一倍体数、即ち、この倍は１０）からなっていた。ＴＤＣＢグループでは、２つの異数体細胞集団が見られた。一方の集団は三倍体から四倍体であり、他方の集団は四倍体から５倍体であった。ＰＦ２４時間では、正倍数性ピークは現れなかった。７日目に、ＴＤグループで生存している幼生から誘導された細胞は、未だに異数体が主であったが、２．５ｎにおけるピークは全く現れなかった。ＴＤグループの異数体ピークは二倍体の方に傾いた。一方、ＴＤＣＢグループでは、７日目に生存している幼生は、四倍体または四倍体に近い異数体であった。三倍体または三倍体に近い異数体に小さなピークが見られた。
１３日後には、複製２及び３のＴＤ及びＴＤＣＢグループにおいて幼生は残っていなかった。ＴＤ１における生き残りが極めて少ないため、フローサイトメトリー用のサンプリングができなかった。ＴＤＣＢ１からの注目幼生のサンプルは１３日目に収集され、約１００個の凝集体をフローサイトメトリー用の単一細胞懸濁液とした。２ｎ、３ｎ、及び４ｎに分類される細胞の比率は、各々４％、１６％、及び８０％と見積もられた。２２日目に、ＴＤＣＢ１からの１２の変態した幼生を分析したところ、８の四倍体（６７％）、２の三倍体（１７％）、及び２のモザイク（１７％）が観察された。ＴＤ１グループにおいて、生存している２つの卵を殺傷したところ、一方が二倍体で他方が三倍体であった。フローサイトメトリーによってＤＮＡ含有量のわずかな差を検出するのは困難であるので、ここで挙げた（ＴＤ１からの）正倍数性は、僅かに染色体の多い又は少ない異数体を含んでいると考えられる。
実質的に定着後に死亡することはなかった。ＰＦ３ヶ月で、ＴＤＣＢ１からのカキは１−４ｃｍの長さになった。体重測定及び染色体計数のために、ＴＤＣＢ１から３１のカキをサンプリングした。３０のカキから曖昧さのない染色体数が得られたが、残りのカキは十分に評価できる中期を示さなかったので、分析から除いた。３０のカキのうち、１つは２０染色体を持ち、１つは３０染色体を持っており、それらは各々二倍体（３．３％）及び三倍体（３．３％）に分類した。２０のカキは、正確に４０染色体を持ち、四倍体に分類した（６６．７％）。７のカキは、異数体（２３．３％）であり、２１、３１、３２、３３、３８（２）、３９及び４０の染色体を持っていた。１のカキは、細胞の７３％が３２染色体を持ち、２７％が４０染色体を持つモザイクであった。
四倍体カキは、平均２８４ｍｇの体重（内臓）を持ち、各体重は１５ｍｇから６１０ｍｇの範囲であった（表２参照）。平均して、異数体カキは、四倍体より有意に小さかった（ｐ＜０．０５）。しかし、３８の染色体を持ち４７９の体重のカキが１つあり、このグループ内では４番目に大きく、（殻を含めた）全重量が最も大きなカキであった。二倍体及び三倍体カキは、四倍体は比較して小さかった。
実施例２
青カラス貝(blue musels)ミチタス・エドゥリス(Mytitus edulis)の四倍体を、本質的に実施例１の手法に従って、対応する三倍体からの卵と二倍体からの一倍体精細胞を用いて製造した。
実施例３
真珠カキ(pearl oysters)プリンクタダ・マガラチフェラ(Princtada magaratifera)の四倍体を、本質的に実施例１の手法に従って、対応する三倍体からの卵と二倍体からの一倍体精細胞を用いて製造した。
実施例４
クモモト・カキ(Kumomoto oyster)クラソストレア・シカマイ(Crassostrea sikamai)の四倍体を、本質的に実施例１の手法に従って、三倍体からの卵と二倍体からの一倍体精細胞を用いて製造した。
実施例５
スミノエ・カキ(Suminoe oyster)クラソストレア・リブラリス(Crassostea rivularis)の四倍体を、本質的に実施例１の手法に従って、対応する三倍体からの卵と二倍体からの一倍体精細胞を用いて製造した。
実施例６
アメリカン・カキ(Amerikan oyster)クラソストレア・バージニカ(Crassostrea virginica)の四倍体を、本質的に実施例１の手法に従って、三倍体からの卵と二倍体からの一倍体精細胞を用いて製造した。
実施例７
湾ホタテ貝(bay scallop)アルゴペクチン・イラディアンス(Argopectin irradians)の四倍体を、本質的に実施例１の手法に従って、対応する三倍体からの卵と二倍体からの一倍体精細胞を用いて製造した。
実施例８
チャルミス(Chlamys)属、特に中国ホタテ貝(Chinese scallop)チャルミス・ファラリ(Chlamys farrari)の四倍体を、本質的に実施例１の手法に従って、対応する三倍体からの卵と二倍体からの一倍体精細胞を用いて製造した。
実施例９
マニラハマグリ(Manila clam)タペス・フィリピナルム(Tapes philippinarum)の四倍体を、本質的に実施例１の手法に従って、対応する三倍体からの卵と二倍体からの一倍体精細胞を用いて製造した。
実施例１０
パチノペクチン(Patinopecten)属、特に日本ホタテ貝(Japanese scallop)パチノペクチン・イェソエンシス(Patinopecten yessoensis)の四倍体を、本質的に実施例１の手法に従って、対応する三倍体からの卵と二倍体からの一倍体精細胞を用いて製造した。
実施例１１
腹足類軟体動物、特にアワビ、ハリオタス(Haliotus)属の四倍体を、本質的に実施例１の手法に従って、対応する三倍体からの卵と二倍体からの一倍体精細胞を用いて製造した。
実施例１２
実施例のデータは、本発明の四倍体が、三倍体製造に極めて有効であることを示している。通常の二倍体のように、四倍体は１年齢で成熟する。成熟に際して、四倍体太平洋カキ、クラソストレア・ギガス・ツンベルグ(Crassostrea gigas Thunberg)をサンプリングした。これらは、適当な比率で雄と雌を含んでいる。三倍体では生産性がかなり低下するのに対して、四倍体は二倍体と同等の生産性を示す。四倍体と二倍体の交差かけ合わせを行った。四倍体×二倍体（及びレクリプロカル(recriprocal)）かけ合わせからの卵を、フローサイトメトリー分析によって三倍体である限り全て検査した。
二倍体（Ｄ）と四倍体（Ｔ）との全部で４通りの可能な組合せ：ＤＤ、ＤＴ、ＴＤ、ＴＴ（先に書いた型が雌である）を行った。二倍体雌は、８９０万の卵を有し、四倍体雌は６４０万の卵を有する。全てのグループで受精レベルは良好で、９２．３から９７．８％であった（表１）。通常の二倍体対照実験（ＤＤ）と比較して、ＤＴ及びＴＤ交差における卵段階まで生存する受精卵の数は良好であった。ＴＴかけ合わせでは、生存が極めて少なかった。
受精後５０日に、ＤＤ、ＤＴ及びＴＤかけ合わせ殻のカキ（各グループ３０個のカキ）を、フローサイトメトリーによる倍数性決定のためにサンプリングした。ＤＤからのカキは、３０個全てが二倍体であった。ＤＴ及びＴＤ掛け合わせの善６０個のカキは三倍体であった。ＴＴかけ合わせからの３個のカキを分析したところ、四倍体であった。
上記の操作を、本発明のクラソストレア・バージニカ(Crassostrea virginica)カキ四倍体と、クラソストレア・バージニカ(Crassostrea virginica)カキ二倍体とを用いて繰り返した。ＤＴ及びＴＤかけ合わせのクラソストレア・バージニカ(Crassostrea virginica)カキ三倍体を、良好な収率で得た。
上述した本発明の方法で起こっていると思われる種々の生物学的事象は、三倍体雌と二倍体雄とから、ＰＢ１ブロックによる四倍体生成を導くが、これを図２に示した。これらの事象は、図１に示した通常の条件とは異なっている。
上記に説明した三倍体から得た卵で四倍体を製造することは、細胞数欠損仮説(cell-number deficiency hypothesis)を裏付けるものである。三倍体からの卵は、二倍体からの卵より容量で５４％大きく、この増加した容量が細胞数の増加を導くと考えられる。
本発明に従って、ひとたび成熟した四倍体カキが製造されれば、それらは通常の二倍体カキとかけ合わせて三倍体を生成することができる４ｎ×２ｎ＞３ｎ。簡単に言えば、三倍体は通常の二倍体より再現性の低い競合体であるので、商業的生産者にとって大きな市場に転換するためのある種の生理学的利点を有する（Allen、1988）。三倍体カキは、米国の西海岸で広く培養され、東海岸でも増加している。三倍体は、欧州（例えば仏国、アイルランド）、及びアジア（例えば日本、中国、韓国）でも培養される。
三倍体の今日の商業的生産における重要な特徴は、抗生物質であるサイトカラシンＢ（ＣＢ）を用いて生産されることである。ＣＢは、多くのヒト及び動物実験において奇形発生原及び突然変異原であることが見出されている。それはカキの卵に用いられるので、ＣＢは市販される大きさのカキには存在せず、組織に残る危険は無い。しかし、この薬剤の本来の毒性により、衛生局及びヒューマン・サービスの獣医医学センサーは、ＣＢを「優先規制外(not low regulatory priority)」に位置づけている。おそらく、他の国においても、ＣＢ及び他の化学種に対して同様の心配がなされている。四倍体から三倍体カキを製造する新たなルートであり、本発明で推奨されているルートは、全世界でこの心配を未然に防ぐ。
「（薬剤及び他の方法による）誘導」に対する「かけ合わせ」による三倍体の生成には少なくとも３つの他の利点がある。（ｉ）四倍体と二倍体とのかけ合わせによって製造された三倍体は、薬剤処理によって製造された三倍体より強壮である。これは、四倍体卵が二倍体卵より極めて大きいことによる（三倍体卵は、二倍体卵の約１．５倍の容積である。四倍体は、二倍体の２倍の大きさである）。増加した卵の大きさは、幼生サイクルの早期に貯蓄されるより活性な発達した胚を与えるので有利である。本発明の実施において、四倍体貝類が配偶子を生成すること、及び四倍体の卵が大きいことが明らかになった。（ｉｉ）４ｎ×２ｎかけ合わせで製造された三倍体は、第２の極体の阻害による近交低下(inbreeding depression)が無い。（ｉｉｉ）理論的には、４ｎ×２ｎかけ合わせの倍数性は、１００％三倍体になり、このような高い成功率は誘導した三倍体では得られなかった。純粋な三倍体の集合は、不確定な数の二倍体及びモザイクの混ざった集合に対して極めて重大な利点を有する。非天然種または変形生物のように、三倍体集団は機能的に繁殖不能である（３ｎ×３ｎかけ合わせは生育不能）ので、エコシステムにおける再生性を未然に防ぐために使用できる。
四倍体の利点及び応用は、上記以外にも多数存在する。即ち、四倍体は通常はハイブリダイズすることのできない２つの種の間の橋渡しとして使用できる。四倍体は、さらなる四倍体の生成に有効である、４ｎ×４ｎ＞４ｎ。四倍体は、雌性発生として知られる方法を通して、独特な二倍体の生成に使用することができる。本発明の他の利点及び応用は、本明細書を注意深く読めば当業者には理解されるであろう。
本発明の前述の説明は、本発明の好ましい実施態様を主に強調したが、本発明の範囲は好ましい実施態様に何ら限定されるものではなく、後述の請求の範囲にのみ制限される。
前に述べたように、本発明の理解のために、いくつかの技術用語の簡単な説明を以下に与える。
異数体(aneuploid)：通常の二倍体に比較して、（全染色体組ではなく）１またはそれ以上の個々の染色体が欠失されたか、または増加した形態。
動原体(centromere)：紡錘体が結合する部位を含む染色体の構成領域。
染色分体(chromatids)：複製によって生成された染色体のコピー。
二倍体(diploid)：一倍体数の基本数（ｎ）の２倍の染色体組を持つ形態。
正倍数性(euploid)：染色体基本組に必要な数を持つ形態。
一倍体(haploid)：染色体の基本組を持つ形態。
減数分裂(Meiosis)：性細胞の成熟で生ずる細胞分割の特別な過程であり、各娘核が染色体の半数を受け取る。即ち受精とは反対である。通常の状況における受精による染色体数の倍増を補償する。
有糸分裂(Mitosis)：細胞核の分裂であって、紡錘体及び染色体が含まれる。この過程により、互いに同じで元の核とも同じ２つの娘核となる。
四倍体：一倍体の４倍の染色体を有する形態。
三倍体：一倍体の３倍の染色体を有する形態。
参考文献
Allen, Jr., S.K., (1988); Oceanus, 31, 58-63.
Allen, Jr., S.K., (1991); J. Shellfish Research, 10, 19-22.
Guo, X., (1991); Ph.D. Dissertation, University of Washington, Seattle, Washinton.
Guo, X., Cooper, K., Hershberger, W.K. and Chew, K.K., (1992a); Biol. Bull., 183, 381-386.
Gou, X., Hershberger, W.K., Cooper, K. and Chew, K.K., (1992b); Biol. Bull., 183, 387-393.
Gou, X., Hershberger, W.K., Cooper, K. and Chew, K.K., (1993); Aquaculture, 113, 201-214.
Lu, J.-K., (1986); M.S. Thesis, Universityu of Washington, Seattle, Washington.
Perdue, J.A., (1983); Ph.D. Dissertation, University of Washington, Seattle, Washington.
Quayle, D.B., (1988); Can. Bull. Fish. Aquat. Sci., 218, 1-214.
Stephens, L.B. and Downing, S.L.,)1989); J. Shellfish Research 8(1). 324.
本発明は、カキを含む貝類の生育可能な四倍体の製造に関する。前記四倍体は、染色体組操作技術(chromosome set manipulation techniques)を用いて製造される。
発明の背景
ほとんどの有性生殖動物は、２組の染色体を持ち、従って二倍体と呼ばれている。減数分裂は、染色体数を１／２にし、各世代が倍数化(doubling)しても染色体数を一定に保つ過程である。これは、２段階過程であり、それによって１個の二倍体細胞が４個の一倍体細胞を生じ、この一倍体細胞は各々１組の染色体を有している。これらの一倍体細胞の１つまたは４つ全部が、機能卵または精細胞に成熟され、これは配偶子としても知られている。
動物における四倍体（即ち、４組の染色体を有しているもの）は、一般に、三倍体の生成、ハイブリダイゼーション、及び他の交配プログラムを含む種々の目的にとって重要である。しかしながら、カキを含む軟体動物の生育可能な四倍体を製造する従来の研究は満足のゆくものではなかった。二倍体卵に含まれる四倍体が生育できない理由の一部は、大きな四倍体核による正常な二倍体卵細胞の開裂から生ずる細胞数欠失である可能性があると推測されている。軟体類において、通常の孵化過程を通して生育可能であり、完全成長した軟体類に成熟する四倍体接合子を製造して、軟体類四倍体の供給を確実にしたり、例えば三倍体軟体類の商業規模の製造に用いられるような方法を開発することが強く望まれている。
本発明を、太平洋カキ、クラソストレア・ギガス・ツンベルグ(Crassostrea gigas Thunberg)を用いて以下に説明する。
太平洋カキの場合、有糸分裂Ｉのブロック（Guo、1991）、極体Ｉのブロック（Guo等、1992a、b）、割球融合（Guo、1991）及び雌性発性（Guo等、1993）を含むいくつかの方法によって四倍体胚が製造されているが、これらは全て二倍体からの卵におけるものであり、製造された胚は変態を経て生存することができなかった。上記したように、誘導された四倍体が生育できないのは、大きな四倍体核による正常卵の開裂によって生ずる細胞数欠失によるものであるとされている。一方、三倍体カキからの卵は、通常の二倍体カキからのものよりかなり大きい（Stephens及びDowning、1989）。
三倍体太平洋カキは現在でも入手可能である（Allen、1988）。そのような三倍体太平洋カキは、好ましい味を持つ通常の二倍体カキよりも商業的に有利な点を有している。特に、生殖期間が通常と同じで成長速度が向上していることである（Allen、1988）。現在、このような商業的三倍体太平洋カキは、通常の二倍体カキから、ある種の染色体組操作技術を用いて製造され、この技術によって、卵母細胞の減数分裂が、第２極体を保持するように操作されるが、それ自身は第２の減数分裂の間にそれを放出する（Allen、1988）。よって、このような三倍体カキは、「誘導(induced)三倍体」と呼ばれることもある。これに対して、本発明によって直接的に得られる利点は、「かけ合わせ(mated)三倍体」が、成熟した四倍体と通常の二倍体とを単にかけ合わせることによって製造できることである。
発明の要旨
本発明によると、三倍体軟体類の卵における第１の極体が、生育可能な四倍体軟体類（貝類）を生成するように操作される。典型的には、卵は三倍体雌の解体によって得られ、その後、濾過した海水で洗浄される。卵を、通常の二倍体雄から得た精子で受精させる。卵の受精後の適当な時間（例えば、受精５分後）において、卵からの極体Ｉの放出をブロックする過程が、適当な長さの時間行なわれる。引き続き、卵は通常の孵化条件でインキュベートされる。本発明の好ましい実施態様では、前記極体Ｉ（ＰＢＩ）をブロックする過程は、受精した卵を、濾過海水に適当な濃度で溶解させたサイトカラシンＢまたは他のブロック剤で処理することによって行われるが、この過程は、受精した卵に熱的または流体静力学的ショックを与えることによって行ってもよい。本発明によって、成長して成熟することのできる生育可能な四倍体貝類が製造される。
発明の詳細な説明
本発明は、軟体類一般に適用できる。しかし、発明の詳細な説明は、二枚貝の太平洋カキ、クラソストレア・ギガス・ツンベルグ(Crassostrea gigas Thunberg)を用いて例示する。二枚貝とは、弾性を持つ靱帯で蝶着された２つの部材または貝殻(valve)からなる殻を有する任意の軟体類である。
本発明を理解するために、数種の技術用語の定義を、この明細書の最後に与える。しかし、この定義は、当業者によって一般に認められている定義を限定するものでもそれを越えるものでもない。
太平洋カキは、日本、韓国、及び中国の海域に自然に分布するベントイック(benthic)な海洋二枚貝である。太平洋カキは、微小藻類や小さな有機砕片を主に食するフィルター・フィーダー(filter feeder)である。これは雌雄異体であり、それらの間に受精が起こる。第二次性徴は観察されず、性別は生殖組織の検査によってのみ同定される。卵塊季節の間、この太平洋カキは、その体重の半分以上を配偶子の生成に捧げることもある（Perdue、1983）。平均的な商業サイズの雌太平洋カキは、５千万から１憶の卵を産生する（Quayle、1988）。新たに放出された太平洋カキの卵は、西洋ナシ型をしているが、受精すると球状になり、その直径は約５０μｍである。受精卵は、迅速な変化を経て、２５℃において受精後６−７時間で泳動性トロコフォア(trochophores)として孵化する。受精後約２４時間では、このトロコフォアは、２つの殻を形成し、「Ｄ」型の幼生が出現する。自由泳動性の幼生段階は約３−５週間続き、その間に潮流によって広範に広がることができる。自由泳働段階の終わりに、約０．３ｍｍの大きさに達すると、幼生変態して硬い表皮に結合する。温度及び入手できる餌に応じて、１−２年齢で性的成熟に到達する。
太平洋カキは、クラソストレア(Crassostea)属の全ての種と同様に、２０染色体数の二倍体を有する。太平洋カキの成熟卵は、第１の減数分裂前記において阻止される（Lu、1986）。顕微鏡観察によって、新たに受精した卵の中に１０本のシナプス化した四分染色体が見られた。受精または活性化の後、１０本の四分染色体は、通常２つの減数分裂を経て２つの極体、即ち、２０の二分染色体を含む極体Ｉと、１０染色分体を含む極体ＩＩを放出する。卵母細胞に残った１０染色分体は、精細胞からの１０染色分体と合体して、二倍体接合子を形成する。通常のカキに観察される上述した減数分裂及び受精の通常の過程を図１に示した。
図１を参照すると、そこには（ａ）から（ｈ）の素過程が含まれるが、それらは、（ａ）減数分裂以前に、２組の染色体が倍数化して２組の複製染色体を形成する；複製染色体は動原体内に一緒に保持される、（ｂ）受精が卵を活性化して減数分裂を再開する、（ｃ）第１の減数分裂によって第１の極体内の複製された染色体の組の全部が脱離される、（ｄ）第２の減数分裂で動原体に一緒に保持された残りの染色体が分割される、（ｅ）第２の極体内で１組が脱離される、（ｆ）卵からの残りの四倍体組と精細胞のそれとが配偶子接合と呼ばれる過程で合体して細胞の二倍体性が回復される、（ｇ）染色体の二倍体組を複製し、（ｈ）分裂して二倍体胚を形成する。
本発明によると、四倍体カキは三倍体雌と二倍体雄とから、染色体組操作を用いて製造される。最後に、三倍体雌を、高温及び豊富な食料の環境におくことよって調節する。調節は、冬眠に続いて、配偶子形成の早い段階で始めるのが好ましい。前に述べたように、三倍体カキは今日商業規模で入手できる。それらは典型的には二倍体カキから、減数分裂の間の受精卵からの極体ＩＩの放出をブロックすることによって製造されている。（本発明によって、三倍体カキの製造の新たなルートが開かれ、この新たなルートは従来のものよりかなりの利点がある。しかし、従来技術を出発点としてそれに基づいて本発明を達成することを目的として、従来技術の雌の三倍体カキを出発材料として用いる。後に明らかになるが、新規なタイプの三倍体カキが、本発明の四倍体カキ（雌）と通常の二倍体雄カキとをかけ合わせることによって得られる。このような新たなタイプの三倍体カキは、通常のかけ合わせによって製造され、受精過程においても人工的な操作を含まないが、極体ＩＩのブロックを含む人工授精によって製造される従来技術の三倍体カキよりもかなりの利点を有している。さらなる議論は以下を参照。）三倍体動物は、その倍数性を確認するために、産卵に先だってフローサイトメトリーで検査した（Guo、1991）。
次の段階において、三倍体雌から解剖によって卵を回収した（卵塊剥離）。卵は、濾過した海水で洗浄し、２５μｍのスクリーンといった適当なスクリーン上に保持した。
次いで、卵を通常の雄から得た精細胞で受精した。受精に用いる精細胞の量は、典型的には、卵細胞１個に対して精細胞約１０個である。
受精卵からの極体Ｉの放出の抑制は、受精後適当な時点で開始しなければならない。極体Ｉ（ＰＢ１）の抑制は、熱的または流体静力学的ショックを与えたり、サイトカラシンＢや６−ジメチルアミノプリンといった化学試薬を用いて行うことができる。本発明では、サイトカラシンＢ（ＣＢ）を用いて前記ＰＢ１抑制を行うのが好ましい。受精卵の化学処理を行う時間は、最適な結果が得られるように調製しなければならない。典型的には、ＣＢ処理の時間は、未処理の三倍体卵の半分が、化学試薬の無い同条件下で極体Ｉを放出するのに要する時間の統計的平均時間とする。ほとんどの場合、前記統計的平均時間は顕微鏡試験によって決定でき、２５℃では太平洋カキについて約２５分である。よって、ＣＢ処理は、典型的には２５℃で１５−２０分間とする。ＣＢ処理を開始する時間も、最適な結果が得られるように調製する必要がある。典型的にはＣＢ処理の開始時間は受精後約５分である。
ＰＢ１ブロック過程が行われた後、卵はその過程の影響から取り出し、通常の貝類孵化工業の標準的な工程に移す。
以下に、実施例を用いて本発明を例示する。
実施例
この実験で用いた三倍体太平洋カキは、２年齢であり、ＰＢ２放出をブロックすることによって製造した。三倍体動物は、産卵に先立って個々にフローサイトメトリーで確認した。配偶子は卵塊剥離によって得た。卵は、８５μｍのスクリーンを通して大きな組織砕片を取り除き、２５μｍスクリーン上で洗浄した。全ての受精及び処理は、２５−２８℃において、濾過（２μｍ）した海水を用いて行った。この実験で用いた海水の塩分は、約２０−２２ｐｐｔであった。
三倍体からの卵は二倍体からの一倍体精細胞で受精した。受精後、卵を２つのグループ（ＴＤ及びＴＤＣＢグループ）に分けた。ＴＤグループにおいては、受精卵をいかなる化学試薬でも処理せず、対照グループとして培養した。ＴＤＣＢグループでは、受精卵をサイトカラシンＢ（ＣＢ）で処理して、ＰＢ１の放出をブロックした。ＣＢは、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中で調製し、最終濃度０．５ｍｇ／（リットル、０．５％ＤＭＳＯ）で受精卵に添加した。ＣＢ処理は、受精後（ＰＦ）５分に開始して１５分間継続した。ＣＢ処理の後、卵をＤＭＳＯ−海水（１％）で洗浄し、６５卵／ｍｌの密度で培養した。３対のカキを親として３つの複製を作成した。三倍体雌の生産性の低さ、及びそれに先立つ実験グループの生存の低さから、全ての入手可能な卵を使用し、３つの複製の卵の数は規格化しなかった。また、四倍体の生存を確実にするために、さらなる卵をＴＤＣＢグループに割り当てたが、培養密度はほぼ同じに維持した。
ＴＤ及びＴＤＣＢグループの分裂割合を、ＰＦ９０−１２０分に決定した。両方のグループにつき、Ｄ−段階（１日）、７日及び産卵（３５日）まで、分裂した胚の生存を記録した。また、これらのサンプリング日には、生存している幼生の倍数性組成をフローサイトメトリーで決定した。
ＰＦ３ヶ月で、生存しているカキをサンプリングして体重と染色体数を測定した。染色体分析では、カキをまずコルヒチン（０．００５％）の１２時間に渡る集中的供与で処理した。カキの内蔵部分を殻から分離して重さを測定した。次いで全体を刻んで、酢酸／メタノール（１：３）中に固定した。適当な量の固定サンプルをスライド上に取り、空気乾燥させた。スライドをライシュマン（Leishman）の染色法で染色した。各カキについて、明らかな染色体欠損のサインを示さない１０の中期の最小値を数えた。染色体数を確実に同定した個体のみを分析に取り入れた。２０、３０、及び４０の染色体を持つカキを、各々二倍体、三倍体、及び四倍体に分類した。
平均すると、三倍体からの卵は、二倍体からの卵より直径で１５％大きく、これは、容量で５４％の増加に相当する。三倍体から得た卵の数は、３つの複製間で変化していた。即ち、３つの三倍体雌は、各々８２０万、４０万、及び７０万の卵を産生した。ＣＢ処理は、初期の有糸分裂にはあまり影響を与えず、分裂割合は、ＴＤ及びＴＤＣＢグループでほぼ同じであった。表１参照。
分裂した卵のＤ−段階（２４時間）間での生存比率は、３つの複製間で異なっていた（表１）。複製１では、ＴＤＣＢグループの生存割合はＴＤグループより低かった。複製２では、両グループはほぼ同じであった。しかし複製３では、ＴＤＣＢグループの生存割合はＴＤグループより高かった。後の段階を比較すると、ＴＤＣＢグループの方が、対応するＴＤグループよりも圧倒的に生存比率が高いことがわかった。複製２及び３において、７日目では、ＴＤＣＢグループはＴＤグループより生存割合が高かったが、いずれの複製においても、ＴＤ及びＴＤＣＢグループにおいて３５日に生存しているものは無かった。複製１では、７日目に、ＴＤＣＢグループはＴＤグループより低い生存率を示した。しかし、変態及び定着の後、ＴＤＣＢ１グループ（即ち、複製１からのＴＤＣＢグループ）は、ＴＤ１グループ（即ち、複製１からのＴＤグループ）よりも、かなり多く産卵をした。０．０７３８％の分割した卵を示すＴＤＣＢ１から合計２，５００の産卵を収集したが、０．０００３％の分割した卵を示すＴＤ１からは、わずか２産卵しか得られなかった。
ＰＦ２４時間後、ＴＤグループの分裂した胚は、フローサイトメトリーで分析したところ、主に２．５ｎ異数体細胞（ｎは一倍体数、即ち、この倍は１０）からなっていた。ＴＤＣＢグループでは、２つの異数体細胞集団が見られた。一方の集団は三倍体から四倍体であり、他方の集団は四倍体から５倍体であった。ＰＦ２４時間では、正倍数性ピークは現れなかった。７日目に、ＴＤグループで生存している幼生から誘導された細胞は、未だに異数体が主であったが、２．５ｎにおけるピークは全く現れなかった。ＴＤグループの異数体ピークは二倍体の方に傾いた。一方、ＴＤＣＢグループでは、７日目に生存している幼生は、四倍体または四倍体に近い異数体であった。三倍体または三倍体に近い異数体に小さなピークが見られた。
１３日後には、複製２及び３のＴＤ及びＴＤＣＢグループにおいて幼生は残っていなかった。ＴＤ１における生き残りが極めて少ないため、フローサイトメトリー用のサンプリングができなかった。ＴＤＣＢ１からの注目幼生のサンプルは１３日目に収集され、約１００個の凝集体をフローサイトメトリー用の単一細胞懸濁液とした。２ｎ、３ｎ、及び４ｎに分類される細胞の比率は、各々４％、１６％、及び８０％と見積もられた。２２日目に、ＴＤＣＢ１からの１２の変態した幼生を分析したところ、８の四倍体（６７％）、２の三倍体（１７％）、及び２のモザイク（１７％）が観察された。ＴＤ１グループにおいて、生存している２つの卵を殺傷したところ、一方が二倍体で他方が三倍体であった。フローサイトメトリーによってＤＮＡ含有量のわずかな差を検出するのは困難であるので、ここで挙げた（ＴＤ１からの）正倍数性は、僅かに染色体の多い又は少ない異数体を含んでいると考えられる。
実質的に定着後に死亡することはなかった。ＰＦ３ヶ月で、ＴＤＣＢ１からのカキは１−４ｃｍの長さになった。体重測定及び染色体計数のために、ＴＤＣＢ１から３１のカキをサンプリングした。３０のカキから曖昧さのない染色体数が得られたが、残りのカキは十分に評価できる中期を示さなかったので、分析から除いた。３０のカキのうち、１つは２０染色体を持ち、１つは３０染色体を持っており、それらは各々二倍体（３．３％）及び三倍体（３．３％）に分類した。２０のカキは、正確に４０染色体を持ち、四倍体に分類した（６６．７％）。７のカキは、異数体（２３．３％）であり、２１、３１、３２、３３、３８（２）、３９及び４０の染色体を持っていた。１のカキは、細胞の７３％が３２染色体を持ち、２７％が４０染色体を持つモザイクであった。
四倍体カキは、平均２８４ｍｇの体重（内臓）を持ち、各体重は１５ｍｇから６１０ｍｇの範囲であった（表２参照）。平均して、異数体カキは、四倍体より有意に小さかった（ｐ＜０．０５）。しかし、３８の染色体を持ち４７９の体重のカキが１つあり、このグループ内では４番目に大きく、（殻を含めた）全重量が最も大きなカキであった。二倍体及び三倍体カキは、四倍体は比較して小さかった。
青カラス貝(blue musels)ミチタス・エドゥリス(Mytitus edulis)の四倍体を、本質的に実施例１の手法に従って、対応する三倍体からの卵と二倍体からの一倍体精細胞を用いて製造した。
実施例３
真珠カキ(pearl oysters)プリンクタダ・マガラチフェラ(Princtada magaratifera)の四倍体を、本質的に実施例１の手法に従って、対応する三倍体からの卵と二倍体からの一倍体精細胞を用いて製造した。
実施例４
クモモト・カキ(Kumomoto oyster)クラソストレア・シカマイ(Crassostrea sikamai)の四倍体を、本質的に実施例１の手法に従って、三倍体からの卵と二倍体からの一倍体精細胞を用いて製造した。
実施例５
スミノエ・カキ(Suminoe oyster)クラソストレア・リブラリス(Crassostea rivularis)の四倍体を、本質的に実施例１の手法に従って、対応する三倍体からの卵と二倍体からの一倍体精細胞を用いて製造した。
実施例６
アメリカン・カキ(Amerikan oyster)クラソストレア・バージニカ(Crassostrea virginica)の四倍体を、本質的に実施例１の手法に従って、三倍体からの卵と二倍体からの一倍体精細胞を用いて製造した。
実施例７
湾ホタテ貝(bay scallop)アルゴペクチン・イラディアンス(Argopectin irradians)の四倍体を、本質的に実施例１の手法に従って、対応する三倍体からの卵と二倍体からの一倍体精細胞を用いて製造した。
実施例８
チャルミス(Chlamys)属、特に中国ホタテ貝(Chinese scallop)チャルミス・ファラリ(Chlamys farrari)の四倍体を、本質的に実施例１の手法に従って、対応する三倍体からの卵と二倍体からの一倍体精細胞を用いて製造した。
実施例９
マニラハマグリ(Manila clam)タペス・フィリピナルム(Tapes philippinarum)の四倍体を、本質的に実施例１の手法に従って、対応する三倍体からの卵と二倍体からの一倍体精細胞を用いて製造した。
実施例１０
パチノペクチン(Patinopecten)属、特に日本ホタテ貝(Japanese scallop)パチノペクチン・イェソエンシス(Patinopecten yessoensis)の四倍体を、本質的に実施例１の手法に従って、対応する三倍体からの卵と二倍体からの一倍体精細胞を用いて製造した。
実施例１１
腹足類軟体動物、特にアワビ、ハリオタス(Haliotus)属の四倍体を、本質的に実施例１の手法に従って、対応する三倍体からの卵と二倍体からの一倍体精細胞を用いて製造した。
実施例１２
実施例のデータは、本発明の四倍体が、三倍体製造に極めて有効であることを示している。通常の二倍体のように、四倍体は１年齢で成熟する。成熟に際して、四倍体太平洋カキ、クラソストレア・ギガス・ツンベルグ(Crassostrea gigas Thunberg)をサンプリングした。これらは、適当な比率で雄と雌を含んでいる。三倍体では生産性がかなり低下するのに対して、四倍体は二倍体と同等の生産性を示す。四倍体と二倍体の交差かけ合わせを行った。四倍体×二倍体（及びレクリプロカル(recriprocal)）かけ合わせからの卵を、フローサイトメトリー分析によって三倍体である限り全て検査した。
二倍体（Ｄ）と四倍体（Ｔ）との全部で４通りの可能な組合せ：ＤＤ、ＤＴ、ＴＤ、ＴＴ（先に書いた型が雌である）を行った。二倍体雌は、８９０万の卵を有し、四倍体雌は６４０万の卵を有する。全てのグループで受精レベルは良好で、９２．３から９７．８％であった（表１）。通常の二倍体対照実験（ＤＤ）と比較して、ＤＴ及びＴＤ交差における卵段階まで生存する受精卵の数は良好であった。ＴＴかけ合わせでは、生存が極めて少なかった。
受精後５０日に、ＤＤ、ＤＴ及びＴＤかけ合わせ殻のカキ（各グループ３０個のカキ）を、フローサイトメトリーによる倍数性決定のためにサンプリングした。ＤＤからのカキは、３０個全てが二倍体であった。ＤＴ及びＴＤ掛け合わせの善６０個のカキは三倍体であった。ＴＴかけ合わせからの３個のカキを分析したところ、四倍体であった。
上述した本発明の方法で起こっていると思われる種々の生物学的事象は、三倍体雌と二倍体雄とから、ＰＢ１ブロックによる四倍体生成を導くが、これを図２に示した。これらの事象は、図１に示した通常の条件とは異なっている。
上記に説明した三倍体から得た卵で四倍体を製造することは、細胞数欠損仮説(cell-number deficiency hypothesis)を裏付けるものである。三倍体からの卵は、二倍体からの卵より容量で５４％大きく、この増加した容量が細胞数の増加を導くと考えられる。
本発明に従って、ひとたび成熟した四倍体カキが製造されれば、それらは通常の二倍体カキとかけ合わせて三倍体を生成することができる４ｎ×２ｎ＞３ｎ。簡単に言えば、三倍体は通常の二倍体より再現性の低い競合体であるので、商業的生産者にとって大きな市場に転換するためのある種の生理学的利点を有する（Allen、1988）。三倍体カキは、米国の西海岸で広く培養され、東海岸でも増加している。三倍体は、欧州（例えば仏国、アイルランド）、及びアジア（例えば日本、中国、韓国）でも培養される。
三倍体の今日の商業的生産における重要な特徴は、抗生物質であるサイトカラシンＢ（ＣＢ）を用いて生産されることである。ＣＢは、多くのヒト及び動物実験において奇形発生原及び突然変異原であることが見出されている。それはカキの卵に用いられるので、ＣＢは市販される大きさのカキには存在せず、組織に残る危険は無い。しかし、この薬剤の本来の毒性により、衛生局及びヒューマン・サービスの獣医医学センサーは、ＣＢを「優先規制外(not low regulatory priority)」に位置づけている。おそらく、他の国においても、ＣＢ及び他の化学種に対して同様の心配がなされている。四倍体から三倍体カキを製造する新たなルートであり、本発明で推奨されているルートは、全世界でこの心配を未然に防ぐ。
「（薬剤及び他の方法による）誘導」に対する「かけ合わせ」による三倍体の生成には少なくとも３つの他の利点がある。（ｉ）四倍体と二倍体とのかけ合わせによって製造された三倍体は、薬剤処理によって製造された三倍体より強壮である。これは、四倍体卵が二倍体卵より極めて大きいことによる（三倍体卵は、二倍体卵の約１．５倍の容積である。四倍体は、二倍体の２倍の大きさである）。増加した卵の大きさは、幼生サイクルの早期に貯蓄されるより活性な発達した胚を与えるので有利である。本発明の実施において、四倍体貝類が配偶子を生成すること、及び四倍体の卵が大きいことが明らかになった。（ｉｉ）４ｎ×２ｎかけ合わせで製造された三倍体は、第２の極体の阻害による近交低下(inbreeding depression)が無い。（ｉｉｉ）理論的には、４ｎ×２ｎかけ合わせの倍数性は、１００％三倍体になり、このような高い成功率は誘導した三倍体では得られなかった。純粋な三倍体の集合は、不確定な数の二倍体及びモザイクの混ざった集合に対して極めて重大な利点を有する。非天然種または変形生物のように、三倍体集団は機能的に繁殖不能である（３ｎ×３ｎかけ合わせは生育不能）ので、エコシステムにおける再生性を未然に防ぐために使用できる。
四倍体の利点及び応用は、上記以外にも多数存在する。即ち、四倍体は通常はハイブリダイズすることのできない２つの種の間の橋渡しとして使用できる。四倍体は、さらなる四倍体の生成に有効である、４ｎ×４ｎ＞４ｎ。四倍体は、雌性発生として知られる方法を通して、独特な二倍体の生成に使用することができる。本発明の他の利点及び応用は、本明細書を注意深く読めば当業者には理解されるであろう。
本発明の前述の説明は、本発明の好ましい実施態様を主に強調したが、本発明の範囲は好ましい実施態様に何ら限定されるものではなく、後述の請求の範囲にのみ制限される。
前に述べたように、本発明の理解のために、いくつかの技術用語の簡単な説明を以下に与える。
異数体(aneuploid)：通常の二倍体に比較して、（全染色体組ではなく）１またはそれ以上の個々の染色体が欠失されたか、または増加した形態。
動原体(centromere)：紡錘体が結合する部位を含む染色体の構成領域。
染色分体(chromatids)：複製によって生成された染色体のコピー。
二倍体(diploid)：一倍体数の基本数（ｎ）の２倍の染色体組を持つ形態。
正倍数性(euploid)：染色体基本組に必要な数を持つ形態。
一倍体(haploid)：染色体の基本組を持つ形態。
減数分裂(Meiosis)：性細胞の成熟で生ずる細胞分割の特別な過程であり、各娘核が染色体の半数を受け取る。即ち受精とは反対である。通常の状況における受精による染色体数の倍増を補償する。
有糸分裂(Mitosis)：細胞核の分裂であって、紡錘体及び染色体が含まれる。この過程により、互いに同じで元の核とも同じ２つの娘核となる。
四倍体：一倍体の４倍の染色体を有する形態。
三倍体：一倍体の３倍の染色体を有する形態。
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Claims (14)
- （ｉ）三倍体雌軟体類からの卵を、二倍体雄軟体類からの精子で受精させ、（ｉｉ）受精卵からの極体Ｉの放出をブロックし、（ｉｉｉ）該受精卵を培養することからなる生育可能な四倍体軟体類の製造方法。
- 前記軟体類が二枚貝である請求項１記載の方法。
- 前記軟体類がカキである請求項１記載の方法。
- 前記カキが、クラソストレア・ギガス・ツンベルグ（Crassostrea gigas Thunberg）種に属する請求項３記載の方法。
- 前記カキが、プリンクタダ・マガラチフェラ（Princtada magaratifera）、クラソストレア・シカマイ（Crassostrea sikamai）、クラソストレア・リブラリス（Crassostrea rivularis）、及びクラソストレア・バージニカ（Crassostrea virginica）からなる種から選択される請求項３記載の方法。
- 前記極体Ｉのブロックが、サイトカラシンＢを用いて行われる請求項１から５のいずれかに記載の方法。
- 請求項１に記載の製造方法を用いて四倍体雌軟体類を製造し、さらに前記四倍体雌軟体類と二倍体雄軟体類とをかけ合わせることからなる三倍体軟体類の製造方法。
- 製造される軟体類が二枚貝である請求項７記載の方法。
- 製造される軟体類がカキである請求項７記載の方法。
- 製造されるカキが、クラソストレア・ギガス・ツンベルグ（Crassostrea gigas Thunberg）種に属する請求項９記載の方法。
- 請求項１に記載の製造方法を用いて四倍体雌軟体類と四倍体雄軟体類とを製造し、これらをかけ合わせることからなる四倍体軟体類の製造方法。
- 製造される軟体類が二枚貝である請求項１１記載の方法。
- 製造される軟体類がカキである請求項１２記載の方法。
- 製造されるカキが、クラソストレア・ギガス・ツンベルグ（Crassostrea gigas Thunberg）種に属する請求項１３記載の方法。
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