JP3616392B2 - アクチン結合性化合物の療法的使用 - Google Patents

Description

本発明は、政府援助を得てなされたものであり、政府が本発明に係る特定の権利を有している。
発明の分野
本発明は、アクチン関連障害、特に血漿中の又は組織及び器官の細胞外空間に析出されるアクチン・レベルを減少することが望ましい、障害の処置方法に関する。この方法は、かかる処置を必要とする対象物に対する効能のある量のアクチン結合性化合物又はそのアクチン結合性断片の投与に関する。
発明の背景
アクチンは、動物細胞のなかで最も豊富なタンパク質であり、多くの有核細胞のタンパク質の10−20％また筋細胞のタンパク質の30％を構成する。アクチン分子は、それぞれATP分子と結合し、長い糸状体に自己組立し、その間にATPは、ADPに加水分解する。
動物組織の損傷は、結果として血流を含む細胞外の空間へのアクチンの放出を生ずる。非筋細胞アクチンの約半分は、線維アクチン（球形アクチン単量体から組み合わされる二重らせん、棒状、糸状体のアクチン）であるが、細胞外の流体のイオン状態はアクチン重合を好むので、死にかけている細胞から血液中に放出される実質的にすべてのアクチンは、フィラメントに重合されると予測される（リンド、エス・イー等、Am.Rev.Respir.Dis 138:429−434（1988））。精製溶液中で、フィラメント短縮タンパク質がない場合には、アクチン・フィラメントは、容易に数ミクロンの長さとなることもできる。損傷した細胞から放出されるアクチンの断片は、不可逆的に変性するものもあるが、以下に述べる細胞内のアクチン結合タンパク質の一つに結合するものもある。このアクチンは、引き続き単量体のままとなる。
アクチンと自然結合するタンパク質は多数ある（アクチン結合生タンパク質については、ストッセル、ティー・ピー等、Ann.Rev.Cell Biol. １:353−402（1985）；ポラード、ティー・ディー等、Ann.Rev.Biochem. 55:987−1035（1986）を参照）がゲルゾリン（gelsolin）及びDBP（ビタミンＤ結合性タンパク質）の２種類のタンパク質が、主に細胞外アクチンの結合を担当していると考えられている（ジャンミー、ピー・エイ等、Bl ood 70:529−530（1987））。
ゲルゾリンは、クローン化されており（キワットカウスキー、ディー・ジェイ等、Nature 323:455−458（1986）、キワットカウスキー、ディー・ジェイ等、J.Cell Biol．106:375−384（1988））、またアクチン結合能力を有する自生タンパク質の断片が確認されている（ブライアン、ジェイ、J.Cell Biol. 106:1553−1562（1988）、イン、エイチ、エル等、J.Cell Biol. 107:465a（1988）、abst.no.2616）、キワットカウスキー、ディー・ジェイ等、J.Cell Biol. 108:1717−1726（1989）、ウェイ、エム等、J.Cell Biol.109:593−605（1989））。DBPもクローン化されている（クーク、エヌ・イー等、J.Clin.Invest. 76:2420−2424（1985）、ヤン、エフ等、Proc.Ntl.Acad.Sci.USA 82:7994−7998（1985））。
細胞内のアクチンは大量であるので、死にかけている細胞からのアクチンの放出は、血漿の細胞外流体の粘性の増加及び／又は細胞のエントラップその他の未確認の有害な効果を有する方法のいずれかによって、マイクロ環境に重大な影響を与えるに十分な量のアクチンを提供する。細胞外遊離アクチンの浸出は、動物細胞、特に腎及び心肺系に有害なものである（ハーパー、ケイ・ディー等、Clin.Res. 36:625A（1988）、ハダッド、ジェイ・ジー等、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:1381−1385（1990））。急性腎機能不全は、筋損傷の合併症であり、ネズミでのアクチンの浸出は、腎機能不全と一貫したBUN及びクレアチニン・レベルの一時的な上昇を生ずる。
さらに、フィラメント状の細胞外アクチン分子それぞれが、これと結合しているADPを有しているため、血液中における細胞外アクチンの存在は、宿主にとって有益でない方法で血小板の凝集を誘発し、又は増大させる傾向にある（リンド、エス・イー等、Am.Rev.Respir.Dis 138:429−434（1988）、スカーボロー等、Biochem,Bi ophy,Res.Commun. 100:1314−1319（1981））。
細胞外アクチンのゲルゾリン又はDBPとの結合によって、循環中の線維アクチンの形成を予防し、かかるアクチンが血流からの除去の標的となる機構となりうることが提案されている（リンド、エス・イー等、J.Clin.Inv est. 78:736−742（1986）、サンガー、ジェイ等、Cli n.Res. 36:625A（1988））。例えば、循環アクチン−ゲルゾリン複合物が以下のウサギ及びネコのオレイン酸誘発肺損傷（スミス、ディー・ビー等、Am.J.Path. 13 0:261−267（1988））において、またウサギのフェニルヒドラジン誘発容血（スミス、ダブリュー・オー等、Bl ood 72:214−218）においてみられることは知られているところである。臨床的な凝結において、成人呼吸疲労症候群（ARDS）患者（リンド、エス・イー等、Am.Rev.R espir.Dis. 138:429−434（1988））、及び急性ファルキパルム（falciparum）マラリア患者の血漿（スミス、ディー・ビー等、Blood 72:214−218（1988））中で、ゲルゾリン・レベルが低下しており、またかかる患者の血液中で、ゲルゾリン・アクチン複合物が検出可能である。さらに、アクチンのDBPとの複合物は、閃光性肝壊死の患者の血漿においてみられる（ヤング、ダブリュー・オー等、J.Lab.Clin.Med. 110:83（1987））。また、血漿タンパク質の細胞外遊離アクチンを結合する能力が限度を超えた場合に、血管内におけるフィラメントの形成及び内皮細胞の損傷が検出できることが提案されている（ハーパー、ケイ・ディー等、Clin.Res. 36:625A（1988）、ハダッド、ジェイ・ジー等、Proc.Natl.Ac ad.Sci. 87:1381−1389（1990））。
アクチンが血液の凝結及び線維素溶解事象の通常のシーケンスを阻害することは知られているところである。アクチンは、通常の線維素の転移が「優秀な」又は「当然の」凝結であることを阻害し（ジャンミー、ピー・エイ等、Biochem.Biophys.Acta 841:151−161（1985））、また線維素溶解酵素プラスミンの強い抑制因子でもある。
血流及び／又は組織内のアクチンに反応して生ずる対象物の組織損傷を阻止又は改善することができる処置については説明されていない。従って、かかる処置を改善し、処理し、又は防止できる方法が必要である。
発明の概要
本発明は、組織損傷後に、対象物に対してアクチン結合性化合物又はその生物学的能動誘導体を投与することがその他の健康な組織に対して細胞質保護を提供するとの発明者の考察に基づいてなされたものである。特に、かかる投与は、体のその他の部位で組織損傷が生じた後での、腎組織及び／又は肺組織の二次損傷及び腎機能及び／又は肺機能の二次障害に対する保護を提供する。
従って、本発明の目的は、動物の血流及び細胞外空間でのアクチン・レベルを減少するための方法を提供することである。
また、本発明の目的は、動物の血流及び細胞外空間内のアクチンの毒性を減ずるための方法を提供することである。
また、本発明の目的は、血漿内の異常に高いアクチン・レベルによって生ずる二次的な組織損傷を抑止するための動物の処置に使用できる療法的処置を提供することである。
また、本発明の目的は、ARDS、閃光性肝臓壊死、急性肝不全、筋肉損傷及び障害当のアクチン関連障害、並びにBUN及びクレアチニン・レベルの一時的な上昇を特徴とするその他の障害の処置方法を提供することである。
また、本発明の目的は、臨床サンプルのアクチン・レベル検出のための診断検定を提供することである。
以下にさらに明らかとなる、本発明のこれらの目的及びその他の目的は、対象物に対して、炎症又は組織損傷に応じて、血流又は細胞外空間へのアクチンの放出後に生ずる二次的な組織損傷の原因を阻止し、処置し又は治療するような投薬量で、また養生法に基づいて、１種又はそれ以上のアクチン結合性化合物又はその能動断片を投与することによって得られたものである。
実施態様
明細書及び請求の範囲の理解をより明確かつ一貫したものとするため、かかる用語に与えられる範囲を含めて、以下の定義を定める。
アクチン結合性化合物
「アクチン結合性化合物」は、アクチンの多くの機能を修正する「アクチン・モノマーの糸状体への重合の抑止を含む」ためにアクチンと結合でき、また宿主の生体内（原子核又は成熟核内）、又は試験管内（化学合成の結果）のいずれかで当該化合物と結合する自然汚染物がほとんどない化合物、特にタンパク質（又はペプチド）を含む。かかる化合物は、ゲルゾリン及びDBP等の細胞外アクチン結合性タンパク質、及び血管内に最も豊富なもの（例えば、ミオシン、トロポミオシン、プロフィリン（profilin）及びコフィリン（cofilin））、また非筋細胞で最も豊富なもの等の細胞内アクチン結合性タンパク質を含むがこれらに限定されない。本発明の方法の範囲内でのアクチン結合性化合物は、以下のものも含むがこれらに限定されない。（ａ）アクチン単量体を優勢的に封鎖するアクチン結合性化合物、すなわち重合に対する抵抗力のある複合物内の結合単量体（例えば、DBP、プロフィリン、デパクチン（depactin）、コフィリン及びDNAase Ｉ）、（ｂ）モノマーを封鎖し、糸状体分離活動を有するアクチン結合性化合物（例えば、ゲルゾリン、ヴィリン（villin）、フラグミン（fragmin）及びセベリン（severi））、（ｃ）優勢的にアクチン・フィラメントの端を閉塞し、単量体のかかる端との交換を防止するアクチン結合性化合物（例えば、キャッピング（capping）タンパク質、ベーターアクニン（ −actinin）及びアキュメンチン（acumentin））、及び（ｄ）アクチンにおいてかかる効能を有するアクチン結合性非タンパク性分子（アクチン・フィラメントの端を閉塞する、チトカラシン（cytochalasin）又はその生物学的能動誘導体）。
望ましい場合には、かかる化合物は、動物に対する治療上受容可能な塩の形式で投与できる。
血栓事象
「血栓事象」の用語は、結果として線維素溶解を生ずる血管の閉塞、血栓、梗塞その他の生物学的摂動に係る血管の状態を意味する。
動物
「動物」の用語は、血流又は細胞外空間における遊離アクチン又はアクチン・フィラメントの滞留が動物生理学的に有害となるすべての動物を含む。かかる動物の中でも主要なものは人間であるが、本発明は人間に限定することを趣旨とするものではなく、本発明の有利な効能を経験し得る一切の動物を処置することは、本発明の趣旨の範囲内である。
効能のある量
アクチン結合性化合物の「効能のある量」は、動物に対するアクチンの有害な影響を減ずるか又は除去するに十分な量である。
自然汚染物がほとんどない
精製前に通常かつ自然的に見られる素材から実質的に精製された場合には、素材は、「自然汚染物がほとんどない」状態にあるといえる。アクチン結合性化合物と結合する可能性のある自然汚染物の例としては、非アクチン結合性ペプチド、炭水化物、グリコシレートされたペプチド、脂質、皮膜等が挙げられる。また、生体内又は試験管内の物質において通常かつ自然的に見られるかかる汚染物が素材のサンプルにほとんどない場合には、素材に自然汚染物がほとんどないと言える。「ほとんどない」とは、完全に存在しないか、又はその存在が（１）当該調製が動物に投与されるときに調製において活性剤（本明細書においてアクチン結合性化合物）の希望の治療上の効果に影響を与えず、かつ（２）かかる調製の動物への投与の結果動物にとって有害とならないような低い濃度で存在する場合のいずれかを意味する。
投与
「投与」の用語は、医療の当業者に知られている適切な手段（経腸又は非経口的（例えば静脈）投与を含むがこれらに限定されない）での動物へのアクチン結合性化合物の導入を含む。
治療上受容可能な塩
「治療上受容可能な塩」の用語は、本発明のアクチン結合性化合物の塩を含むことが意図されている。かかる塩は、例を挙げれば、硫酸、塩酸、硝酸、リン酸等の酸、又はアルカリ、もしくはアルカリ土金属水酸化物、水酸化アンモニウム、水酸化アルキルアンモニウム等の基、といった医療上受容可能な酸又は基から形成できる。
治療上受容可能な運搬者
「治療上受容可能な運搬者」の用語は、本発明のアクチン結合性化合物の調製の添加物として使用され、よってかかる化合物投与のキャリア又は補助剤を提供する、溶剤、キャリア、希釈剤等を含むことが意図されている。
処置
「処置」又は「処置する」の用語は、アクチン関連障害の予防、回復、防止又は治療を含む目的のための対象物に対するアクチン結合性化合物の投与を含むことが意図されている。
断片
「断片」の用語は、アクチン単量体を結合できるアクチン結合性化合物の部分を提供する分子の部分を含む。この用語は、あらゆる原材料、例を挙げれば、自然発生するペプチド・シーケンス、合成又は化学合成されたペプチド・シーケンス及び遺伝的に処理されたペプチド・シーケンス等の原材料から形成されるアクチン結合性断片を含む。さらに、かかる断片がペプチドである場合には、かかるアクチン結合性タンパク質のペンプチドの断片は、アクチン結合性タンパク質の変異体を含む。
変異体
アクチン結合性化合物等の化合物の「変異体」は、自生化合物又はその断片のいずれかと構造的に、また生物学的活動において実質的に類似する化合物をいう。
本発明の化合物の生物学的活動は、アクチンと結合し、修正されていないアクチンよりも害の少ない形態にアクチンを修正する能力である。かかる修正は、化合物の本質的な結合の結果、又はかかる結合から生ずる化学的又は酵素による反応の結果である。
官能誘導体
アクチン結合性化合物の「官能誘導体」は、アクチン結合性化合物とほぼ類似する生物学的活動を有する誘導体である。「ほぼ類似する」とは、量的には異なるが、質的には同一の活動を意味する。例を挙げれば、本発明のアクチン結合性タンパク質の官能誘導体は、アクチン結合性タンパク質と同様のアミノ酸土台を含むが、例えば診断検定又は医療処置の実施についての当該修正の必要性によって、結合燐脂質、又は共有結合する炭水化物等の翻訳後修正等のその他の修正を含む。本明細書において使用される場合には、かかる用語は、アクチン結合性化合物の化学的誘導体を含む。かかる誘導体は、化合物の可溶性、吸収、生物学的な半減期等を改善できる。また、誘導体は、分子の毒性を減じ、又は分子等の望ましくない副作用を除去もしくは減少できる。誘導体、特に、かかる効能を媒介できる化学的成分は、レミントンズ・ファーマセウティカル・サイエンス（Remington's Pharmaceutical Sciences）（1980）に開示されている。かかる成分を分子とカップリングする工程は、当業者に既知の工程である。「官能誘導体」の用語は、分子の「断片」、「変異体」、「類似体」又は「化学的な誘導体」を含むことが意図されている。
類似体
本発明のアクチン結合性化合物の「類似体」は、自生のアクチン結合性化合物又はその断片のいずれかと機能的にほぼ類似する化合物を意味する。例えば、アクチン結合性タンパク質の類似体は、アクチン結合性タンパク質と同一のアミノ酸シーケンスを有しないが、かかるアクチン結合性タンパク質の生物学的活動を得られるに十分な程度にアクチン結合性化合物と相同関係にあるのタンパク質である。
本発明の方法は、身体のあらゆる部位の炎症又は損傷に反応して、アクチンとアクチン結合性タンパク質のゲルゾリン及びDBPとの複合体が血中に現れ、血漿中の遊離ゲルゾリン及びDBPのレベルが大幅に低下したときに、その結果として肺及び／又は腎臓の二次的損傷がしばしば生じるという所見に、部分的に基づいている。
遊離細胞外アクチンの注入が肺及び腎臓にとって有毒であり、かつ繊維素溶解を抑制することに鑑み、発明者は、肺及び腎臓の二次的組織損傷を引き起こすのは血中の非複合アクチンであるという所見をなした。発明者は、さらに、組織損傷及び炎症が、そのような有毒性遊離細胞外アクチンを複合させ、かつ除去する宿主の機能を飽和状態にし得るというユニークな所見をなした。その結果、発明者は、細胞外アクチンの毒性効果、特に肺及び／又は腎臓に対する細胞保護効果の改善は、細胞外アクチンを複合させるか、又はその他の方法で非毒性単量体形態に変性させるのに十分な量のアクチン結合性化合物を対象物に投与することによって得られるという結論に達した。
本発明方法の対象である特定のアクチン結合性分子とは、精製された天然及び組み替え型のアクチン結合性タンパク質、その他の非タンパク性アクチン結合性分子、及びその生物学的活性断片であり、アクチンを単量体形態に封鎖するか、アクチン・フィラメントを素早く分離又は解重合するか、宿主細胞にとって有毒である部位を被覆することのできる生物学的活性を有する、ユニークなアクチン結合域の存在によって特徴づけられる。この生物学的活性を有する個々のアクチン結合域はまた、合成による方法、酵素による方法、タンパク質分解による方法、化学的方法又は組み替え型DNAによる方法によって生産し得る。
好適実施態様において、ゲルゾリン、DBP、又はそのアクチン結合性断片、又はゲルゾリンとDBP及び／又はそのアクチン結合性断片との化合物が、処置を必要とする対象物に供給される。血漿ゲルゾリン（ブレビン又はアクチン解重合化要素ともいう）及びDBP（Gcグロブリンともいう）は、血漿中に存在する二つの高親和性アクチン結合性タンパク質である。高親和性アクチン結合性タンパク質は、アクチンを10^-8より小さいK_dと結合させる。ゲルゾリン及びDBPは両方とも血清中のアクチンに結合し、アクチン解重合化活性を有する。DBPは単量体アクチンと優先的に結合し、ゲルゾリンはアクチン・フィラメントと優先的に結合する。
ゲルゾリンは、哺乳類の細胞質及び細胞外液から摂取される多機能のアクチン結合性タンパク質である。血漿ゲルゾリンは、分子のアミノ末端において25個のアミノ酸が追加されているという点でのみ、細胞ゲルゾリンと異なっており、両方のゲルゾリンとも一つの遺伝子からの産物である。血漿ゲルゾリンには、三つのアクチン結合域があり、高親和性をもって球状アクチン（Ｇ−actin）又は線維アクチン（Ｆ−actin）のいずれかと結合する。
血漿ゲルゾリンは、第一アクチン分子と結合するときよりも高い親和性をもって第二アクチン分子と結合し、従って１対１の複合体よりも優先的に２対１の複合体を形成し、単量体に優先してフィラメントと結合する。線維アクチンに添加されると、血漿ゲルゾリンは非タンパク質分解方法でフィラメントを分離し、新たに形成されたフィラメントの一方の端に結合されたままとなる。遊離ゲルゾリン分子が存在する場合は、これらの分子は、２対１のアクチン−ゲルゾリン複合体のみが存在する状態になるまで、アクチン・フィラメントを完璧に分離し、これによってフィラメントを素早く解重合する。
遊離ゲルゾリン分子と、（アクチンとの）複合ゲルゾリン分子は、機能的特性において異なっている。遊離ゲルゾリンはアクチン・フィラメントを分離できるが、アクチン−ゲルゾリン複合体はこれを分離できない。
血漿中のゲルゾリンの主な機能は、アクチン・フィラメントを分離することである。アクチンより多くゲルゾリンが存在する場合は、ゲルゾリン−アクチン複合体のみが結果として生じる。アクチンのほうが多い場合は、遊離アクチン低重合体及びゲルゾリン−アクチン複合体が存在する。アクチン分離は、隣接するアクチン分子の非共有結合の非タンパク質分解分割によって生じる。ゲルゾリンの分離活性はミクロモルCa²⁺⁺によって活性化され、ホスファチジル・イノシトール、バイホスフェート（PIP2）及びホスファチジル・イノシトール・モノホスフェート（PIP）によって抑制されることが示されている。細胞外Ca²⁺⁺濃度はミクロモル・レベルであり、細胞外液は通常、ゲルゾリンを抑制する形態ではPIP又はPIP2を含まないため、血漿ゲルゾリンは細胞外液において本質的に活性である。
DBPにはアクチン結合域が一つあり、本質的に線維アクチンではなく単量体に結合する。
ある実施態様においては、効能のあるレベルのアクチン結合性化合物が、過度の細胞外アクチンの二次的毒性効果に対する治療上の恩恵を提供するために投与される。「効能のあるレベル」のアクチン結合性化合物とは、遊離細胞外アクチンの毒性効果が最低限に改善されるレベルをいう。「過度の」細胞外アクチンとは、二次的組織損傷又は毒性効果なしに、アクチンを結合し、かつ細胞外液からアクチンを除去する血漿タンパク質の機能を越える細胞外アクチンの量をいう。「二次的」組織損傷又は毒性効果とは、血漿中の過度の細胞外アクチンの存在によって、何もなければ健康であった組織、器官及びその細胞に生じる組織損傷又は毒性効果で、通常は身体のあらゆる部位において生じた「一次的」組織損傷の結果として生じる組織損傷又は毒性効果をいう。
本発明の方法において、アクチン結合性化合物（例えばゲルゾリン、DBP、又はそのアクチン結合性断片）を注入することにより、ａ）アクチン・フィラメントへの凝結を防ぐためにアクチン単量体に結合し、及び／又はｂ）アクチン・フィラメントを単量体の状態に分割し、及び／又はｃ）アクチン結合性タンパク質又は断片に複合したアクチンを、循環又は細胞外組織環境から強化除去することとなる。
アクチン結合性化合物は、化学的に又は遺伝子工学によって、その他の薬剤の断片と共役され得るもので、これは目標作用位置にむけてアクチン結合性化合物を供給することとなる。
腎糸球体フィルターを介して移送する機能を有するアクチン結合性化合物又はその活性断片は、腎臓にとって有毒なアクチンを減少させるために使用することができる。65kDより小さい分子量を有するアクチン結合性化合物は、腎糸球体フィルターを通過するものと思われ、濾過されたアクチンの毒性効果を中和することができる。このような化合物はまた、あらゆる器官の毛細血管又は細胞外隙に滞留するアクチンの栓をより容易に透過することができる。
また、その他の化合物は、化学的に又は遺伝子工学によって、アクチン結合性化合物又はその活性断片に共役され得るもので、そのアクチン結合性化合物の追加的特性、特にアクチンの毒性効果の軽減を促進する化合物の機能を強化する特性を強化又は供給する。例えば、アクチンが脈管内の血液凝固を促進し、繊維素溶解を抑制するため、組織プラスミノゲン活性剤及び／又はアンチトロンビン（例えばヒルジン又はその活性断片）をアクチン結合性化合物に共役させることにより、組織損傷がアクチンを解放し、それによって脈管内の血液凝固を促進した場所を目標として繊維素溶解剤を供給することができる。
アクチン結合性化合物の投与量及び養生法は、アクチン関連の傷害、組織損傷及び炎症の処置を行う医療技術に関する通常の知識を有する当業者によって難なく決められる。一般的に、アクチン結合性化合物処置の適用量は、以下の点を考慮することによって変化する。適用されるアクチン結合性化合物の種類、年齢、健康状態、処置が施される状況、同時処置（もしあれば）の種類、処置の頻度及び望ましい効果の質、組織損傷の範囲、性別、症状の持続期間、反対適用（counter indications）（もしあれば）、及び個々の医師によって調整されるその他の可変項目。望ましい結果を得るために、１回以上の適用によって適用量は投与され得る。
適用量は、以下の方法で算出される。通常の血中ゲルゾリン濃度は2.4μＭ（2.4μmol/L）であり、通常の血中DBP濃度は５μＭ（５μmol/L）である。従って、総血中アクチン結合性容量（ABC）は約7.5μＭ（7.5μmol/L）である。血液量は体重の６％であるから、70kgの人は4.2リットルの血液を有し、（4.2L x 7.5μmol/L）31.5μmolのABCを有しているということである。DBP及びゲルゾリンは細胞外隙（体重の10％）に渡って分布しているので、身体には（7.5 x 7）52.5μmolのABCが含まれている。
内生ABCの全体的複合化又は除去を行うためには、32μmol乃至53μmolのアクチン結合性化合物（又は0.46μmol/kg体重）を投与することが望ましい。0.425mgのアクチンは１μmolに等しく、また骨格筋1gにつき4.86gのアクチンが存在するため、筋肉1gにつき11.3μmolのアクチンが含まれ、又は4.6gの筋肉破損は身体中の全ABCを中和し得る。しかし、アクチンの毒性効果はおそらく局所的であるか（例えば凝塊溶解の抑制）、封鎖されるか、又は運動により決まるので（例えば結合性タンパク質が器官を中和するよりも速くアクチンはその器官を透過する）、理論的に最小限の適用量は、運動学的に好ましい治療効果を達成するために多めに調整されなければならないものと思われる。運動学的効果は重要であり得る。例えば、約半分の赤血球組織系の溶血現象（4.2μmolのアクチンだけを解放する）は血漿ゲルゾリン濃度を急激に半分に減少させ（スミス等、Blood 72:214−2181（1988））、脈管外域と血管域がゆっくりと平衡することを示す。逆に言うと、アクチンの局部的沈着を分解することができる治療上効果的な状況は、高濃度のアクチン結合性分子の過度脈（transient pulse）によってのみ達成可能である。
本発明の化合物は、投与のためのあらゆる適切な治療用運搬体によって投与することができる。この化合物は、人間及び動物の組織損傷の予防条件、緩和条件、予防可能条件、又は治癒条件に影響を与える形態で、投与することができる。
本発明の非経口投与用のアクチン結合性タンパク質の製剤は、無菌水溶性又は非水溶性の溶媒、懸濁及び乳剤を含む。非水溶性溶剤の例は、プロピレン・グリコール、ポリエチレン・グリコール、野菜油、魚油及び注入可能な有機エステルである。水溶性運搬体は、水、水−アルコール溶液、乳剤又は懸濁（塩水及び塩化ナトリウムを含む緩衝医療用非経口運搬体を含む）、リンガーのデキストロース溶液、デキストロース及び塩化ナトリウム溶液、ラクトースを含むリンガー溶液、又は混合油を含む。静脈内運搬体は、流体及び栄養補給剤、電解質補給剤（リンガーのデキストロース（Ringer's dextrose）等に基づくものなど）を含む。
本発明のアクチン結合性タンパク質は、特に主な損傷が急性のものではなく延長又は晩発のものである場合、ポンプを介して、又は持続解放形態で投与することもできる。主な損傷がしばしば急性のものではなく延長又は晩発のものである一例は心筋梗塞であり、この場合、心筋への損傷は第一次心臓発作の後何日か経過するまで露見しない（又は持続する）。また、本発明のアクチン結合性分子を、適切に注入されたカテーテルを介して、又は特定の器官を目標とするように配列されたキメラ分子（又は複合体）の一部としてアクチン結合性分子を供給することによって、高濃度で特定の器官に送ることもできる。
延長期間中繰り返し注入を行うということが示された場合、患者にとって持続解放形態での投与が都合がよい。例えば、患者を最大限に楽な気分にさせるため、本発明の方法がアクチン関連の傷害に基づく遺伝的又は慢性の疾患の処置に使用される場合、本発明のアクチン結合性タンパク質を持続的解放形態で投与することが望ましい。
本発明のアクチン結合性タンパク質は、経口投与用の錠剤、カプセル、粉末又は液体等の投与形態で使用され得る。但し、タンパク質の生物学的活性が消化過程において破壊されず、また化合物の特性により腸組織全体に渡ってそのタンパク質の吸収が可能となる場合に限る。
本発明の治療用組成物は、例えば、従来の混合、粒状化、ドラジェー製法（dragee−making）、溶解、凍結乾燥又は類似のプロセスによる、本質的に既知の方法によって製造される。本発明の組成物は本来、アクチン誘発生理損傷の制御における効用を慢性又は急性のものとする。本発明の組成物は、最大限の潜在能力をもって血流又は細胞外組織中の過度のアクチンに対処する身体それ自体のメカニズムを導くものである。静脈投与の形態では、本発明の組成物は、潜在的組織損傷の急性処置に役立つように十分に速く作用が開始する。
さらに、軽度の又は慢性的アクチン関連傷害の処置において、低効能のものが有用である。
また、本発明の組成物は、動物の血流又は細胞外組織におけるアクチン・レベルを実験分析するための必須試薬を供給する。
自然汚染物がほとんどないアクチン結合性タンパク質は、このようなタンパク質を分離するのに従来使用されてきた当分野における従来の条件及び技術に従って（抽出、沈澱、クロマトグラフィー、アフィニティー・クロマトグラフィー、電気泳働等）、その自然源又は組み替え源から分離され、かつ浄化され得る。
当業者は、不当な実験によらずとも、従来技術を使用してアクチン結合性化合物のアクチン結合域を確認でき、かかる領域は、本発明の方法において好適である。例を挙げれば、自生アクチン結合性タンパク質の誘導体、又は組み換えによって生成されたアクチン結合性タンパク質の誘導体は、例えば、トリプシン、キモトリプシン及びスブチリシン等の共通のプロテアーゼを有する標準的な長さのアクチン結合性タンパク質のタンパク質開裂によって形成できる。アクチン誘導樹脂との親和性クロマトグラフィーを、かかる断片のアクチン結合能力の検定に使用できる。
アクチン分離活動を有する化合物又はその断片の確認が望ましいときには、かかる化合物又は断片を、例えば、ピレン標識線維アクチンの解重合率の追跡といった、従来技術を使用して確認することもできる。
さらに、かかる断片は、機能が相同関係にあると予測される、その他の既知のアクチン結合又はアクチン分離領域に対する相同性によって確認できる、例を挙げれば、セベリン、ゲルゾリン及びヴィリン、特にセベリン中のアミノ酸残渣40−351及びゲルゾリン中のアミノ酸残渣63−383は、線維アクチン分離活動を担当する領域において広範囲な相同関係を示していることが知られている。
ゲルゾリンのＮ−末端側の半分、例えば、CT45として知られているＮ−末端トリプシン断片は、線維アクチンを分離することができ、また２個のアクチン結合部位を含む。これらの部位の１は、高い親和力でアクチン単量体及びフィラメントの端を結合する、キモトリプシン断片、CT15N（ヒト・ゲルゾリン残渣24−150）に存し、他方の部位は、線維アクチンの側面をポリファスフォイノシタイド調整方法で結合する、隣接断片CT28N（残渣151−400）に含まれる。いずれの断片も、それ自体によってアクチン・フィラメントを分離するものではない。線維アクチンを分離できる最小のゲルゾリン・ポリペプチドは、血漿ゲルゾリンの残渣25−165を包囲する。
自然汚染物がほとんどない効能のある量のCT45は、心臓又は組織に対する損傷が判明するまでの期間を通じて、深刻な心筋梗塞その他の血栓事象を有する患者に投与できる。投与されるペプチドの量は、死にかけている心臓細胞によって放出されたアクチンとともに飽和状態になっている総ゲルゾリンの留分を決定するために患者の血漿中の総ゲルゾリンに対する結合したゲルゾリンの割合を検定し、かつこの割合を最低でも健常者においてみられるレベルに回復するに十分なアクチン結合能力を提供するに必要な量を算出した後に決定できる。さらに、患者のBUN等の腎障害及びクレアチニン・レベルのインジケータは、綿密に監視することができ、またかかるインジケータによって腎障害が生じていることが判明した場合には、必要に応じてアクチン結合性分子の投与量をさらに高く調整できる。
従って、本発明は、動物に対するアクチン結合性化合物を、（ａ）アクチン・フィラメントの形成を防止し、かつ／又は（ｂ）アクチン・フィラメントを「安定した」単量体状態に処理するに十分なレベルで、遊離アクチンの滞留又は血流中の放出について望ましくない生理的な影響を処置しかつ／又は防止するに十分な量で投与するために使用できる。
さらに、アクチン結合性タンパク質等の化合物は、種の中で保存性が高く、非ヒト（ウシ属、ブタ）血漿及び／又は筋組織から容易に大量分離することができ、またこれらのタンパク質の断片は、従来技術によって化学的に又は酵素性分解によって調製できる。従って、かかるアクチン結合性化合物は、本発明の治療法を必要とする対象物に対して、深刻な免疫反応を誘発することなく投与できる。
本適応において引用するすべての参考文献は、本明細書での言及によって本明細書に組み込まれるものである。本発明を概括的に述べてきたので、以下の実施例によって、さらに本発明の遂行に使用される素材及び方法を詳述する。実施例は、いかなる方法でも本発明を制限することを意図するものではない。
実施例
実施例１
アクチン誘発組織損傷に対する保護又は改善
効能のある量のアクチン結合性分子、例えばCT45、又は球形と線維アクチンを高い親和性をもって結合する血漿ゲルゾリンの残渣25−165を含むペプチドは、アクチン・フィラメントを分離することができ、また自然汚染物がほとんどない状態であり、また治療上受容可能な運搬者において、原因の如何を問わず最近大量の障害、急性溶血現象又は横紋筋腫を経験した対象物に投与される。与えられるアクチン結合性分子の量及び治療期間は、合計血漿ゲルゾリン濃度又は血漿中で混合するアクチン・ゲルゾリンの測定によって細胞外アクチン結合能力の消耗を監視することによって決定できる。内生ゲルゾリンは、自生ゲルゾリン分子の異なった領域におけるエキトープに向けられる単クローン抗体（かかる抗体は当業者によって知られている）によってゲルゾリンの治療上の断片から容易に分化できる。（シャポニアー等、J.Cell Biol. 103:1473−1481（1986））。さらに、肺機能は、例えば、動脈血液酸素飽和の測定によって、かつ／又は腎機能は、例えば血清BUN及びクレアチニン濃度の測定によって監視する。
実施例２
線維素溶解のアクチン誘発抑制の予防
効能のある量のアクチン結合性分子を、動脈血栓による急性心筋梗塞を患った患者に、血栓崩壊剤の投与前に又は投与と同時に与える、血漿ゲルゾリン・レベルが急性心筋梗塞の後で徐々に減少することが知られており、またアクチンがすべての血栓崩壊処置によって活性化される酵素である、プラスミンを抑止することが示されていることから、この方法がとられる。また、これは、現行のすべての線維素溶解療法破損率が有限であること、すなわち動脈開出が達成されないか、あるいは再閉塞が生ずることもこの理由となっている。この破損が内生的に生成されたプラスミンの抑制によって、又は血栓療法の結果として遊離アクチンが壊死粉瘤斑又は梗塞を生じた心筋から浸出することによって生ずる範囲で、アクチン結合性分子療法は、この破損機構に向けられている。
本発明について十分に説明してきたが、本発明又はその実施態様の精神又は範囲に影響を与えることなく、広範囲かつ相応の状態、パラメータ等の範囲内で目的を遂行できることが当業者によって理解されるところである。

Claims (1)

1. 臨床サンプルである、動物からの血漿中におけるアクチン結合性化合物から遊離された細胞外アクチンの検出方法であって、
   前記アクチン結合性化合物である検出用ゲルゾリンと前記アクチンとの複合体の形成から、遊離アクチンのレベルを前記サンプルに対して検出する工程と、
   前記検出用ゲルゾリンと、前記血漿中の内生ゲルゾリン とを区別する工程であって、前記内生ゲルゾリンは前記 検出用ゲルゾリンの異なった領域におけるエピトープに 向けられるモノクローナル抗体によって前記検出用ゲル ゾリンの治療上の断片から区別する工程と、
   前記形成された複合体のレベルを検出する工程と、
   を含む検出方法。