JP3677237B2 - 核酸検出方法及び装置並びに核酸検出用容器 - Google Patents
核酸検出方法及び装置並びに核酸検出用容器 Download PDFInfo
- Publication number
- JP3677237B2 JP3677237B2 JP2001367484A JP2001367484A JP3677237B2 JP 3677237 B2 JP3677237 B2 JP 3677237B2 JP 2001367484 A JP2001367484 A JP 2001367484A JP 2001367484 A JP2001367484 A JP 2001367484A JP 3677237 B2 JP3677237 B2 JP 3677237B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- nucleic acid
- container
- electrode
- immobilized
- containers
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Images
Classifications
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、被検物質中における特定配列を有する核酸の存在を検出するための核酸検出方法及び装置並びに核酸検出用容器に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年、核酸固定化アレイ（ＤＮＡアレイ）による遺伝子検出技術が注目を集めている(Beattie et al. 1993, Fodor et al. 1991, Khrapko et al. 1989, Southern et al. 1994)。
ＤＮＡアレイは、例えば図２０に示されるように、１０1〜１０5種類の配列が異なる核酸プローブを固定化した、数ｃｍ角の硝子やシリコンのＤＮＡアレイ１６１からなる。このＤＮＡアレイ上であらかじめ蛍光色素や放射線同位元素（ＲＩ）等で標識した被検遺伝子を反応させるか、あるいは未標識の被検遺伝子と標識オリゴヌクレオチドの混合物をサンドイッチハイブリダイゼーションで反応させる。被検遺伝子に、ＤＮＡアレイ上の核酸プローブとの相補的な配列が存在するとき、アレイ上の特定部位で標識に由来する信号（蛍光強度、ＲＩ強度）が得られる。固定化しておいた核酸プローブの配列と位置があらかじめ分っていれば、被検遺伝子中に存在する塩基配列を簡単に調べることができる。
【０００３】
このようなＤＮＡアレイは、微量サンプルで塩基配列に関する多くの情報が得られることから、遺伝子検出技術に止まらずシーケンス技術としても大いに期待されている(Pease et al. 1994, Parinov et a1. 1996)。
【０００４】
さらに、前記ＤＮＡアレイとして、核酸プローブを固定化した電極を設けたものを用い、電気化学的にハイブリダイゼーション反応を制御する方法も報告されている(Heller et al. 1997)。核酸はリン酸骨格にマイナス荷電を有しているので、電極にプラス電圧を印加すると電極上に被検遺伝子が濃縮される。この方法を用いると、従来では数時間を要していたハイブリダイゼーション反応が僅か数分で終了する。
【０００５】
しかしながら、上記のＤＮＡアレイを用いた遺伝子検出方法は、ＤＮＡアレイ上での核酸プローブと被検遺伝子とのハイブリッド形成を、蛍光強度やＲＩ強度を指標にして検知する方法である。したがって、予め被検遺伝子を蛍光色素やＲＩ等で標識するための煩雑で高価な前処理が必要であった。また、微小領域からの蛍光やＲＩを検出しなければならないことから、分解能の高い高感度な蛍光検出システムが必要であり、それに伴いシステムも複雑で大型かつ高価になるといった問題点があった。
【０００６】
電気化学的な手法に基づくさらに進んだ遺伝子検出技術も報告されている(Hashimoto et al. 1994, Wang et a1. 1998)。この手法は被検遺伝子の標識が不要であり、また検出も電気信号を測定するために蛍光検出のような複雑なシステムが不要になる。この技術では、システムの小型化が期待でき、ＤＮＡアレイヘの適用も可能である。
【０００７】
しかし、従来から知られているＤＮＡアレイは１種類のサンプル（被検物質）に対する多種類遺伝子の検出には優れているが、多種類のサンプルの処理には必ずしも適しているとは言えないという問題点がある。
【０００８】
現在、マイクロタイタープレートとエンザイムイムノアッセイを組み合わせた方法が、感染症などの多種類のサンプルの遺伝子検出で用いられている。図２１にその概念図を示す。それぞれ異なるサンプルを別々に注入可能なように複数の容器１７１を備えたマイクロタイタープレート１７２を用い、各容器１７１内にはあらかじめ核酸プローブ１７３を存在させておく。
【０００９】
次に、各容器１７１に、あらかじめ蛍光色素やＲＩ等で標識した被検遺伝子１７４を含む、異なるサンプルをそれぞれ注入する。被検遺伝子に核酸プローブと相補的な配列が存在すると、その容器で標識に由来する信号（蛍光強度、ＲＩ強度）が得られる。このようにして各サンプルの被検遺伝子が特定配列を有する遺伝子であるか否かを検出する。
【００１０】
しかしながらこの方法は、多種類のサンプルに対する検出には優れているが、多種類遺伝子の検出には必ずしも適していないという問題点がある。また、被検遺伝子を蛍光色素やＲＩ等で標識する煩雑で高価な前処理が必要である。更に、微小領域の蛍光を検出する必要があるため、分解能の高い高感度な蛍光検出システムが必要であり、それに伴いシステムも複雑で大型かつ高価になるといった問題点がある。
【００１１】
今後必要とされるテイラーメイド医療などでは、多種サンプルもしくは多種類核酸の場合においても容易に、かつ簡易な設備により遺伝子検出を行うことが望まれており、これらに対応可能な手段が望まれている。
【００１２】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、従来の遺伝子検出技術では難しかった多サンプルもしくは多種類核酸を扱った多種の遺伝子検出を容易にかつ簡易な設備で高精度に行い、ひいてはテイラーメイド医療などで期待されている遺伝子検査を精度良く、かつ効率的に行うことを目的とする。
【００１３】
【課題を解決するための手段】
本発明の実施形態においては、核酸検出方法として電気化学的な手法を用いる。即ち、核酸プローブが導電体に固定化されてなる核酸固定化電極と、対極とを被検物質（サンプル）に接触させ、被検物質中の核酸に核酸プローブとのハイブリタリゼーション反応に起因する核酸固定化電極と対極間の電気化学的変化を検出することにより、被検物質中の特定核酸の存在を検知するものである。このため被検遺伝子を蛍光色素やＲＩ等で標識する煩雑で高価な前処理や、分解能の高い高感度な蛍光検出システムが不要である。
【００１４】
さらに本発明の実施形態は、被検物質を存在させる容器を複数個備え、容器の底面または内側面に対極を設置することにより、各容器毎に異なる被検物質を注入し、核酸固定化電極を各容器に挿入して被検物質と接触させるという単純な操作により各容器毎の電気化学的変化を別々に検出することを可能とするものである。このとき、対極は各容器の内側面または底面にあらかじめ形成されているため、核酸固定化電極と対極との両方を各容器に挿入する場合に比べて操作性や装置構成が簡易である。
【００１５】
また本発明の実施形態は、対極を底面または内側面に設けた容器を用いた核酸検出プロセスに関する。かかる核酸検出プロセスは以下の工程を含んでいる。すなわち、第１の容器を準備し、底面又は内側面に対極を備えると共に挿入剤溶液が注入された第２の容器を準備する工程と、被検物質を第１の容器に注入する工程と、導電体部及び該導電体部上に固定化された核酸プローブを有する核酸固定化電極を第１の容器内に挿入する工程と、第１の容器内にてハイブリダイゼーション反応を行わせる工程と、核酸固定化電極を第１の容器から抜出して第２の容器内に挿入する工程と、核酸固定化電極と対極との間に所定の電圧を印加し、挿入剤溶液の電気化学的信号を測定する工程である。
【００１６】
あるいは、第１の容器を準備し、底面又は内側面に対極を備えると共に挿入剤溶液が注入された第２の容器を準備する工程と、被検物質を前記第１の容器に注入する工程と、導電体部及び該導電体部上に固定化された核酸プローブを有する核酸固定化電極を第１の容器内に挿入する工程と、第１の容器内にてハイブリダイゼーション反応を行わせる工程と、核酸固定化電極を第１の容器から抜出して洗浄用の容器内に挿入する工程と、洗浄用容器内にて核酸固定化電極を洗浄する工程と、核酸固定化電極を洗浄用容器から抜出して第２の容器内に挿入する工程と、核酸固定化電極と対極との間に所定の電圧を印加し、挿入剤溶液の電気化学的信号を測定する工程を具備するようにしてもよい。
【００１７】
【発明の実施の形態】
本発明の一実施形態に係る核酸検出装置の構成を図１の概略図を参照しながら説明する。図１に示すように、核酸検出装置は、核酸固定化電極２と、容器１と、容器１の底面あるいは内側面に設置される対極３と、核酸固定化電極２と対極３との間に電圧を印加する電気回路４とを備える。この電気回路４は、電圧の印加を制御するための制御回路、及び外部電源に接続される電源回路を含む。
【００１８】
複数の被検物質を測定するために、容器１は複数用意されていることが好ましく、それらが一体化されていると取り扱いが容易になりさらに好ましい。
【００１９】
核酸固定化電極２は、基板に導電体が形成されてなるものであってもよいし、導電体のみからなるものでも良い。強度や製造コストなどを考慮すると、基板に導電体が形成されてなるものが望ましい。導電体の露出部分２’には核酸プローブ５が固定化される。各々の容器１には被検物質或いは挿入剤が注入される。
【００２０】
核酸固定化電極２は容器１に挿入可能であり、核酸プローブ５と容器１内に注入される被検物質とが接触可能となる。
【００２１】
被検物質中の核酸と核酸プローブ５とのハイブリタリゼーション反応が生じた場合、その反応に起因して核酸固定化電極２と対極３間の電気化学的変化が生じるため、それを検出することにより被検物質中における核酸プローブ５とのハイブリタリゼーション反応する核酸の存在を検知することができる。
【００２２】
核酸検出装置の幾つかの実施形態の一つは、核酸固定化電極２を作用極とし、この作用極と対極３のみを使用する２電極系の装置である。他の実施形態は作用極、対極に加えさらに参照極を使用する３電極系の装置である。参照極は、対極と同様に、容器１の底面または内側面に形成されていても良いし、もしくは核酸固定化電極２と同一の基板に形成されていてもよい。
【００２３】
核酸固定化電極２の形状は、特に限定されない。例えば本実施形態では、基板部分も含め、その外形が、市販の２４、４８、９６、３８４、もしくは１５３６穴のマイクロタイタープレートに挿入できるように、少なくとも幅が６mm以下１mm以上の柱状または円柱状とする。
【００２４】
複数の被検物質の測定を同時に行うことができるように、核酸固定化電極２は複数備えられていてもよい。複数の核酸固定化電極の制御は、液晶表示に採用されているマトリックス方式により実現してもよい。あるいはこの方式をＭＯＳＦＥＴを用いたアクティブマトリックス方式としてもよい。ＭＯＳイメージセンサー型の走査回路も用いることも可能である。複数の核酸固定化電極は、各電極に同一の塩基配列を有する核酸プローブが固定されていても良いし、多種類の核酸を検出するためにそれぞれの電極に異なる塩基配列を有する核酸プローブが固定化されていても良い。
【００２５】
以下、核酸固定化電極２についてさらに詳細に説明する。
【００２６】
核酸プローブ５が固定化される核酸固定化電極２において、核酸プローブ５を固定化させる導電体２’としては、金を用いることが最も望ましい。しかし、他の材料も使用可能である。例えば、金の合金、銀、プラチナ、水銀、ニッケル、パラジウム、シリコン、ゲルマニウム、ガリウム、タングステン等の金属単体及びそれらの合金、あるいはグラファイト、グラシーカーボン等の炭素等、またはこれらの酸化物、化合物を用いる事ができる。
【００２７】
これらの導電体は、ガラスなど他の材料からなる基板表面にメッキ、印刷、スパッタ、蒸着などで形成されていることが望ましい。蒸着を行う場合は、抵抗加熱法、高周波加熱法、電子ビーム加熱法により電極膜を形成することができる。また、スパッタリングを行う場合は、直流２極スパッタリング、バイアススパッタリング、非対称交流スパッタリング、ゲッタスパッタリング、高周波スパッタリングで電極膜を形成することが可能である。ここで、導電体２’に金を使用する場合は、金の結晶構造の（１１１）面の配向指数が重要である。配向指数はWillsonの方法により以下の式から求められる。
【００２８】
配向指数（hkl）＝ＩＦ(hkl)／ＩＦＲ(hkl)
hkl；面指数
ＩＦ（ hkl ）；（hkl）面の相対強度
ＩＦＲ(hkl)；ＡＳＴＭカードに記載されている標準金としてのＩＦ（ hkl ）
特に配向指数が１以上であることが望ましい。更に配向指数が２以上であることが望ましい。配向性を高めるために、蒸着あるいはスパッタリング時に基板を加熱することも有効である。加熱温度は特に限定されないが、５０℃〜５００℃の範囲であることが望ましい。配向性を制御することで、核酸プローブ５の固定化量を均一に制御することが可能になる。
【００２９】
また、基板に上記導電体を蒸着、あるいはスパッタリングする場合には、基板と金との間にチタン、あるいはクロム、銅、ニッケル、これらの合金を接着層として単独あるいは組み合わせて介在させることで、安定な電極層を形成することが可能になる。
【００３０】
核酸固定化電極２において導電体２’が形成される基板を構成する材料は特に限定されるものではない。例えば、ガラス、石英ガラス、シリコン、アルミナ、サファイア、フォルステライト、炭化珪素、酸化珪素、窒化珪素、等の無機絶縁材料を使用できる。また、ポリエチレン、エチレン、ポリプロピレン、ポリイソブチレン、ポリエチレンテレフタレート、不飽和ポリエステル、含フッ素樹脂、ポリ塩化ビニル、ポリ塩化ビニリデン、ポリ酢酸ビニル、ポリビニルアルコール、ポリビニルアセタール、アクリル樹脂、ポリアクリロニトリル、ポリスチレン、アセタール樹脂、ポリカーボネート、ポリアミド、フェノール樹脂、ユリア樹脂、エポキシ樹脂、メラミン樹脂、スチレン・アクリロニトリル共重合体、アクリロニトリルブタジエンスチレン共重合体、シリコーン樹脂、ポリフェニレンオキサイド、ポリスルホン等の有機材料を用いることができる。
【００３１】
核酸固定化電極２を得る際に、基板上に所望形状の導電体２’を形成するには基板上に導電体を形成後、フォトレジスト材料を用いフォトリソグラフィープロセスを行うことが好ましい。フォトレジスト材料としては、光露光用フォトレジスト、遠紫外用フォトレジスト、Ｘ線用フォトレジスト、電子線用フォトレジストが用いられる。光露光用フォトレジストには、主原料が環化ゴム、ポリけい皮酸、ノボラック樹脂があげられる。遠紫外用フォトレジストには、環化ゴム、フェノール樹脂、ポリメチルイソプロペニルケトン（ＰＭＩＰＫ）、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）等が用いられる。また、Ｘ線用レジストには、ＣＯＰ、メタルアクリレートのほか、様々な物質を用いることができる、更に電子線用レジストには、ＰＭＭＡ等、他の物質を用いることが可能である。
【００３２】
フォトリソグラフィーを行う際に用いるフォトレジスト層は１００オングストローム以上１ｍｍ以下であることが望ましい。フォトレジストで導電体を被覆し、所望形状の凹凸パターンにパターンニングした後に、パターンニングされたフォトレジストをマスクとして導電体をエッチングすることで導電体２’の面積を一定にすることが可能になる。これにより、固定化される核酸プローブ５の固定化量がそれぞれの電極間で均一になり、再現性に優れた測定を可能にする。また、フォトレジスト層は導電体の加工のためのマスクとして使用するのみならず、電極の保護膜として残留させてもよい。また、フォトリソグラフィープロセスを使うと精度の高く導電体を作製できるが、若干製造コストがかかる場合がある。低コストに電極を作製するにはプリント基板を用いることも可能である。この場合、基板材料としてポリイミドやガラスエポキシ樹脂などを用いることが可能になる。
【００３３】
次に核酸固定化電極２の導電体２’への核酸プローブ５の固定化方法について説明する。核酸固定化電極２に設けられた導電体２’に、核酸プローブ５を固定化するにあたっては、まず、導電体表面の活性化を行うことが望ましい。導電体表面の活性化は、硫酸の溶液中での電位掃引によって行うことが可能である。また、混酸、王水、等でも行うことができる。また、導電体表面をドライエッチングガスで処理することでも活性化を行うことが可能である。
【００３４】
核酸プローブ５としては、あらかじめ塩基配列が既知の一本鎖核酸を用いる。核酸プローブ５の構成材料は特に限定されるものではないが、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、メチルホスホネート骨格の核酸、その他核酸類似体を用いることが可能である。
【００３５】
核酸プローブ５の固定化方法は特に限定されるものではない。例えば、核酸プローブ５に導入したチオール基と金との結合を利用すると簡単に行うことができる。その他、物理吸着、化学吸着、疎水結合、抱埋、共有結合等で固定化が可能である。また、ビオチン−アビジン結合やカルボジイミドなどの縮合剤を用いることもできる。これらの場合、あらかじめ導電体表面を官能基を有する分子で修飾しておくことで、固定化を容易にすることができる。更に、導電体表面への核酸および拝入剤等の非特異的な吸着を抑制するために、導電体表面をメルカプトエタノール等のメルカプタンや、ステアリルアミンなどの脂質で被覆することが望ましい。
【００３６】
ＤＮＡスポッターやＤＮＡアレイヤーと呼ばれる固定化装置を用いると比較的容易にプローブの固定化を行うことができる。この際、導電体の表面を傷つけないために、インクジェット方式や静電方式のスポッターを用いることが望ましい。また、電極表面で直接核酸の合成を行うことも可能である。
【００３７】
複数の核酸固定化電極が使用される場合、それらを保持できるよう、図２に示されるような核酸固定化電極２を保持するホルダー６を使用してもよい。このホルダー６には核酸固定化電極２を保持する挿入孔６’が設けられている。
【００３８】
挿入孔６’は、保持された核酸固定化電極２が市販の２４、４８、９６、３８４、１５３６穴のマイクロタイタープレートに挿入できる３６mm（３×２）、１８mm（６×４）、９mm（１２×８）、４．５mm（２４×１６）、２．２５（４８×３２）mmのピッチで形成されていることが望ましい。図２においては、説明の便宜の為、挿入孔６’の径を誇張して示してある。
【００３９】
図示しないが、複数の核酸固定化電極２から電気信号を取り出すためにコネクターが使用される。コネクターの種類は特に限定されないが、例えば本実施形態では、市販の２４、４８、９６、３８４、１５３６穴のマイクロタイタープレートに挿入できる３６mm（３×２）、１８mm（６×４）、９mm（１２×８）、４．５mm（２４×１６）、２．２５（４８×３２）mmのピッチで形成される。
【００４０】
容器１としては、免疫検査などで一般的に用いられている、複数の容器が一体化された２４、４８、９６、３８４、１５３６穴のマイクロタイタープレート等に電極を形成したものを使用することが可能である。この電極は、核酸固定化電極２と対向する対極３である。対極３は、それぞれの容器１毎に別々に分離して複数個形成することも可能であるし、各容器共通の１つの電極を底面に設けることも可能である。複数の容器１が一体化されたマイクロタイタープレートの底面に複数個の対極３を設置する場合は、液晶の表示に用いられているマトリックス方式を用いることも可能である。更にはＭＯＳＦＥＴを用いたアクティブマトリックス方式であってもよい。また、ＭＯＳイメージセンサー型の走査回路も用いることが可能である。
【００４１】
容器１の底面または内側面に設置する対極３は、容器１と一体型の構造であることが望ましいが、容器１の底面または内側面から分離可能な構造としてもよい。この場合も対極３を複数形成することが可能である。対極３に加え、参照極をさらに備える３電極系についても同様に構成可能である。容器１と対極３との間に、電子の移動が可能なイオン透過膜を設置していても良い。
【００４２】
対極３（及び参照極）の材料は特に限定されるものではなく、金、金の合金、銀、プラチナ、水銀、ニッケル、パラジウム、シリコン、ゲルマニウム、ガリウム、タングステン等の金属単体及びそれらの合金、あるいはグラファイト、グラシーカーボン等の炭素等、またはこれらの酸化物、化合物を用いる事ができる。
【００４３】
これらの電極は、容器１に対してメッキ、印刷、スパッタ、蒸着などで作製することができる。蒸着を行う場合は、抵抗加熱法、高周波加熱法、電子ビーム加熱法により電極膜を形成することができる。また、スパッタリングを行う場合は、直流２極スパッタリング、バイアススパッタリング、非対称交流スパッタリング、ゲッタスパッタリング、高周波スパッタリングで電極膜を形成することが可能である。また、参照電極を形成する場合は銀／塩化銀を塗布することにより得ることも可能である。これら対極３や参照極はニトロセルロースやナイロン膜などの疎水性の膜上あるいは膜を貫通して形成することも可能である。この場合、通常用いられているフィルター付きマイクロプレートと同様に、ろ過が可能になる。
【００４４】
以下、図１に示した核酸検出装置を用いた核酸検出プロセスについて説明する。
【００４５】
まず、核酸固定化電極を作成するため導電体に核酸プローブを固定化する際の条件について述べる。ここでは、導電体が金の場合を例に挙げて説明する。
【００４６】
金からなる導電体は脱イオン水で洗浄後、活性化処理を行う。活性化には、０．１〜１０ｍｏｌ／Ｌの硫酸溶液が用いられる。この溶液中において、−０．５〜２Ｖ(vs Ag/AgCl)の範囲で、１ｖ／ｓ〜１０００００ｖ／ｓの範囲で電位を走査させる。これにより、電極表面はプローブを固定化できる状態にまで活性化される。
【００４７】
固定化に用いる核酸プローブには５‘あるいは３’末端にチオール基を導入しておく。チオール化核酸プローブは、固定化直前までＤＴＴ等の還元剤の溶液に溶解しておき、使用直前にゲル濾過あるいは酢酸エチルによる抽出操作等でＤＴＴを除去する。
【００４８】
固定化は至って簡単であり、イオン強度０．０１〜５の範囲でｐＨ５〜１０の範囲内の緩衝液中に、プローブＤＮＡを１ｎｇ／ｍｌ〜１ｍｇ／ｍＬの範囲になるように溶解させ、活性化した直後の電極を浸漬する。固定化反応は、４〜１００℃の範囲で１０分から１晩程度行う。
【００４９】
核酸プローブ固定化後の電極は核酸分解酵素（ヌクレアーゼ）が存在しない条件で保存することとし、できれば遮光する。なお、短期的な場合であればウェット状態で保存しても良い。保存液の組成はハイブリダイゼーション反応を行う液の組成、Tris-EDTA緩衝液あるいは脱イオン水であることが望ましい。更に、保存温度は４℃以下、好ましくは−２０℃である。また、核酸プローブ固定化後の電極を長期に保存する場合は、ドライ状態で保存することが望ましい。ドライ状態にする方法は特に限定されないが、凍結乾燥、風乾等で行うことができる。気相は特に限定されないが、アルゴン等の不活性ガス、窒素、乾燥空気、あるいは真空状態であることが望ましい。
【００５０】
被検物質（サンプル）は特に限定されない。例えば、血液、血清、白血球、尿、便、精液、唾液、組織、培養細胞、喀疾、食品、土壌、排水、廃水、空気等を用いることができる。特にこれらから核酸成分の抽出を行ったものを被検物質とすることが望ましい。核酸成分の抽出方法は、フェノールー−クロロホルム法等の液−液抽出法や担体を用いる固液抽出法を用いることができる。また、市販の核酸抽出方法ＱＩＡａｍｐ（ＱＩＡＧＥＮ社製）、スマイテスト（住友金属社製）等を利用することも可能である。
【００５１】
図３は本実施形態に係る核酸検出プロセスおよびその比較例を示した図である。本実施形態に係る核酸検出プロセスは、図１に示したスティック形状の核酸固定化電極２を用いる。核酸固定化電極２には核酸プローブ５が固定化されている。核酸固定化電極２が挿入される容器１の底面又は内側面には、対極３が配置されており、核酸固定化電極２と対極３との間に電気回路４によって電圧を印加する。本実施形態では、容器を複数用い、少なくとも、ハイブリダイゼーション反応プロセスと核酸の測定プロセスとで異なる容器を用いる。例えば本実施形態では、３つの容器１ａ〜１ｃを用いる。容器１ａ（第１の容器）の底面には対極３ａが配置されている。容器１ｂは核酸固定化電極２の洗浄用であり、対極は設けられていない。容器１ｃ（第２の容器）は容器１ａと同様に底面に対極３ｃが設けられている。ただし、第１の容器には対極３ａは必ずしも設けられなくても良いが、ハイブリダイゼーション反応の制御に使用するため設けられていることが望ましい。
【００５２】
一方、比較例に係る核酸検出プロセスは、核酸プローブが固定化された電極が底面に設けられた容器２００を一つだけ用いる。なお、反応溶液を容器２００に分注するために容器２０１、容器２００から除去した不要な溶液を排出するための容器２０２、洗浄液を容器２００に分注するための容器２０３、挿入剤溶液を容器２００に分注するための容器２０４も用いる。
【００５３】
特定核酸の検出を行うためには、まず被検物質中の二本鎖核酸を一本鎖核酸に変性させるプロセスを行う。続いて、核酸プローブと前記一本鎖核酸とのハイブリダイゼーション反応プロセスを行う必要がある。このプロセスは本発明に係る核酸検出プロセス及び比較例に係るプロセスともに同一である。
【００５４】
先ず、容器１ａ内に二本鎖核酸を含む被検物質を含む反応溶液を注入する。続いて前記二本鎖核酸を一本鎖に変性させる。次に、図３に示すように、核酸固定化電極２を容器１ａの位置に移動させる（ステップＳ１）。
【００５５】
図４は核酸固定化電極の移動制御機構の構成例を示した図である。同図に示される移動制御機構は、核酸固定化電極２を保持するアーム部３００と、アーム部３００を同図に示す矢印の方向に駆動するアーム駆動部３０１と、アーム駆動部３０１によるアーム部３００の駆動を制御する制御部３０２を備える。制御部３０２からの制御に従いアーム駆動部３０１がアーム部３００を駆動し、これにより核酸固定化電極２が容器１上の所定位置に移動する。次に、核酸固定化電極２の導電体の露出部分２’が容器１内の溶液中に浸るまで、核酸固定化電極２を下方向に移動するようアーム部３００は駆動される。
【００５６】
ハイブリダイゼーション反応プロセスは、容器１ａ内に被検物質を含んだ反応溶液を注入し、さらに容器１ａ内に核酸固定化電極２を挿入することにより、被検物質の核酸成分と核酸固定化電極２の露出部分２’との間で行われる。
ここまでのプロセスをさらに具体的に説明する。
【００５７】
反応溶液は、イオン強度０．０１〜５の範囲で、ｐＨ５〜１０の範囲の緩衝液が望ましい。この溶液中にはハイブリダイゼーション促進剤である硫酸デキストランや、サケ精子ＤＮＡ、牛胸腺ＤＮＡ、ＥＤＴＡ、界面活性剤、デキストランサルフェート、フォルムアミド、ＢＳＡ（Bovine Serum albumin）、Ｆｉｃｏｌｌ、ＰＶＰ（polyvinyl pyrrolidone）などを添加することが可能である。次に、反応溶液にさらに被検物質を注入し、９０℃以上で加熱し二本鎖核酸を一本鎖に熱変性させる。核酸固定化電極２の挿入は、変性直後、あるいは０℃に急冷後に行うことができる。
【００５８】
ハイブリダイゼーション反応中は、撹拌、あるいは振とうなどの操作で反応速度を高めることもできる。反応温度は１０℃〜９０℃の範囲とし、反応時間は少なくとも１分以上、好ましくは１晩程度とする。
【００５９】
熱変性に続くハイブリダイゼーション反応は、電気化学的に制御することが望ましい。容器１ａの内側面または底面に設置された電極３ａと、核酸固定化電極２との間に、電極２’の表面がプラスに電圧するよう電気回路４によって電圧を印加すると、マイナスに帯電した核酸は電極２’の表面に濃縮され反応が促進される。なお、電極２’の表面にマイナス電圧を印加すると、非特異的な結合を除去することができる。電極２にプラス電圧を印加することは、従来、数時間から数日必要であった反応時間を数分に短縮する。この場合、電圧は定速で掃引するか、あるいはパルスで印加するか、あるいは、定電圧を印加する。
【００６０】
電気回路４は、ポテンショスタット、デジタルマルチメーター、ファンクションジェネレーター等を含み、電流制御又は電圧制御により電位の印加を行う。
【００６１】
ハイブリダイゼーション反応の後、本実施形態では電極を取り出して洗浄する。
【００６２】
上述した移動制御機構は、核酸固定化電極２を容器１ｂの位置に移動させ、同容器１ｂ内の洗浄液に浸す。洗浄には、例えば、イオン強度０．０１〜５の範囲で、ｐＨ５〜１０の範囲の緩衝液が用いられる。なお、かかる洗浄プロセスは必須ではない。
【００６３】
洗浄の後、移動制御機構は、核酸固定化電極２を容器１ｃの位置に移動させ、これを同容器１ｃ内の挿入剤溶液中に浸す。洗浄プロセスに続くこの測定プロセスにおいては、電極２’表面に形成した二本鎖部分に選択的に結合する二本鎖核酸特異結合物質（挿入剤）を作用させ、電気化学的な信号の測定を行う。電気化学的な信号は、核酸固定化電極２と対極３ｃとの間に生じる酸化還元電流変化、酸化還元電位変化、電気容量変化、抵抗変化、あるいは電気化学発光変化を指標にすることが可能である。これらの信号変化は挿入剤、すなわち二本鎖核酸に特異的に結合する物質併用により効果が促進される。
【００６４】
ここで用いられる二本鎖核酸特異結合物質（挿入剤）は特に限定されるものではない。メタロインターカレーターと呼ばれるルテニウム、コバルト、鉄などの金属錯体や、ヘキスト３３２５８、アクリジンオレンジ、エチジウムブロマイド、ビスインターカレーター、トリスインターカレーター等の有機化合物、抗体、酵素などの生体高分子を用いることが可能である。また、フェロセン等の金属錯体等で標識した第二核酸プローブを用いたサンドイッチハイブリダイゼーションでの検出も可能である。
【００６５】
特に望ましくは、上述したヘキスト３３２５８、アクリジンオレンジ、キナタリン、ドウノマイシン、メタロインターカレーター、ビスアクリジン等のビスインターカレーター、トリスインターカレーター、ポリインターカレータ一等の挿入剤である。
【００６６】
挿入剤溶液の濃度は、その種類によって異なるが、一般的には１ng/m1〜１mg/mlの範囲で使用する。この際、イオン強度０．００１〜５の範囲で、ｐＨ５〜１０の範囲の緩衝液を用いる。
【００６７】
電極２’を挿入剤と反応させた後、電気化学的な測定を行う。測定では、挿入剤が電気化学的に反応する電位以上の電圧を電気回路４が電極２’に対して印加し、挿入剤に由来する反応電流値を測定する。この際、電圧は定速で掃引するか、あるいはパルスで印加するか、あるいは、定電圧を印加する。電圧は、容器１ｃの内側面または底面に設置した電極３ｃと、核酸固定化電極２の導電体の露出部分２’との間に印加する。この結果、挿入剤から得られた電流値を基に、検量線から標的遺伝子の濃度を算出することができる。
【００６８】
次に、比較例による核酸検出プロセスを説明する。
【００６９】
図３に示すように、底面に核酸固定化電極が配置された容器２００に、先ず反応溶液を分注し、上述した変性プロセス及びハイブリダイゼーション反応を行う（ステップＮ１）。変性プロセス及びハイブリダイゼーション反応自体については上述した本実施形態に係るプロセスと同様である。次に、容器２００からハイブリダイゼーション反応で用いた反応溶液を除去し、これを容器２０２に排出する（ステップＮ２）。次に、容器２０３から、反応溶液が除去された容器２００に洗浄液を分注する（ステップＮ３）。これにより容器２００の洗浄を行った後、洗浄液を容器２００から除去し、これを容器２０２に排出する（ステップＮ４）。そして、容器２０４から、洗浄液が除去された容器２００に挿入剤溶液を分注し、測定プロセスを実行する（ステップＮ５）。
【００７０】
この説明から明らかなように、比較例に係る核酸検出プロセスは、底面に核酸固定化電極を備えた容器を用いているために、溶液の分注及び排出作業を繰り返し行う必要がある。一方、本発明に係る核酸検出プロセスは、底面に対極のみを備えた容器を複数用い、核酸固定化電極２をこれら容器のそれぞれに移動させるようにしている。つまり、ハイブリダイゼーション反応を行う容器と、測定を行う容器とを別離させている。
【００７１】
このような本発明の実施形態によれば、比較例のような溶液排出作業が不要であり、核酸検出プロセスを容易化できる。これは、多数の被検物質を検査するような場合に有効である。
【００７２】
また、ハイブリダイゼーション反応を行う容器と、測定を行う容器とを別離させているので、ハイブリダイゼーションプロセス時に未反応の特異結合が測定プロセスにおいて残存し、これが不所望の電流となって測定結果にノイズを生じさせることを防止できるという利点もある。
【００７３】
（実施例１）核酸固定化電極
図５は核酸検出装置用の核酸固定化電極の一例を示した図である。核酸固定化電極３１は厚さ０．８ｍｍのガラス基板３２上にチタン（５００Å）および金（２０００Å）の薄膜をガラス基板−チタン−金の順でスパッタにより積層し、さらに前記金表面は核酸プローブ固定化部分３３（直径０．５ｍｍの円形領域）と端子部分３４を除いてレジスト３５で被覆することにより作成された。
【００７４】
核酸プローブ固定化部分３３と端子部分３４はレジスト３５の裏面側で接続される。また、チオール化核酸プローブが、核酸プローブ固定化部分３３にチオール／金の結合で固定化されている。本電極の外形は３８４穴のマイクロプレートに入るように、幅を１．５ｍｍに設定してある。また、長さは５ｃｍである。図６に、核酸固定化電極３１におけるＡ−Ａ’の断面図を示す。また、図７に、核酸固定化電極３１におけるＢ−Ｂ’の断面図を示す。
【００７５】
（実施例２）核酸固定化電極
図８は核酸検出装置用の核酸固定化電極及び参照極を一体化した電極構造体４１の一例を示した図である。前記電極構造体４２は以下のようにして作成された。まず厚さ０．８ｍｍのガラス基板４２上にチタン（５００Å）および金（２０００Å）がガラス基板一チタン−金の順でスパッタにより積層され基板の長手方向に沿って２本の線状に形成した。さらにまた前記チタンと金の積層体に対し、一方の線の前記金表面は核酸プローブ固定化部分４３（直径０．５ｍｍの円形領域）及び端子部分４４を除いてレジスト４５で被覆し、もう一方の線の前記金表面は銀／塩化銀が形成された参照極（直径０．５ｍｍの円形領域）部分４６及び端子部分４７を除いてレジスト４５で被覆して作成された。参照極部分４６は銀／塩化銀溶液中で電解を行い、金電極表面に析出させ形成した。チオール化核酸プローブは、プローブ固定化部分４３にチオール／金の結合で固定化した。本電極構造体の外形は９６穴のマイクロプレートに入るように、幅を３ｍｍに設定してある。また、長さは１０ｃｍである。
【００７６】
（実施例３）核酸固定化電極のホルダー
図９は核酸固定化電極のホルダーの一例を示す断面図である。複数の核酸固定化電極２を９６穴のマイクロタイタープレートに一度に挿入可能とするために、核酸固定化電極２を支持するホルダー６０は６ｍｍのピッチで１２×８個のアレイ状に挿入孔６０’が設けられ、前記挿入孔６０’に核酸固定化電極２が設置されている。
【００７７】
（実施例４）電極一体型マイクロタイタープレート
図１０は核酸検出用容器である電極一体型マイクロタイタープレートの一例を示す断面図である。マイクロタイタープレート７には複数の容器７’が設けられている。各容器７’底面にはカーボンフィルム電極（対極）８が貼り付けてある。容器７’に液体を注入した際は、液体は直接カーボンフィルム電極８と接触し、また容器７’内に保持される。
【００７８】
（実施例５）電極一体型マイクロタイタープレート
図１１は核酸検出用容器である電極一体型マイクロタイタープレートの一例を示した断面図である。マイクロタイタープレート７には複数の容器７’が設けられている。容器７’の底面にはカーボンフィルム電極８、銀／塩化銀が形成されたカーボンフィルム電極９が貼り付けてあるニトロセルロースフィルム１０が設置されており、液体は容器内に保持することができる。８は対極、９は参照極として用いる。液体は容器内に保持されている。使用方法に応じて吸引などによるろ過も可能になる。
【００７９】
（実施例６）電極一体型マイクロタイタープレート
図１２は核酸検出用容器である電極一体型マイクロタイタープレートの一例を示した断面図である。マイクロタイタープレート７には複数の容器７’が設けられている。容器７’底面にはそれぞれに金電極（対極）８１が形成されたニトロセルロースフィルム１０が貼り付けてある。容器７’に液体を注入した際は、液体は金電極８１と接触し、また容器７’内に保持されている。使用方法に応じて吸引などによるろ過も可能になる。
【００８０】
（実施例７）電極分離型マイクロタイタープレート
図１３は核酸検出用容器である電極分離型マイクロタイタープレートの一例を示した断面図である。マイクロタイタープレート７には複数の容器７’が設けられている。容器７’の底面には疎水性の、イオンが移動可能なフィルター１１が貼り付けられており、液体は容器内に保持することができる。その下にはカーボンフィルム電極（対極）９１を貼り付けた容器１２が設置されており、フィルター１１を介して電圧を印加する構成になっている。
【００８１】
（実施例８）電極分離型マイクロタイタープレート
図１４は核酸検出用容器である電極分離型マイクロタイタープレートの一例を示した図である。マイクロタイタープレート７には複数の容器７’が設けられている。容器７’の底面には疎水性の、イオン移動可能なフィルター１１が貼り付けられており、液体は容器内に保持することができる。その下には各容器７’に対応する形でカーボンフィルム電極（対極）１０１を取り付けた容器１２が設置されており、これらはマトリックス構造の配線で外部電源と接続されている。
【００８２】
（実施例９）電極分離型マイクロタイタープレート
図１５は核酸検出用容器である電極分離型マイクロタイタープレートの一例を示した図である。マイクロタイタープレート７には複数の容器７’が設けられている。マイクロタイタープレート７の底面には疎水性の、イオン移動可能なフィルター１１が貼り付けられており、液体は容器内に保持することができる。その下には各容器７’に対応する形でカーボンフィルム（対極）電極１１２、銀／塩化銀が形成されたカーボンフィルム電極（参照極）１１１が設置されており、これらはアクティブマトリックス構造の配線で外部電源と接続されている。
【００８３】
（実施例１０）電極分離型マイクロタイタープレートの電極配置
図１６は実施例８に記載した電極分離型マイクロタイタープレートを用いた際の各電極に対する電極配線を模式的に示した図である。カーボンフィルム電極１５（実施例８ではカーボンフィルム電極１０１と表現）はゲート線１６と、ソース線１７に接続されており、電源からの電圧はソース線１７を介して印加する構造になっている。スイッチングはゲート線のＯＮ／ＯＦＦで行う。
【００８４】
（実施例１１）電極分離型マイクロタイタープレートの電極配置
図１７は実施例９に記載した電極分離型マイクロタイタープレートを用いた際の各電極に対する電極配線を模式的に示した図である。カーボンフィルム電極１５（実施例９ではカーボンフィルム電極１１２と表現）は対極として作用する。カーボンフィルム電極１５はゲート線１６と、ソース線１７に接続されており、電源からの電圧はソース線１７を介して印加する構造になっている。スイッチングはゲート線１６につながったＴＦＴ１９でＯＮ／ＯＦＦで行う。また、銀塩化銀電極１８（実施例９では銀／塩化銀が形成されたカーボンフィルム電極１１１と表現）は参照極として作用する。銀塩化銀電極１８はゲート線２０と、ソース線１７に接続されており、電圧はソース線を介して印加する構造になっている。スイッチングはゲート線２０につながったＴＦＴ１９でＯＮ／ＯＦＦで行う。
【００８５】
（実施例１２）電極一体型マイクロタイタープレートを用いた検出装置
図１８は実施例４の電極一体型マイクロタイタープレートと実施例１の核酸固定化電極を用いた核酸検出装置である。この装置は、核酸固定化電極２と、各々分離されてなる複数の容器７’と容器７’の底面に設置された対極８とを備える９６穴のマイクロタイタープレートと、核酸固定化電極２と対極８との間に電圧を印加する手段（電源）４とを備える。核酸固定化電極２は複数備えられている（１本のみ図示）。
【００８６】
血液から抽出した遺伝子を含む被検物質はマイクロプレートの容器１の中に分注し、核酸固定化電極２を挿入する。ハイブリダイゼーション反応は各核酸固定化電極２と対極８との間に０．５Ｖの電圧を印加することで促進が可能で、約５分で反応が終了した。前記マイクロタイタープレートと同様な構成のマイクロタイタープレートを用意した。続いて、挿入剤ヘキスト３３２５８を添加した溶液を容器７’に挿入し、各容器７’に核酸固定化電極２を挿入して電圧印加時の電流測定を行った。ヘキスト３３２５８由来の電流測定は電極２と８との間に０．６Ｖ印加し、９６サンプルについて同時に遺伝子の検出が可能であった。
【００８７】
（実施例１３）電極分離型マイクロタイタープレートを用いた検出装置
図１９は実施例７の電極分離型マイクロタイタープレートと、実施例１の核酸固定化電極を用いた検出装置を示している。この装置は、核酸固定化電極２５と、各々分離されてなる複数の容器２４と前記容器２４の底面に位置するように設置された対極２６を備える容器とを備える９６穴のマイクロタイタープレートと、前記核酸固定化電極２５と前記対極２６間に電圧を印加する手段（電源）２７とを備える。核酸固定化電極２は複数備えられている（１本のみ図示）。
【００８８】
血液から抽出した遺伝子を含む被検物質は９６穴マイクロプレートの容器２４の中に分注し、核酸固定化電極２５を挿入する。ハイブリダイゼーション反応は電極２５と対極２６との間に０．５Ｖの電圧を印加することで促進が可能で、約５分で反応が終了した。前記マイクロタイタープレートと同様な構成のマイクロタイタープレートを用意した。続いて、挿入剤ヘキスト３３２５８を添加した溶液を容器７’に注入し、各容器２６に核酸固定化電極２を挿入して電圧印加時の電流測定を行った。ヘキスト３３２５８の電流測定は電極２５と対極２６との間に０．６Ｖ印加し、９６サンプルについて同時に遺伝子の検出が可能であった。
【００８９】
本発明の核酸検出装置によって検出する核酸は特に限定されるものではない。例えば、肝炎ウイルス（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ型）、ＨＩＶ、インフルエンザウイルス、ヘルペス群ウイルス、アデノウイルス、ヒトポリオーマウイルス、ヒトパピローマウイルス、ヒトパルボウイルス、ムンプスウイル素、ヒトロタウイルス、エンテロウイルス、日本脳炎ウイルス、デングウイルス、風疹ウイルス、ＨＴＬＶ、等のウイルス感染症、黄色ブドウ球菌、溶血性連鎖球菌、病原性大腸菌、腸炎ビブリオ菌、ヘリコバクターピロリ菌、カンピロバクター、コレラ菌、赤痢菌、サルモネラ菌、エルシニア、淋菌、リステリア菌、レプトスピラ、レジオネラ菌、スピロヘータ、肺炎マイコプラズマ、リケッチア、クラミジア、マラリア、赤痢アメーバ、病原真菌、等の細菌感染症、寄生虫、真菌等の検出に用いることができる。
【００９０】
また、遺伝性疾患、網膜芽細胞腫、ウイルムス腫瘍、家族性大腸ポリポーシス、遺伝性非ポリポーシス大腸癌、神経腺維腫症、家族性乳ガン、色素性乾皮症、脳腫瘍、口腔癌、食道癌、胃ガン、大腸癌、肝臓癌、膵臓癌、肺ガン、甲状腺腫瘍、乳腺腫瘍、泌尿器腫瘍、男性器腫瘍、女性器腫瘍、皮膚腫瘍、骨・軟部腫瘍、白血病、リンパ腫、固形腫瘍、等の腫瘍性疾患等を検査することが可能である。
【００９１】
また、医療以外にも、食品検査、検疫、医薬品検査、法医学、農業、畜産、漁業、林業などで遺伝子検査が必要なものに全て適応可能である。更に、制限酵素断片多系（ＲＦＬＰ）や１塩基多系（ＳＮＰｓ）、マイクロサテライト配列等の検出も可能である。また、未知の塩基配列解析に用いることも可能である。更に、ｍＲＮＡ鎖、ｃＤＮＡ鎖、ｃＲＮＡ鎖の解析に用いることも可能である。
【００９２】
尚、本発明は上述した実施形態に限定されることなく種々変形して実施可能である。
【００９３】
【発明の効果】
以上説明したように、本発明によれば多サンプルもしくは多種核酸を扱った多種の核酸検出を容易にかつ簡易な設備で高精度に行う際に有用な核酸検出方法及び装置並びに核酸検出用容器を提供できる。ひいては、テイラーメイド医療などで期待されている遺伝子検査などを精度良く、かつ効率的に行うことができるようになる。
【図面の簡単な説明】
【図１】 本発明の一実施形態に係る核酸検出装置の概略構成を示すブロック図
【図２】 核酸固定化電極のホルダーの一例を示す図
【図３】 本発明に係る核酸検出プロセスおよびその比較例を示す図
【図４】 核酸固定化電極の移動制御機構の構成例を示す図
【図５】 実施例１に係る核酸固定化電極の一例を示す図
【図６】 図５に示した核酸固定化電極におけるＡ−Ａ’の断面図
【図７】 図５に示した核酸固定化電極におけるＢ−Ｂ’の断面図
【図８】 実施例２に係り、対極及び参照極を含む核酸固定化電極構造体の一例を示す図
【図９】 実施例３に係る核酸固定化電極のホルダーの一例を示す図
【図１０】 実施例４に係る電極一体型マイクロタイタープレートの一例を示す図、
【図１１】 実施例５に係る電極一体型マイクロタイタープレートの一例を示す図、
【図１２】 実施例６に係る電極一体型マイクロタイタープレートの一例を示す図、
【図１３】 実施例７に係る電極分離型マイクロタイタープレートの一例を示す図、
【図１４】 実施例８に係る電極分離型マイクロタイタープレートの一例を示す図、
【図１５】 実施例９に係る電極分離型マイクロタイタープレートの一例を示す図
【図１６】 実施例１０に係る電極分離型マイクロタイタープレートの電極配置の一例を示す図
【図１７】 実施例１１に係る電極分離型マイクロタイタープレートの電極配置の一例を示す図
【図１８】 実施例１２に係る電極一体型マイクロタイタープレートを用いた核酸検出装置の一例を示す図
【図１９】 実施例１３に係る電極分離型マイクロタイタープレートを用いた核酸検出装置の一例を示す図
【図２０】 従来のＤＮＡアレイを示す斜視図
【図２１】 従来の遺伝子検出方法を示す概念図
【符号の説明】
１…容器
２…核酸固定化電極
３…対極
４…電気回路
【発明の属する技術分野】
本発明は、被検物質中における特定配列を有する核酸の存在を検出するための核酸検出方法及び装置並びに核酸検出用容器に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年、核酸固定化アレイ（ＤＮＡアレイ）による遺伝子検出技術が注目を集めている(Beattie et al. 1993, Fodor et al. 1991, Khrapko et al. 1989, Southern et al. 1994)。
ＤＮＡアレイは、例えば図２０に示されるように、１０1〜１０5種類の配列が異なる核酸プローブを固定化した、数ｃｍ角の硝子やシリコンのＤＮＡアレイ１６１からなる。このＤＮＡアレイ上であらかじめ蛍光色素や放射線同位元素（ＲＩ）等で標識した被検遺伝子を反応させるか、あるいは未標識の被検遺伝子と標識オリゴヌクレオチドの混合物をサンドイッチハイブリダイゼーションで反応させる。被検遺伝子に、ＤＮＡアレイ上の核酸プローブとの相補的な配列が存在するとき、アレイ上の特定部位で標識に由来する信号（蛍光強度、ＲＩ強度）が得られる。固定化しておいた核酸プローブの配列と位置があらかじめ分っていれば、被検遺伝子中に存在する塩基配列を簡単に調べることができる。
【０００３】
このようなＤＮＡアレイは、微量サンプルで塩基配列に関する多くの情報が得られることから、遺伝子検出技術に止まらずシーケンス技術としても大いに期待されている(Pease et al. 1994, Parinov et a1. 1996)。
【０００４】
さらに、前記ＤＮＡアレイとして、核酸プローブを固定化した電極を設けたものを用い、電気化学的にハイブリダイゼーション反応を制御する方法も報告されている(Heller et al. 1997)。核酸はリン酸骨格にマイナス荷電を有しているので、電極にプラス電圧を印加すると電極上に被検遺伝子が濃縮される。この方法を用いると、従来では数時間を要していたハイブリダイゼーション反応が僅か数分で終了する。
【０００５】
しかしながら、上記のＤＮＡアレイを用いた遺伝子検出方法は、ＤＮＡアレイ上での核酸プローブと被検遺伝子とのハイブリッド形成を、蛍光強度やＲＩ強度を指標にして検知する方法である。したがって、予め被検遺伝子を蛍光色素やＲＩ等で標識するための煩雑で高価な前処理が必要であった。また、微小領域からの蛍光やＲＩを検出しなければならないことから、分解能の高い高感度な蛍光検出システムが必要であり、それに伴いシステムも複雑で大型かつ高価になるといった問題点があった。
【０００６】
電気化学的な手法に基づくさらに進んだ遺伝子検出技術も報告されている(Hashimoto et al. 1994, Wang et a1. 1998)。この手法は被検遺伝子の標識が不要であり、また検出も電気信号を測定するために蛍光検出のような複雑なシステムが不要になる。この技術では、システムの小型化が期待でき、ＤＮＡアレイヘの適用も可能である。
【０００７】
しかし、従来から知られているＤＮＡアレイは１種類のサンプル（被検物質）に対する多種類遺伝子の検出には優れているが、多種類のサンプルの処理には必ずしも適しているとは言えないという問題点がある。
【０００８】
現在、マイクロタイタープレートとエンザイムイムノアッセイを組み合わせた方法が、感染症などの多種類のサンプルの遺伝子検出で用いられている。図２１にその概念図を示す。それぞれ異なるサンプルを別々に注入可能なように複数の容器１７１を備えたマイクロタイタープレート１７２を用い、各容器１７１内にはあらかじめ核酸プローブ１７３を存在させておく。
【０００９】
次に、各容器１７１に、あらかじめ蛍光色素やＲＩ等で標識した被検遺伝子１７４を含む、異なるサンプルをそれぞれ注入する。被検遺伝子に核酸プローブと相補的な配列が存在すると、その容器で標識に由来する信号（蛍光強度、ＲＩ強度）が得られる。このようにして各サンプルの被検遺伝子が特定配列を有する遺伝子であるか否かを検出する。
【００１０】
しかしながらこの方法は、多種類のサンプルに対する検出には優れているが、多種類遺伝子の検出には必ずしも適していないという問題点がある。また、被検遺伝子を蛍光色素やＲＩ等で標識する煩雑で高価な前処理が必要である。更に、微小領域の蛍光を検出する必要があるため、分解能の高い高感度な蛍光検出システムが必要であり、それに伴いシステムも複雑で大型かつ高価になるといった問題点がある。
【００１１】
今後必要とされるテイラーメイド医療などでは、多種サンプルもしくは多種類核酸の場合においても容易に、かつ簡易な設備により遺伝子検出を行うことが望まれており、これらに対応可能な手段が望まれている。
【００１２】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、従来の遺伝子検出技術では難しかった多サンプルもしくは多種類核酸を扱った多種の遺伝子検出を容易にかつ簡易な設備で高精度に行い、ひいてはテイラーメイド医療などで期待されている遺伝子検査を精度良く、かつ効率的に行うことを目的とする。
【００１３】
【課題を解決するための手段】
本発明の実施形態においては、核酸検出方法として電気化学的な手法を用いる。即ち、核酸プローブが導電体に固定化されてなる核酸固定化電極と、対極とを被検物質（サンプル）に接触させ、被検物質中の核酸に核酸プローブとのハイブリタリゼーション反応に起因する核酸固定化電極と対極間の電気化学的変化を検出することにより、被検物質中の特定核酸の存在を検知するものである。このため被検遺伝子を蛍光色素やＲＩ等で標識する煩雑で高価な前処理や、分解能の高い高感度な蛍光検出システムが不要である。
【００１４】
さらに本発明の実施形態は、被検物質を存在させる容器を複数個備え、容器の底面または内側面に対極を設置することにより、各容器毎に異なる被検物質を注入し、核酸固定化電極を各容器に挿入して被検物質と接触させるという単純な操作により各容器毎の電気化学的変化を別々に検出することを可能とするものである。このとき、対極は各容器の内側面または底面にあらかじめ形成されているため、核酸固定化電極と対極との両方を各容器に挿入する場合に比べて操作性や装置構成が簡易である。
【００１５】
また本発明の実施形態は、対極を底面または内側面に設けた容器を用いた核酸検出プロセスに関する。かかる核酸検出プロセスは以下の工程を含んでいる。すなわち、第１の容器を準備し、底面又は内側面に対極を備えると共に挿入剤溶液が注入された第２の容器を準備する工程と、被検物質を第１の容器に注入する工程と、導電体部及び該導電体部上に固定化された核酸プローブを有する核酸固定化電極を第１の容器内に挿入する工程と、第１の容器内にてハイブリダイゼーション反応を行わせる工程と、核酸固定化電極を第１の容器から抜出して第２の容器内に挿入する工程と、核酸固定化電極と対極との間に所定の電圧を印加し、挿入剤溶液の電気化学的信号を測定する工程である。
【００１６】
あるいは、第１の容器を準備し、底面又は内側面に対極を備えると共に挿入剤溶液が注入された第２の容器を準備する工程と、被検物質を前記第１の容器に注入する工程と、導電体部及び該導電体部上に固定化された核酸プローブを有する核酸固定化電極を第１の容器内に挿入する工程と、第１の容器内にてハイブリダイゼーション反応を行わせる工程と、核酸固定化電極を第１の容器から抜出して洗浄用の容器内に挿入する工程と、洗浄用容器内にて核酸固定化電極を洗浄する工程と、核酸固定化電極を洗浄用容器から抜出して第２の容器内に挿入する工程と、核酸固定化電極と対極との間に所定の電圧を印加し、挿入剤溶液の電気化学的信号を測定する工程を具備するようにしてもよい。
【００１７】
【発明の実施の形態】
本発明の一実施形態に係る核酸検出装置の構成を図１の概略図を参照しながら説明する。図１に示すように、核酸検出装置は、核酸固定化電極２と、容器１と、容器１の底面あるいは内側面に設置される対極３と、核酸固定化電極２と対極３との間に電圧を印加する電気回路４とを備える。この電気回路４は、電圧の印加を制御するための制御回路、及び外部電源に接続される電源回路を含む。
【００１８】
複数の被検物質を測定するために、容器１は複数用意されていることが好ましく、それらが一体化されていると取り扱いが容易になりさらに好ましい。
【００１９】
核酸固定化電極２は、基板に導電体が形成されてなるものであってもよいし、導電体のみからなるものでも良い。強度や製造コストなどを考慮すると、基板に導電体が形成されてなるものが望ましい。導電体の露出部分２’には核酸プローブ５が固定化される。各々の容器１には被検物質或いは挿入剤が注入される。
【００２０】
核酸固定化電極２は容器１に挿入可能であり、核酸プローブ５と容器１内に注入される被検物質とが接触可能となる。
【００２１】
被検物質中の核酸と核酸プローブ５とのハイブリタリゼーション反応が生じた場合、その反応に起因して核酸固定化電極２と対極３間の電気化学的変化が生じるため、それを検出することにより被検物質中における核酸プローブ５とのハイブリタリゼーション反応する核酸の存在を検知することができる。
【００２２】
核酸検出装置の幾つかの実施形態の一つは、核酸固定化電極２を作用極とし、この作用極と対極３のみを使用する２電極系の装置である。他の実施形態は作用極、対極に加えさらに参照極を使用する３電極系の装置である。参照極は、対極と同様に、容器１の底面または内側面に形成されていても良いし、もしくは核酸固定化電極２と同一の基板に形成されていてもよい。
【００２３】
核酸固定化電極２の形状は、特に限定されない。例えば本実施形態では、基板部分も含め、その外形が、市販の２４、４８、９６、３８４、もしくは１５３６穴のマイクロタイタープレートに挿入できるように、少なくとも幅が６mm以下１mm以上の柱状または円柱状とする。
【００２４】
複数の被検物質の測定を同時に行うことができるように、核酸固定化電極２は複数備えられていてもよい。複数の核酸固定化電極の制御は、液晶表示に採用されているマトリックス方式により実現してもよい。あるいはこの方式をＭＯＳＦＥＴを用いたアクティブマトリックス方式としてもよい。ＭＯＳイメージセンサー型の走査回路も用いることも可能である。複数の核酸固定化電極は、各電極に同一の塩基配列を有する核酸プローブが固定されていても良いし、多種類の核酸を検出するためにそれぞれの電極に異なる塩基配列を有する核酸プローブが固定化されていても良い。
【００２５】
以下、核酸固定化電極２についてさらに詳細に説明する。
【００２６】
核酸プローブ５が固定化される核酸固定化電極２において、核酸プローブ５を固定化させる導電体２’としては、金を用いることが最も望ましい。しかし、他の材料も使用可能である。例えば、金の合金、銀、プラチナ、水銀、ニッケル、パラジウム、シリコン、ゲルマニウム、ガリウム、タングステン等の金属単体及びそれらの合金、あるいはグラファイト、グラシーカーボン等の炭素等、またはこれらの酸化物、化合物を用いる事ができる。
【００２７】
これらの導電体は、ガラスなど他の材料からなる基板表面にメッキ、印刷、スパッタ、蒸着などで形成されていることが望ましい。蒸着を行う場合は、抵抗加熱法、高周波加熱法、電子ビーム加熱法により電極膜を形成することができる。また、スパッタリングを行う場合は、直流２極スパッタリング、バイアススパッタリング、非対称交流スパッタリング、ゲッタスパッタリング、高周波スパッタリングで電極膜を形成することが可能である。ここで、導電体２’に金を使用する場合は、金の結晶構造の（１１１）面の配向指数が重要である。配向指数はWillsonの方法により以下の式から求められる。
【００２８】
配向指数（hkl）＝ＩＦ(hkl)／ＩＦＲ(hkl)
hkl；面指数
ＩＦ（ hkl ）；（hkl）面の相対強度
ＩＦＲ(hkl)；ＡＳＴＭカードに記載されている標準金としてのＩＦ（ hkl ）
特に配向指数が１以上であることが望ましい。更に配向指数が２以上であることが望ましい。配向性を高めるために、蒸着あるいはスパッタリング時に基板を加熱することも有効である。加熱温度は特に限定されないが、５０℃〜５００℃の範囲であることが望ましい。配向性を制御することで、核酸プローブ５の固定化量を均一に制御することが可能になる。
【００２９】
また、基板に上記導電体を蒸着、あるいはスパッタリングする場合には、基板と金との間にチタン、あるいはクロム、銅、ニッケル、これらの合金を接着層として単独あるいは組み合わせて介在させることで、安定な電極層を形成することが可能になる。
【００３０】
核酸固定化電極２において導電体２’が形成される基板を構成する材料は特に限定されるものではない。例えば、ガラス、石英ガラス、シリコン、アルミナ、サファイア、フォルステライト、炭化珪素、酸化珪素、窒化珪素、等の無機絶縁材料を使用できる。また、ポリエチレン、エチレン、ポリプロピレン、ポリイソブチレン、ポリエチレンテレフタレート、不飽和ポリエステル、含フッ素樹脂、ポリ塩化ビニル、ポリ塩化ビニリデン、ポリ酢酸ビニル、ポリビニルアルコール、ポリビニルアセタール、アクリル樹脂、ポリアクリロニトリル、ポリスチレン、アセタール樹脂、ポリカーボネート、ポリアミド、フェノール樹脂、ユリア樹脂、エポキシ樹脂、メラミン樹脂、スチレン・アクリロニトリル共重合体、アクリロニトリルブタジエンスチレン共重合体、シリコーン樹脂、ポリフェニレンオキサイド、ポリスルホン等の有機材料を用いることができる。
【００３１】
核酸固定化電極２を得る際に、基板上に所望形状の導電体２’を形成するには基板上に導電体を形成後、フォトレジスト材料を用いフォトリソグラフィープロセスを行うことが好ましい。フォトレジスト材料としては、光露光用フォトレジスト、遠紫外用フォトレジスト、Ｘ線用フォトレジスト、電子線用フォトレジストが用いられる。光露光用フォトレジストには、主原料が環化ゴム、ポリけい皮酸、ノボラック樹脂があげられる。遠紫外用フォトレジストには、環化ゴム、フェノール樹脂、ポリメチルイソプロペニルケトン（ＰＭＩＰＫ）、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）等が用いられる。また、Ｘ線用レジストには、ＣＯＰ、メタルアクリレートのほか、様々な物質を用いることができる、更に電子線用レジストには、ＰＭＭＡ等、他の物質を用いることが可能である。
【００３２】
フォトリソグラフィーを行う際に用いるフォトレジスト層は１００オングストローム以上１ｍｍ以下であることが望ましい。フォトレジストで導電体を被覆し、所望形状の凹凸パターンにパターンニングした後に、パターンニングされたフォトレジストをマスクとして導電体をエッチングすることで導電体２’の面積を一定にすることが可能になる。これにより、固定化される核酸プローブ５の固定化量がそれぞれの電極間で均一になり、再現性に優れた測定を可能にする。また、フォトレジスト層は導電体の加工のためのマスクとして使用するのみならず、電極の保護膜として残留させてもよい。また、フォトリソグラフィープロセスを使うと精度の高く導電体を作製できるが、若干製造コストがかかる場合がある。低コストに電極を作製するにはプリント基板を用いることも可能である。この場合、基板材料としてポリイミドやガラスエポキシ樹脂などを用いることが可能になる。
【００３３】
次に核酸固定化電極２の導電体２’への核酸プローブ５の固定化方法について説明する。核酸固定化電極２に設けられた導電体２’に、核酸プローブ５を固定化するにあたっては、まず、導電体表面の活性化を行うことが望ましい。導電体表面の活性化は、硫酸の溶液中での電位掃引によって行うことが可能である。また、混酸、王水、等でも行うことができる。また、導電体表面をドライエッチングガスで処理することでも活性化を行うことが可能である。
【００３４】
核酸プローブ５としては、あらかじめ塩基配列が既知の一本鎖核酸を用いる。核酸プローブ５の構成材料は特に限定されるものではないが、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、メチルホスホネート骨格の核酸、その他核酸類似体を用いることが可能である。
【００３５】
核酸プローブ５の固定化方法は特に限定されるものではない。例えば、核酸プローブ５に導入したチオール基と金との結合を利用すると簡単に行うことができる。その他、物理吸着、化学吸着、疎水結合、抱埋、共有結合等で固定化が可能である。また、ビオチン−アビジン結合やカルボジイミドなどの縮合剤を用いることもできる。これらの場合、あらかじめ導電体表面を官能基を有する分子で修飾しておくことで、固定化を容易にすることができる。更に、導電体表面への核酸および拝入剤等の非特異的な吸着を抑制するために、導電体表面をメルカプトエタノール等のメルカプタンや、ステアリルアミンなどの脂質で被覆することが望ましい。
【００３６】
ＤＮＡスポッターやＤＮＡアレイヤーと呼ばれる固定化装置を用いると比較的容易にプローブの固定化を行うことができる。この際、導電体の表面を傷つけないために、インクジェット方式や静電方式のスポッターを用いることが望ましい。また、電極表面で直接核酸の合成を行うことも可能である。
【００３７】
複数の核酸固定化電極が使用される場合、それらを保持できるよう、図２に示されるような核酸固定化電極２を保持するホルダー６を使用してもよい。このホルダー６には核酸固定化電極２を保持する挿入孔６’が設けられている。
【００３８】
挿入孔６’は、保持された核酸固定化電極２が市販の２４、４８、９６、３８４、１５３６穴のマイクロタイタープレートに挿入できる３６mm（３×２）、１８mm（６×４）、９mm（１２×８）、４．５mm（２４×１６）、２．２５（４８×３２）mmのピッチで形成されていることが望ましい。図２においては、説明の便宜の為、挿入孔６’の径を誇張して示してある。
【００３９】
図示しないが、複数の核酸固定化電極２から電気信号を取り出すためにコネクターが使用される。コネクターの種類は特に限定されないが、例えば本実施形態では、市販の２４、４８、９６、３８４、１５３６穴のマイクロタイタープレートに挿入できる３６mm（３×２）、１８mm（６×４）、９mm（１２×８）、４．５mm（２４×１６）、２．２５（４８×３２）mmのピッチで形成される。
【００４０】
容器１としては、免疫検査などで一般的に用いられている、複数の容器が一体化された２４、４８、９６、３８４、１５３６穴のマイクロタイタープレート等に電極を形成したものを使用することが可能である。この電極は、核酸固定化電極２と対向する対極３である。対極３は、それぞれの容器１毎に別々に分離して複数個形成することも可能であるし、各容器共通の１つの電極を底面に設けることも可能である。複数の容器１が一体化されたマイクロタイタープレートの底面に複数個の対極３を設置する場合は、液晶の表示に用いられているマトリックス方式を用いることも可能である。更にはＭＯＳＦＥＴを用いたアクティブマトリックス方式であってもよい。また、ＭＯＳイメージセンサー型の走査回路も用いることが可能である。
【００４１】
容器１の底面または内側面に設置する対極３は、容器１と一体型の構造であることが望ましいが、容器１の底面または内側面から分離可能な構造としてもよい。この場合も対極３を複数形成することが可能である。対極３に加え、参照極をさらに備える３電極系についても同様に構成可能である。容器１と対極３との間に、電子の移動が可能なイオン透過膜を設置していても良い。
【００４２】
対極３（及び参照極）の材料は特に限定されるものではなく、金、金の合金、銀、プラチナ、水銀、ニッケル、パラジウム、シリコン、ゲルマニウム、ガリウム、タングステン等の金属単体及びそれらの合金、あるいはグラファイト、グラシーカーボン等の炭素等、またはこれらの酸化物、化合物を用いる事ができる。
【００４３】
これらの電極は、容器１に対してメッキ、印刷、スパッタ、蒸着などで作製することができる。蒸着を行う場合は、抵抗加熱法、高周波加熱法、電子ビーム加熱法により電極膜を形成することができる。また、スパッタリングを行う場合は、直流２極スパッタリング、バイアススパッタリング、非対称交流スパッタリング、ゲッタスパッタリング、高周波スパッタリングで電極膜を形成することが可能である。また、参照電極を形成する場合は銀／塩化銀を塗布することにより得ることも可能である。これら対極３や参照極はニトロセルロースやナイロン膜などの疎水性の膜上あるいは膜を貫通して形成することも可能である。この場合、通常用いられているフィルター付きマイクロプレートと同様に、ろ過が可能になる。
【００４４】
以下、図１に示した核酸検出装置を用いた核酸検出プロセスについて説明する。
【００４５】
まず、核酸固定化電極を作成するため導電体に核酸プローブを固定化する際の条件について述べる。ここでは、導電体が金の場合を例に挙げて説明する。
【００４６】
金からなる導電体は脱イオン水で洗浄後、活性化処理を行う。活性化には、０．１〜１０ｍｏｌ／Ｌの硫酸溶液が用いられる。この溶液中において、−０．５〜２Ｖ(vs Ag/AgCl)の範囲で、１ｖ／ｓ〜１０００００ｖ／ｓの範囲で電位を走査させる。これにより、電極表面はプローブを固定化できる状態にまで活性化される。
【００４７】
固定化に用いる核酸プローブには５‘あるいは３’末端にチオール基を導入しておく。チオール化核酸プローブは、固定化直前までＤＴＴ等の還元剤の溶液に溶解しておき、使用直前にゲル濾過あるいは酢酸エチルによる抽出操作等でＤＴＴを除去する。
【００４８】
固定化は至って簡単であり、イオン強度０．０１〜５の範囲でｐＨ５〜１０の範囲内の緩衝液中に、プローブＤＮＡを１ｎｇ／ｍｌ〜１ｍｇ／ｍＬの範囲になるように溶解させ、活性化した直後の電極を浸漬する。固定化反応は、４〜１００℃の範囲で１０分から１晩程度行う。
【００４９】
核酸プローブ固定化後の電極は核酸分解酵素（ヌクレアーゼ）が存在しない条件で保存することとし、できれば遮光する。なお、短期的な場合であればウェット状態で保存しても良い。保存液の組成はハイブリダイゼーション反応を行う液の組成、Tris-EDTA緩衝液あるいは脱イオン水であることが望ましい。更に、保存温度は４℃以下、好ましくは−２０℃である。また、核酸プローブ固定化後の電極を長期に保存する場合は、ドライ状態で保存することが望ましい。ドライ状態にする方法は特に限定されないが、凍結乾燥、風乾等で行うことができる。気相は特に限定されないが、アルゴン等の不活性ガス、窒素、乾燥空気、あるいは真空状態であることが望ましい。
【００５０】
被検物質（サンプル）は特に限定されない。例えば、血液、血清、白血球、尿、便、精液、唾液、組織、培養細胞、喀疾、食品、土壌、排水、廃水、空気等を用いることができる。特にこれらから核酸成分の抽出を行ったものを被検物質とすることが望ましい。核酸成分の抽出方法は、フェノールー−クロロホルム法等の液−液抽出法や担体を用いる固液抽出法を用いることができる。また、市販の核酸抽出方法ＱＩＡａｍｐ（ＱＩＡＧＥＮ社製）、スマイテスト（住友金属社製）等を利用することも可能である。
【００５１】
図３は本実施形態に係る核酸検出プロセスおよびその比較例を示した図である。本実施形態に係る核酸検出プロセスは、図１に示したスティック形状の核酸固定化電極２を用いる。核酸固定化電極２には核酸プローブ５が固定化されている。核酸固定化電極２が挿入される容器１の底面又は内側面には、対極３が配置されており、核酸固定化電極２と対極３との間に電気回路４によって電圧を印加する。本実施形態では、容器を複数用い、少なくとも、ハイブリダイゼーション反応プロセスと核酸の測定プロセスとで異なる容器を用いる。例えば本実施形態では、３つの容器１ａ〜１ｃを用いる。容器１ａ（第１の容器）の底面には対極３ａが配置されている。容器１ｂは核酸固定化電極２の洗浄用であり、対極は設けられていない。容器１ｃ（第２の容器）は容器１ａと同様に底面に対極３ｃが設けられている。ただし、第１の容器には対極３ａは必ずしも設けられなくても良いが、ハイブリダイゼーション反応の制御に使用するため設けられていることが望ましい。
【００５２】
一方、比較例に係る核酸検出プロセスは、核酸プローブが固定化された電極が底面に設けられた容器２００を一つだけ用いる。なお、反応溶液を容器２００に分注するために容器２０１、容器２００から除去した不要な溶液を排出するための容器２０２、洗浄液を容器２００に分注するための容器２０３、挿入剤溶液を容器２００に分注するための容器２０４も用いる。
【００５３】
特定核酸の検出を行うためには、まず被検物質中の二本鎖核酸を一本鎖核酸に変性させるプロセスを行う。続いて、核酸プローブと前記一本鎖核酸とのハイブリダイゼーション反応プロセスを行う必要がある。このプロセスは本発明に係る核酸検出プロセス及び比較例に係るプロセスともに同一である。
【００５４】
先ず、容器１ａ内に二本鎖核酸を含む被検物質を含む反応溶液を注入する。続いて前記二本鎖核酸を一本鎖に変性させる。次に、図３に示すように、核酸固定化電極２を容器１ａの位置に移動させる（ステップＳ１）。
【００５５】
図４は核酸固定化電極の移動制御機構の構成例を示した図である。同図に示される移動制御機構は、核酸固定化電極２を保持するアーム部３００と、アーム部３００を同図に示す矢印の方向に駆動するアーム駆動部３０１と、アーム駆動部３０１によるアーム部３００の駆動を制御する制御部３０２を備える。制御部３０２からの制御に従いアーム駆動部３０１がアーム部３００を駆動し、これにより核酸固定化電極２が容器１上の所定位置に移動する。次に、核酸固定化電極２の導電体の露出部分２’が容器１内の溶液中に浸るまで、核酸固定化電極２を下方向に移動するようアーム部３００は駆動される。
【００５６】
ハイブリダイゼーション反応プロセスは、容器１ａ内に被検物質を含んだ反応溶液を注入し、さらに容器１ａ内に核酸固定化電極２を挿入することにより、被検物質の核酸成分と核酸固定化電極２の露出部分２’との間で行われる。
ここまでのプロセスをさらに具体的に説明する。
【００５７】
反応溶液は、イオン強度０．０１〜５の範囲で、ｐＨ５〜１０の範囲の緩衝液が望ましい。この溶液中にはハイブリダイゼーション促進剤である硫酸デキストランや、サケ精子ＤＮＡ、牛胸腺ＤＮＡ、ＥＤＴＡ、界面活性剤、デキストランサルフェート、フォルムアミド、ＢＳＡ（Bovine Serum albumin）、Ｆｉｃｏｌｌ、ＰＶＰ（polyvinyl pyrrolidone）などを添加することが可能である。次に、反応溶液にさらに被検物質を注入し、９０℃以上で加熱し二本鎖核酸を一本鎖に熱変性させる。核酸固定化電極２の挿入は、変性直後、あるいは０℃に急冷後に行うことができる。
【００５８】
ハイブリダイゼーション反応中は、撹拌、あるいは振とうなどの操作で反応速度を高めることもできる。反応温度は１０℃〜９０℃の範囲とし、反応時間は少なくとも１分以上、好ましくは１晩程度とする。
【００５９】
熱変性に続くハイブリダイゼーション反応は、電気化学的に制御することが望ましい。容器１ａの内側面または底面に設置された電極３ａと、核酸固定化電極２との間に、電極２’の表面がプラスに電圧するよう電気回路４によって電圧を印加すると、マイナスに帯電した核酸は電極２’の表面に濃縮され反応が促進される。なお、電極２’の表面にマイナス電圧を印加すると、非特異的な結合を除去することができる。電極２にプラス電圧を印加することは、従来、数時間から数日必要であった反応時間を数分に短縮する。この場合、電圧は定速で掃引するか、あるいはパルスで印加するか、あるいは、定電圧を印加する。
【００６０】
電気回路４は、ポテンショスタット、デジタルマルチメーター、ファンクションジェネレーター等を含み、電流制御又は電圧制御により電位の印加を行う。
【００６１】
ハイブリダイゼーション反応の後、本実施形態では電極を取り出して洗浄する。
【００６２】
上述した移動制御機構は、核酸固定化電極２を容器１ｂの位置に移動させ、同容器１ｂ内の洗浄液に浸す。洗浄には、例えば、イオン強度０．０１〜５の範囲で、ｐＨ５〜１０の範囲の緩衝液が用いられる。なお、かかる洗浄プロセスは必須ではない。
【００６３】
洗浄の後、移動制御機構は、核酸固定化電極２を容器１ｃの位置に移動させ、これを同容器１ｃ内の挿入剤溶液中に浸す。洗浄プロセスに続くこの測定プロセスにおいては、電極２’表面に形成した二本鎖部分に選択的に結合する二本鎖核酸特異結合物質（挿入剤）を作用させ、電気化学的な信号の測定を行う。電気化学的な信号は、核酸固定化電極２と対極３ｃとの間に生じる酸化還元電流変化、酸化還元電位変化、電気容量変化、抵抗変化、あるいは電気化学発光変化を指標にすることが可能である。これらの信号変化は挿入剤、すなわち二本鎖核酸に特異的に結合する物質併用により効果が促進される。
【００６４】
ここで用いられる二本鎖核酸特異結合物質（挿入剤）は特に限定されるものではない。メタロインターカレーターと呼ばれるルテニウム、コバルト、鉄などの金属錯体や、ヘキスト３３２５８、アクリジンオレンジ、エチジウムブロマイド、ビスインターカレーター、トリスインターカレーター等の有機化合物、抗体、酵素などの生体高分子を用いることが可能である。また、フェロセン等の金属錯体等で標識した第二核酸プローブを用いたサンドイッチハイブリダイゼーションでの検出も可能である。
【００６５】
特に望ましくは、上述したヘキスト３３２５８、アクリジンオレンジ、キナタリン、ドウノマイシン、メタロインターカレーター、ビスアクリジン等のビスインターカレーター、トリスインターカレーター、ポリインターカレータ一等の挿入剤である。
【００６６】
挿入剤溶液の濃度は、その種類によって異なるが、一般的には１ng/m1〜１mg/mlの範囲で使用する。この際、イオン強度０．００１〜５の範囲で、ｐＨ５〜１０の範囲の緩衝液を用いる。
【００６７】
電極２’を挿入剤と反応させた後、電気化学的な測定を行う。測定では、挿入剤が電気化学的に反応する電位以上の電圧を電気回路４が電極２’に対して印加し、挿入剤に由来する反応電流値を測定する。この際、電圧は定速で掃引するか、あるいはパルスで印加するか、あるいは、定電圧を印加する。電圧は、容器１ｃの内側面または底面に設置した電極３ｃと、核酸固定化電極２の導電体の露出部分２’との間に印加する。この結果、挿入剤から得られた電流値を基に、検量線から標的遺伝子の濃度を算出することができる。
【００６８】
次に、比較例による核酸検出プロセスを説明する。
【００６９】
図３に示すように、底面に核酸固定化電極が配置された容器２００に、先ず反応溶液を分注し、上述した変性プロセス及びハイブリダイゼーション反応を行う（ステップＮ１）。変性プロセス及びハイブリダイゼーション反応自体については上述した本実施形態に係るプロセスと同様である。次に、容器２００からハイブリダイゼーション反応で用いた反応溶液を除去し、これを容器２０２に排出する（ステップＮ２）。次に、容器２０３から、反応溶液が除去された容器２００に洗浄液を分注する（ステップＮ３）。これにより容器２００の洗浄を行った後、洗浄液を容器２００から除去し、これを容器２０２に排出する（ステップＮ４）。そして、容器２０４から、洗浄液が除去された容器２００に挿入剤溶液を分注し、測定プロセスを実行する（ステップＮ５）。
【００７０】
この説明から明らかなように、比較例に係る核酸検出プロセスは、底面に核酸固定化電極を備えた容器を用いているために、溶液の分注及び排出作業を繰り返し行う必要がある。一方、本発明に係る核酸検出プロセスは、底面に対極のみを備えた容器を複数用い、核酸固定化電極２をこれら容器のそれぞれに移動させるようにしている。つまり、ハイブリダイゼーション反応を行う容器と、測定を行う容器とを別離させている。
【００７１】
このような本発明の実施形態によれば、比較例のような溶液排出作業が不要であり、核酸検出プロセスを容易化できる。これは、多数の被検物質を検査するような場合に有効である。
【００７２】
また、ハイブリダイゼーション反応を行う容器と、測定を行う容器とを別離させているので、ハイブリダイゼーションプロセス時に未反応の特異結合が測定プロセスにおいて残存し、これが不所望の電流となって測定結果にノイズを生じさせることを防止できるという利点もある。
【００７３】
（実施例１）核酸固定化電極
図５は核酸検出装置用の核酸固定化電極の一例を示した図である。核酸固定化電極３１は厚さ０．８ｍｍのガラス基板３２上にチタン（５００Å）および金（２０００Å）の薄膜をガラス基板−チタン−金の順でスパッタにより積層し、さらに前記金表面は核酸プローブ固定化部分３３（直径０．５ｍｍの円形領域）と端子部分３４を除いてレジスト３５で被覆することにより作成された。
【００７４】
核酸プローブ固定化部分３３と端子部分３４はレジスト３５の裏面側で接続される。また、チオール化核酸プローブが、核酸プローブ固定化部分３３にチオール／金の結合で固定化されている。本電極の外形は３８４穴のマイクロプレートに入るように、幅を１．５ｍｍに設定してある。また、長さは５ｃｍである。図６に、核酸固定化電極３１におけるＡ−Ａ’の断面図を示す。また、図７に、核酸固定化電極３１におけるＢ−Ｂ’の断面図を示す。
【００７５】
（実施例２）核酸固定化電極
図８は核酸検出装置用の核酸固定化電極及び参照極を一体化した電極構造体４１の一例を示した図である。前記電極構造体４２は以下のようにして作成された。まず厚さ０．８ｍｍのガラス基板４２上にチタン（５００Å）および金（２０００Å）がガラス基板一チタン−金の順でスパッタにより積層され基板の長手方向に沿って２本の線状に形成した。さらにまた前記チタンと金の積層体に対し、一方の線の前記金表面は核酸プローブ固定化部分４３（直径０．５ｍｍの円形領域）及び端子部分４４を除いてレジスト４５で被覆し、もう一方の線の前記金表面は銀／塩化銀が形成された参照極（直径０．５ｍｍの円形領域）部分４６及び端子部分４７を除いてレジスト４５で被覆して作成された。参照極部分４６は銀／塩化銀溶液中で電解を行い、金電極表面に析出させ形成した。チオール化核酸プローブは、プローブ固定化部分４３にチオール／金の結合で固定化した。本電極構造体の外形は９６穴のマイクロプレートに入るように、幅を３ｍｍに設定してある。また、長さは１０ｃｍである。
【００７６】
（実施例３）核酸固定化電極のホルダー
図９は核酸固定化電極のホルダーの一例を示す断面図である。複数の核酸固定化電極２を９６穴のマイクロタイタープレートに一度に挿入可能とするために、核酸固定化電極２を支持するホルダー６０は６ｍｍのピッチで１２×８個のアレイ状に挿入孔６０’が設けられ、前記挿入孔６０’に核酸固定化電極２が設置されている。
【００７７】
（実施例４）電極一体型マイクロタイタープレート
図１０は核酸検出用容器である電極一体型マイクロタイタープレートの一例を示す断面図である。マイクロタイタープレート７には複数の容器７’が設けられている。各容器７’底面にはカーボンフィルム電極（対極）８が貼り付けてある。容器７’に液体を注入した際は、液体は直接カーボンフィルム電極８と接触し、また容器７’内に保持される。
【００７８】
（実施例５）電極一体型マイクロタイタープレート
図１１は核酸検出用容器である電極一体型マイクロタイタープレートの一例を示した断面図である。マイクロタイタープレート７には複数の容器７’が設けられている。容器７’の底面にはカーボンフィルム電極８、銀／塩化銀が形成されたカーボンフィルム電極９が貼り付けてあるニトロセルロースフィルム１０が設置されており、液体は容器内に保持することができる。８は対極、９は参照極として用いる。液体は容器内に保持されている。使用方法に応じて吸引などによるろ過も可能になる。
【００７９】
（実施例６）電極一体型マイクロタイタープレート
図１２は核酸検出用容器である電極一体型マイクロタイタープレートの一例を示した断面図である。マイクロタイタープレート７には複数の容器７’が設けられている。容器７’底面にはそれぞれに金電極（対極）８１が形成されたニトロセルロースフィルム１０が貼り付けてある。容器７’に液体を注入した際は、液体は金電極８１と接触し、また容器７’内に保持されている。使用方法に応じて吸引などによるろ過も可能になる。
【００８０】
（実施例７）電極分離型マイクロタイタープレート
図１３は核酸検出用容器である電極分離型マイクロタイタープレートの一例を示した断面図である。マイクロタイタープレート７には複数の容器７’が設けられている。容器７’の底面には疎水性の、イオンが移動可能なフィルター１１が貼り付けられており、液体は容器内に保持することができる。その下にはカーボンフィルム電極（対極）９１を貼り付けた容器１２が設置されており、フィルター１１を介して電圧を印加する構成になっている。
【００８１】
（実施例８）電極分離型マイクロタイタープレート
図１４は核酸検出用容器である電極分離型マイクロタイタープレートの一例を示した図である。マイクロタイタープレート７には複数の容器７’が設けられている。容器７’の底面には疎水性の、イオン移動可能なフィルター１１が貼り付けられており、液体は容器内に保持することができる。その下には各容器７’に対応する形でカーボンフィルム電極（対極）１０１を取り付けた容器１２が設置されており、これらはマトリックス構造の配線で外部電源と接続されている。
【００８２】
（実施例９）電極分離型マイクロタイタープレート
図１５は核酸検出用容器である電極分離型マイクロタイタープレートの一例を示した図である。マイクロタイタープレート７には複数の容器７’が設けられている。マイクロタイタープレート７の底面には疎水性の、イオン移動可能なフィルター１１が貼り付けられており、液体は容器内に保持することができる。その下には各容器７’に対応する形でカーボンフィルム（対極）電極１１２、銀／塩化銀が形成されたカーボンフィルム電極（参照極）１１１が設置されており、これらはアクティブマトリックス構造の配線で外部電源と接続されている。
【００８３】
（実施例１０）電極分離型マイクロタイタープレートの電極配置
図１６は実施例８に記載した電極分離型マイクロタイタープレートを用いた際の各電極に対する電極配線を模式的に示した図である。カーボンフィルム電極１５（実施例８ではカーボンフィルム電極１０１と表現）はゲート線１６と、ソース線１７に接続されており、電源からの電圧はソース線１７を介して印加する構造になっている。スイッチングはゲート線のＯＮ／ＯＦＦで行う。
【００８４】
（実施例１１）電極分離型マイクロタイタープレートの電極配置
図１７は実施例９に記載した電極分離型マイクロタイタープレートを用いた際の各電極に対する電極配線を模式的に示した図である。カーボンフィルム電極１５（実施例９ではカーボンフィルム電極１１２と表現）は対極として作用する。カーボンフィルム電極１５はゲート線１６と、ソース線１７に接続されており、電源からの電圧はソース線１７を介して印加する構造になっている。スイッチングはゲート線１６につながったＴＦＴ１９でＯＮ／ＯＦＦで行う。また、銀塩化銀電極１８（実施例９では銀／塩化銀が形成されたカーボンフィルム電極１１１と表現）は参照極として作用する。銀塩化銀電極１８はゲート線２０と、ソース線１７に接続されており、電圧はソース線を介して印加する構造になっている。スイッチングはゲート線２０につながったＴＦＴ１９でＯＮ／ＯＦＦで行う。
【００８５】
（実施例１２）電極一体型マイクロタイタープレートを用いた検出装置
図１８は実施例４の電極一体型マイクロタイタープレートと実施例１の核酸固定化電極を用いた核酸検出装置である。この装置は、核酸固定化電極２と、各々分離されてなる複数の容器７’と容器７’の底面に設置された対極８とを備える９６穴のマイクロタイタープレートと、核酸固定化電極２と対極８との間に電圧を印加する手段（電源）４とを備える。核酸固定化電極２は複数備えられている（１本のみ図示）。
【００８６】
血液から抽出した遺伝子を含む被検物質はマイクロプレートの容器１の中に分注し、核酸固定化電極２を挿入する。ハイブリダイゼーション反応は各核酸固定化電極２と対極８との間に０．５Ｖの電圧を印加することで促進が可能で、約５分で反応が終了した。前記マイクロタイタープレートと同様な構成のマイクロタイタープレートを用意した。続いて、挿入剤ヘキスト３３２５８を添加した溶液を容器７’に挿入し、各容器７’に核酸固定化電極２を挿入して電圧印加時の電流測定を行った。ヘキスト３３２５８由来の電流測定は電極２と８との間に０．６Ｖ印加し、９６サンプルについて同時に遺伝子の検出が可能であった。
【００８７】
（実施例１３）電極分離型マイクロタイタープレートを用いた検出装置
図１９は実施例７の電極分離型マイクロタイタープレートと、実施例１の核酸固定化電極を用いた検出装置を示している。この装置は、核酸固定化電極２５と、各々分離されてなる複数の容器２４と前記容器２４の底面に位置するように設置された対極２６を備える容器とを備える９６穴のマイクロタイタープレートと、前記核酸固定化電極２５と前記対極２６間に電圧を印加する手段（電源）２７とを備える。核酸固定化電極２は複数備えられている（１本のみ図示）。
【００８８】
血液から抽出した遺伝子を含む被検物質は９６穴マイクロプレートの容器２４の中に分注し、核酸固定化電極２５を挿入する。ハイブリダイゼーション反応は電極２５と対極２６との間に０．５Ｖの電圧を印加することで促進が可能で、約５分で反応が終了した。前記マイクロタイタープレートと同様な構成のマイクロタイタープレートを用意した。続いて、挿入剤ヘキスト３３２５８を添加した溶液を容器７’に注入し、各容器２６に核酸固定化電極２を挿入して電圧印加時の電流測定を行った。ヘキスト３３２５８の電流測定は電極２５と対極２６との間に０．６Ｖ印加し、９６サンプルについて同時に遺伝子の検出が可能であった。
【００８９】
本発明の核酸検出装置によって検出する核酸は特に限定されるものではない。例えば、肝炎ウイルス（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ型）、ＨＩＶ、インフルエンザウイルス、ヘルペス群ウイルス、アデノウイルス、ヒトポリオーマウイルス、ヒトパピローマウイルス、ヒトパルボウイルス、ムンプスウイル素、ヒトロタウイルス、エンテロウイルス、日本脳炎ウイルス、デングウイルス、風疹ウイルス、ＨＴＬＶ、等のウイルス感染症、黄色ブドウ球菌、溶血性連鎖球菌、病原性大腸菌、腸炎ビブリオ菌、ヘリコバクターピロリ菌、カンピロバクター、コレラ菌、赤痢菌、サルモネラ菌、エルシニア、淋菌、リステリア菌、レプトスピラ、レジオネラ菌、スピロヘータ、肺炎マイコプラズマ、リケッチア、クラミジア、マラリア、赤痢アメーバ、病原真菌、等の細菌感染症、寄生虫、真菌等の検出に用いることができる。
【００９０】
また、遺伝性疾患、網膜芽細胞腫、ウイルムス腫瘍、家族性大腸ポリポーシス、遺伝性非ポリポーシス大腸癌、神経腺維腫症、家族性乳ガン、色素性乾皮症、脳腫瘍、口腔癌、食道癌、胃ガン、大腸癌、肝臓癌、膵臓癌、肺ガン、甲状腺腫瘍、乳腺腫瘍、泌尿器腫瘍、男性器腫瘍、女性器腫瘍、皮膚腫瘍、骨・軟部腫瘍、白血病、リンパ腫、固形腫瘍、等の腫瘍性疾患等を検査することが可能である。
【００９１】
また、医療以外にも、食品検査、検疫、医薬品検査、法医学、農業、畜産、漁業、林業などで遺伝子検査が必要なものに全て適応可能である。更に、制限酵素断片多系（ＲＦＬＰ）や１塩基多系（ＳＮＰｓ）、マイクロサテライト配列等の検出も可能である。また、未知の塩基配列解析に用いることも可能である。更に、ｍＲＮＡ鎖、ｃＤＮＡ鎖、ｃＲＮＡ鎖の解析に用いることも可能である。
【００９２】
尚、本発明は上述した実施形態に限定されることなく種々変形して実施可能である。
【００９３】
【発明の効果】
以上説明したように、本発明によれば多サンプルもしくは多種核酸を扱った多種の核酸検出を容易にかつ簡易な設備で高精度に行う際に有用な核酸検出方法及び装置並びに核酸検出用容器を提供できる。ひいては、テイラーメイド医療などで期待されている遺伝子検査などを精度良く、かつ効率的に行うことができるようになる。
【図面の簡単な説明】
【図１】 本発明の一実施形態に係る核酸検出装置の概略構成を示すブロック図
【図２】 核酸固定化電極のホルダーの一例を示す図
【図３】 本発明に係る核酸検出プロセスおよびその比較例を示す図
【図４】 核酸固定化電極の移動制御機構の構成例を示す図
【図５】 実施例１に係る核酸固定化電極の一例を示す図
【図６】 図５に示した核酸固定化電極におけるＡ−Ａ’の断面図
【図７】 図５に示した核酸固定化電極におけるＢ−Ｂ’の断面図
【図８】 実施例２に係り、対極及び参照極を含む核酸固定化電極構造体の一例を示す図
【図９】 実施例３に係る核酸固定化電極のホルダーの一例を示す図
【図１０】 実施例４に係る電極一体型マイクロタイタープレートの一例を示す図、
【図１１】 実施例５に係る電極一体型マイクロタイタープレートの一例を示す図、
【図１２】 実施例６に係る電極一体型マイクロタイタープレートの一例を示す図、
【図１３】 実施例７に係る電極分離型マイクロタイタープレートの一例を示す図、
【図１４】 実施例８に係る電極分離型マイクロタイタープレートの一例を示す図、
【図１５】 実施例９に係る電極分離型マイクロタイタープレートの一例を示す図
【図１６】 実施例１０に係る電極分離型マイクロタイタープレートの電極配置の一例を示す図
【図１７】 実施例１１に係る電極分離型マイクロタイタープレートの電極配置の一例を示す図
【図１８】 実施例１２に係る電極一体型マイクロタイタープレートを用いた核酸検出装置の一例を示す図
【図１９】 実施例１３に係る電極分離型マイクロタイタープレートを用いた核酸検出装置の一例を示す図
【図２０】 従来のＤＮＡアレイを示す斜視図
【図２１】 従来の遺伝子検出方法を示す概念図
【符号の説明】
１…容器
２…核酸固定化電極
３…対極
４…電気回路
Claims (9)
- 被検物質中における特定配列を有する核酸の存在を電気化学的に検出する核酸検出方法であって、
複数の第１の容器を準備し、底面又は内側面に対極を備えると共に挿入剤溶液が注入された第２の容器を準備する工程と、
複数の異なる被検物質を前記複数の第１の容器に注入する工程と、
各々が複数の導電体部と、該複数の導電体部上に固定化され、種類の異なる複数の核酸プローブとを有する複数の核酸固定化電極を前記複数の第１の容器内に挿入する工程と、
前記複数の第１の容器内にてハイブリダイゼーション反応を行わせる工程と、
前記複数の核酸固定化電極を前記複数の第１の容器から抜出して前記第２の容器内に挿入する工程と、
前記複数の核酸固定化電極と前記対極との間に所定の電圧を印加し、前記挿入剤溶液の電気化学的信号を測定する工程と、を具備する核酸検出方法。 - 前記複数の第１の容器及び前記第２の容器がマイクロタイタープレートに形成される請求項１に記載の核酸検出方法。
- 前記複数の第１の容器及び前記第２の容器に共通して一つの対極が設けられる請求項１に記載の核酸検出方法。
- 前記複数の第１の容器及び前記第２の容器の各々の底面又は内側面に対極が設けられる請求項１に記載の核酸検出方法。
- 前記複数の第１の容器又は前記第２の容器の少なくとも一方が、さらに参照極を有する請求項１乃至４のいずれかに記載の核酸検出方法。
- 前記参照極は、前記第１又は第２の容器の少なくとも一方の内側面又は底面に設けられる請求項５に記載の核酸検出方法。
- 被検物質中における特定配列を有する核酸の存在を電気化学的に検出する方法であって、
複数の第１の容器を準備し、底面又は内側面に対極を備えると共に挿入剤溶液が注入された第２の容器を準備する工程と、
複数の異なる被検物質を前記複数の第１の容器に注入する工程と、
各々が複数の導電体部と、該複数の導電体部上に固定化され、種類の異なる複数の核酸プローブとを有する複数の核酸固定化電極を前記複数の第１の容器内に挿入する工程と、
前記複数の第１の容器内にてハイブリダイゼーション反応を行わせる工程と、
前記複数の核酸固定化電極を前記複数の第１の容器から抜出して洗浄用の容器内に挿入する工程と、
前記洗浄用容器内にて前記核酸固定化電極を洗浄する工程と、
前記複数の核酸固定化電極を前記洗浄用容器から抜出して前記第２の容器内に挿入する工程と、
前記複数の核酸固定化電極と前記対極との間に所定の電圧を印加し、前記挿入剤溶液の電気化学的信号を測定する工程と、を具備する核酸検出方法。 - 被検物質中における特定配列を有する核酸の存在を電気化学的に検出する核酸検出装置であって、
各々が複数の導電体部と、該複数の導電体部上に固定化され、種類の異なる複数の核酸プローブとを有する複数の核酸固定化電極と、
前記核酸プローブと前記被検物質とを接触させるための複数の容器と、
前記容器の底面あるいは内側面に設置された対極と、
前記複数の核酸固定化電極と前記対極との間に電圧を印加する電気回路と、を具備し、前記複数の核酸固定化電極は前記複数の容器に挿入されるスティック形状を有する核酸検出装置。 - 請求項８に記載の核酸検出装置に用いられる核酸検出用容器であって、複数の容器と、前記容器の底面又は内側面に形成され、対極として用いられる複数の電極と、を具備する核酸検出用容器。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2001367484A JP3677237B2 (ja) | 2000-11-30 | 2001-11-30 | 核酸検出方法及び装置並びに核酸検出用容器 |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2000-364614 | 2000-11-30 | ||
| JP2000364614 | 2000-11-30 | ||
| JP2001367484A JP3677237B2 (ja) | 2000-11-30 | 2001-11-30 | 核酸検出方法及び装置並びに核酸検出用容器 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2002223755A JP2002223755A (ja) | 2002-08-13 |
| JP3677237B2 true JP3677237B2 (ja) | 2005-07-27 |
Family
ID=26604930
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2001367484A Expired - Fee Related JP3677237B2 (ja) | 2000-11-30 | 2001-11-30 | 核酸検出方法及び装置並びに核酸検出用容器 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3677237B2 (ja) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP5540980B2 (ja) * | 2010-08-06 | 2014-07-02 | 東洋製罐グループホールディングス株式会社 | 生体関連分子の検出方法、検出用キット、及び検出システム |
| JP7333928B2 (ja) * | 2018-10-05 | 2023-08-28 | 国立大学法人山形大学 | 電気化学式非標識核酸検出の測定方法 |
-
2001
- 2001-11-30 JP JP2001367484A patent/JP3677237B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2002223755A (ja) | 2002-08-13 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US6670131B2 (en) | Nucleic acid detection method and apparatus, and vessel for detecting nucleic acid | |
| US6489160B2 (en) | Method for producing nucleic acid strand immobilized carrier | |
| US6818109B2 (en) | Nucleic acid detections sensor | |
| US7659068B1 (en) | Carrier for gene detection and its use for detecting validity of interferon therapy | |
| JP4398953B2 (ja) | 核酸検出用センサ | |
| JP2002522748A (ja) | サンプル中の標的の検出 | |
| JP2002195997A (ja) | 核酸検出用センサ | |
| JPH10146183A (ja) | 電極、検出装置およびセンサ | |
| JP2003090815A (ja) | 遺伝子の電気化学的検出方法と核酸チップ | |
| JP4143046B2 (ja) | 核酸検出基板および該装置を使用する核酸検出方法 | |
| JP4427525B2 (ja) | 核酸検出用センサ | |
| JP3677237B2 (ja) | 核酸検出方法及び装置並びに核酸検出用容器 | |
| JP4261077B2 (ja) | 核酸鎖固定化担体の製造方法 | |
| JP3482140B2 (ja) | 核酸鎖合成方法、核酸固定化チップおよび核酸鎖検出方法 | |
| JP4309942B2 (ja) | 電極および検出装置 | |
| US8410027B2 (en) | Density modification in arrays of surface-attached nucleic acid molecules | |
| JP3848226B2 (ja) | 生体物質検出装置及び生体物質検出素子 | |
| JP3842600B2 (ja) | 荷電物質移動装置 | |
| SOSNOWSKI et al. | MICHAEL J. HELLER, EUGENE TU, ANITA HOLMSEN |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20040907 |
|
| A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20041108 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20050201 |
|
| A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20050404 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20050426 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20050506 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20090513 Year of fee payment: 4 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20090513 Year of fee payment: 4 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20100513 Year of fee payment: 5 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20110513 Year of fee payment: 6 |
|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |