JP3627015B2 - ポリアミノ酸 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、側鎖にフェノール類を有する高分子量ポリアミノ酸及びその製造方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
チロシンや３，４−ジヒドロキシフェニルアラニン（ドーパ）はフェノール基を有するアミノ酸であり、これらを含むタンパク質が多く知られている。生体内では酸化還元酵素により、タンパク質のチロシン間の酸化カップリングが生じ、生体機能維持に重要な役割を果たす。また、貝の産出するタンパクの接着や昆虫の外皮形成は、チロシナーゼ触媒によるタンパク質に含まれるドーパの酸化反応が重要な関与をしている。このような自然界の優れた機能を模倣する材料開発は、より精密な機能制御や未来型新材料設計に必要である。
【０００３】
近年、天然タンパク質をペルオキシダーゼ酵素を用いて硬化させることにより、タンパク質の物性を改良する研究が報告されている。（例えば、Ｊ．ＦｏｏｄＳｃｉ．，５９，１３３２（１９９４）やＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．，６３，４４９（１９９９））。これらは高分子量タンパク質の分子間架橋を検討したものであり、不溶性の架橋系高分子材料が合成されていることが特徴である。
【０００４】
一方、高分子量ポリアミノ酸を合成する方法として、アミノ酸Ｎ−カルボキシ無水物の開環重合が知られている。
【０００５】
【課題を解決するための課題】
しかしながら、上記タンパク質の物性を改良する研究は、より広範な用途、特に生医学用途への応用に必要な溶解性、加工性において問題があった。また、自然界でのタンパク質のチロシン間架橋は非常に低い濃度での反応であり、物質生産に適したものでなく、ドーパの酸化反応は不溶性構造骨格を生じるものであることから、可溶性タンパク質は合成されないという問題もある。
【０００６】
また、上記高分子ポリアミノ酸を合成する方法は、モノマー合成に極めて毒性の高いホスゲンまたはその誘導体の使用が必須であることから、一般性が欠如している。また、単独重合では多くの場合に不溶性ポリマーしか得られない。
【０００７】
また、いずれの方法においても実用的な可溶性タンパク質は得られていない。したがって、実用的な可溶性タンパク質、及びそのような可溶性タンパク質を一般性、汎用性が高く、効率的に得る方法が望まれていた。
【０００８】
本発明は、可溶性の高分子量ポリアミノ酸を提供することを目的とする。さらに可溶性の高分子量ポリアミノ酸の製造方法を提供することを目的とする。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、生体機構に着目し、生体内の酸化反応が重要な役割を有していることから、酸化触媒について鋭意検討した結果、可溶性の高分子量ポリアミノ酸及びその製造方法を見出し、本発明を完成するに至った。
【００１０】
即ち、本発明は、下記式［化６］で表されるＡ又はＢのいずれかのユニットを少なくとも１つ含むペプチド同士が、少なくとも一部のフェノール部位で酸化カップリングしていることを特徴とする。
【化６】
（但し、式中、Ａ及びＢユニットは、フェノール性基を含むユニットを示す。Ａ及びＢユニットに関し、Ｒはメチレンあるいはエチレン基を示し、ｍは０〜５の整数、フェノール性水酸基はベンゼン環のオルト位、メタ位、あるいはパラ位に結合し、ｎは １〜４の整数を示す。）
【００１１】
本発明のポリアミノ酸の好適な実施態様において、前記酸化カップリングが、下記式
【化７】
又は、
【化８】
で表されることを特徴とする。
【００１２】
本発明のポリアミノ酸の好適な実施態様において、重合度が３〜３００であることを特徴とする。
【００１３】
本発明のポリアミノ酸の好適な実施態様において、数平均分子量が５，０００〜１０，０００，０００の範囲であることを特徴とする。
【００１４】
本発明のポリアミノ酸の製造方法は、一般式、
【化９】
（但し、式中、Ａ及びＢユニットは、フェノール性基を含むユニットを示す。Ａ及びＢユニットに関し、Ｒはメチレンあるいはエチレン基を示し、ｍは０〜５の整数、フェノール性水酸基はベンゼン環のオルト位、メタ位、あるいはパラ位に結合し、ｎは １〜４の整数を示す。）で表されるＡ又はＢのいずれかのユニットを少なくとも１つ含むオリゴアミノ酸を酸化触媒を用いて酸化カップリングすることを特徴とする。
【００１５】
本発明のポリアミノ酸の製造方法の好適な実施態様において、酸化触媒が酸化還元酵素または遷移金属錯体であることを特徴とする。
【００１６】
本発明のポリアミノ酸の製造方法の好適な実施態様において、酸化還元酵素がペルオキシダーゼまたはオキシダーゼであること特徴とする。
【００１７】
本発明のポリアミノ酸の製造方法の好適な実施態様において、遷移金属錯体が、
一般式
【化１０】
（式中、Ｍは遷移金属原子を含む残基を示す。Ｒ１、Ｒ６はそれぞれ独立に水素原子、炭化水素基、置換炭化水素基、Ｏ−、炭化水素オキシ基、置換炭化水素オキシ基、アミノ基または置換アミノ基を表し、Ｒ２、Ｒ５はそれぞれ独立に水素原子、炭化水素基、置換炭化水素基、炭化水素オキシ基、置換炭化水素オキシ基、炭化水素オキシカルボニル基、置換炭化水素オキシカルボニル基、シアノ基、ニトロ基またはハロゲン基を表し、Ｒ３、Ｒ４はそれぞれ独立に水素原子、炭化水素基、置換炭化水素基またはＯ−を表す。Ｒ７は二価の炭化水素基または置換炭化水素基を表す。Ｒ１とＲ２とがおよび／またはＲ５とＲ６とが環を形成してもよい）で表されることを特徴とする。
【００１８】
本発明のポリアミノ酸の製造方法の好適な実施態様において、さらに、助触媒としてアミンを用いることを特徴とする。
【００１９】
【発明の実施の形態】
まず、本発明に関わるオリゴアミノ酸を出発物質とする可溶性ポリアミノ酸の製造方法を説明する。
【００２０】
本発明の製造方法において、下記の一般式［化１１］で表されるＡ又はＢのいずれかのユニットを少なくとも１つ含む、アミノ酸、オリゴアミノ酸、又はポリアミノ酸を用いることができる。以下では、オリゴアミノ酸を例に説明するがこれに限定される意図ではない。
【００２１】
【化１１】
（但し、式中、Ａ及びＢユニットは、フェノール性基を含むユニットを示す。Ａ及びＢユニットに関し、Ｒはメチレンあるいはエチレン基を示し、ｍは０〜５の整数、フェノール性水酸基はベンゼン環のオルト位、メタ位、あるいはパラ位に結合し、ｎは １〜４の整数を示す。）［化１１］で表される。
【００２２】
このオリゴアミノ酸は、主鎖に不斉炭素を含む場合が多いが、本発明では光学活性体を用いても良いし、ラセミ体を用いてもよい。
【００２３】
［化１１］中、Ａ又はＢユニットの水酸基の結合位置及びその数に特に制限はないが、フェノール部位として例えば４−ヒドロキシフェニル、３−ヒドロキシフェニル、２−ヒドロキシフェニル、３，４−ジヒドロキシフェニル等を示すことができる。
【００２４】
たとえば、上記［化１１］Ａユニットの具体例として、Ｎ−（２−（４−ヒドロキシフェニル）エチル）−Ｌ−グルタミン、Ｎ−（２−（４−ヒドロキシフェニル）エチル）−Ｌ−アスパラギン、Ｎ−（２−（３−ヒドロキシフェニル）エチル）−Ｌ−グルタミン、Ｎ−（２−（３，４−ジヒドロキシフェニル）エチル）−Ｌ−グルタミン、Ｎ−（２−（４−ヒドロキシフェニル）エチル）−Ｌ−グルタミン、Ｎ−（２−（３−ヒドロキシフェニル）エチル）−Ｌ−グルタミン、Ｎ−（２−（４−ヒドロキシフェニル）エチル）−Ｌ−アスパラギン、Ｎ−（２−（４−ヒドロキシフェニル）エチル）−Ｄ−グルタミン、Ｎ−（２−（４−ヒドロキシフェニル）エチル）−Ｄ−アスパラギン、Ｎ−（２−（３−ヒドロキシフェニル）エチル）−Ｄ−グルタミン等のペプチドユニットが挙げられる。効率的に反応を進行させるためのスペーサー導入という観点から、Ａユニットとしては、Ｎ−（２−（４−ヒドロキシフェニル）エチル）−Ｌ−グルタミン、Ｎ−（２−（３−ヒドロキシフェニル）エチル）−Ｌ−グルタミン、Ｎ−（２−（４−ヒドロキシフェニル）エチル）−Ｌ−アスパラギン等が好ましい。
【００２５】
［化１１］Ａ又はＢユニットのいずれか１つを含むポリアミノ酸は、特に制限はなく、Ａ又はＢユニット以外にフェノール性基を含んでいてもよい。ポリアミノ酸を構成するアミノ酸は限定されず、たとえば、Ｌ−アラニン、Ｌ−バリン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−プロリン、グリシン、Ｌ−セリン、Ｌ−トレオニン、Ｌ−システイン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−グルタミン、Ｌ−リシン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−グルタミン酸−γ−エチルエステル、Ｌ−グルタミン酸−γ−メチルエステル、Ｌ−グルタミン酸−γ−フェニルエステル、Ｌ−グルタミン酸−γ−ベンジルエステル、Ｌ−アスパラギン酸−β−エチルエステル、Ｌ−アスパラギン酸−β−メチルエステル、Ｌ−アスパラギン酸−β−フェニルエステル、Ｌ−アスパラギン酸−β−ベンジルエステル、Ｄ−アスパラギン酸、Ｄ−グルタミン酸、Ｄ−グルタミン酸−γ−エチルエステル、Ｄ−グルタミン酸−γ−メチルエステル、Ｄ−アスパラギン酸−β−エチルエステル、Ｄ−アスパラギン酸−β−メチルエステル、Ｄ−アスパラギン酸−β−フェニルエステル、Ｄ−アスパラギン酸−β−ベンジルエステル等のペプチドが挙げられる。溶解性付与という観点から、ペプチドとしては、Ｌ−グルタミン酸−γ−エチルエステル、Ｌ−グルタミン酸−γ−ベンジルエステル、Ｌ−アスパラギン酸−β−エチルエステル等が好ましい。
【００２６】
上記［化１１］の重合度は３〜３００の間であれば、特に制限はない。重合度の範囲をこのようにしたのは、ゲル化を伴わないで高分子量の可溶性ポリマーを得るという理由からである。
【００２７】
上記［化１１］のＡ又はＢユニットをいずれか含むポリアミノ酸中において、フェノール基を含むユニットの割合に特に制限はない。好ましくは５〜１００モル％、特に好ましくは１０〜１００モル％である。
【００２８】
本発明で用いられる酸化還元酵素は、フェノール基を酸化できるものであればよく、従来既知なもの、例えばペルオキシダーゼやオキシダーゼを含む。本発明で使用されるペルオキシダーゼは種々の起源のものが使用でき、特に制限はない。ペルオキシダーゼとしては、例えば植物由来、細菌由来、坦子菌類由来のペルオキシダーゼを挙げることができる。これらの中で、西洋ワサビペルオキシダーゼは酸化能が高く、しかも量産されて安価であり、好ましく使用することができる。
【００２９】
本発明で使用できるオキシダーゼとしてラッカーゼを挙げることができる。ラッカーゼは種々の起源のものが使用でき、特に制限はないが、例えば植物由来、細菌由来、坦子菌類由来のラッカーゼを挙げることができる。これらの例としては、漆の木から得られるラッカーゼ、Ｐｙｒｉｃｕｌａｒｉａ、Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ、Ｐｙｃｎｏｐｏｒｕｓ、Ｐｏｌｙｓｔｉｃｔｕｓ、Ｍｙｃｅｌｏｐｔｈｏｒａ、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ属の微生物ラッカーゼを挙げることができる。特にＰｙｃｎｏｐｏｒｕｓ、Ｍｙｃｅｌｏｐｔｈｏｒａ属のラッカーゼを好ましく使用できる。なお使用する酵素の状態は、精製・未精製を問わない。酵素量はオリゴアミノ酸１ｇに対して０．００１ｍｇ〜１０ｇ、好ましくは０．００５ｍｇ〜５ｇ、さらに好ましくは０．０１ｍｇ〜３ｇである。
【００３０】
また、本発明で用いる遷移金属錯体は好ましくは下記［化１２］で表されるものである。
【化１２】
（式中、Ｍは遷移金属原子を含む残基を示す。Ｒ１、Ｒ６はそれぞれ独立に水素原子、炭化水素基、置換炭化水素基、Ｏ−、炭化水素オキシ基、置換炭化水素オキシ基、アミノ基または置換アミノ基を表し、Ｒ２、Ｒ５はそれぞれ独立に水素原子、炭化水素基、置換炭化水素基、炭化水素オキシ基、置換炭化水素オキシ基、炭化水素オキシカルボニル基、置換炭化水素オキシカルボニル基、シアノ基、ニトロ基またはハロゲン基を表し、Ｒ３、Ｒ４はそれぞれ独立に水素原子、炭化水素基、置換炭化水素基またはＯ−を表す。Ｒ７は二価の炭化水素基または置換炭化水素基を表す。Ｒ１とＲ２とがおよび／またはＲ５とＲ６とが環を形成してもよい）
【００３１】
上記［化１２］における置換炭化水素オキシ基は、ハロゲン原子、アルコキシ基、アミノ基等で置換された炭化水素オキシ基であり、具体例としては、トリフルオロメトキシ基、２−ｔ−ブチルオキシエトキシ基、３−ジフェニルアミノプロポキシ基等が挙げられる。なお、ハロゲン原子として好ましくは、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子であり、さらに好ましくは塩素原子、臭素原子である。
【００３２】
上記［化１２］における置換アミノ基としては、炭素原子数１〜２０の置換アミノ基が好ましく、具体的には、メチルアミノ基、エチルアミノ基、プロピルアミノ基、ブチルアミノ基、フェニルアミノ基、ジメチルアミノ基、ジエチルアミノ基、ジプロピルアミノ基、メチルエチルアミノ基、ジフェニルアミノ基等が挙げられる。
【００３３】
上記［化１２］における炭化水素オキシカルボニル基としては、炭素数１〜２０の炭化水素オキシカルボニル基が好ましく、具体的には、メトキシカルボニル基、エトキシカルボニル基、プロピキシカルボニル基、ｔ−ブチルオキシカルボニル基、フェノキシカルボニル基等が挙げられる。
【００３４】
上記［化１２］における置換炭化水素オキシカルボニル基は、ハロゲン原子、アルコキシ基、アミノ基等で置換された炭化水素オキシカルボニル基であり、具体例としては、トリフルオロメトキシカルボニル基、２−ｔ−ブチルオキシエトキシカルボニル基、３−ジフェニルアミノプロポキシカルボニル基等が挙げられる。なお、ハロゲン原子として好ましくは、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子であり、さらに好ましくは塩素原子、臭素原子である。
【００３５】
上記［化１２］の二価の炭化水素基または置換炭化水素基として、具体例としては、メチレン基、１，２−エチレン基、１，３−プロピレン基、１，４−ブチレン基等のアルキレン基、１，２−シクロペンチレン基、１，２−シクロヘキシレン基等のシクロアルキレン基、フェニレン基、ナフチレン基等のアリーレン基等を挙げることができ、好ましくは、メチレン基、エチレン基、１，３−プロピレン基、１，２−シクロヘキシレン基である。
【００３６】
上記［化１２］で表される遷移金属錯体における具体例四座配位子として、Ｎ，Ｎ’−ジサリシリデンエチレンジアミン、Ｎ−（３−オキソペンチリデン）−Ｎ’−サリシリデンエチレンジアミン、Ｎ，Ｎ’−ビス（３−オキソブチリデン）―１，２−フェニルエチレンジアミン、Ｎ，Ｎ’−ビス（３−オキソブチリデン）―１，３−プロパンジアミン、Ｎ，Ｎ’−ビス（１−メチル−３−オキソブチリデン）エチレンジアミン、Ｎ，Ｎ’−ビス（３−オキソペンチリデン）エチレンジアミン、Ｎ，Ｎ’−ビス（３−オキソヘキシリデン）エチレンジアミン、Ｎ，Ｎ’−ビス（４−トリフルオロメチル−３−オキソブチリデン）エチレンジアミン、Ｎ，Ｎ’−ビス（２−シアノ−３−オキソブチリデン）エチレンジアミン、Ｎ，Ｎ’−ビス（２−ニトロ−３−オキソブチリデン）エチレンジアミン、Ｎ，Ｎ’−（１，２−エチレン）−ビス（マロン酸モノメチルモノアミド）等、あるいはそれらからプロトンを一つまたはそれ以上取り去って得られる陰イオンを挙げることができる。
【００３７】
本発明に用いる遷移金属錯体については、配位子と遷移金属錯体以外の構造は、触媒能を失活させないならば特に限定されるものではない。例えば、配位子としてＮ，Ｎ’−ジサリシリデンエチレンジアミン（以下サレンと表記することがある）を、遷移金属として鉄を用いた、Ｎ，Ｎ’−ジサリシリデンエチレンジアミナト鉄（ＩＩ）（以下、Ｆｅ−サレンと表記することがある）遷移金属錯体は、酸素下において容易に酸素架橋体であるμ−オキソ−ビス（Ｎ，Ｎ’−ジサリシリデエチレンジアミナト鉄（ＩＩＩ））を形成することが知られているが、このものを用いても何ら問題はない。
【００３８】
本発明に用いる遷移金属錯体には、電気的に中性を保たせるようなカウンターイオンが必要な場合がある。カウンターアニオンとしては、通常ブレンステッド酸の共役塩基が使用され、具体例としては、フッ化物イオン、塩化物イオン、臭化物イオン、ヨウ素イオン、硫酸イオン、炭酸イオン、過塩素酸イオン、メタンスルホン酸イオン、酢酸イオン等が挙げられる。また、カウンターカチオンとしては、アルカリ金属やアルカリ土類金属等のカチオンを適宜用いることができる。また、本発明の遷移金属錯体には、錯体の原料、合成過程および／または酸化カップリング過程で、溶媒などが配位しても良い。
【００３９】
本発明において遷移金属錯体の添加量は、用いる触媒の酸化カップリング活性により適宜加減すればよいが、触媒量はオリゴアミノ酸１ｇに対して０．００１ｍｇ〜１０ｇ、好ましくは０．００５ｍｇ〜５ｇ、さらに好ましくは０．０１ｍｇ〜３ｇである。
【００４０】
本発明に用いる遷移金属錯体の活性を高めるために、助触媒としてアミンを用いても良い。用いるアミン種としては、遷移金属錯体の活性に影響を及ぼさないものであれば特に制限はなく、公知のものが使用できる。具体的には、ピリジン、トリエチルアミン、２，６−ルチジン等の第三級アミンを用いることができ、反応収率の向上という観点から、アミノ酸オリゴマー１ｇに対して０．０１ｍｇ〜１ｇの範囲で用いることが好ましい。
【００４１】
本発明において、酸化剤は任意のものが使用できるが、好ましくはペルオキシドまたは酸素が使用できる。ペルオキシドの例としては、過酸化水素、ｔ−ブチルハイドロペルオキシド、ジ−ｔ−ブチルペルオキシド、クメンハイドロペルオキシド、過酢酸、過安息香酸等を示すことができる。触媒にペルオキシダーゼまたはＦｅ−サレンを用いる場合には、特に過酸化水素が好ましい。ペルオキシドを用いる場合には、オリゴアミノ酸に含まれるフェノール基に対して、通常０．５当量以上５当量以下を使用するが、当量以上３当量以下を使用するのが好ましい。触媒にラッカーゼを用いる場合には、特に酸素が望ましく、この場合の酸素としては、純酸素のほか、空気あるいは酸素と不活性ガスの混合物の形で用いることができる。これらは、反応混合物中に吹き込んでも良いが、単に重合雰囲気中に存在させるだけでも良い。
【００４２】
重合に用いる溶媒としては、オリゴアミノ酸と触媒が共に溶解するものが好ましい。遷移金属錯体を触媒に用いる場合は、オリゴアミノ酸と遷移金属錯体に対して不活性でかつ反応温度において液体であれば、特に限定されるものではない。溶媒例を示すと、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、メタノール、エタノール、２，２，２−トリフルオロエタノール、ジメチルスルホキシド、Ｎ−メチルピロリドン、ニトロメタン、ニトロベンゼン、アセトン、テトラヒドロフラン、ピリジン等が挙げられる。これらは単独あるいは混合物として使用される。
【００４３】
酵素を触媒に用いる場合は、有機溶媒と水の混合溶媒が好ましく、有機溶媒として水と相溶する溶媒がより好ましい。水と相溶する有機溶媒として、メタノール、エタノール、２，２，２−トリフルオロエタノール、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、ジメチルスルホキシド、Ｎ−メチルピロリドン、ニトロメタン、ニトロベンゼン、ピリジン、１，４−ジオキサン、アセトン、メチルエチルケトン等が挙げられる。これらは単独あるいは混合物として使用される。
【００４４】
水は蒸留水や脱イオン水でもよいが、水の代わりに緩衝液を用いてもよい。緩衝液を用いる場合はｐＨ２〜１２の範囲が望ましい。緩衝液の種類としては、酢酸緩衝液、リン酸緩衝液、炭酸緩衝液等が望ましいが、これらに限定されるものではない。また、有機溶媒−水の混合比はオリゴアミノ酸と酵素が溶解する場合には任意の量を用いることができる。好ましくは５：９５〜９５：５、特に好ましくは２０：８０〜８０：２０の範囲である。
【００４５】
上記溶媒または混合溶媒は、反応中にゲル化が起こらない任意の量を用いることができる。ゲル化が起こらない条件は用いるアミノ酸オリゴマーによって異なるが、アミノ酸オリゴマー濃度が０．５〜２００ｇ／Ｌがより好ましい。
【００４６】
本発明のポリアミノ酸の製造方法において、上記［化１１］に示すオリゴアミノ酸を酸化触媒を用いて酸化カップリングさせる場合の反応温度は、触媒が不活性化しない温度が望ましい。好ましくは０〜１００℃の範囲であり、より好ましくは１０〜６０℃の範囲である。反応温度が高い場合は、一般に酵素は失活するが、溶媒系によっては酵素を安定化するので、その場合は高い反応温度も採用可能となる。
【００４７】
本発明において、アミノ酸オリゴマーと酸化触媒との反応には多くの異なる方法を利用することができる。例えば、アミノ酸オリゴマー、酸化触媒の溶液を個々に調製した後に同一容器中に注入してもよいし、アミノ酸オリゴマーの溶液に触媒を添加してもよい。この他にも種々の組合せが可能であるが、触媒が失活（不活性化）するような方法でない限り、各種の方法を採用できる。
【００４８】
本発明によって得られる可溶性ポリアミノ酸の数平均分子量は５，０００〜１０，０００，０００の範囲であるが、好ましくは８，０００〜５，０００，０００、より好ましくは１０，０００〜３，０００，０００の範囲である。
【００４９】
本発明において得られるポリアミノ酸はＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、ジメチルスルホキシド等の極性溶媒に可溶である。そのため、該ポリマーを生分解性材料、生体適合性材料、ドラッグキャリヤー、抗菌材料、酸化防止剤として使用する場合、成形加工を容易に行うことが可能であり、オリゴアミノ酸の使用では得られない様々な効果を期待することができる。例えば、オリゴアミノ酸では困難な薄膜形成能は生分解性材料や生体適合性材料に必須の物性である。
【００５０】
また、本発明のポリアミノ酸は、下記式［化１３］で表されるＡ又はＢのいずれかのユニットを少なくとも１つ含むポリアミノ酸同士が、少なくとも一部のフェノール部位で酸化カップリングしている。
【化１３】
（但し、［化１］中、Ａ及びＢユニットは、フェノール性基を含むユニットを示す。Ａ及びＢユニットに関し、Ｒはメチレンあるいはエチレン基を示し、ｍは０〜５の整数、フェノール性水酸基はベンゼン環のオルト位、メタ位、あるいはパラ位に結合し、ｎは １〜４の整数を示す。）
【００５１】
上記ユニットを含むものであれば、ペプチドとしては特に限定される事はない。
ペプチドとしては、たとえば、上述のポリアミノ酸の製造方法において説明したようなペプチドを用いる事ができる。
【００５２】
また、少なくとも一部のフェノール部位でペプチド同士が結合していれば良く、ペプチドの側鎖に存在するフェノール部位の全てが結合している必要はない。本発明のポリアミノ酸の好適な実施態様において、前記酸化カップリングが、下記式
【化１４】
又は、
【化１５】
で表されるが、これに限定されない。
【００５３】
また、ポリアミノ酸の重合度は３〜３００であることが好ましい。これは、ゲル化を伴わないで高分子量の可溶性ポリマーを得るという理由からである。さらにポリアミノ酸の数平均分子量は５，０００〜１０，０００，０００の範囲であることが好ましい。これは、高分子材料としての用途開発に望ましい加工性付与という理由からである。
【００５４】
【実施例】
ここで、本発明の一実施例を説明するが、本発明は、下記の実施例に限定して解釈されるものではない。また、本発明の要旨を逸脱することなく、適宜変更することが可能であることは言うまでもない。
【００５５】
実施例１
５０ミリリットルナスフラスコに、５０ミリグラムのオリゴ（Ｎ−（２−（４−ヒドロキシフェニル）エチル）−Ｌ−グルタミン）（分子量１，２００）と３．２ミリグラムのＦｅ−サレンを取り、２．５ミリリットルのＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドを加えて室温で攪拌し、溶解させた。１０マイクロリットルのピリジンを加え、３０％過酸化水素５．７マイクロリットルを１５分毎に４回加えた。３時間後、反応液のＧＰＣ測定を行ったところ、オリゴアミノ酸が７７％転化し、分子量３３万のポリアミノ酸が生成した。また、ＮＭＲ、ＩＲ分析により、フェノール部位が反応したことが推測された。ＮＭＲの結果を図１及び下記に示す。
１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６， ｐｐｍ） １．２ （ｂｒ， ＣＨ ３ＣＨ２）， １．９ （ｂｒ， ＣＨＣＨ ２ＣＨ２）， ２．３ （ｂｒ， Ｃ（＝Ｏ）ＣＨ２）， ２．５ （ｂｒ， ＡｒＣＨ２）， ３．２ （ｂｒ， ＮＨＣＨ ２）， ４．０ （ｂｒ， ＯＣＨ２）， ４．３ （ｂｒ， ＮＨＣＨ）， ６．７ （ｄ， Ａｒ）， ７．０ （ｄ， Ａｒ）， ８．０ （ｂｒ， ＮＨ）， ９．３ （ｂｒ， ＡｒＯＨ）
ＩＲ （ＫＢｒ， ｃｍ−１） ３３００ （ｂｒ， Ｏ−Ｈ， Ｎ−Ｈの伸縮振動）， １７３０ （ｓ， エステル基カルボニルの伸縮振動）、１６３０ （ｓ， アミド基カルボニルの伸縮振動）
【００５６】
比較例１
実施例１の操作において、Ｆｅ−サレンを使用しないで反応を行ったところ、オリゴアミノ酸が未反応で回収された。
【００５７】
実施例２
実施例２は、実施例１の操作において、オリゴアミノ酸の構造、Ｆｅ−サレンとＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドの使用量を変えて実験を行った。
フェノール基の導入率を変化させたペプチドを合成した。ペプチドの合成は、Ｇｌｕ γ−Ｅｔオリゴぺプチドとチラミンとを反応させて行なった。具体的に、溶媒としてＤＭＳＯを用いて、１００℃で２４時間、Ｇｌｕ γ−Ｅｔオリゴぺプチドとチラミンとを反応させた。使用したフェノール部位を有するペプチドは、以下式［化１６］の通りである。
【００５８】
【化１６】
【００５９】
本実施例においては、カップリング反応出発物質として３種類のペプチドを合成した。すなわち、式中、Ａ、Ｂの比率を変化させたペプチドを用いた。具体的には、ペプチド１ａは、Ａ：Ｂ ＝ ８０：２０であり、ペプチド１ｂは、Ａ：Ｂ＝５０：５０であり、ペプチド１ｃは、Ａ：Ｂは、２０：８０である。
【００６０】
ペプチド１ａを酸化カップリングした場合の結果を表１に示す。
【００６１】
【表１】
【００６２】
それぞれ、触媒と酸化剤として、Ｆｅサレン錯体と過酸化水素（０．２ｍｍｏｌ）を用いて、ピリジン（１０μＬ）存在下、溶媒ＤＭＦ中、室温で３時間大気圧下で、オリゴペプチド１ａ（４９．６ｍｇ）を反応させた。ａ）は溶離剤として０．ＭＬｉＣＬ／ＤＭＦを使用してＧＰＣによって決定した。ｂ）は、ゲル化が生じたことを表す。
【００６３】
【表２】
【００６４】
それぞれ、触媒と酸化剤として、Feサレン錯体と過酸化水素(０．２mmol)を用いて、ピリジン(１０μL)存在下、溶媒DMF中、室温で３時間大気圧下で、オリゴペプチド１ｂ(81.0ｍｇ)を反応させた。ａ）は溶離剤として0.ＭLiCL/DMFを使用してGPCによって決定した。ｂ)は、ゲル化が生じたことを表す。
【００６５】
【表３】
【００６６】
それぞれ、触媒と酸化剤として、Feサレン錯体と過酸化水素(０．２mmol)を用いて、ピリジン(１０μL)存在下、溶媒DMF中、室温で３時間大気圧下で、オリゴペプチド１ｃ(175.2ｍｇ)を反応させた。ａ）は溶離剤として0.ＭLiCL/DMFを使用してGPCによって決定した。ｂ)は、ゲル化が生じたことを表す。
【００６７】
また、種々の触媒濃度での酸化カップリングの追跡結果を図２に示す。触媒を加えないコントロール系では低分子量領域にしかピークが見られないが、触媒を添加することにより、高分子量領域にピークがみられ、触媒量が多いほど分子間カップリングポリマーの割合が増加した。
【００６８】
以上の結果、一部を除いて可溶性のポリアミノ酸を得ることが判明した。
【００６９】
実施例３
オリゴ（Ｎ−（２−（４−ヒドロキシフェニル）エチル）−Ｌ−グルタミン）（分子量１，２００） ２４８ミリグラム
西洋ワサビペルオキシダーゼ ３ミリグラム
メタノール １７．５ミリリットル
リン酸緩衝液（ｐＨ７） ７．５ミリリットル
３０％過酸化水素 １１４マイクロリットル
を用いて実施例１と同様の操作を行い、３時間反応を行った。反応液の溶媒を減圧下留去し、残査のＧＰＣ測定を行ったところ、オリゴアミノ酸が５２％転化していた。ポリマー部分には三分岐のピークが見られ、おのおのの数平均分子量は３１万（１７％）、２万８千（６８％）、１７００（１５％）であった（括弧内はポリマー部分のピーク面積比）。
【００７０】
実施例４
オリゴ（Ｎ−（２−（４−ヒドロキシフェニル）エチル）−Ｌ−グルタミン）（分子量１，２００） ２４８ミリグラム
Ｍｙｃｅｌｏｐｔｈｏｒａラッカーゼ １ミリリットル
メタノール １７．５ミリリットル
リン酸緩衝液（ｐＨ７） ７．５ミリリットル
を用いて実施例１と同様の操作を行い、２４時間反応を行った。反応液の溶媒を減圧下留去し、残査のＧＰＣ測定を行ったところ、オリゴアミノ酸が４４％転化していた。ポリマー部分には三分岐のピークが見られ、おのおのの数平均分子量は１６万（１８％）、１万３千（４０％）、１８００（４２％）であった（括弧内はポリマー部分のピーク面積比）。
【００７１】
実施例５
他のアミノ酸ポリマーとして、ポリ（Ｎ−（２−（４−ヒドロキシフェニル）エチル）−α／β−アスパラギン）を用いた。これは、ポリ（スクシイミド）とチラミンの反応をＤＭＦ中、６０℃で２４時間行い、蒸留水からの再沈殿により単離・精製した。ＧＰＣ測定により求めた数平均分子量は３万４千、分子量分布は２．６であった。次にポリアミノ酸合成は以下のものを用いて実施例１と同様の操作を行い、３時間反応を行った。
ポリ（Ｎ−（２−（４−ヒドロキシフェニル）エチル）−α／β−アスパラギン）４７ミリグラム
Ｆｅ−サレン １．６ミリグラム
ＤＭＦ ５ミリリットル
ピリジン ２０マイクロリットル
３０％過酸化水素 ２３マイクロリットル
【００７２】
反応液のＧＰＣ測定を行ったところ、原料は全て消失し、新たに数平均分子量１９万、分子量分布１．４のピークが見られ、高分子量ポリアミノ酸が得られたことがわかった。これの構造はＮＭＲ、ＩＲにより確認した。ＮＭＲの結果を以下に示す。
１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６， ｐｐｍ） ２．５ （ｂｒ， ＡｒＣＨ２）， ３．２ （ｂｒ， ＮＨＣＨ ２）， ３．３ （ｂｒ， ＣＨ ２ＣＨ）， ４．５ （ｂｒ， ＣＨ２ＣＨ）， ６．７ （ｄ， Ａｒ）， ７．０ （ｄ， Ａｒ）， ８．３ （ｂｒ， ＮＨ）， ９．２ （ｂｒ， ＡｒＯＨ）
ＩＲ （ＫＢｒ， ｃｍ−１） ３５００ （ｂｒ， Ｏ−Ｈ， Ｎ−Ｈの伸縮振動）， １６５０ （ｓ， アミド基カルボニルの伸縮振動）
【００７３】
以上の実施例により、種々の構造、分子量をもつ可溶性ポリアミノ酸が製造された。また、オリゴアミノ酸の構造や反応条件により可溶性アミノ酸の分子量が異なることが明らかとなった。
【００７４】
【発明の効果】
本発明では、可溶性の高分子量ポリアミノ酸がオリゴアミノ酸の酸化カップリングにより製造された。このようにして得られたポリアミノ酸は材料加工性が改良され、生分解性材料、生体適合性材料、ドラッグキャリヤー、抗菌材料、酸化防止剤等の用途として極めて有用である。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、本発明のポリアミノ酸の一例についてのＮＭＲの結果を示す図である。
【図２】図２は、Ｆｅサレン錯体の濃度の違いによる酸化カップリングの変動を示す図である。
【発明の属する技術分野】
本発明は、側鎖にフェノール類を有する高分子量ポリアミノ酸及びその製造方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
チロシンや３，４−ジヒドロキシフェニルアラニン（ドーパ）はフェノール基を有するアミノ酸であり、これらを含むタンパク質が多く知られている。生体内では酸化還元酵素により、タンパク質のチロシン間の酸化カップリングが生じ、生体機能維持に重要な役割を果たす。また、貝の産出するタンパクの接着や昆虫の外皮形成は、チロシナーゼ触媒によるタンパク質に含まれるドーパの酸化反応が重要な関与をしている。このような自然界の優れた機能を模倣する材料開発は、より精密な機能制御や未来型新材料設計に必要である。
【０００３】
近年、天然タンパク質をペルオキシダーゼ酵素を用いて硬化させることにより、タンパク質の物性を改良する研究が報告されている。（例えば、Ｊ．ＦｏｏｄＳｃｉ．，５９，１３３２（１９９４）やＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．，６３，４４９（１９９９））。これらは高分子量タンパク質の分子間架橋を検討したものであり、不溶性の架橋系高分子材料が合成されていることが特徴である。
【０００４】
一方、高分子量ポリアミノ酸を合成する方法として、アミノ酸Ｎ−カルボキシ無水物の開環重合が知られている。
【０００５】
【課題を解決するための課題】
しかしながら、上記タンパク質の物性を改良する研究は、より広範な用途、特に生医学用途への応用に必要な溶解性、加工性において問題があった。また、自然界でのタンパク質のチロシン間架橋は非常に低い濃度での反応であり、物質生産に適したものでなく、ドーパの酸化反応は不溶性構造骨格を生じるものであることから、可溶性タンパク質は合成されないという問題もある。
【０００６】
また、上記高分子ポリアミノ酸を合成する方法は、モノマー合成に極めて毒性の高いホスゲンまたはその誘導体の使用が必須であることから、一般性が欠如している。また、単独重合では多くの場合に不溶性ポリマーしか得られない。
【０００７】
また、いずれの方法においても実用的な可溶性タンパク質は得られていない。したがって、実用的な可溶性タンパク質、及びそのような可溶性タンパク質を一般性、汎用性が高く、効率的に得る方法が望まれていた。
【０００８】
本発明は、可溶性の高分子量ポリアミノ酸を提供することを目的とする。さらに可溶性の高分子量ポリアミノ酸の製造方法を提供することを目的とする。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、生体機構に着目し、生体内の酸化反応が重要な役割を有していることから、酸化触媒について鋭意検討した結果、可溶性の高分子量ポリアミノ酸及びその製造方法を見出し、本発明を完成するに至った。
【００１０】
即ち、本発明は、下記式［化６］で表されるＡ又はＢのいずれかのユニットを少なくとも１つ含むペプチド同士が、少なくとも一部のフェノール部位で酸化カップリングしていることを特徴とする。
【化６】
【００１１】
本発明のポリアミノ酸の好適な実施態様において、前記酸化カップリングが、下記式
【化７】
【化８】
【００１２】
本発明のポリアミノ酸の好適な実施態様において、重合度が３〜３００であることを特徴とする。
【００１３】
本発明のポリアミノ酸の好適な実施態様において、数平均分子量が５，０００〜１０，０００，０００の範囲であることを特徴とする。
【００１４】
本発明のポリアミノ酸の製造方法は、一般式、
【化９】
【００１５】
本発明のポリアミノ酸の製造方法の好適な実施態様において、酸化触媒が酸化還元酵素または遷移金属錯体であることを特徴とする。
【００１６】
本発明のポリアミノ酸の製造方法の好適な実施態様において、酸化還元酵素がペルオキシダーゼまたはオキシダーゼであること特徴とする。
【００１７】
本発明のポリアミノ酸の製造方法の好適な実施態様において、遷移金属錯体が、
一般式
【化１０】
【００１８】
本発明のポリアミノ酸の製造方法の好適な実施態様において、さらに、助触媒としてアミンを用いることを特徴とする。
【００１９】
【発明の実施の形態】
まず、本発明に関わるオリゴアミノ酸を出発物質とする可溶性ポリアミノ酸の製造方法を説明する。
【００２０】
本発明の製造方法において、下記の一般式［化１１］で表されるＡ又はＢのいずれかのユニットを少なくとも１つ含む、アミノ酸、オリゴアミノ酸、又はポリアミノ酸を用いることができる。以下では、オリゴアミノ酸を例に説明するがこれに限定される意図ではない。
【００２１】
【化１１】
【００２２】
このオリゴアミノ酸は、主鎖に不斉炭素を含む場合が多いが、本発明では光学活性体を用いても良いし、ラセミ体を用いてもよい。
【００２３】
［化１１］中、Ａ又はＢユニットの水酸基の結合位置及びその数に特に制限はないが、フェノール部位として例えば４−ヒドロキシフェニル、３−ヒドロキシフェニル、２−ヒドロキシフェニル、３，４−ジヒドロキシフェニル等を示すことができる。
【００２４】
たとえば、上記［化１１］Ａユニットの具体例として、Ｎ−（２−（４−ヒドロキシフェニル）エチル）−Ｌ−グルタミン、Ｎ−（２−（４−ヒドロキシフェニル）エチル）−Ｌ−アスパラギン、Ｎ−（２−（３−ヒドロキシフェニル）エチル）−Ｌ−グルタミン、Ｎ−（２−（３，４−ジヒドロキシフェニル）エチル）−Ｌ−グルタミン、Ｎ−（２−（４−ヒドロキシフェニル）エチル）−Ｌ−グルタミン、Ｎ−（２−（３−ヒドロキシフェニル）エチル）−Ｌ−グルタミン、Ｎ−（２−（４−ヒドロキシフェニル）エチル）−Ｌ−アスパラギン、Ｎ−（２−（４−ヒドロキシフェニル）エチル）−Ｄ−グルタミン、Ｎ−（２−（４−ヒドロキシフェニル）エチル）−Ｄ−アスパラギン、Ｎ−（２−（３−ヒドロキシフェニル）エチル）−Ｄ−グルタミン等のペプチドユニットが挙げられる。効率的に反応を進行させるためのスペーサー導入という観点から、Ａユニットとしては、Ｎ−（２−（４−ヒドロキシフェニル）エチル）−Ｌ−グルタミン、Ｎ−（２−（３−ヒドロキシフェニル）エチル）−Ｌ−グルタミン、Ｎ−（２−（４−ヒドロキシフェニル）エチル）−Ｌ−アスパラギン等が好ましい。
【００２５】
［化１１］Ａ又はＢユニットのいずれか１つを含むポリアミノ酸は、特に制限はなく、Ａ又はＢユニット以外にフェノール性基を含んでいてもよい。ポリアミノ酸を構成するアミノ酸は限定されず、たとえば、Ｌ−アラニン、Ｌ−バリン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−プロリン、グリシン、Ｌ−セリン、Ｌ−トレオニン、Ｌ−システイン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−グルタミン、Ｌ−リシン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−グルタミン酸−γ−エチルエステル、Ｌ−グルタミン酸−γ−メチルエステル、Ｌ−グルタミン酸−γ−フェニルエステル、Ｌ−グルタミン酸−γ−ベンジルエステル、Ｌ−アスパラギン酸−β−エチルエステル、Ｌ−アスパラギン酸−β−メチルエステル、Ｌ−アスパラギン酸−β−フェニルエステル、Ｌ−アスパラギン酸−β−ベンジルエステル、Ｄ−アスパラギン酸、Ｄ−グルタミン酸、Ｄ−グルタミン酸−γ−エチルエステル、Ｄ−グルタミン酸−γ−メチルエステル、Ｄ−アスパラギン酸−β−エチルエステル、Ｄ−アスパラギン酸−β−メチルエステル、Ｄ−アスパラギン酸−β−フェニルエステル、Ｄ−アスパラギン酸−β−ベンジルエステル等のペプチドが挙げられる。溶解性付与という観点から、ペプチドとしては、Ｌ−グルタミン酸−γ−エチルエステル、Ｌ−グルタミン酸−γ−ベンジルエステル、Ｌ−アスパラギン酸−β−エチルエステル等が好ましい。
【００２６】
上記［化１１］の重合度は３〜３００の間であれば、特に制限はない。重合度の範囲をこのようにしたのは、ゲル化を伴わないで高分子量の可溶性ポリマーを得るという理由からである。
【００２７】
上記［化１１］のＡ又はＢユニットをいずれか含むポリアミノ酸中において、フェノール基を含むユニットの割合に特に制限はない。好ましくは５〜１００モル％、特に好ましくは１０〜１００モル％である。
【００２８】
本発明で用いられる酸化還元酵素は、フェノール基を酸化できるものであればよく、従来既知なもの、例えばペルオキシダーゼやオキシダーゼを含む。本発明で使用されるペルオキシダーゼは種々の起源のものが使用でき、特に制限はない。ペルオキシダーゼとしては、例えば植物由来、細菌由来、坦子菌類由来のペルオキシダーゼを挙げることができる。これらの中で、西洋ワサビペルオキシダーゼは酸化能が高く、しかも量産されて安価であり、好ましく使用することができる。
【００２９】
本発明で使用できるオキシダーゼとしてラッカーゼを挙げることができる。ラッカーゼは種々の起源のものが使用でき、特に制限はないが、例えば植物由来、細菌由来、坦子菌類由来のラッカーゼを挙げることができる。これらの例としては、漆の木から得られるラッカーゼ、Ｐｙｒｉｃｕｌａｒｉａ、Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ、Ｐｙｃｎｏｐｏｒｕｓ、Ｐｏｌｙｓｔｉｃｔｕｓ、Ｍｙｃｅｌｏｐｔｈｏｒａ、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ属の微生物ラッカーゼを挙げることができる。特にＰｙｃｎｏｐｏｒｕｓ、Ｍｙｃｅｌｏｐｔｈｏｒａ属のラッカーゼを好ましく使用できる。なお使用する酵素の状態は、精製・未精製を問わない。酵素量はオリゴアミノ酸１ｇに対して０．００１ｍｇ〜１０ｇ、好ましくは０．００５ｍｇ〜５ｇ、さらに好ましくは０．０１ｍｇ〜３ｇである。
【００３０】
また、本発明で用いる遷移金属錯体は好ましくは下記［化１２］で表されるものである。
【化１２】
【００３１】
上記［化１２］における置換炭化水素オキシ基は、ハロゲン原子、アルコキシ基、アミノ基等で置換された炭化水素オキシ基であり、具体例としては、トリフルオロメトキシ基、２−ｔ−ブチルオキシエトキシ基、３−ジフェニルアミノプロポキシ基等が挙げられる。なお、ハロゲン原子として好ましくは、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子であり、さらに好ましくは塩素原子、臭素原子である。
【００３２】
上記［化１２］における置換アミノ基としては、炭素原子数１〜２０の置換アミノ基が好ましく、具体的には、メチルアミノ基、エチルアミノ基、プロピルアミノ基、ブチルアミノ基、フェニルアミノ基、ジメチルアミノ基、ジエチルアミノ基、ジプロピルアミノ基、メチルエチルアミノ基、ジフェニルアミノ基等が挙げられる。
【００３３】
上記［化１２］における炭化水素オキシカルボニル基としては、炭素数１〜２０の炭化水素オキシカルボニル基が好ましく、具体的には、メトキシカルボニル基、エトキシカルボニル基、プロピキシカルボニル基、ｔ−ブチルオキシカルボニル基、フェノキシカルボニル基等が挙げられる。
【００３４】
上記［化１２］における置換炭化水素オキシカルボニル基は、ハロゲン原子、アルコキシ基、アミノ基等で置換された炭化水素オキシカルボニル基であり、具体例としては、トリフルオロメトキシカルボニル基、２−ｔ−ブチルオキシエトキシカルボニル基、３−ジフェニルアミノプロポキシカルボニル基等が挙げられる。なお、ハロゲン原子として好ましくは、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子であり、さらに好ましくは塩素原子、臭素原子である。
【００３５】
上記［化１２］の二価の炭化水素基または置換炭化水素基として、具体例としては、メチレン基、１，２−エチレン基、１，３−プロピレン基、１，４−ブチレン基等のアルキレン基、１，２−シクロペンチレン基、１，２−シクロヘキシレン基等のシクロアルキレン基、フェニレン基、ナフチレン基等のアリーレン基等を挙げることができ、好ましくは、メチレン基、エチレン基、１，３−プロピレン基、１，２−シクロヘキシレン基である。
【００３６】
上記［化１２］で表される遷移金属錯体における具体例四座配位子として、Ｎ，Ｎ’−ジサリシリデンエチレンジアミン、Ｎ−（３−オキソペンチリデン）−Ｎ’−サリシリデンエチレンジアミン、Ｎ，Ｎ’−ビス（３−オキソブチリデン）―１，２−フェニルエチレンジアミン、Ｎ，Ｎ’−ビス（３−オキソブチリデン）―１，３−プロパンジアミン、Ｎ，Ｎ’−ビス（１−メチル−３−オキソブチリデン）エチレンジアミン、Ｎ，Ｎ’−ビス（３−オキソペンチリデン）エチレンジアミン、Ｎ，Ｎ’−ビス（３−オキソヘキシリデン）エチレンジアミン、Ｎ，Ｎ’−ビス（４−トリフルオロメチル−３−オキソブチリデン）エチレンジアミン、Ｎ，Ｎ’−ビス（２−シアノ−３−オキソブチリデン）エチレンジアミン、Ｎ，Ｎ’−ビス（２−ニトロ−３−オキソブチリデン）エチレンジアミン、Ｎ，Ｎ’−（１，２−エチレン）−ビス（マロン酸モノメチルモノアミド）等、あるいはそれらからプロトンを一つまたはそれ以上取り去って得られる陰イオンを挙げることができる。
【００３７】
本発明に用いる遷移金属錯体については、配位子と遷移金属錯体以外の構造は、触媒能を失活させないならば特に限定されるものではない。例えば、配位子としてＮ，Ｎ’−ジサリシリデンエチレンジアミン（以下サレンと表記することがある）を、遷移金属として鉄を用いた、Ｎ，Ｎ’−ジサリシリデンエチレンジアミナト鉄（ＩＩ）（以下、Ｆｅ−サレンと表記することがある）遷移金属錯体は、酸素下において容易に酸素架橋体であるμ−オキソ−ビス（Ｎ，Ｎ’−ジサリシリデエチレンジアミナト鉄（ＩＩＩ））を形成することが知られているが、このものを用いても何ら問題はない。
【００３８】
本発明に用いる遷移金属錯体には、電気的に中性を保たせるようなカウンターイオンが必要な場合がある。カウンターアニオンとしては、通常ブレンステッド酸の共役塩基が使用され、具体例としては、フッ化物イオン、塩化物イオン、臭化物イオン、ヨウ素イオン、硫酸イオン、炭酸イオン、過塩素酸イオン、メタンスルホン酸イオン、酢酸イオン等が挙げられる。また、カウンターカチオンとしては、アルカリ金属やアルカリ土類金属等のカチオンを適宜用いることができる。また、本発明の遷移金属錯体には、錯体の原料、合成過程および／または酸化カップリング過程で、溶媒などが配位しても良い。
【００３９】
本発明において遷移金属錯体の添加量は、用いる触媒の酸化カップリング活性により適宜加減すればよいが、触媒量はオリゴアミノ酸１ｇに対して０．００１ｍｇ〜１０ｇ、好ましくは０．００５ｍｇ〜５ｇ、さらに好ましくは０．０１ｍｇ〜３ｇである。
【００４０】
本発明に用いる遷移金属錯体の活性を高めるために、助触媒としてアミンを用いても良い。用いるアミン種としては、遷移金属錯体の活性に影響を及ぼさないものであれば特に制限はなく、公知のものが使用できる。具体的には、ピリジン、トリエチルアミン、２，６−ルチジン等の第三級アミンを用いることができ、反応収率の向上という観点から、アミノ酸オリゴマー１ｇに対して０．０１ｍｇ〜１ｇの範囲で用いることが好ましい。
【００４１】
本発明において、酸化剤は任意のものが使用できるが、好ましくはペルオキシドまたは酸素が使用できる。ペルオキシドの例としては、過酸化水素、ｔ−ブチルハイドロペルオキシド、ジ−ｔ−ブチルペルオキシド、クメンハイドロペルオキシド、過酢酸、過安息香酸等を示すことができる。触媒にペルオキシダーゼまたはＦｅ−サレンを用いる場合には、特に過酸化水素が好ましい。ペルオキシドを用いる場合には、オリゴアミノ酸に含まれるフェノール基に対して、通常０．５当量以上５当量以下を使用するが、当量以上３当量以下を使用するのが好ましい。触媒にラッカーゼを用いる場合には、特に酸素が望ましく、この場合の酸素としては、純酸素のほか、空気あるいは酸素と不活性ガスの混合物の形で用いることができる。これらは、反応混合物中に吹き込んでも良いが、単に重合雰囲気中に存在させるだけでも良い。
【００４２】
重合に用いる溶媒としては、オリゴアミノ酸と触媒が共に溶解するものが好ましい。遷移金属錯体を触媒に用いる場合は、オリゴアミノ酸と遷移金属錯体に対して不活性でかつ反応温度において液体であれば、特に限定されるものではない。溶媒例を示すと、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、メタノール、エタノール、２，２，２−トリフルオロエタノール、ジメチルスルホキシド、Ｎ−メチルピロリドン、ニトロメタン、ニトロベンゼン、アセトン、テトラヒドロフラン、ピリジン等が挙げられる。これらは単独あるいは混合物として使用される。
【００４３】
酵素を触媒に用いる場合は、有機溶媒と水の混合溶媒が好ましく、有機溶媒として水と相溶する溶媒がより好ましい。水と相溶する有機溶媒として、メタノール、エタノール、２，２，２−トリフルオロエタノール、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、ジメチルスルホキシド、Ｎ−メチルピロリドン、ニトロメタン、ニトロベンゼン、ピリジン、１，４−ジオキサン、アセトン、メチルエチルケトン等が挙げられる。これらは単独あるいは混合物として使用される。
【００４４】
水は蒸留水や脱イオン水でもよいが、水の代わりに緩衝液を用いてもよい。緩衝液を用いる場合はｐＨ２〜１２の範囲が望ましい。緩衝液の種類としては、酢酸緩衝液、リン酸緩衝液、炭酸緩衝液等が望ましいが、これらに限定されるものではない。また、有機溶媒−水の混合比はオリゴアミノ酸と酵素が溶解する場合には任意の量を用いることができる。好ましくは５：９５〜９５：５、特に好ましくは２０：８０〜８０：２０の範囲である。
【００４５】
上記溶媒または混合溶媒は、反応中にゲル化が起こらない任意の量を用いることができる。ゲル化が起こらない条件は用いるアミノ酸オリゴマーによって異なるが、アミノ酸オリゴマー濃度が０．５〜２００ｇ／Ｌがより好ましい。
【００４６】
本発明のポリアミノ酸の製造方法において、上記［化１１］に示すオリゴアミノ酸を酸化触媒を用いて酸化カップリングさせる場合の反応温度は、触媒が不活性化しない温度が望ましい。好ましくは０〜１００℃の範囲であり、より好ましくは１０〜６０℃の範囲である。反応温度が高い場合は、一般に酵素は失活するが、溶媒系によっては酵素を安定化するので、その場合は高い反応温度も採用可能となる。
【００４７】
本発明において、アミノ酸オリゴマーと酸化触媒との反応には多くの異なる方法を利用することができる。例えば、アミノ酸オリゴマー、酸化触媒の溶液を個々に調製した後に同一容器中に注入してもよいし、アミノ酸オリゴマーの溶液に触媒を添加してもよい。この他にも種々の組合せが可能であるが、触媒が失活（不活性化）するような方法でない限り、各種の方法を採用できる。
【００４８】
本発明によって得られる可溶性ポリアミノ酸の数平均分子量は５，０００〜１０，０００，０００の範囲であるが、好ましくは８，０００〜５，０００，０００、より好ましくは１０，０００〜３，０００，０００の範囲である。
【００４９】
本発明において得られるポリアミノ酸はＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、ジメチルスルホキシド等の極性溶媒に可溶である。そのため、該ポリマーを生分解性材料、生体適合性材料、ドラッグキャリヤー、抗菌材料、酸化防止剤として使用する場合、成形加工を容易に行うことが可能であり、オリゴアミノ酸の使用では得られない様々な効果を期待することができる。例えば、オリゴアミノ酸では困難な薄膜形成能は生分解性材料や生体適合性材料に必須の物性である。
【００５０】
また、本発明のポリアミノ酸は、下記式［化１３］で表されるＡ又はＢのいずれかのユニットを少なくとも１つ含むポリアミノ酸同士が、少なくとも一部のフェノール部位で酸化カップリングしている。
【化１３】
【００５１】
上記ユニットを含むものであれば、ペプチドとしては特に限定される事はない。
ペプチドとしては、たとえば、上述のポリアミノ酸の製造方法において説明したようなペプチドを用いる事ができる。
【００５２】
また、少なくとも一部のフェノール部位でペプチド同士が結合していれば良く、ペプチドの側鎖に存在するフェノール部位の全てが結合している必要はない。本発明のポリアミノ酸の好適な実施態様において、前記酸化カップリングが、下記式
【化１４】
【化１５】
【００５３】
また、ポリアミノ酸の重合度は３〜３００であることが好ましい。これは、ゲル化を伴わないで高分子量の可溶性ポリマーを得るという理由からである。さらにポリアミノ酸の数平均分子量は５，０００〜１０，０００，０００の範囲であることが好ましい。これは、高分子材料としての用途開発に望ましい加工性付与という理由からである。
【００５４】
【実施例】
ここで、本発明の一実施例を説明するが、本発明は、下記の実施例に限定して解釈されるものではない。また、本発明の要旨を逸脱することなく、適宜変更することが可能であることは言うまでもない。
【００５５】
実施例１
５０ミリリットルナスフラスコに、５０ミリグラムのオリゴ（Ｎ−（２−（４−ヒドロキシフェニル）エチル）−Ｌ−グルタミン）（分子量１，２００）と３．２ミリグラムのＦｅ−サレンを取り、２．５ミリリットルのＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドを加えて室温で攪拌し、溶解させた。１０マイクロリットルのピリジンを加え、３０％過酸化水素５．７マイクロリットルを１５分毎に４回加えた。３時間後、反応液のＧＰＣ測定を行ったところ、オリゴアミノ酸が７７％転化し、分子量３３万のポリアミノ酸が生成した。また、ＮＭＲ、ＩＲ分析により、フェノール部位が反応したことが推測された。ＮＭＲの結果を図１及び下記に示す。
１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６， ｐｐｍ） １．２ （ｂｒ， ＣＨ ３ＣＨ２）， １．９ （ｂｒ， ＣＨＣＨ ２ＣＨ２）， ２．３ （ｂｒ， Ｃ（＝Ｏ）ＣＨ２）， ２．５ （ｂｒ， ＡｒＣＨ２）， ３．２ （ｂｒ， ＮＨＣＨ ２）， ４．０ （ｂｒ， ＯＣＨ２）， ４．３ （ｂｒ， ＮＨＣＨ）， ６．７ （ｄ， Ａｒ）， ７．０ （ｄ， Ａｒ）， ８．０ （ｂｒ， ＮＨ）， ９．３ （ｂｒ， ＡｒＯＨ）
ＩＲ （ＫＢｒ， ｃｍ−１） ３３００ （ｂｒ， Ｏ−Ｈ， Ｎ−Ｈの伸縮振動）， １７３０ （ｓ， エステル基カルボニルの伸縮振動）、１６３０ （ｓ， アミド基カルボニルの伸縮振動）
【００５６】
比較例１
実施例１の操作において、Ｆｅ−サレンを使用しないで反応を行ったところ、オリゴアミノ酸が未反応で回収された。
【００５７】
実施例２
実施例２は、実施例１の操作において、オリゴアミノ酸の構造、Ｆｅ−サレンとＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドの使用量を変えて実験を行った。
フェノール基の導入率を変化させたペプチドを合成した。ペプチドの合成は、Ｇｌｕ γ−Ｅｔオリゴぺプチドとチラミンとを反応させて行なった。具体的に、溶媒としてＤＭＳＯを用いて、１００℃で２４時間、Ｇｌｕ γ−Ｅｔオリゴぺプチドとチラミンとを反応させた。使用したフェノール部位を有するペプチドは、以下式［化１６］の通りである。
【００５８】
【化１６】
本実施例においては、カップリング反応出発物質として３種類のペプチドを合成した。すなわち、式中、Ａ、Ｂの比率を変化させたペプチドを用いた。具体的には、ペプチド１ａは、Ａ：Ｂ ＝ ８０：２０であり、ペプチド１ｂは、Ａ：Ｂ＝５０：５０であり、ペプチド１ｃは、Ａ：Ｂは、２０：８０である。
【００６０】
ペプチド１ａを酸化カップリングした場合の結果を表１に示す。
【００６１】
【表１】
それぞれ、触媒と酸化剤として、Ｆｅサレン錯体と過酸化水素（０．２ｍｍｏｌ）を用いて、ピリジン（１０μＬ）存在下、溶媒ＤＭＦ中、室温で３時間大気圧下で、オリゴペプチド１ａ（４９．６ｍｇ）を反応させた。ａ）は溶離剤として０．ＭＬｉＣＬ／ＤＭＦを使用してＧＰＣによって決定した。ｂ）は、ゲル化が生じたことを表す。
【００６３】
【表２】
それぞれ、触媒と酸化剤として、Feサレン錯体と過酸化水素(０．２mmol)を用いて、ピリジン(１０μL)存在下、溶媒DMF中、室温で３時間大気圧下で、オリゴペプチド１ｂ(81.0ｍｇ)を反応させた。ａ）は溶離剤として0.ＭLiCL/DMFを使用してGPCによって決定した。ｂ)は、ゲル化が生じたことを表す。
【００６５】
【表３】
それぞれ、触媒と酸化剤として、Feサレン錯体と過酸化水素(０．２mmol)を用いて、ピリジン(１０μL)存在下、溶媒DMF中、室温で３時間大気圧下で、オリゴペプチド１ｃ(175.2ｍｇ)を反応させた。ａ）は溶離剤として0.ＭLiCL/DMFを使用してGPCによって決定した。ｂ)は、ゲル化が生じたことを表す。
【００６７】
また、種々の触媒濃度での酸化カップリングの追跡結果を図２に示す。触媒を加えないコントロール系では低分子量領域にしかピークが見られないが、触媒を添加することにより、高分子量領域にピークがみられ、触媒量が多いほど分子間カップリングポリマーの割合が増加した。
【００６８】
以上の結果、一部を除いて可溶性のポリアミノ酸を得ることが判明した。
【００６９】
実施例３
オリゴ（Ｎ−（２−（４−ヒドロキシフェニル）エチル）−Ｌ−グルタミン）（分子量１，２００） ２４８ミリグラム
西洋ワサビペルオキシダーゼ ３ミリグラム
メタノール １７．５ミリリットル
リン酸緩衝液（ｐＨ７） ７．５ミリリットル
３０％過酸化水素 １１４マイクロリットル
を用いて実施例１と同様の操作を行い、３時間反応を行った。反応液の溶媒を減圧下留去し、残査のＧＰＣ測定を行ったところ、オリゴアミノ酸が５２％転化していた。ポリマー部分には三分岐のピークが見られ、おのおのの数平均分子量は３１万（１７％）、２万８千（６８％）、１７００（１５％）であった（括弧内はポリマー部分のピーク面積比）。
【００７０】
実施例４
オリゴ（Ｎ−（２−（４−ヒドロキシフェニル）エチル）−Ｌ−グルタミン）（分子量１，２００） ２４８ミリグラム
Ｍｙｃｅｌｏｐｔｈｏｒａラッカーゼ １ミリリットル
メタノール １７．５ミリリットル
リン酸緩衝液（ｐＨ７） ７．５ミリリットル
を用いて実施例１と同様の操作を行い、２４時間反応を行った。反応液の溶媒を減圧下留去し、残査のＧＰＣ測定を行ったところ、オリゴアミノ酸が４４％転化していた。ポリマー部分には三分岐のピークが見られ、おのおのの数平均分子量は１６万（１８％）、１万３千（４０％）、１８００（４２％）であった（括弧内はポリマー部分のピーク面積比）。
【００７１】
実施例５
他のアミノ酸ポリマーとして、ポリ（Ｎ−（２−（４−ヒドロキシフェニル）エチル）−α／β−アスパラギン）を用いた。これは、ポリ（スクシイミド）とチラミンの反応をＤＭＦ中、６０℃で２４時間行い、蒸留水からの再沈殿により単離・精製した。ＧＰＣ測定により求めた数平均分子量は３万４千、分子量分布は２．６であった。次にポリアミノ酸合成は以下のものを用いて実施例１と同様の操作を行い、３時間反応を行った。
ポリ（Ｎ−（２−（４−ヒドロキシフェニル）エチル）−α／β−アスパラギン）４７ミリグラム
Ｆｅ−サレン １．６ミリグラム
ＤＭＦ ５ミリリットル
ピリジン ２０マイクロリットル
３０％過酸化水素 ２３マイクロリットル
【００７２】
反応液のＧＰＣ測定を行ったところ、原料は全て消失し、新たに数平均分子量１９万、分子量分布１．４のピークが見られ、高分子量ポリアミノ酸が得られたことがわかった。これの構造はＮＭＲ、ＩＲにより確認した。ＮＭＲの結果を以下に示す。
１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６， ｐｐｍ） ２．５ （ｂｒ， ＡｒＣＨ２）， ３．２ （ｂｒ， ＮＨＣＨ ２）， ３．３ （ｂｒ， ＣＨ ２ＣＨ）， ４．５ （ｂｒ， ＣＨ２ＣＨ）， ６．７ （ｄ， Ａｒ）， ７．０ （ｄ， Ａｒ）， ８．３ （ｂｒ， ＮＨ）， ９．２ （ｂｒ， ＡｒＯＨ）
ＩＲ （ＫＢｒ， ｃｍ−１） ３５００ （ｂｒ， Ｏ−Ｈ， Ｎ−Ｈの伸縮振動）， １６５０ （ｓ， アミド基カルボニルの伸縮振動）
【００７３】
以上の実施例により、種々の構造、分子量をもつ可溶性ポリアミノ酸が製造された。また、オリゴアミノ酸の構造や反応条件により可溶性アミノ酸の分子量が異なることが明らかとなった。
【００７４】
【発明の効果】
本発明では、可溶性の高分子量ポリアミノ酸がオリゴアミノ酸の酸化カップリングにより製造された。このようにして得られたポリアミノ酸は材料加工性が改良され、生分解性材料、生体適合性材料、ドラッグキャリヤー、抗菌材料、酸化防止剤等の用途として極めて有用である。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、本発明のポリアミノ酸の一例についてのＮＭＲの結果を示す図である。
【図２】図２は、Ｆｅサレン錯体の濃度の違いによる酸化カップリングの変動を示す図である。
Claims (9)
- 一般式
（但し、［化１］中、Ａ及びＢユニットは、フェノール性基を含むユニットを示す。Ａ及びＢユニットに関し、Ｒはメチレンあるいはエチレン基を示し、ｍは０〜５の整数、フェノール性水酸基はベンゼン環のオルト位、メタ位、あるいはパラ位に結合し、ｎは １〜４の整数を示す。） - 前記酸化カップリングが、下記式
- 重合度が３〜３００であることを特徴とする請求項１又は２項に記載のポリアミノ酸。
- 数平均分子量が５，０００〜１０，０００，０００の範囲である請求項１〜３項のいずれか１項に記載のポリアミノ酸。
- 一般式
- 酸化触媒が酸化還元酵素または遷移金属錯体である請求項５記載の方法。
- 酸化還元酵素がペルオキシダーゼまたはオキシダーゼである請求項５又は６項に記載の方法。
- 遷移金属錯体が、
一般式
- さらに、助触媒としてアミンを用いることを特徴とする請求項５〜８項のいずれか１項に記載の方法。
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