JP3529793B2 - Ｈｙｐｅｒａｂａｓ：８’―メチル又は９’―メチル炭素原子に不飽和炭素置換基を有する生物学的に活性なアブシジン酸類似体 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 発明の背景 本発明は、8'−又は9'−炭素原子において変性された
新しいクラスのアブシジン酸（ABA）類似体、及びかか
るABA類似体を合成するための新規方法に関する。

背 景 アブシジン酸は、種子の発達及び発芽、蒸散及びスト
レスに対する応答を含む植物の成長のさまざまな面を調
整する植物ホルモンである。

アブシジン酸、（＋）−ABA（炭素原子及び立体配座
表示のための番号付けシステムを伴う）。

このホルモン自体は、摂取及び安定性の問題及びコス
トを理由として、外部的に塗布される植物成長調節物質
としての限定された用途しか有していなかった。

その上、ABA作用のメカニズムの検討、受容タンパク
質の同定及びホルモンの細胞内位置確認は、植物内のホ
ルモンの急速な代謝回転により制約を受けてきた。同様
に、応用ABAの農業用途は、植物内のホルモンの急速な
代謝により制限されてきた。

植物の中で、（＋）−ABAの代謝の支配的な経路（以
下参照）には、ファゼイン酸（PA,3）を産生するエノン
系に対する8'−ヒドロキシル基の攻撃により環化を受け
る8'−ヒドロキシABA（２）を与える8'位置における水
酸化が関与する。中間水酸化ABA化合物２は、植物抽出
物内にめったに発見されたことがなく、これは、操作中
にそれが容易に環化するためである確率が最も高い。最
も容易に単離可能なABA異化代謝産物であるファゼイン
酸（３）は、大部分の検定において、ほとんど又は全く
活性をもたない。

先行技術の説明 近年、8'又は9'−炭素原子のいずれかにメトキシ基を
支持する新しいABA類似体が、日本のヒライ研究所（Y.
トドコリ、N.ヒライ及びK.コシムズ、アブシジン酸の代
謝拮抗類似体としての8'及び9'−メトキシアブシジン
酸、Biosci,Biotech.Biochem 1994,58:707−715）:S.ナ
カノ、Y.トドロキ、N.ヒライ及びH.オヒガシ、アブシジ
ン酸の7'−,8'−及び9'−アルキル類似体の合成及び生
物活性）によって合成され試験された。これらの化合物
は、検定に応じて、強い活性をもつことがわかった。そ
れらの結果は、いくつかの例において、一つの原子に１
対の原子が結合したジメチル基を修飾することにより分
子がABA様のものとして感知されることが妨げられるこ
とはない。ということを示唆しており、研究者達は、変
性が、ABAを分解する酵素による急速な代謝損傷を妨げ
るということを仮定している。

しかしながら、彼らが使用した合成は実用的なもので
はない。メトキシ誘導体のための彼らの手順には、２重
結合異性体の混合物を与える１つの反応と、1'及び6'炭
素でジアステレオマを与えるもう１つの反応を伴う、15
の段階が必要である。トランス形との混合物、すなわち
４つの化合物としてのラセミメチルエーテルの収量は、
彼らの実験結果から0.22％として計算されている。アル
キル類似体は、類似のルートで全体的に低い効率で合成
される。

２つの研究班が、強い生物活性をもつ8'でフッ素置換
されたABA類似体を合成した（Y.トドロキ、N.ヒライ、
K.コシミズ、アブシジン酸の極めて強く持続性のある類
似体としての8,8'−ジフルオロ及び8',8',8'−トリフル
オロアブシジン酸。Phytochem.1995 38:561−568。B.T.
Kim.Y.K.Min.T.Asami.NK.Park.I.H.Jeong,K.Y.Cho及び
S.Yoshida.新しいフッ素化アブシジン酸の合成及び生物
活性、Bioorganic and Medicinal.Chem.Lett.1995 5 27
5−278）。両方のケースにおいて、合成は長時間にわた
り、植物成長調節物質としての応用には実用的でない。

発明の要約 農業及び基礎研究の利用分野のための、植物中のABA
の効果を延長させるのに使用できる強くかつ生物学的に
安定したABA類似体を開発することが、本発明の目的で
ある。

本発明のもう１つの目的は、酵素による酸化（恐らく
はチトクロムＰ−450モノオキシゲナーゼが関与するも
の）に対する耐性をもつものの天然ホルモンの生物活性
を保持するか又はこれに対する増強を提供するような類
似体を開発するため、ABAの8'又は9'−炭素原子を変性
させることにある。

本発明の１つの形態に従うと、 という構造式Ｉの化合物において、R₁のうちの１方がア
ルケニル、アルキニル、アリール、シクロアルケニル、
重水素含有残基を含むその他のさらに置換された炭素
鎖、及びヘテロ原子及びハロゲンを伴う炭素含有置換基
であり、もう１方がメチルであり、さらに５成員炭素側
鎖がC3にメチル基を含み、示されている通りC5が環に付
着しており、C4〜C5位置にトランス２重結合又はこの位
置で３重結合してC2〜C3位置にシス又はトランスのいず
れかの２重結合が含まれており、さらにR₂はCH₂OH,CHO,
COOH,COOアルキル又はその誘導体であり、シクロヘキサ
ノン環２重結合を還元することもできる、化合物が提供
されている。

本発明のもう１つの形態に従うと、 という構造式I aをもち、ここで R₁がアルケニル、アルキニル、アリール、シクロアル
ケニル、重水素含有残基を含むその他のさらに置換され
た炭素鎖、及びヘテロ原子及びハロゲンを伴う炭素含有
置換基であり、さらに５成員炭素側鎖がC3にメチル基を
含み、示されている通りC5が環に付着しており、C4〜C5
位置にトランス２重結合又はこの位置で３重結合、C2〜
C3位置にシス又はトランスのいずれかの２重結合が含ま
れており、さらにR₂はCH₂OH,CHO,COOH,COOアルキル又は
その誘導体であり、シクロヘキサノン環２重結合を還元
することもできる、新しいクラスの8'−アブシジン酸
（ABA）類似体が提供されている。

本発明のもう１つの形態に従うと、R₁及びR₂が構造式
I aについて以上で定義づけした通りである、 という構造式I bの新しいクラスの9'−アブシジン酸（A
BA）類似体が提供されている。

本発明のもう１つの形態に従うと、8'−ABA類似体の
合成のための新しい方法が提供されている。

8'類似体が求められる場合、全体的プロセスには、2,
6−ジメチルシクロヘキサ−2,5−ジエン−1,4−ジオン
又はC4におけるケタールといった誘導体と、３−メチル
ペント−２−en−４−yn−１−ol又はヒドロキシ保護さ
れた誘導体のジアニオンとの反応が関与する。エノンに
対する不飽和基の接合体添加は、グリニヤール試薬を用
いて行なわれる。機能的誘導体、例えば酸、エステル、
酸塩化物などへのC1ヒドロキシル基の酸化は、標準的方
法を用いて達成される。C4〜C5 ３重結合は、例えば適
切な水素化物といった水素化物還元剤を用いてトランス
３重結合まで還元され得る。

我々の検定は、天然ABAと比較するべく光学的に純粋
な材料に対して行なわれたものの、ラセミ材料が利用さ
れる場合、分割段階が必要となることがわかるだろう。

C4〜C5でのアセチレン類似体の調製は、以下の要領で
ケタール化されていないキノン（以下の図式Ａ）を用い
ると最も効果的である。３−メチルペント−２−en−４
−yn−１−olのジアニオンは、ｎ−ブチルリチウムを２
当量添加することにより−78℃から−20℃まででTHF内
で生成される。これは、テトラメチルエチレンジアミン
の存在下で100℃でTHF中の１当量のキノン溶液に添加さ
れる。この反応は、より干渉を受けたカルボニルに対し
選択的に側鎖を加える。この反応に対しさらにグリニャ
ール試薬（R₁MgX、なお式中Ｘ＝Cl,Br又はＩ）を加える
と、8'位置にR₁基が付加され、１つのポット内に8'置換
されたケオ−ジオールを与えることになる。

C4〜C5のトランス２重結合を伴う類似体の調製は、以
下の条件下でケタール（以下の図式Ｂ）から最もうまく
実施される。３−メチルペント−２−en−４−yn−１−
olのジアニオンは、２当量のｎ−ブチルリチウムを添加
することによって、−78゜から−20℃でTHF中で生成さ
れる。これに対して１当量のケタール化されたキノンが
添加される。反応が完了した後、３重結合の還元を、０
℃でRed−A1を添加することによりインサイチュで行う
ことができる。０℃でTHF中10％のHClを用いて、ケター
ルを除去することができる。Ｒ基の接合体添加は、銅媒
介のグリニャール試薬との反応を通して行なわれる。ケ
トジオールのジアニオンはまず最初に、メチルリチウ
ム、リチウムジイソプロピルアミド又は水素化ナトリウ
ムのいずれかを用いて−78゜から−20℃で生成され、次
に−78゜から−20℃でヨウ化銅及びR₁MgX（Ｘ＝Br,Cl又
はＩ）の溶液に移される。

酸へのC1ヒドロキシル基の酸化は、標準的方法を用い
て達成される。

8'位置のさらなる修飾は、選択的なオゾン分解法及び
それに続く8'−メチレンABAの形成されたアルデヒド上
のWittigタイプの反応を通して実施できる。

合成を短縮するためいくつかの反応を組合わせること
が可能である。

例えば、R₁＝CH₂CCH,C≡CH,CH₂CH＝CH₂,CH＝CH₂。

以下のより詳細な反応図（ｉ）〜（iv）はさらに図式
Ｂのプロセスを例示している。

以下のものは、図式Ａのプロセスをさらに詳細に説明
する、より詳しい反応図（ｖ）である。

構造式I bの9'−類似体は、ヨウ化アリルでの2,6−ジ
メチル−4,4エチレンジオキシシクロヘク−２−セノン
のアルキル化によって合成できる。その後生成物を３−
メチル−ペント−２−en−４−yn−１−olのジアニンを
反応させることにより、8'−及び9'−で置換されたアセ
チレンABA類似体の1:1の混合物が得られる。C4〜C5の３
重結合をトランス２重結合に還元しC1炭素ヒドロキシル
基を適当なレベル（例えば酸）まで酸化する作業は、標
準的方法により達成される。8'及び9'−アリルエステル
は、キラル支持体（Daicel Chiralcel−OD）を伴うカラ
ムを用いてHPLCにより分離できる。

以下に示すのは、9'−類似体の合成のためのより詳細
な反応図式Ｃである。

図面の簡単な説明 図１は、（＋）−ABA及び8'メチレンABAについての成
長阻害用量応答を例示するグラフである。

図２は、BMS細胞懸濁培養の培地のpHに対する（＋）
−8'−メチレンABA及び（＋）−ABAの効果を例示するグ
ラフである。

図３は、（＋）−ABA（100μＭ）及び（＋）−8'−メ
チレンABA（125μＭ）での３時間の処理の後の小麦実生
の蒸散量の減少を例示するグラフである。

図４は、小麦実生（10μＭの類似体での処理から３時
間後）に対する複数のABA類似体の蒸散効果を例示する
グラフである。

図５は、コショウソウの種子の発芽に対する（＋）−
8'−メチレンABA及び天然ABAの効果を例示するグラフで
ある。

図６は、遺伝子導入タバコ植物内のβ−グルクロニダ
ーゼ（GUS）活性の誘発を例示するグラフである。

図７は、（＋）−ABA及び9'誘導体の成長阻害を例示
するグラフである。

図８は、（＋）−メチルABA（100μＭ）及び（＋）−
9'−エチレンメチルABA（100μＭ）での３時間の処理後
の小麦実生の蒸散量の減少を例示するグラフである。

図９は、ABA及び8'アセチレンABAのコーン（トウモロ
コシ）成長阻害を例示するグラフである。

図10は、メイズ（トウモロコシ）細胞懸濁培養の培地
中（＋）−ABA、（＋）−8'−メチレンABA及び（＋）−
8'−メチルABAの残存率の経緯を例示するグラフであ
る。

図11は、コーン細胞成長に対する（＋）−ABA及び
（＋）−８−メチルABAの効果を例示するグラフであ
る。

図12は、切除された小麦胚芽の発芽阻害物質としての
（＋）−ABA及び（＋）−8'−メチレンABAの生物活性を
例示するグラフである。

図13は、切除された小麦胚芽の発芽阻害物質としての
（＋）−ABA、（＋）−8'−メチレンABA、（−）−8'−
メチレンABA及び（＋）−8'−メチルABAの生物活性を例
示するグラフである。

図14は、トランスジーンPror6,6−GUSを含有する同型
接合のタバコ実生からの子葉ホモジネート内のGUS特異
的活性に対する（＋）−ABA及び（＋）−8'−メチレンA
BAの効果を例示するグラフである。そして、 図15は、トランスジーンPror6,6−GUSを含有する同型
接合のタバコ実生からの子葉ホモジネート内のGUS特異
的活性に対する（＋）−ABA及び（＋）−8'−メチルABA
の効果を例示するグラフである。

図16は、Canola種子の出芽に対するPBI−365の効果を
例示するグラフである。

図17は、メチル−8'−メチレンABAでの処理の後の干
ばつ条件に対する移植されたトウヒ実生の耐久生存を例
示するグラフである。

図18及び21は、移植されたトウヒ実生に対する、異な
る濃度のメチル−8'−メチレンABAの効果を例示するグ
ラフである。

好ましい実施形態の説明 新規ABA類似体は、8'−又は9'−炭素原子において、
不飽和を含む炭素鎖で変性される。例えば、Ｃ−8'又は
9'メチル基は、CH₂＝CH（メチレン）、CH₂CH＝CH₂（ア
リル）、Ｃ≡CH（アセチレン）、CH₂CCH（プロパルギ
ル）又は不飽和を伴うより長い炭素鎖で置換され得、環
式化合物及びヘテロ原子を伴う置換基を内含する。

我々は同様に、実用的かつ経済的でしかも容易に入手
可能な前駆物質から数多くの生物活性化合物を効率良く
提供するような合成方法も開発した。

以下の例中で記述する一定数の異なる検定における結
果は、新しい8'−又は9'−変性類似体が、天然ホルモン
のものと比較できる又はそれ以上の活性をもつことを示
している。従って、これらの類似体は、ABAが関与する
植物内のあらゆる生物学的プロセスを変性するのに利用
できる可能性がある。

ここで請求されている8'置換されたABA類似体は、ABA
の異化においてファゼイン酸へと酸化される炭素原子に
おいて、ABA分子に対する変性を有する。この要領でABA
分子を変性すると、ホルモン類似体は、生物分解に対し
より耐性の高いものとなる。8'−及び9'−炭素原子に不
飽和鎖をもつ類似体は、飽和したものに比べより活性が
強いことがわかった。

作物改良に対する8'−及び9'−炭素不飽和置換ABA類
似体の潜在的利用について、以下で箇条書きで概略的に
示す。

− 抗蒸散剤：移植中又は土壌の水分が少ないか又は利
用できない場合の水分損失の削減。

− 干ばつ条件下または実生樹立中の根の成長及び／又
は根−苗条比の増大の促進。

− 特に温度及びその他の非生物的ストレスに起因す
る、最適以下の成長条件下での耐久生存の増大と損傷の
削減。

− 例えば以下のことによる発芽／休眠の調節 ・休眠を維持することにより収穫前の軟白を防止するこ
と、 ・早すぎる発芽を阻害することにより春作物の秋実生を
可能にすること、 ・作物が株立ちするまでの雑草成長の予防又はホルモン
毒性のいずれかによる潜在的な除草力。

− ABA依存型トランスジーンの発現の増加を含む、胚
芽配達中の種子タンパク質及び脂質の産生を増大させる
ことによる、種子産物の産生、 − 微小繁殖のための人工的種子の産生。体細胞胚芽の
乾燥及び培地中の正常な発達を容易にする。

− ABA活動及び代謝に関与するタンパク質を同定する
ための親和性標識付げ試薬。

新しい8'−不飽和ABAの合成方法及び生物活性の一例
を以下に示す。

すなわち、類似体8'−メチレンABAは、以下で一般的
に示されるように、側鎖Ｒを含有する炭素を伴う対称シ
クロヘキサジエノンに対しグリニャール試薬（R₁MgBr）
を銅を触媒として1,4−接合体添加することにより合成
される。

関与する反応のさらなる詳細は、上述の反応図（ｖ）
に示されている。

ここで記述される類似体の合成において使用される出
発材料については、我々が以前に報告した（本書にその
開示が参考として内含されている、B.Lei,S.R.Abrams.
B.Ewan.及びL.V.Gusta.1994,Phytochem.37:289−96、ア
ブシジン酸のアキラル性シクロヘキサジエノン類似体：
その合成と生物活性）。

一般的実験条件：融点（mp）は補正されず、Ernst Leit
z Weltzler高温段融点装置上で記録される。Bruker AMX
−500分光計（500MHz）上で陽子核磁気共鳴（¹H NMR）
を記録した。炭素−13（¹³C NMR）スペクトルをBvuker
AMX−500分光計（125MHz）上で記録した。

CHCl₃を基準とするすべてのNMR実験においてCDCl₃を
溶剤として使用した。化学シフト（δ）及びカップリン
グ定数（Ｊ）は、あたかもそれらが一次的なものである
かのように報告される。デジタルPDP 11/73データシス
テムを伴うVG70−250SEQ−２重集束ハイブリッド分光計
を用いて電子衝撃モードで高分解能質量スペクトル（HR
MS）を記録した。Merckシリカゲル60（230〜400メッシ
ュ）を用いて、フラッシュカラムクロマトグラフィを実
施した。ナトリウム及びベンゾフェノンから蒸留により
溶剤テトラヒドロフラン（THF）を乾燥させた。相反す
る指示のないかぎり、全ての反応は、乾燥アルゴンの雰
囲気下で行なわれた。

（±）メチル8'−アブシジン酸メチレン ０℃でCuI（摩砕粉末、0.38g,2mmol）に対し臭化ビニ
ルマグネシウム（Aldrich,THF中1.0M,34ml,34mmol）を
加えることにより、グリニャール/CuI溶液を調製した。
混合物を10分間０℃で撹拌し、いつでも使用できる状態
にした。

乾燥THF（300ml）の中にメチル−（2Z,4E）−５−
（2,6−ジメチル−１−ヒドロキシ−４−オキソシクロ
ヘキサ−2,5−ジエニル）−３−メチルペント−2,4−ジ
エノエートPBI−252（3.60g,13.7mmol）（Lei et al.19
94;上記参照）を溶解させ、外部ドライアイス／アセト
ン浴を用いて−78℃まで冷却した。MeLi（Aldrich.THF
中、1.4M,9.7ml,13.7mmol）を添加し、赤色溶液を形成
させた。溶液を15分間撹拌し、次に調製済みのグリニャ
ール/CuI溶液をそれに移した。結果として得た暗色溶液
を20分間−78℃で撹拌し、ドライアイス／アセトン浴を
除去した後エーテル（200ml）で希釈し、次に、200mlの
10:1の飽和NH₄Cl/20％NH₄OH溶液を用いて急冷した。混
合物を20分間撹拌し、分離した。有機層を塩水（100m
l）で洗浄した。組合わされた水性層をエーテル（２×1
00ml）で抽出した。有機層を組合せ、無水MgSO₄上で乾
燥させ、濃縮した。カラムクロマトグラフィ（25％の酢
酸エチル／ヘキサン）により残渣を精製し、固体として
2.74g（69％）の生成物を得た。エーテル／ヘキサンか
らの再結晶により、白色結晶が得られた。mp 116−117
℃;¹H NMR:δ7.846（d,1H,J＝16.0Hz,H−４）,6.058（d
d,1H,J＝10.8,17.6Hz,H−8'）,6.056（d,1H,J＝16.0Hz,
H−５）,5.961（s,1H,H−3'）,5.734（s,1H,H−２）,5.
291（d,1H,J＝10.8Hz,H−10',H−８に対するシス）、5.
231（d,1H,J＝17.6Hz,H−10',H−８に対するトラン
ス）、3.679（s,3H,OMe）,2.493（d,1H,J＝17.2Hz,H−
5'）,2.411（d,1H,J＝17.2Hz,H−5'）,2.000（s,3H,C−
6,Me）,1.892（d,3H,J＝0.9Hz,C−7',Me）,1.124（s,3
H,C−9',Me）ppm。¹³C NMR:δ197.0,166.3,163.0,149.
2,140.7,134,9,129.1,127.3,118.5,118.0,78.2,51.2,4
7.7,47.5,21.1,20.6,19.2ppm。HRMS:C₁₇H₂₂O₄（M⁺）の
理論値290.1518,実際値290.1522。

（±）メチル8'−アブシジン酸メチレンの分割 前処理用キラル高圧液体クロマトグラフィ（HPLC）に
より分割を行なった。1:4の２−プロパノール／ヘキサ
ン（1ml約20mg/ml）中のラセミメチルエステル溶液をCh
iralcel ODカラム（Daicel,250mm×100mm IDをこれに先
行するWhatman CSKl HC Pellosil保護カラム）の中に注
入し、1:4の２プロパノール／ヘキサンで2ml/分で溶出
させ、262nmでUV検出した。４回の注入は、14分で溶出
する（＋）メチル8'−アフシジン酸メチル（55mg）及び
23分で溶出する（−）メチル8'−アブシジン酸メチレン
（44mg）を提供した。各々の異性体は分析用HPLC（Daic
el Chiralcel OD 250mm×4.6mm ID）により決定される
ように、99％以上の光学純度を有していた。

（＋）メチル8'−アブシジン酸メチレン。〔α〕D²⁴
＋386.6゜（CHCl₃中ｃ＝1.3％）;mp（エーテル／ヘキサ
ン）124−125℃;¹H NMR:δ7.802（d,1H,J＝16.1Hz,H−
４）,6.019（dd,1H,J＝11.0,17.5Hz,H−8'）,6.018（d,
1H,J＝16.1Hz,H−５）,5.918（d,1H,J＝0.8Hz,H−3'）,
5.692（s,1H,H−２）,5.245（d,1H,J＝11.0Hz,H−10',H
−８に対するシス）、5.185（d,1H,J＝17.5Hz,H−10',H
−８に対するトランス）、3.635（s,3H,OMe）,2.493
（d,1H,J＝17.2Hz,H−5'）,2.411（d,1H,J＝17.2Hz,H−
5'）,1.958（s,3H,C−6,Me）,1.851（s,3H,C−7',Me）,
1.081（s,3H,C−9',Me）ppm。¹³C NMR:δ196.9,166.3,1
63.0,149.2,140.7,134.9,129.1,127.3,118.5,118.0,78.
2,51.2,47.7,47.5,21.1,20.6,19.2ppm。

（−）メチル8'−アブシジン酸メチレン、〔α〕D²⁴
−386.5゜（CHCl₃中ｃ＝1.7％）;mp（エーテル／ヘキサ
ン）124−125℃;¹H及び¹³C NMRスペクトルは（＋）鏡像
異性体のものと同一。

（＋）8'−メチレンアブシジン酸 メタノール（7ml）中で（＋）メチル−8'−メチレンA
BA（23mg）を溶解させ、7mlの2N NaOH溶液を滴下にて添
加した。溶液を４時間、室温で撹拌し、濃縮して大部分
のメタノールを除去した。残渣を2NのNaOH（5ml）中に
溶解させ、エーテル（5ml）で洗浄した。水性層を10％
のHCl溶液で酸性化し、次に酢酸エチル（３×10ml）で
抽出した。組合せられた酢酸エチル層を無水Na₂SO₄上で
乾燥させ、蒸発させて固体として（＋）8'−メチレンAB
A（21.3mg,97％）を得た。〔α〕D²⁴＋351.3゜（CHCl₃
中ｃ＝2.3％）,¹H NMR:δ7.756（d,1H,J＝16.1Hz,H−
４）,6.057（d,1H,J＝16.1Hz,H−５）,6.027（dd,1H,J
＝11.0,17.5Hz,H−8'）,5.938（s,1H,H−3'）,5.707
（s,1H,H−２）,5.231（d,1H,J＝11.0Hz,H−10',H−８
に対するシス）、5.171（d,1H,J＝17.5Hz,H−10',H−８
に対するトランス）、2.508（d,1H,J＝17.3Hz,H−5'）,
2.424（d,1H,J＝17.3Hz,H−5'）,1.995（s,3H,C−6,M
e）,1.854（s,3H,C−7',Me）,1.090（s,3H,C−9',Me）p
pm。¹³C NMR:δ197.3,170.9,163.2,151.5,140.8,135.7,
129.2,127.3,118.2,117.8,78.5,47.7,47.3,21.4,20.7,1
9.3ppm。HRMS:C₁₆H₂₂O₄（M⁺）についての理論値276.136
2,実際値276.1354。

（−）8'−メチレンアブシジン酸 上述の通りの方法を用いた（−）メチルエステル（26
mg）の加水分解は、固体として（−）8'−メチレンABA
（21.5mg,87％）を生成した。〔α〕D²⁴−368.1゜（CHO
l₃中ｃ＝2.3％）¹H及び¹³C NMRスペクトルは（＋）鏡像
異性体のものと同一であった。

新しい炭素含有基の添加は、レジオ選択的に進めら
れ、ヒドロキシル基に対する新しいシス基を提供する。
新しい類似体の構造及びアルキル化のレジオ化学は、グ
リニャール反応中トリジューテロメチルヨウ化マグネシ
ウムを用いることによって作られた同位元素標識付けさ
れた類似体を用いて証明された。従来の形質転換による
側鎖の修飾後に得られた産物である、１つの原子に１対
の原子が結合したジメチル対内の１つのジューテロメチ
ル基を伴うABAを分割させ、我々の最近の論文（本書に
参考として内含されているBalsevich et al Plant Phys
iol.1994 106;135−142）に記された手順に従って、
（＋）−鏡像異性体を、培養されたコーン細胞による酸
化に付した。ジューテロ化されたABAを細胞により、２
つのジュウテリウム原子を含有するファゼイン酸へと転
化させた。この結果は、新しいメチル基がヒドロキシル
基と同じ側から添加されていることを確認するものであ
る。

この方法は、数多くの8'−置換されたABA類似体の合
成のために従うべきものであり、異なる化合物を得るべ
くグリニャール試薬のR₁基を変更することしか必要でな
い。全体的転化率は高い。例えば、8'−メチレンABAに
ついて、我々の現行の合成方法を用いると、市販されて
いる出発材料からの収量は9.2％であり、段階の数は８
である。側鎖内にアセチレン及びアルコール又はアルデ
ヒドを有する類似体については、段階数は２つ又は３つ
だけ減り、全体的収量は増大することになる。ここでの
特定的な例は、その光学的に純粋な形へと分割されるラ
セミ化合物のものであるが、当該方法は、キラル試薬を
用いた光学的に活性な化合物の合成をも可能にする。

8'−炭素置換器を伴うABA類似体の生物活性 8'−置換されたABA類似体は、ABAについての広い検定
範囲において活性である。新しい類似体は、天然ホルモ
ンに類似の要領で、植物により認識されると思われる。
これらの類似体の主要な特長は、分子に対する置換がAB
A分子の重要な官能基を無傷の状態に残す、という点に
ある。このことにより、これらの類似体に見られる広範
な活性の説明がつくかもしれない。これらの類似体につ
いて観察されるABA効果の範囲の一例として、ABAについ
てのものと比較した8'−メチレンABAの（＋）−鏡像異
性体についての検定結果を以下に記す： コーン細胞の成長阻害及びコーン細胞培地内のpH変化 天然ABAは、成長阻害をひき起こす（Balsevich et a
l.1994,Plant Physiol,106:135−142）。図１は、懸濁
培養されたコーン細胞（Black Mexican Sweet品種）を
用いた成長阻害実験結果を示す。ｙ軸は、天然ABA又は
対応するg'−メチレン誘導体のいずれかを添加してから
４日目における初期重量の百分率として表わされた細胞
成長（乾燥重量）を示している。濃度は、ｘ軸上に示さ
れている。各々の濃度における成長測定は、同一条件で
３回行なわれ（Balsevich et al,1994,Plant Physiol,1
06:135−142にある通り）、平均値及び標準偏差が示さ
れている。成長の50％阻害に必要とされる濃度は、8'−
メチレンABA0.33μＭ未満であり、天然ABAについては約
10μＭであった。これは、これまであらゆるABA類似体
によって生じた成長阻害のうち最も強いものである。こ
の検定では、40以上の化合物がテストされた。

天然ABAは、培養されたコーン細胞の培地のpHにおけ
るシフトをひき起した（Balsevich et al 1994,Plant P
hysiol,106:135−142）。図２は、懸濁培養されたコー
ン細胞の培地のpHに対する、同じ濃度の天然ABAに比べ
た（＋）−8'−メチレンABAの10μＭ溶液の効果を示し
ている。8'−メチレン化合物は、ABAと同じ位大きいpH
シフトをひき起こす。

小麦実生内の蒸散 ABAは、植物内の蒸散を調節することに関与する主要
なシグナル分子である（W.J.Davies T.A.Mansfield 198
8。植物中のアブシジン酸及び干ばつ耐性ISIAtlas of S
cience:Animal and Plant Science 0894−3761,p263−2
69）。図３は、小麦実生内の蒸散の減少に対する天然AB
A及び（＋）−8'−メチレンABAの効果を示している。12
5μＭの溶液を実生の根に塗布し、処置から３時間後に
蒸散減少率を決定した。飽和した8'−側鎖を伴う類似体
は、ビニル類似体ほど活性ではない。

この活性差は図４に示されており、この図で、ABAの
メチルエステル（214）、8'−メチル（370）及び８−メ
チレンABA（357）の（＋）−形により行なわれる蒸散率
が比較されている。構造は以下の通りである。

種子の発芽 ABAは種子の発芽を阻害する（例えば、L.V.Gusta,B.E
wan.M.J.T Reaney及びS.R.Abrams 1992、コショウソウ
の発芽に対するアブシジン酸代謝産物の効果、Can J.Bo
t,70:1550−1555を参照のこと）。図５は、コショウソ
ウの種子の発芽に対する（＋）−8'−メチレンABA及び
天然ABAの効果を示している。１μＭで、８−メチレン
類似体は、ABAよりもさらに強く、５μＭでは、ABA処理
された種子が発芽し始めるのに対し、同じ濃度で類似体
の浸染を受けた種子は発芽しない。実験条件は以下の通
りである：すなわち、ペトリ皿の中で9cmのWhatman No.
1ろ紙上に100個の種子を置き、5mlの溶液で処理する。

ABA誘導性遺伝子発現 図６は、200μmolのABA又は（＋）−８‘−メチレンA
BAを24時間吸収させたトランスジェニックタバコ実生に
おけるβ−グルクロニダーゼ（GUS）活性の誘導を示
す。トランスジェニック実生は、GUSのコード配列と融
合したArabidopsis thaliana（Wang et al.1994,Plant
Physiol.104:291−292）（この記載内容は、参照により
本明細書に含まれる）からのABA−反応性cor6.6プロモ
ーターを含有した。この構築物を含有するトランスジェ
ニック植物のABA−誘導性及びその他の特性は、これま
でも記載されている（Wang et al.1995,Plant Mol.Bio
l.,28:605−617）（この記載内容は、参照により本明細
書中に含まれる）。ｙ軸は、任意の単位のGUS特異的活
性（Jefferson,1987,Plant.Mol.Biol.Reporter 5:387−
405（この記載内容は、参照により本明細書中に含まれ
る）に記載されているのと同様に実施した抽出及び検
定）を示す。結果は、34の実生を含む試料に関する２回
の検定の平均を示す。処理はいずれも、未処理対照に対
して、GUS活性を強度に誘導した。

９‘−アリル置換記を有するABA類似体（9'エチレンAB
A）の生物学的活性 成長阻害 ９‘−エチレンABA（R1＝アリール）の２つの異性体
の成長阻害特性を、図７に示す。図１に記載されている
のと同様に、検定を実行した。両異性体は、10μmolで
不活性で、100μmolで比較可能な活性を示した。ABAよ
りは弱い阻害剤であるが、しかしそれらは強力な活性を
保有した。

蒸散 図８に、（＋）形態のABAのメチルエステル及び９
‘−エチレンABAにより引き起こされる蒸散の低減の結
果を示す。両方の化合物に関して、同等の高活性が観察
された。

有用であるためには、ABA類似体はホルモン作動薬と
して作用する能力を保持しなければならない。付加的炭
素の立体障害は、ホルモン受容体タンパク質との結合を
妨害しないに相違ない。有望なことに、ABAの受容体と
の結合及びヒドロキシラーゼとの結合は主にABA分子の
異なる構造的特長に依っているという証拠がある。コム
ギ胚発芽を阻害する場合のABAの７‘、８‘及び９‘メ
チル基の相対的重要性の比較は、7'メチル基の存在が絶
対に不可欠であるがしかし他のものは重要性が低いこと
を示した（Welker−Simmons¹,et al.,1994）。これは、
受容体結合に重要な分子の一部（７‘炭素）に影響を及
ぼさずに基質結合部位（8'炭素）を変えるためのある程
度の自由が存在し得ることを示唆する。８‘又は9'−炭
素原子上にメトキシ又はアルキル基（Todoroki et a
l².,1994;Nakano et al³.,1995）を、あるいは８‘−炭
素原子上にフッ素（Todoroki et al⁴.,1995;Kim et a
l⁵.,1995）を保有するABA類似体は強力なABA作動薬であ
り、これはいくつかの場合のジェミナルジメチル基の修
飾がABA物質としての分子の認識を妨げないことを示唆
する。同様に、7'、８‘及び9'位置でのアルキル置換に
より、高ホルモン活性は一般に（＋）−ABAと同一の絶
対立体化学を有する分子に関して保持されることが明ら
かにされた（Nakano et al³.,1995）。これらの試験の
途中で、Nakano et al³.,1995は、（＋）−８‘−メチ
ルABAがGA₃刺激性α−アミラーゼ活性の遮断に際して
（＋）−ABAとほぼ同一の活性を有し、そしてレタス種
子発芽阻害、ムラサキツユクサの気孔開口及びイネ実生
葉の伸長において（＋）−ABAより高い活性を有するこ
とを示した。8'−メチルABAの高活性は、（同様の立体
的嵩量の）メチレン類似体もABA様物質として認識され
るべきであることを示唆した。これは、８‘−メチル及
び8'−メチレンABAの生物学的活性の比較が、それらは
類似の分子であるけれども８‘メチレンABAだけが8'−
ヒドロキシラーゼを不可逆的に不活性化する能力を有す
るために、考慮さるべき対象であることを意味する。

我々の化学的試験の重要な判定基準は、類似体が連続
的に短時間で、効率よく合成されて、生理学的活性の広
範な試験に、そしてさらに８‘−位置での修飾に十分な
量の物質を提供し得ることである。コショウソウ及びコ
ムギにおける発芽阻害、トウモロコシ懸濁細胞の成長阻
害、並びにコムギ実生における蒸散の低減を含めたいく
つかの生物学的検定において、（＋）−8'−メチレンAB
AがABAより有効であることを我々は後述する。

（＋）−８‘−メチルABA（７）の合成 臭化エチルマグネシウムを臭化ビニルマグネシウムに
置換することにより、（±）メチル８‘−メチレンアブ
シシン酸塩に関するのと同様の手法を用いて、（±）メ
チル８‘−メチルアブシジン酸塩を合成した。キラルHP
LCにより（±）メチル８‘−メチルアブシシン酸塩の２
つの鏡像異性体を分離し、そのエステルを（±）メチル
８‘−メチレンアブシジン酸の場合と同一方法で対応す
る酸に加水分解した。酸及びエステルの両方のスペクト
ル特性は、過去に報告された特性（Nakano et al³.,199
5）と一致した。

トウモロコシ懸濁細胞からの（＋）−８‘−メチレン
ABA［（＋）−４］の代謝体 ブラックメシキカンスイートBlack Mexican Sweetト
ウモロコシ細胞18gを、過去に記載された（Balsevich e
t al⁶.,1994）と同様に、滅菌培地500mlを含有する1Lフ
ラスコ中で継代培養した。翌日、エタノール0.5mlに溶
解した（＋）８‘−メチレンABA13.5mgを培地に入れ
て、最終濃度を100μＭとした。培養を回転振盪器で室
温で90時間インキュベートし、この時点でHPLCは高濃度
の代謝体を示した。培養期間終了時に、細胞を濾過して
除去した。単離のために処理加工するまで、濾液を凍結
した。

Supelco Amberlite XAD−２樹脂を用いたクロマトグ
ラフィー法（Balsevich et al.,6,1994）により、代謝
体を培養濾液から抽出した。樹脂から単離した粗製物質
を分取TLC（シリカゲル60 GF₂₅₄、20cmx20cmx1mm、溶
離液としてトルエン−EtOAc−HOAc 25:15:2）により一
部精製し、２つの異性体酸を得た。酸を別々にジアゾメ
タンと反応させて、次にHPLCによりさらに精製して、そ
のメチルエステルとして各代謝体約0.5mgを得た。スペ
クトルデータは、代謝体が２つの異性体エポキシドであ
ることを示した。

代謝体1:メチル８‘−メチレンオキシドABA5/6のメチ
ルエステル。FTIR（純）υ_maxcm^-1:3446（Ｏ−Ｈ）,171
7（Ｃ＝O,エステル）、1654（Ｃ＝O,エノン）、HREIMS:
m/z307,1573での［Ｍ＋１］^＋（C₁₇H₂₃O₅は307.1545を
要する）;¹H−NMR:δ7.89（d,J＝16.1Hz,1Hz,1H−４）,
6.01（d,J＝16.1Hz,1H−５）,5.99（d,J＝1.2z,1H−
５）,5.76（s,1H−２）,3.69（s,3H、CO₂CH₃）,3.23（d
d,J＝4.0,3.1Hz,1H−8'）,2.77（s,1H,OH）,2.74（t,J
＝4.1Hz,1H−10‘）,2.69（t,J＝3.0Hz,1H−10'）,2.34
（s,2H−５‘）,1.99（s,5H−6,7'）,0.91（s,3H−
９‘）。

代謝体2:8‘−メチレンオキシドABA5/6のメチルエス
テル。FTIR（純）υ_maxcm^-1:3447（Ｏ−Ｈ）,1717（Ｃ
＝O,エステル）、1654（Ｃ＝O,エノン）、HREIMS:m/z30
7.1560での［Ｍ＋１］^＋（C₁₇H₂₃O₅は307.1545を要す
る）;¹H−NMR:δ7.87（d,J＝16.1Hz,1H−４）,6.01（d,
J＝16.1Hz,1H−５）,5.99（d,J＝1.2z,1H−５）,5.76
（s,1H−２）,3.69（s,3H,CO₂CH₃）,3.23（dd,J＝4.0,
3.1Hz,1H−8'）,2.77（s,1H,OH）,2.74（t,J＝4.1Hz,1H
−10‘）,2.69（t,J＝3.0Hz,1H−10'）,2.34（s,2H−５
‘）,1.99（d,J＝1.0HZ,3H−6/7‘）,1.94（d,J＝1.1H
z,3H−6/7'）,1.02（s,3H−９‘）。

トウモロコシ細胞培地からの（＋）−８−メチレンAB
A、（＋）−８‘−メチルABA及び（＋）−ABAの消耗の
比較 （＋）−ABA、（＋）−８‘−メチレンABA及び（＋）
−8'−メチルABAのエタノール性ストック溶液を、トウ
モロコシ細胞0.2g及び培地10mlを含有するフラスコに付
加し、最終濃度100μＭのホルモン又は類似体を得た。
培地のアリコート（100μｌ）を時々取り出して、前記
（Balsevich et al⁶.,1994）と同様にHPLCによりABA又
はABA類似体含量に関して分析した。各化合物をフラス
コ中に植え付け、指示された時点で試料を２回取り出し
た。トウモロコシ細胞は、継代培養後１又は２日目に用
いた。

（＋）−８‘−メチレンABA［（＋）−４］の生物学的
定量トウモロコシ細胞の成長阻害及びpHの作用 前述（Balsevich et al⁶.,1994）と同様に、４日間の
最新重量の変化により、細胞成長を測定した。（＋）−
ABA及び（＋）−８‘−メチレンABAの付加に伴う培地の
pH変化も、Balsevich et al⁶.,（1994）により記載され
と同様に測定した。

コムギ実生における蒸散 ６〜10日齢コムギ実生（Triticum aestivum J.cv Kat
epwa）の蒸散率を、過去に記載された（Rose et al⁷.,1
996）（この記載内容は、参照により本明細書中に含ま
れる）のと同様に測定した。コムギ実生の蒸散率が50％
だけ低減される濃度を確定するために一連の濃度で類似
体（水中の１％エタノール溶液としての調製）の抗蒸散
活性を測定した。蒸散率（μmol H₂O/cm²）を算出し、
植物の初期蒸散率（典型的には0.28〜0.35μmol H₂O/cm
²）のパーセンテージとして示し、対照（１％エタノー
ル）の作用に対して修正した。

コショウソウ（cress）種子の発芽 Gusta等（1992）が記載したのと同様に、コショウソ
ウ種子（cress）発芽阻害試験を実行したが、但し、実
験は25℃の代わりに23℃で行い、アセトンの代わりにエ
タノールを用いて類似体を溶解した。検定溶液中のエタ
ノールの最終濃度は、＜0.05％であった。検定は各ペト
リ皿中に100個の種子を用いて実行し、３回実施した。
発芽測定は、主根の成長を基礎にした。根が種子とほぼ
同じ長さになったときに、種子は発芽したと考えられ
た。

コムギ胚発芽 軟質白色コムギ（Triticum aestivum L.cv.Clark's C
ream）の穀粒を用いた。生物学的定量のために、いくつ
かの付着内胚乳及び付着し果皮を有する胚をかみそりの
刃で穀粒から切り離した。最小量のDMSOに溶解して、0.
1M溶液を調製し、次に10μM Mes,pH5.8で0.001、0.1、
１、10及び100μＭに希釈することにより、類似体を調
製した。各類似体濃度に関して、６回の反復発芽検定
を、30℃で10個の胚の各々で実施した。胚を、溶液6ml
を含有するペトリ皿（100x15mm）中でインキュベートし
た。発芽した胚の数を４日間毎日計数し、加重発芽指数
を算出した（Walker−Simmons et al⁸.,1992）（この記
載内容は、参照により本明細書中に含まれる）。

トランスジェニックタバコにおける遺伝子発現 トランスジーンPcor6.6−GUSを含有するホモ接合体タ
バコ実生からの子葉のホモジネートのGUS特異的活性
を、H.Wang et al⁹.,（1995）による記載と同様に、測
定した。示した結果は、34の実生からの子葉を含有する
２回の試料の平均である。

ABAの両鏡像異性体が同様に有効であるコムギ胚成長
阻害試験では、４つの両鏡像異性体を（＋）−ABAと比
較した。メチレン類似体の生物学的活性を前に報告され
た８−メチルABA（Todoroki et al².,1994）と比較し得
るように、８−メチル同族体７を調製した。

BMS懸濁細胞培養における８−メチレンABAの代謝及び持
続性 培地からの（＋）−ABA及び（＋）−８‘−メチレンA
BA［（＋）−４］の消失の速度を比較して、代謝の相対
速度の簡単な概算をおこなった。図10から分かるよう
に、50％の（＋）−ABAが24時間までに培地から消失し
ていたが、一方（＋）−8'−メチレンABAは100時間まで
にほぼ50％が消費されただけであった。８‘−メチルAB
A（７）は、メチレン誘導体と同様の速度で消費され
た。これらの実験は、8'−メチレンABAが天然ホルモン
より持続性がかなり高いことを示す。

（＋）−８‘−メチレンABAの安定性及び代謝経路を
査定するために、（＋）−８‘−メチレンABA（＋）−
４の代謝中間体を単離し、ABA代謝が過去に記載されて
いる（Balsevich et al⁶.,1994）トウモロコシ懸濁培養
を用いて同定した。（＋）−８−メチレンABAを細胞に
摂取させて、２つの代謝中間体を培地から単離し、そし
てそれらのメチルエステルとして精製した。質量スペク
トル分析は、代謝中間体が各々、8'−メチレンABAのメ
チルエステルより以上に１個の酸素を含有することを示
した。２つの代謝中間体の¹H NMRは非常によく似てい
て、各々３つのビニル性陽子に関する信号を失ってお
り、そして各々３つの陽子信号を獲得し、化学シフトは
エポキシド組成と一致する。２つの異性体エポキシドは
二重結合の両面から酸化により生成されたと思われる。
位相性酸様分子に環化できないエポキシド酸化生成物も
活性であると考えられる。その生物学的活性を試験する
のに十分な量のこれらのエポキシドを合成するためにさ
らなる研究が進行中である。

BMS懸濁細胞培養における（＋）−８‘−メチレンABAの
生物学的活性 トウモロコシ懸濁培養化細胞は、ABA及びABA類似体の
生物学的活性及び代謝を比較するのに有用であった（Ba
lsevich et al⁶.,1994;Rose et al⁷.,1996）十分特性化
された実験系である。（＋）−ABAは、４日間に亘って
トウモロコシ懸濁培養化細胞の成長を阻害する（Balsev
ich et al.,1994）。本試験では、（＋）−８‘−メチ
レンABAは全試験濃度で（＋）−ABAより強力な成長阻害
活性を示した（図１）。誘導体の効力増大は、低濃度で
より顕著であった。0.33μＭでは、（＋）−ABAは対照
に対して17％だけ成長を阻害したが、一方（＋）−8'−
メチレンABAは64％低減を生じた。８‘−メチルABAによ
り引き起こされる阻害は、（＋）−ABAにより生じる阻
害に匹敵した（図11）。（＋）−メチレンABAは、
（＋）−ABA又は（＋）−8'−メチルABAより有意に強力
であった。活性増強は、単なる立体嵩量以上の余分の炭
素原子によるものに違いない。８‘−メチレン及び8'−
メチル類似体は同様の速度で培地から消耗されるため、
８‘−メチレンABAはいくつかの付加的特性を、おそら
くは受容体に対するより高い親和性を有するにちがいな
い。

天然ABAはトウモロコシ培地のpHの一過性上昇を引き
起こし、ABA付加後約６時間で最大に達する（Balsevich
et al⁶.,1994）。図２は、懸濁培養化トウモロコシ細
胞の培地のpHに及ぼす、同一濃度の天然ABAと比較した
場合の、（＋）−８‘−メチレンABAの10μＭ溶液の作
用を示す。pH変化の意味は明らかでないけれども、それ
は、ABA作用の早期顕示であると思われ、PAにより、並
びに非天然ABA（−）−異性体によりわずかだけ（Balse
vich et al⁶.,1994）を生じたのではない。この検定の
実益は、それが付加化合物の固有のホルモン活性の相対
的に迅速な試験であることである。8'−メチレン化合物
は、ABAにより引き起こされるのに匹敵するpHのシフト
を生じ、これはそれが同様の方法で作用することを示唆
する。

発芽阻害における８‘−メチレンABAの生物学的活性 休眠コムギ穀粒からの胚の発芽の阻害 休眠穀物粒から単離した胚は発芽阻害剤としての外因
性ABAに対して高反応性を示し、休眠はABAの適用により
元に戻される。天然（＋）−ABA及びその鏡像異性体
（−）−ABAはともに、コムギの切除胚に供給された場
合、発芽を阻害するのに同等に有効である（Walker−Si
mmons et al⁸.,1992）。図12に示すように、（＋）−８
‘−メチレンABAは天然ABAより少なくとも10倍は効力が
高く、1.0μＭ（＋）−8'−メチレンABAは10μＭ（＋）
−ABAと等価の阻害結果を示した。我々は胚における類
似体の代謝を測定しなかったが、ABAを上回る活性増大
は、一部は持続性が長いことに依っているようである。
これらの結果は、水和休眠穀粒胚のABAレベルの維持が
その成長休止に関与するという推論を支持し、このこと
は長期持続性ABA類似体、例えば８‘−メチレンABAが種
子休眠の誘導及び保持におけるABAの役割を調べるため
の有用な道具であることを示す。

（−）−８‘−メチレンABA（（＋）−８‘−メチレ
ンABAの鏡像）及び（＋）−８‘−メチルABAを含めた8'
−ABA類似体に関して、発芽阻害活性を査定した（図1
3）。（−）−８‘−メチレンABAは、効力が（＋）−AB
Aと同様である。（＋）−8'−メチルABA及び（＋）−８
‘−メチレンABAはともに、（＋）−ABAよりも活性が高
い。全濃度及び時点に亘って最も有効な化合物は、
（＋）−8'−メチレンABAであった。

コショウソウ種子発芽 図５は、コショウソウ種子の発芽に及ぼす２つの濃度
の（＋）−８‘−メチレンABA及び天然ABAの作用を示
す。１μＭで、8'−メチレン類似体はABAより効力が大
きく、5Mでは、ABAを供給された種子は発芽を開始した
が、一方類似体阻害種子は依然として休眠中であった。
要するに、（＋）−8'−メチレンABA ４は、単子葉植
物及び双子葉植物の種子のより有効な発芽阻害剤であ
る。種に対する種子発芽阻害において、類似体４はABA
より活性が高いと予測されるが、この場合、ABAの８
‘−ヒドロキシABAへのヒドロキシル化が分解の主経路
である。

コムギ実生の蒸散における８‘−メチレンABAの生物学
的活性 ABAは植物の蒸散調節に関与する鍵となる信号分子で
ある。本検定ではエステルが酸と同様の活性を有し（デ
ータは示していない）、したがって無傷コムギ実生の蒸
散に及ぼす天然ABA、（＋）−８‘−メチレンABA及び8'
−メチルABAのメチルエステルの作用を適用後３時間目
に比較した。最も活性の高い類似体は8'−メチレン化合
物で、これはコムギ実生の蒸散率を50％に低減するのに
（TR₅₀）５〜10μＭの濃度を要するが、ABAエステルは2
5〜50Mの濃度で50％阻害を引き起こした。飽和8'−側鎖
類似体は本検定では相対的に弱く、50％有効用量は100
μＭであった。この最終結果は、飽和８‘−メチル類似
体が気孔開口検定ではABAよりわずかだけ弱い、という
ことを示したNakano et al³.,（1995）による報告結果
とは非常に異なる。反応の差は、無傷コムギ実生におけ
る8'−メチルABAの摂取低減によると考えられる。

ABA誘導性遺伝子発現における８‘−メチレンABAの生物
学的活性 図14及び15は、（＋）−ABA、（＋）−８‘−メチレ
ンABA又は（＋）−８−メチルABAを24時間吸収させたト
ランスジェニックタバコ実生におけるABA−反応性遺伝
子発現の誘導を示す。トランスジェニック実生は、β−
グルクロニダーゼのタンパク質コード配列と融合したAr
abidopsis thaliana（Wang et al.,1994）からのABA−
反応性cor6.6プロモーターを含有した。100μＭでは、
（＋）−8'−メチレンABAはABAよりわずかに弱い誘導物
質であるが、類似体はABA−反応性遺伝子発現の誘導に
際しては非常に有効であった。８‘−メチルABAは、ABA
より約３倍弱かった（図15）。

以下の新規の化合物において、ABAの８‘−炭素原子
はアセチレンにより、又は付加的メチル基を保有するア
セチレンにより置換されていた。本化合物の一般的形態
を以下に示す： ８‘−メチレンABAの場合と同様に、PBI252から分子
を調製した。新規の類似体の実験手法及びスペクトルデ
ータを以下に示す。以下の実験では、トウモロコシ細胞
の成長阻害に際して、8'−アセチレンABAをABAと比較し
た。図９に示したように、新規の化合物はABAより有効
であった。したがって、それは超ABAとして作用する。

８‘−アセチレンABA及び8'−メチルアセチレンABA−メ
チル８‘−アセチレンABA −78℃でドライTHF（40ml）中のPBI 252（500mg）
に、臭化エチニルマグネシウム（５当量、19.1ml、THM
中の0.5M溶液）を付加した。溶液を−20℃に暖めて、16
時間放置した。反応混合物を水性NH₄Clで急冷し、酢酸
エチル（3x30m1）中に抽出した。併合有機抽出物を飽和
NaCl溶液で洗浄し、Na₂SO₄上で乾燥し、濃縮して、フラ
ッシュクロマトグラフィーで精製し、生成物360mgを得
た。HREMIS:m/zでの［M⁺］289.1416（C₁₇H₂₁O₄は289.14
40を要する）;IR υ_maxcm^-1:3286（w,O−Ｈ）,1716.6,
1669.7（Ｃ＝Ｏ）,¹H−NMR:δ7.86（d,1H−4,J＝16.1H
z）,6.02（t,1H−３‘,J＝1.1Hz）,5.90（d,1H−4,J＝1
6.1Hz）,5.74（s,1H−２）,3.68（s,CO₂CH₃）,2.64（s,
1H,OH）,2.63（dd,1H−5',J＝15.9,0.9Hz）,2.50（d,1H
−５‘,J＝16.8Hz）,2.27（s,1H−HCC）,1.98（d,3H−
６又は3',J＝1.1Hz）,1.95（d,3H−６又は３‘,J＝1.4H
z）,1.31（s,3H−９‘）。

Chiracel ODカラム（ヘキサン中10％IPA 3ml/分,1回
当たり20mgで注入）用いて、エステルを２つの鏡像異性
体に分離した。保持時間25.5分でのピーク［α］D²⁰＝
（＋）339.5［MeOH中0.43％］。保持時間36.3分でのピ
ーク［α］D²⁰＝（＋）342.8［MeOH中0.35％］。

（＋）−８‘−アセチレンABA MeOH 1mlに溶解した上記の（−）−エステル（10m
g）の溶液に、2M KOH 2mlを付加した。混合物を室温で
４時間攪拌し、その時点でそれをH₂O 5mlで希釈し、CH
₂Cl₂（3x20ml）で洗浄した。有機層を捨て、水性層を1M
HClで酸性にして、次にCH₂Cl₂（3x20ml）で抽出した。
併合有機抽出物を飽和NaCl溶液で洗浄し、Na₂SO₄上で乾
燥して、濃縮後、（＋）−８‘−アセチレンABA 7.9mg
（収率80％）を得た。

IRυ_maxcm^-1:3500−2500（br,O−Ｈ）,1684（Ｃ＝Ｏ）,
¹H−NMR:δ7.81（d,1H−4,J＝16.2Hz）,6.03（s,1H−３
‘）,5.95（d,1H−4,J＝16.1Hz）,5.77（s,1H−２）,2.
80（br,s,1H−OH）,2.63（d,1H−5',J＝17.0Hz）,2.50
（d,1H−５‘,J＝16.9Hz）,2.27（s,1H−HCC）,2.02
（d,3H−６又は3',J＝0.7Hz）,1.95（d,3H−６又は
３‘,J＝1.Hz）,1.31（s,3H−９‘）．［α］D²⁵＝
（＋）−316.8［MeOH中0.5％］。

同様の方法で（−）−８‘−アセチレンABAを製造
し、（＋）−鏡像異性体と同一のスペクトルデータが得
られ、以下の変化を示した：［α］D²⁰＝（−）−296.9
［MeOH中0.78％］。

メチル−８‘−メチルアセチレンABA −78℃でドライTHF（40ml）中のPBI 252（500mg）
に、臭化１−プロピニルマグネシウム（５当量、19.1m
l、THM中の0.5M溶液）を付加した。溶液を−20℃に暖め
て、２時間放置した。反応混合物を水性NH₄Clで急冷
し、酢酸エチル（3x30ml）中に抽出した。併合有機抽出
物を飽和NaCl溶液で洗浄し、Na₂SO₄上で乾燥し、濃縮し
た。粗製固体を得てるから再結晶化し、残りの母液を濃
縮し、フラッシュクロマトグラフィー（ヘキサン中25％
酢酸エチル）で精製し、生成物415mg（収率72％）を得
た。HREIMS:m/zでの［M⁺］303.1609（C₁₈H₂₃O₄は303.15
96を要する）;¹H−NMR:δ7.81（d,1H−4,J＝16.1Hz）,
5.98（s,1H−３‘）,5.90（d,1H−4,J＝16.1Hz）,5.72
（s,1H−２）,3.66（s,CO₂CH₃）,2.73（s,1H−OH）,2.5
5（dd,1H−5',J＝16.6,0.7Hz）,2.46（d,1H−５‘,J＝1
6.7Hz）,1.97（d,3H−６又は3',J＝1.0Hz）,1.92（d,3H
−６又は３‘,J＝1.3Hz）,1.75（s,3H−CH₃CC）,1.24
（s,3H−9'）。

Chiracel ODカラム（ヘキサン中の20％IPA 3ml/分）
を用いて、エステルを２つの鏡像異性体に分離した。保
持時間12.7分でのピーク［α］D²⁵＝（＋）350.8［CHCl
₂中3.54％］。保持時間18.4分でのピーク［α］D²⁵＝
（−）368.8［CHCl₂中3.35％］。

（＋）−８‘−メチルアセチレンABA MeOH 7mlに溶解した上記の（＋）−エステル（35m
g）の氷冷溶液に、2M KOH 7mlを付加した。混合物を室
温で４時間攪拌し、その時点でそれをH₂O 5mlで希釈
し、CH₂Cl₂（3x20ml）で洗浄した。有機層を捨て、水性
層を1M HClで酸性にして、次にCH₂Cl₂（3x20ml）で抽出
した。併合有機抽出物を飽和NaCl溶液で洗浄して、Na₂S
O₄上で乾燥して、濃縮後、（＋）−８‘−メチルアセチ
レンABA 30mgを得た。¹H−NMR:δ7.78（d,1H−4,J＝1
6.2Hz）,6.00（s,1H−３‘）,5.95（d,1H−4,J＝16.1H
z）,5.74（s,1H−２）,2.80（br,s,1H−OH）,2.56（d,1
H−5',J＝16.7Hz）,2.46（d,1H−５‘,J＝16.7Hz）,2.0
1（s,3H−６又は3'）,1.92（d,3H−６又は3',J＝0.9H
z）,1.74（s,3H,CCCH₃）,1.24（s,3H−９‘）.¹³C NM
R:δ196.24,170.62,163.25,151.21,133.18,130.17,127.
52,118.36,81.56,80.59,78.29,47.99,44.36,23.53,21.2
6,19.25,3.56［α］D²⁵＝（＋）−364［MeOH中3.0
％］。

同様の方法で（−）−８‘−メチルアセチレンABAを
製造し、（＋）−鏡像異性体と同一のスペクトルデータ
が得られ、以下の変化を示した：［α］D²⁰＝（−）−3
83.8［MeOH中2.84％］。

メチル８‘−メチレンABAの使用 canola種子発芽 減圧下でMeOHに溶解した類似体の10^-3M溶液を蒸発さ
せることにより、canola種子にメチル８‘−メチレンAB
A（PBI−365）を適用した。発芽制御に及ぼす作用を図1
6に示す。

移植したトウヒ実生の生存率を改良するためのメチル８
‘−メチレンABA（PBI−365） ABA類似体＃365で処理した室内装飾用トウヒ実生は、
連続乾燥条件下で優れた乾燥回避能力を有した。この乾
燥回避増強は、乾燥条件下での針状葉伝導率の低減及び
実生水分平衡の改良に依った。この類似体の乾燥回避能
力は、より高い処理濃度で増進した（図17）。

ABA類似体＃365は、最適土壌水分条件下で春及び夏植
物室内装飾用トウヒ実生の成長に負の作用を長期間及ぼ
さなかった（図18）。ABA類似体は、中等度及び重度の
乾燥条件下では実生成長に決定的な作用を及ぼさなかっ
たが、実生がほぼ致死的乾燥条件に曝された時に、成長
に正の影響を及ぼした。類似体は、最適条件下で室内装
飾用トウヒのガス交換能力を１〜３週間低減させ、高濃
度では長期間のガス交換低減を生じた（図19〜21）。

ABA類似体は、養樹灌漑システムによる適用を模倣し
た根−噴霧式水薬として適用された。無傷根−土壌結成
塊を有する実生を容器に入れ、ABA類似体処理液を表面
水薬として適用した。処理実生を、処理液流が結成塊に
再吸収されるように大型容器に２日間入れておいた。こ
れにより処理成分がすべて根の結成塊部分に取り込ま
れ、実生に確実に利用された。試験中、根−土壌結成塊
は無傷に保ち、ABA類似体処理が根系に密着して保持さ
れた。

この試験計画に関しては、ABA類似体＃365を10^-4、10
^−3.5及び10^-3Mの濃度で適用した。類似体をアセトン溶
液（＠１％）中に溶解してABA類似体処理液を調製し
た。さらに、アセトン＠１％のみの対照処理もおこなっ
た。類似体処理は、実験測定の開始２日前に１回適用し
た。各実生は、約20mlの類似体又は対照溶液を摂取し
た。

各濃度でABA類似体で処理した実生に関して、ガス交
換パラメーター（正味光合成（P_n）、針状葉伝導率（g
_wv）、水使用効率−報告せず）を測定した（ｎ＝８）。
ABA類似体適用後、各処理からの実生（ｎ＝75）をピー
ト−バーミキュライト成長培地中に鉢植えにし、制御環
境育成室（空気温度24±３℃、相対湿度40±10％、500
μmol/m²/sで明期20時間）に入れた。測定期間の最初の
20日間に９回、ガス交換パラメーターを査定した。その
後、測定期間の20日目から52日目まで、５回、定期的に
ガス交換を査定した。

処理適用直後に、実生（ｎ＝75）を８〜15日間の急速
乾燥に曝した。ABA類似体適用中は、飽和するまで実生
に注水した。24〜48時間後、ABA類似体溶液が実生の根
結成塊に吸収されると、根系にプラスチック袋を被せ
て、暗室に起き、新芽系を上記の制御環境条件に曝し
た。新芽蒸散により、実生は乾燥させられた。各処理か
らの実生（ｎ＝８）のガス交換パラメーター（P_n及びg
_wv）を、各昼光期間中に測定した。各ガス交換測定時
に、Ψを確定するために、実生を加圧室を用いて測定し
た。ガス交換パラメーター及び実生水分平衡の変化を期
間中測定した。実生は、全処理で、処理集団が＜−4.0M
paの平均Ψを有するか又はPnが負の値になるまで、乾燥
に曝された。

ABA類似体が死に至る可能性のある土壌乾燥に対して
実生にいかなる影響を及ぼしたかを調べるために、試験
を実行した。ABA類似体は、限定された土壌水分利用可
能性下での実生において、水分使用を制限し、有害な生
理学的条件を遅延させる、という仮説が得られた。ABA
類似体は、実生が潜在的致死性乾燥ストレスを回避して
生存し、正常の形態的発達を示すことができるようにす
る。

処理適用直後、実生（ｎ＝75）を急速乾燥させた。乾
燥中、Ψを確定するために、加圧室を用いて実生を測定
した。対照処理が＜−4.0Mpaの平均Ψを示した時点で、
全処理の実生（ｎ＝25）に対して乾燥を終了した。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 バルセビッチ，ジョン ジェイ. カナダ国，サスカチュワン エス７エイ チ ３エー２，サスカトゥーン，レイク クレセント 304 (72)発明者 カルター，エイドリアン ジェイ. カナダ国，サスカチュワン エス７エヌ ３ジェイ８，サスカトゥーン，サイト 509，ボックス ３，ルーラル ロー ド ＃５ (72)発明者 レイ，ボー カナダ国，オンタリオ エム３ジェイ ２ゼット３，ノース ヨーク，マーレイ ロス パークウェイ 500，アパート メント 717 (72)発明者 ローズ，パトリシア エー. カナダ国，サスカチュワン エス７エヌ ０エル５，サスカトゥーン，サスカチ ェワン クレセント イースト ３― 906 (56)参考文献 特開 昭58−148855（ＪＰ，Ａ) 特開 平７−300443（ＪＰ，Ａ) Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ａｂｓｔｒａｃｔ ｓ，要約番号127：275500 Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ａｂｓｔｒａｃｔ ｓ，要約番号123：340433 (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) ＣＡ（ＳＴＮ) ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ)

Claims (23)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】次の構造式（Ｉ）： （式中、R₁の一方はアルケニル、アルキニル、アリール
   又はシクロアルケニルであり、そしてR₁の他方はメチル
   であり、ここでC4〜C5位の結合が二重結合である場合は
   該結合はトランスであり、そしてC2〜C3の結合はシス又
   はトランスであり、そしてR₂はCH₂OH,CHO,COOH又はCOO
   −アルキルであり、ここでシクロヘキサノン環の二重結
   合は還元されていてもよい） により表わされる化合物。
2. 【請求項２】次の構造式（I a）： （式中、R₁はアルケニル、アルキニル、アリール又はシ
   クロアルケニルであり、ここでC4〜C5位の結合が二重結
   合である場合は該結合はトランスであり、そしてC2〜C3
   の結合はシス又はトランスであり、そしてR₂はCH₂OH,CH
   O,COOH又はCOO−アルキルであり、ここでシクロヘキサ
   ノン環の二重結合は還元されていてもよい） により表わされる化合物。
3. 【請求項３】式（I a）において、R₁がCH₂CH＝CH₂,CH＝
   CH₂,C≡CH及びCH₂C≡CHから成る群から選択される、請
   求項２に記載の化合物。
4. 【請求項４】次の構造式（I b）： （式中、R₁はアルケニル、アルキニル、アリール又はシ
   クロアルケニルであり、ここでC4〜C5位の結合が二重結
   合である場合は該結合はトランスであり、そしてC2〜C3
   の結合はシス又はトランスであり、そしてR₂はCH₂OH,CH
   O,COOH又はCOO−アルキルであり、ここでシクロヘキサ
   ノン環の二重結合は還元されていてもよい） により表わされる化合物。
5. 【請求項５】式（I b）において、R₁がCH₂CH＝CH₂,CH＝
   CH₂,C≡CH及びCH₂C≡CHから成る群から選択される、請
   求項４に記載の化合物。
6. 【請求項６】次の構造式： を有する、請求項２に記載の化合物。
7. 【請求項７】次の構造式： を有する、請求項２に記載の化合物。
8. 【請求項８】次の構造式： を有する、請求項２に記載の化合物。
9. 【請求項９】次の構造式： を有する、請求項２に記載の化合物。
10. 【請求項１０】次の構造式： を有する、請求項３に記載の化合物。
11. 【請求項１１】次の構造式（I a）： 〔式中、R₁は、アルケニル、アルキニル、アリール、シ
    クロアルケニル、重水素含有残基を含むその他のさらに
    置換された炭素鎖、及びヘテロ原子及びハロゲンを伴う
    炭素含有置換基であり、さらに５成員炭素側鎖がC3にメ
    チル基を含み、示されている通りC5が環に付着してお
    り、C4〜C5位置にトランス２重結合又はこの位置で３重
    結合そしてC2〜C3位置にシス又はトランスのいずれかの
    ２重結合が含まれており、そしてR₂はCH₂OH,CHO,COOH,C
    OOアルキル又はその誘導体であり、シクロヘキサノン環
    ２重結合を還元することもできる〕 で示される化合物の製造方法であって、 （ａ）不飽和基の接合体添加を行なうため、ＸがCl,Br
    又はＩである式R₁MgXのグリニャール試薬の存在下で、
    ３−メチルペント−２−エン−４−イン−１−オール又
    はそのヒドロキシル保護誘導体のジアニオンと、2,6−
    ジメチルシクロヘキサ−2,5−ジエン−1,4−ジオン又は
    その誘導体を反応させる段階；そして必要な場合には、 （ｂ）C4〜C5 ３重結合をトランス重結合へと還元し、
    C1ヒドロキシルを酸化してその機能的誘導体を形成する
    段階、及び （ｃ）非キラル出発物質が利用される場合、HPLCにより
    （＋）及び（−）異性体を分離する段階及び、 （ｄ）選択的オゾン分解法により8'位置をさらに修飾
    し、その後形成された8'−メチレンABAのアレヒドに対
    しWittigタイプの反応を行なう段階、 を含んで成る方法。
12. 【請求項１２】次の構造式（I b）： 〔式中、R₁がアルケニル、アルキニル、アリール、シク
    ロアルケニル、重水素含有残基を含むその他のさらに置
    換された炭素鎖、及びヘテロ原子及びハロゲンを伴う炭
    素含有置換基であり、さらに５成員炭素側鎖がC3にメチ
    ル基を含み、示されている通りC5が環に付着しており、
    C4〜C5位置にトランス２重結合又はこの位置で３重結合
    そしてC2〜C3位置にシス又はトランスのいずれかの２重
    結合が含まれており、そしてR₂はCH₂OH,CHO,COOH,COOア
    ルキル又はその誘導体であり、シクロヘキサノン環２重
    結合を還元することもできる〕 で表わされる化合物、又はその誘導体の製造方法であっ
    て、 （ａ）2,6−ジメチル−4,4−エチレンジオキシシクロヘ
    キ−２−セノンとR₁−Ｉを反応させ； （ｂ）このように形成された生成物を、３−メチル−ペ
    ント−２−エン−４−イン−１−オールのジアニオンと
    反応させる段階、そして必要な場合には、 （ｃ）C4〜C5の３重結合を２重結合へと還元し、C1アル
    コールを酸化してその官能的誘導体を形成する段階；及
    び （ｄ）8'−R₁エステルと9'−R₁エステルとをHPLCにより
    分離する段階； を含んで成る方法。
13. 【請求項１３】段階（ａ）で、出発物質としてジオンが
    用いられる、請求項11又は12に記載の方法。
14. 【請求項１４】段階（ａ）で、ジオンのC4−ケタールが
    出発物質として用いられる請求項11又は12に記載の方
    法。
15. 【請求項１５】段階（ａ）で、適当な触媒が含まれてい
    る、請求項11記載の方法。
16. 【請求項１６】触媒がヨウ化銅である、請求項15に記載
    の方法。
17. 【請求項１７】R₁が、CH₂CH＝CH₂,CH＝CH₂,C≡CH及びCH
    ₂CCHから成る群から選択される、請求項11〜16のいずれ
    か１項に記載の方法。
18. 【請求項１８】天然ABAの影響を受けていることがわか
    っている植物内の生物学的プロセスに影響を及ぼす用途
    のための、請求項１〜10のいずれか１項に記載の化合
    物。
19. 【請求項１９】植物の種子の発芽の制御のための請求項
    １〜10のいずれか１項に記載の化合物の利用。
20. 【請求項２０】植物内の抗蒸散活性を増強させるため
    の、請求項１〜10のいずれか１項に記載の化合物の利
    用。
21. 【請求項２１】植物内のABA誘発性遺伝子発現を増強す
    るための、請求項１〜10のいずれか１項に記載の化合物
    の利用。
22. 【請求項２２】植物の実生の中の移植ショックを低減さ
    せるための、請求項１〜10のいずれか１項に記載の化合
    物の利用。
23. 【請求項２３】植物がトウヒ実生であり、化合物は有機
    溶剤中10^-3〜10^-4Mの濃度で根部スプレーとして塗布さ
    れる、請求項22に記載の利用。