JP3524920B2 - 抗ウイルス組成物及びその使用方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 ［発明の背景］ 本発明は、メタロ有機コバルト化合物、及びウイルス
及びウイルス感染により引き起こされる状態及び疾患の
患者の治療にそれを使用することに関する。哺乳種に於
けるある種の状態及び疾患、例えば、炎症、熱傷、創傷
並びに細菌及び真菌により引き起こされる疾患が、構造
式： ［式中、各Ａは、同じか又は異なっていてよく、アルキ
ル基、フェニル基、又はフェニル基の置換誘導体であ
り、 各Ｙは、同じか又は異なっていてよく、水素、非分岐
のアルキル基、ハロゲン化物、又は構造式 （但し、Ｒは水素、アルコキシド基、アルキル基又はOH
である）を有する基であり、 各Ｂは同じか又は異なっていてよく、それぞれは水素
又はアルキル基であり、 各Ｘは同じか又は異なっていてよく、それぞれは弱乃
至中度の配位子場強度を有する水溶性基であり、そして Z^-は可溶性の、医薬的に受容し得る陰イオンである］ を有するコバルトのある種の錯体で治療することができ
ることが見出されている。

今日、ウイルス感染は人及び獣医学に於ける罹病率及
び死亡率の重要な原因であることが知られている。これ
らの疾患の多くは治療できないものであるか、又は利用
できる療法は完全には満足することができないか若しく
は最小の臨床的応答を与えるのみである。大抵は、ウイ
ルス疾患が従来の抗生物質による治療に対して応答しな
いことが知られている。抗ウイルス性化学治療剤の開発
に於ける幾つかの最近の成功にもかかわらず、これらの
疾患の新しい治療に於ては、臨床医学に於けるウイルス
感染の管理を改良することが必要である。

上記参照した親出願第502,294号には、上記の化合物
を抗ウイルス剤として使用することが開示されている。

［発明の要旨］ 本発明者は、今や、下記構造式： ［式中、各Ａは、同じか又は異なっていてよく、アルキ
ル基、フェニル基、又はフェニル基の置換誘導体であ
り、 各Ｙは、同じか又は異なっていてよく、水素、非分岐
のアルキル基、ハロゲン化物、又は構造式 （但し、Ｒは水素、アルコキシド基、アルキル基又はOH
である）を有する基であり、 各Ｂは同じか又は異なっていてよく、それぞれは水素
又はアルキル基であり、 Z^-は可溶性の、医薬的に受容し得る陰イオンであり、
そして 各Ｘは、同じか又は異なっていてよく、式： （式中、R¹、R²、R³及びR⁴は同じか又は異なっていてよ
く、水素又は１〜４個の炭素原子を有する低級アルキル
基である） を有する単位、及び式： （式中、R⁵、R⁶、R⁷、R⁸及びR⁹は同じか又は異なってい
てよく、電子供与性基及び電子求引性基からなる群から
選択される） を有する単位からなる群から選択されるアキシアル（ax
ial）配位子である。但し、R¹、R²、R³、R⁴、R⁵、R⁶、R
⁷、R⁸及びR⁹は、立体障害のためにアキシアル配位子のC
o原子への結合を阻止しないように十分に小さい大きさ
のものである。］ を有する一連の新規な化合物を見出した。

本明細書で使用するとき、用語「アキシアル」は、用
語「配位子」と一緒に使用するとき、配位子が分子の平
面の外側に配向している事実を指し、米国特許第5,049,
557号の図１と結びつけて記載されているものと同じ意
味を有する。本明細書で使用するとき、他に示さない限
り、アルキル基は１〜６個の炭素原子を含む線状、分枝
状又は環式アルキル基を意味する。

式IIの構造を有する本発明の化合物は、抗ウイルス剤
として著しい活性を示し、そのままで又は医薬的に受容
し得る担体と組み合わせたとき組成物の形でウイルス感
染を治療するために使用することができる。感染の性質
及びそれが顕れる態様に依存して、本発明の抗ウイルス
組成物を従来の投薬方式、例えば、経口、局所適用、非
経口等々を使用して投薬することができる。

本発明の抗ウイルス組成物は、適当な医薬的に受容し
得る担体、及び感染を起こすウイルスの複製を抑制する
ために及び／又は感染寿命サイクルを阻止するために有
効な量の本発明の化合物からなる。

［図面の簡単な説明］ 図１〜図７は、本発明の化合物で処理した動物及び比
較化合物で処理した動物に於ける皮質疾患研究を描いた
グラフである。

［発明の詳述な記述］ 本発明の化合物は多数の対イオンと共に結晶化させる
ことができる。ハロゲン化物イオン、PF₆ ^-及びBF₄ ^-のよ
うな医薬的に受容でき水溶性である対イオンが好まし
い。本発明の化合物の臭化物及び塩化物塩が、これらが
本発明の化合物の他の塩よりも水溶性であるので最も好
ましい。

上記のように、Ａは、アルキル基、フェニル基、又は
フェニル基の置換誘導体である。好ましくは、アルキル
基はC₁〜C₅基であり、メチル、エチル及びブチル基が特
に好ましい。適当なフェニル基の置換誘導体は、各置換
基がハロゲン化物、アルキル基、又は構造式 （但し、Ｒは水素、アルコキシド基、アルキル基、又は
OH基である）を有する基である誘導体である。今日まで
最も有用な誘導体は、置換基がハロゲン化物又はアルキ
ル基であるものであることが証明されている。

Ｙは、水素、非分岐のアルキル基、ハロゲン化物、又
は構造式 （但し、Ｒは水素、アルコキシド基、アルキル基又はOH
である）を有する基である。ある態様において、Ｙが塩
素原子、水素原子、又はC₁〜C₃アルキル基であることが
好ましい。Ｙが構造式 を有する態様に於いて、Ｒが水素、メチル基又はOH基で
あることが好ましい。

Ｂは水素又はアルキル基であり、好ましくはC₁〜C₃ア
ルキル基である。

Ｘは、環の窒素原子を介してコバルト原子に結合して
いるイミダゾール基又はピリジニル基である。イミダゾ
ール核又はピリジニル核は、水素原子又はそれに置換さ
れた電子供与性若しくは電子求引性基を有していてもよ
い。

側鎖基R¹、R²、R³、R⁴、R⁵、R⁶、R⁷及びR⁸を構成して
もよい電子求引性又は供与性基は、芳香核に特定の電子
求引性又は供与性効果を及ぼす当該技術分野で公知のも
のである。電子供与性基の典型は、アルキル、ヒドロキ
シル等々である。電子求引性基の典型は、NO₂ ^-、Cl^-、B
r^-等々である。特定の基の同一性（identity）は、それ
が化合物の所望の性質に有害である性質、例えば、低下
した抗ウイルス活性、増加した毒性等々をその分子に与
えない限り、非常に重要なことではない。更に、この基
は、立体効果、例えば、立体障害のためにアキシアル配
位子がコバルト原子に結合するのを阻止するほど大きい
ものであってはならない。

好ましくは、結合した基は１〜３個の炭素原子を有す
るアルキルである。中でもメチル及びエチルが最も好ま
しい。非置換、２−メチル、４−メチル及び２−エチル
イミダゾール並びに非置換ピリジニルが好ましい。

下記の表は本発明による好ましい化合物の構造を示
す。抗ウイルス活性を示すものとして親出願第502,294
号に開示されている化合物23は、下記の実施例で比較と
して示されるので含めている。下記の図表に於いて、Ｂ
は各場合にメチルであり、Ａ、Ｙ、Ｘ及びZ^-は構造式II
に使用した記号を指す。

本発明の組成物は医薬的に受容し得る担体及び抗ウイ
ルス有効量の上記定義した化合物からなる。勿論、一般
的にウイルス感染によりもたらされる状態の治療に於い
て、薬物投与がある期間にわたって周期的用量で与えら
れる治療の養生が必要であることが理解される。

何れにしても、本発明の化合物を使用する治療に於い
て、抗ウイルス有効量又は用量及び抗ウイルス有効用量
養生を使用することが重要である。本明細書で使用する
とき、抗ウイルス有効量又は用量又は養生は、ウイルス
の複製を抑制するために及び／又はウイルスの有効寿命
サイクルを阻止するために必要なこれらの濃度を十分に
超えている感染の細胞部位での特定化合物の十分な濃度
になる量、用量又は養生を意味する。

本発明の化合物及び組成物は、種々のウイルスにより
引き起こされる感染を治療する際に使用することができ
る。このグループ内にある種の化合物は、本発明のグル
ープ内の他の化合物に比較して特定されたウイルスに対
して一層大きい効能を示すことができる。従って、本発
明には、組成物が治療する特定のウイルスに対して有効
である量で上記定義したような化合物を含有する本発明
の組成物が含まれる。臨床的に重要な公知のウイルス
は、Stedman′s Medical Dictionary,24th Ed.,William
s ＆ Wilkins,1559−1565頁，（1982）;Virology,B.N.F
ields,D.M.Knipe,R.M.Chanock,J.L.Melnick,＆ R.E.Sho
pe,Raven Press,N.Y.（1985）に開示されている。Antiv
iral Agents and Viral Disease of Man,George J.Gala
sso,Richard J.Whitley,and Thomas C.Meriyan,Ed.,Thi
rd Edition,1990,Raven Press,N.Y.も参照されたい。

本発明の化合物は、中でも、ヘルペスウイルス、例え
ば、HSV−１、HSV−２、CMV、VZV、HHV−６、EBV等々に
対して特に有効である。

本発明の組成物は、適当な投薬形、例えば、糖衣錠、
カプセル剤、錠剤、エリキシル剤、又はその他の経口剤
形で経口で投薬できる。また、この組成物は滅菌蒸留水
又は生理食塩水中で皮下注射により投薬することもでき
る。局所投薬の場合、本発明の組成物はジメチルスルホ
キシド（DMSO）、生理食塩水中に入れたり、又は軟膏、
膏薬、クリーム等々の形態にすることができる。

典型的に、用量は、ウイルス状態の程度及び性質に依
存して、又は毎日よりも少ない頻度、例えば、隔日、毎
週等々のスケジュールに依存して一日１〜９回投薬する
ことができる。本発明の組成物は、マイクロカプセル形
からなるか又はリポゾーム内のカプセル化のような他の
系を介するもののような、持続性放出又は制御放出組成
物に処方することができる。これらの持続性放出系は、
所望の治療効能を得ながらより少ない頻度の投薬を許容
することができる。好ましくは、投薬は医療管理の下に
行い、ウイルス感染が治まるとき用量を減らすか又は一
日の投薬回数を制限する。

本発明の化合物は、溶解度は化合物によって変わるけ
れども水溶性であり、多数の従来の医薬的に受容し得る
担体に溶解することができる。適当な担体には、水又は
標準食塩水のような極性でプロトン性の溶媒が含まれ
る。この化合物はまた水と非混和性である懸濁媒体、例
えば、ペトロラタムに懸濁させることもできる。

これらの本発明の組成物を局所ルートで投薬すると
き、溶媒懸濁媒体中の濃度は0.1〜50mg/mLに変えること
ができる。好ましい濃度範囲は0.5〜10mg/mLである。

本発明の組成物を非経口ルートで与えるとき、0.01mg
/kg/日〜10mg/kg/日の用量範囲を使用することができ
る。

本発明の化合物の一般的な合成方法は、前記参照して
本明細書に含めた米国特許第5,049,557号に記載されて
いる。この特許に記載されているように、Co（II）錯体
と分子状酸素との反応は広範囲に研究された（R.S.Drag
o and B.R.Corden,Acc.Chem.Res.,1980,13,353及びE.C.
Niederhoffer,J.H.Timmons and A.E.Martell,Chem.Rev.
1984,84,137参照）。通常、コバルト（II）は水溶液中
で2:1ペルオキソ橋かけ錯体を形成する（E.C.Niederhof
fer,J.H.Timmons and A.E.Martell,Chem.Rev.1984,84,1
37参照）。近年、多数のCo（II）錯体が室温で1:1コバ
ルト−酸素付加物を与えることが報告されている。これ
らの錯体には、普通、Co（II）に結合したとき低スピン
平面幾何学的配列になる配位子が含まれている。これら
の錯体に塩基及びO₂を添加すると、塩基とO₂がアキシア
ル位置（axial position）を占める八面体錯体が形成す
ることになる（A.Summerville,R.D.Jones,B.M.Hoffman
and F.Basolo,J.Chem.Educ.,1979,56,3,157参照）。

種々の物理的技術を利用した測定に基づいて、Co:O₂
単位の最も正確な電子構造記述は、O₂ ^-に結合したCo（I
II）イオンであり、Co→O₂電子移動の実際の量は配位子
と供与体セットの性質に依存していることが、今よく受
け入れられる事実である（A.Summerville,R.D.Jones,B.
M.Hoffman and F.Basolo,J.Chem.Educ.,1979,56,3,157
及びD.Getz,E.Melamud,B.L.Silver and Z.Dori,J.Am.Ch
em.Soc.,1975,97,3846参照）。電子移動は配位子場強度
の増加につれて増加することが示された（R.S.Drago an
d B.R.Corden,Acc.Chem.Res.,1980,13,353参照）。この
ことは米国特許第5,049,557号の図１に描かれた分子軌
道図解及びその記述から容易に理解できる。

下記の実施例は本発明を示す。実施例で使用した方法
は下記の参照文献に記載されている。

1.修正Vero細胞培養モデル中及び涙液膜中でのin vitro
滴定測定（実施例３）について、Green and Dunkel,Ant
imicrob Agents and Chemother 20;580−582,1981;及び
Green and Dunkel,Invest.Ophthalmol.Vis.Sci.19;1336
−1341,1981参照。

2.in vivo上皮HSV−１誘発角膜炎（実施例３、４及び
５）について、Trousdale,Dunkel,Nesburn,Invest.Opht
halmol.Vis.Sci.19;267−270,1980;Pavan−Langston,La
ss,Campbell,Am.J.Ophthalmol.86;618−623,1978;Gree
n、Dunkel,Pavan−Langston,Exp.Eye Res.45;375−387,
1987参照。

3.in vivo皮質HSV−１誘発角膜炎について、Sabbaga,Pa
van−Langston,Bean,Dunkel,Exp.Eye Res.47;545−553,
Boisjoly,Woog,Pavan−Langston,Park,Arch.Ophthalmo
l.102;1804−1807,1984;Pavan−Langston,Dunkel,Arch.
Ophthalmol.107;1068−1072,1989参照。

4.ヘルペスウイルス用抗ウイルス薬物のin vitro活性及
び毒性について、上記のAntiviral Agents and Viral D
isease of Man,も参照。特に、第３章Dr.Earl R.Kernに
よるPreclinical Evaluation of Antiviral Agents:In
vitro and Animal Model Testing;及び第６章Dr.Debora
h Paran−LangstonによるMajor Ocular Viral Infectio
ns。

実施例１ HSV−１ウイルスでのin vitroアッセイ 試験する化合物の直接殺ウイルス効能、化合物の潜在
的毒性及び細胞内抗ウイルス活性を測定するために、in
vitroアッセイを行った。この試験は下記のようにして
行った。

A.使用したウイルス株 HSV−１ McKrae株を最小必須媒体（MEM）中で10⁵PFU
/mLの最終濃度まで希釈した。その後、この希釈液を便
宜上HSV−１懸濁液と呼ぶ。

B.試験する本発明の化合物の溶液の調製 5mg/mLの濃度の試験すべき各化合物の貯蔵溶液を調製
した。この貯蔵溶液をハンクスの平衡塩類溶液（HBSS）
中で順次希釈して、５、２、１、0.5、0.1、0.01、0.00
1及び0.0001mg/mLの最終薬物濃度を得た。これらの実験
のときに、ある種の化合物はより高い濃度で不活性であ
ることが観察された。このような場合に、得ることがで
きた最も高い溶解した濃度を用いた。後にこの不溶性は
単に溶解のために使用した方法のため、即ち、不十分な
攪拌を使用したことによるものであったことが分かっ
た。十分に攪拌すると、これらの化合物も完全に溶解し
た。

C.直接殺ウイルス効能の測定 それぞれの薬物溶液をHSV−１懸濁液と1:1比率で混合
した。薬物及びHSV−１懸濁混合物を37℃で30分間10分
毎に攪拌しながらインキュベーションした。インキュベ
ーションした後、50μＬのアリコートを三重融合ヒト包
皮線維芽細胞（HFF）細胞単層の上に載せた。接種物を3
0分間吸収させ、次いでMEM中に適当な薬物濃度を含む媒
体を、培養ウエル当り0.5mLの最終容積まで単層に添加
した。単層を37℃でインキュベーションした。発生する
（developing）HSV−１細胞病理（Cytopathology）を倒
立光学顕微鏡により二日間毎日モニターした。力価を重
回帰分析により算出した。全てのデータを接種後（PI）
24時間及び／又は48時間での平均PFU/mL減少として表わ
す。

D.対照 偽接種非処理HFF細胞単層を、「細胞単層対照」とし
て薬物処理単層と共に含めた。

1.HSV−１接種非化合物処理HFF単層を「陽性対照」とし
て含めた。

2.偽接種化合物処理HFF単層を化合物の潜在的「毒性効
果」を示すために含めた。

E.細胞内抗ウイルス活性の測定 HFF細胞単層に、上記のようにして調製したHSV−１懸
濁液を30分間37℃で吸収させることによって接種した。
ウイルスを吸収させた後、接種物を細胞単層から吸引
し、各化合物濃度の500μＬを三重HSV−１感染単層に添
加することにより、HSV−１感染単層を適当な濃度の化
合物の溶液を含む媒体で再水和した。全ての単層を37℃
でインキュベーションした。発生するHSV−１細胞病理
を倒立光学顕微鏡により二日間毎日モニターし、力価を
重回帰分析により算出した。分子内抗ウイルス活性につ
いて、「細胞単層対照」は薬物処理単層と共に偽接種非
処理HFF細胞単層を使用して得た。「陽性対照」はHSV−
１接種非CTC化合物処理HFF単層を使用して得た。

F.結果 表に於いて、記号は下記の意味を有する。

＋ ＝有毒 − ＝毒性無し ＋／− ＝中度の毒性 ND ＝行わず Ｔ ＝CPE評価で干渉された毒性効果 CPE＝細胞変性効果 実験１ 結果： 細胞単層対照 これらの単層中で有害なHFF細胞効果は明らかに無か
った。

コメント： 化合物82の毒性は、観察された23及び76の毒性よりも
一桁小さいと測定された。

82の殺ウイルス効能（IC₅₀）は23及び76について観察
されたものよりも一桁小さかった。それでこれらの化合
物について、HFF細胞毒性の低下は殺ウイルス効能と引
き替えたことが明らかである。

実験２ 結果： 細胞単層対照 これらの単層中で有害なHFF細胞効果は明らかに無か
った。

コメント： 化合物96は10mg/mLの不溶性であった。1mg/mLの濃度
での貯蔵溶液は適度に不溶性であった。前記のように、
この不溶性は不十分な攪拌のためであったことが後でわ
かった。しかしながら、96に毒性が無いことは1mg/mLで
明らかであり、抗ウイルス活性は23について観察された
ものと同様であった。

実験３ 結果： 細胞単層対照 これらの単層中で有害なHFF細胞効果は明らかに無か
った。

実験４ 結果： 細胞単層対照 これらの単層中で有害なHFF細胞効果は明らかに無か
った。

in vivoの化合物の抗ウイルス効能 コメント： 化合物の細胞内抗ウイルス活性は殺ウイルス活性より
少なくとも1log高い。このことは、本発明の化合物がHS
V−１への細胞内効果を有することに加えてHSV−１への
直接殺ウイルス効果を有することを示している。細胞内
効果は非特異性で時間依存性であると思われる。

実験５ 結果： コメント： IC₅₀及びIC₉₀薬物レベルは、非薬物処理対照単層に比
較したHSV力価に於ける減少に基づいて算出する。予め
観察したとき、毒性に於ける減少は効能の低下になる。

実験６ 細胞単層対照 これらの単層中で有害なHFF細胞効果は明らかに無か
った。

コメント： IC₅₀薬物レベルは、非薬物処理対照単層に比較したHS
V力価に於ける減少に基づいて算出した。毒性に於ける
減少（例えば、93及び96）は、この殺ウイルスアッセイ
に於ける化合物の効能の低下をもたらした。93及び96に
ついて観察された毒性を再び示した。毒性は0.5及び0.1
mg/mL濃度で一層顕著であると思われる。毒性は細胞球
状化、単層からの離脱、増大した粒状度及び正常形態の
損失として明らかである。0.5及び0.1mg/mLより低い濃
度では、細胞単層は明白な毒性効果無しに正常であると
（目視により）見えた。

実験７ コメント： 化合物の細胞内抗ウイルス活性は殺ウイルス活性より
少なくとも1log高い。

実施例２ A.使用したウイルス VZVをHFF細胞単層上で３−４＋のVZVによるin vitro
アッセイに於けるCPEレベルまで成長させた。VZVをフラ
スコから掻きとり、遠心分離し、細胞ペレットを完全媒
体10mL中に再懸濁させた。VZV細胞結合接種物100〜200
μＬを、37℃で60分間吸収させることによって集密的HF
F細胞単層に接種した。ウイルスが吸収された後、接種
物を細胞単層から吸引した。

B.試験する溶液の調製 化合物93、96及び23の濃縮物を下記のようにして調製
した。5mg/mLの濃度の各化合物の貯蔵溶液を調製した。
この貯蔵溶液をハンクスの平衡塩類溶液中で順次希釈し
て、５、２、１、0.5、0.1、0.01、0.001及び0.0001mg/
mLの最終薬物濃度を得た。各薬物濃度の500μＬを三重
感染単層に添加した。（化合物93は５及び2mg/mL濃度で
可溶性でなかったことが観察された。これらのアッセイ
で使用したこの化合物の最高濃度は1mg/mLであった。後
で説明するように、これは不十分な攪拌のためであっ
た。） C.接種及び分析 VZV感染単層を、適当な濃度の試験する化合物を含む
媒体で再水和した。全ての単層を37℃でインキュベーシ
ョンした。発生するVZV細胞病理を倒立光学顕微鏡によ
り７日間毎日モニターした。力価を重回帰分析により算
出した。

対照 偽接種非処理HFF細胞単層を、細胞単層対照として薬
物処理単層と共に含めた。

VZV接種非処理HFF単層を陽性対照として含めた。

結果 細胞単層対照 これらの単層中で有害なHFF細胞効果は明らかに無か
った。

in vivo研究 下記の例は、ウサギのRE株HSV−１誘発皮質角膜炎に
於ける本発明の化合物の局所眼効能評価を記載する。こ
れらの評価には、本発明の化合物の単独又はある例では
トリフルオロチミジン（TFT）との組み合わせの両方の
局所効能の分析が含まれていた。評価は、臨床パラメー
ターとウイルス学的（HSV−１回復）パラメーターとの
両方を一緒にした分析により行った。

各例に共通する手順は下記の通りである。

ウイルス接種 特定数のNZWウサギ（1.5〜2.0kg）を使用した。動物
は、これを動物飼育施設の条件に順応させるために接種
の少なくとも二日前に受け入れた。接種前の動物のこの
コンディショニングは動物変動性を最小にする。順応さ
せた後、予め存在する前区眼欠陥を有する全ての動物を
除外するために、動物を細隙光試験にかけた。動物には
10⁵PFU RE株HSV−１の皮質内注射により左右両方に接
種した。次いで動物を再び一匹ずつ檻内に入れた。

動物グループ分け及び毎日の評価 接種後（PI）第三日に、動物を細隙光顕微鏡により評
価した。角膜皮質、虹彩及び結膜疾患を、０＋から４＋
まで酷度の増加する目盛りで評点を付けた。評価した
後、動物を、一致した角膜皮質包含を基にそれぞれ等し
い数の動物を含む特定の数のグループに分けた。動物を
グループ分けした直後に局所治療を開始した。全ての動
物についてPI3日から７日まで毎日細隙光評価を行っ
た。眼HSV−１誘発疾患酷度を毎日記録した。

結膜及び角膜培養からのHSV−１回復 PI0日（前培養物）、３日、５日及び７日に、全ての
眼を感染HSV−１の存在についてモニターした。これ
は、下及び上結膜嚢を綿棒で拭き取り、鼻円蓋中に綿棒
を10秒間留めておくことにより涙膜を得ることによって
行った。この綿棒を個々にHBSS中に溶出した。ウイルス
−HBSS溶出液の50μＬアリコートを融合HFF細胞単層に
５分間吸収させた。この単層をMEMで水和し、37℃でイ
ンキュベーションし、HSV感染（HSV CPE）と一致する
発生する細胞病理を検出するために１〜２週間毎日観察
した。HSV CPEを示さない培養物は、陰性を確認するた
めにブラインド通過させた。

データ解析 本発明の化合物単独の（又は実施例４に於けるTFTと
一緒の）臨床的効能を、TFT及び偽薬治療の効能と比較
した。皮質変化の疾患消散及び発生に於ける差異が満足
できるように分析される。局所治療の間及び後のウイル
ス回復を比較した。

実施例３ 皮質角膜炎のウサギモデルに於ける皮質HSV−１感染
への化合物23及び96の局所効能を評価した。

この研究のために全部で20匹のNZWウサギを使用し
た。治療グループには下記のものが含まれた。

グループ＃1:ウサギ５匹、1mg/mL化合物23局所治療、９
回／日、５日間； グループ＃2:ウサギ５匹、1mg/mL化合物96局所治療、９
回／日、５日間； グループ＃3:ウサギ５匹、0.1％TFT局所治療、９回／
日、５日間； グループ＃4:ウサギ５匹、偽薬（滅菌水）治療、９回／
日、５日間； 全ての動物について、PI3日〜７日、及び９日及び10
日に毎日細隙光評価を行った。眼HSV−１誘発疾患酷度
を毎日記録した。

PI10日目に、動物を犠牲にし、角膜上皮を目から掻き
取り、上皮及び角膜皮質培養をHFF細胞単層上で行っ
た。より深部の皮質ウイルス感染から上皮ウイルスを分
離することにより、これらの明瞭な角膜層中のHSVの分
析が可能になる。角膜上皮及び皮質培養物を、倒立光学
顕微鏡により毎日評価した。HSV CPEを示さない培養物
は、陰性を確認するためにブラインド通過させた。

掻き取りの際に、三重結節腫を除き、HBSSで洗浄し、
細断し複製のHFF細胞単層上に浮かべた。細胞共培養物
を倒立光学顕微鏡で２週間モニターした。陰性の培養物
は７日間隔で二回ブラインド通過させた。全体細胞共培
養物に於けるHSV CPEの検出を、陽性又は陰性で評価し
た。本発明の化合物で処理した、TFTで処理した、及び
偽薬で処理した三重結節腫からのHSV回復を比較し、回
復速度に於ける差異を分析した。

結果 ４匹のウサギに偽接種し、これを化合物96で治療し、
1mg/mLの治療レベルでのウサギの目への潜在的眼毒性効
果を評価した。５日間局所治療をした後、毒性効果は明
らかに無く、角膜、結膜及び虹彩は臨床的に正常であっ
た。

ウサギへのHSV−１皮質感染の間の化合物23及び96の
効能を、TFT及び偽薬での効能と共に図１に示す。治療
グループの全ての目はこの分析に含まれた。図示するよ
うに、化合物96による治療は、PI4日、５日及び６日で
他の局所治療よりも著しく良好な結果（ｐ＜0.05）をも
たらす。ウサギの皮質HSV−１感染の間試験した化合物
の効能順位は下記の通りである。

化合物96＞＞化合物23＞TFT＞偽薬 接種後の皮質疾患発生（development）を三通りの異
なった方法でモニターした。図１は、全ての目を分析し
た第一の分析型を示す。第二の分析に於ては、治療グル
ープを、治療を開始した日に初期皮質疾患酷度が＜0.75
の皮質疾患クラスと＞0.75の皮質疾患クラスとに分け
た。第三の分析には、HSV−１感染の他の眼パラメータ
ーの比較が含まれた。これらのパラメーターには、ウサ
ギに於ける上皮HSV−１障害、結膜炎及び虹彩炎発生が
含まれた。

化合物96は、化合物23に比較してこの研究に於いて使
用した治療の全てに於いて優れた性質を示した。更に、
化合物96は角膜皮質角膜炎の発生を減少させたり及び／
又は防止する上で他の全ての治療剤よりも優れていた。
化合物23はPI7日、９日及び10日でTFT治療よりも優れて
いた。皮質疾患随伴がPI3日（治療を開始した日）に中
乃至高レベルであったとき、局所治療の効能の欠落が観
察された。しかしながら、化合物96での局所治療は、PI
3日目に＜0.75の皮質疾患発生を有する治療した目でTF
T、偽薬及び化合物23よりも満足できるほど良かった。
化合物96で治療した動物に示されるスキャリング（scar
ring）は、TFT動物に於けるスキャリングよりも著しく
低かった（スキャリングは新血管新生を伴うか又は伴わ
ない皮質曇り及びヘイズとして臨床的に明らかであ
る）。

下記の表22に、PI3日、５日、７日及び９日の涙膜培
養物からの並びに角膜上皮、角膜皮質及び三重結節腫か
らのウイルス回復の結果を示す。表の数値は、試料の全
数に対する陽性試料のパーセントを表わす。HSV−１の
涙膜回復は、PI7日のTFT処理グループで著しく異なって
いる。しかしながら、化合物間で示される他の差異は統
計的に有意ではない。しかしながら、角膜上皮培養物か
らのHSV−１の回復は、他の治療グループに比較して化
合物23治療目について著しく減少している。角膜皮質培
養物からの及び三重腫培養物からのHSV−１回復につい
て有意な差異は明らかにない。この結果は、最小のウイ
ルス増殖抑制又は殺ウイルスレベルより低い濃度で局所
的に適用した薬物が三重結節腫のレベルに決して到達し
ないか又は結節腫に到達するので予想されないことであ
る。

実施例４ 皮質角膜炎のウサギモデルの皮質HSV−１感染への化
合物23、96及び82の局所効能を評価した。

この研究のために全部で21匹のNZWウサギを使用し
た。治療グループには下記のものが含まれた。

グループ＃1:ウサギ４匹、1mg/mL化合物23局所治療、９
回／日、５日間； グループ＃2:ウサギ４匹、1mg/mL化合物96局所治療、９
回／日、５日間； グループ＃3:ウサギ５匹、1mg/mL化合物82局所治療、９
回／日、５日間； グループ＃4:ウサギ５匹、0.1％TFT局所治療、９回／
日、５日間； グループ＃5:ウサギ４匹、偽薬治療、９回／日、５日
間； 全ての動物について、PI3日〜７日に毎日細隙光評価
を行った。眼HSV−１誘発疾患酷度を毎日記録した。

結果 接種後の皮質疾患発生を三通りの異なった方法でモニ
ターした。最初に、治療グループの全ての目についての
皮質疾患評価を分析した。二番目に、治療グループを、
治療を開始した日に初期皮質疾患酷度が＜0.5の皮質疾
患クラスと＞0.5の皮質疾患クラスとに分けた。第三の
分析には、実施例３に於けるようなHSV−１感染の他の
眼パラメーターの比較が含まれる。

化合物82（1mg/mL）は、PI3日目に皮質疾患酷度＜0.5
＋を有する目の皮質疾患の発生を減少させるのに有効で
あった。皮質疾患酷度＞0.75を有する目に於いて、化合
物82治療は皮質疾患の発生又は進行を変えなかった。化
合物82は化合物23と96との間の中間の効能を示した。

化合物23、96及び82は全て涙膜内のHSV−１の回復を
減少させた。しかしながら、本発明の化合物とTFTとの
間に満足できる有意な差異は明らかに無かった。

図２は、試験した全ての化合物についての平均皮質疾
患評価を示し、化合物の効能順位が下記の通りであるこ
とを示している。

化合物96＞化合物82＞化合物23＞TFT＝偽薬 実施例５ 皮質角膜炎のウサギモデルの皮質HSV−１感染への、T
FTと組み合わせた化合物23及び96の局所効能を評価し
た。

この研究のために全部で21匹のNZWウサギを使用し
た。治療グループには下記のものが含まれた。

グループ＃1:ウサギ５匹、化合物23（1mg/mL）局所治療
４回／日及びTFT局所治療４回／日、５日間； グループ＃2:ウサギ５匹、化合物96（1mg/mL）局所治療
４回／日及びTFT局所治療４回／日、５日間； グループ＃3:ウサギ５匹、偽薬治療、８回／日、５日
間； グループ＃4:ウサギ２匹、0.1％TFT局所治療、４回／
日、５日間； グループ＃5:ウサギ２匹、化合物23（1mg/mL）局所治
療、４回／日、５日間； グループ＃6:ウサギ２匹、化合物96（1mg/mL）局所治
療、４回／日、５日間； グループ１、２及び３には、それぞれ組み合わせ治療
当り全部で10個の目のために５匹の動物が含まれてい
る。これは、個々の動物変動の最小化及び組み合わせ治
療の結果の統計的分析の実施を可能にした。グループ
３、４及び５にはそれぞれ２匹の動物が含まれている。
これらの単一剤治療はこれらの化合物の効能に於ける前
記のデータを確認するために使用した。化合物は組み合
わせ剤グループの投薬養生に合致させるためにより少な
い頻度の投与で使用した。結局、この研究もより少ない
頻度の局所投与として（前記の研究の９回／日に対して
４回／日）化合物23及び96での比較情報を与える。

PI7日目に、動物を犠牲にし、角膜上皮を目から掻き
取り、上皮及び角膜皮質培養をHFF細胞単層上で行っ
た。より深部の皮質ウイルス感染から上皮ウイルスを分
離することにより、これらの明瞭な角膜層中のHSVの分
析が可能になる。角膜上皮及び皮質培養物を、倒立光学
顕微鏡により毎日評価した。HSV CPEを示さない培養物
は、陰性を確認するためにブラインド通過させた。

結果 図３は、PI3日目に平均皮質疾患評価が＜0.5であった
ときの皮質疾患への組み合わせ薬物治療効能を示す。化
合物23又は化合物96の何れかを含む組み合わせ治療は、
ウサギ角膜に於ける皮質疾患の発生を減少させるのに有
効であった。組み合わせ治療眼皮質疾患評価は、PI6日
及び７日で偽薬治療とは統計的に異なっていた（ｐ＜0.
01:研究者のＴ試験）。この研究の過程で化合物96組み
合わせ治療と化合物23組み合わせ治療との間に統計的差
異は観察されなかった。図４は、PI3日目に平均皮質疾
患評価が＞0.5であったときの皮質疾患への組み合わせ
薬物治療効能を示す。皮質疾患はこれらの中度乃至重度
の皮質疾患目での局所組み合わせ治療に応答しなかっ
た。

図５は、PI3日目に初期皮質疾患が＜0.5であったとき
のTFTプラス化合物23の組み合わせに比較した単一剤TF
T、化合物23及び偽薬治療の効能を示す。TFT及び偽薬治
療は皮質疾患酷度を低下させる上で有効では無かった。
化合物23は皮質疾患の進行を遅くした。組み合わせ薬物
治療はこれらの動物の皮質疾患の進行を低下させる上で
有効であった。組み合わせ治療の結果はPI7日目で全て
の他の治療とは統計的に異なっていた。

図６は、PI3日目に初期皮質疾患が＞0.5であったとき
の偽薬治療に対する及びTFTプラス化合物23の組み合わ
せ治療に対する単一剤TFT、化合物20及び化合物23の効
能を示す。単一剤又は組み合わせ剤治療はこれらの目に
於ける皮質疾患の進行を低下させる上で有効であるとは
思われない。

図７は、PI3日目に平均皮質疾患評価が＜0.5であった
ときの皮質疾患への組み合わせ薬物治療効能対単一剤治
療を比較する。偽薬治療及びTFT治療（４回／日）は皮
質疾患の発生及び進行を低下させる上で有効では無かっ
た。４回／日の頻度での化合物96による治療は非常に有
効で、皮質疾患の進行及び発生を遅くした。この処理グ
ループについての平均皮質疾患はPI6日及び７日に偽薬
治療及びTFT治療の両方とは統計的に異なっていた（ｐ
＜0.01）。単一剤としての化合物96と組み合わせ剤とし
ての化合物96プラスTFTとの間に差異は見られなかっ
た。また組み合わせ薬物治療は皮質疾患を低下させる上
で非常に有効であった。組合わせ治療グループはPI6日
及び７日でTFT及び偽薬治療グループとは統計的に異な
っていた（ｐ＜0.01）。単一剤としての化合物96及びTF
Tとの化合物96の組み合わせの間に、皮質疾患評価に於
ける統計的な差異は観察されなかった。

図７は、PI3日目で平均疾患評価が＞0.5であるときの
HSV誘発皮質疾患への単一剤治療との組み合わせ薬物治
療効能の比較を示す。この疾患の発生及び進行を低下さ
せる上で、組み合わせ治療も単一剤治療も効果を持って
いない。

表23は、単一剤及び組み合わせ剤眼治療からのHSV−
１回復を示す。数値は培養物の全数当りの陽性回復培養
物％を表わす。

表23に示されるように、組み合わせ治療目に於けるウ
イルスの回復は、単一剤で治療した目の場合より低い。

実施例６ モルモットの一次性器HSV−２感染に於ける本発明の
抗ウイルス性化合物23、76及び82の活性を比較するため
に、一連の研究を行った。実験は偽薬対照とするもので
あり、非感染動物を、皮膚刺激を評価し、最大耐量を決
定するために三種の濃度のそれぞれの調合物で処理し
た。

モルモットの一般的HSV−２感染 A.最大耐量の決定 ３匹の非感染動物のグループを、皮膚刺激又は目に見
える毒性を評価するために、各化合物の20、10又は5mg/
mLの濃度で、局所的に（0.1mL膣内に＋0.1mL外性器皮膚
に）一日三回（約８時間毎に）７日間処理した。

B.ウイルス接種 実験動物感染のためにHSV−２のMS株を使用した。体
重250〜300gの雌性ハートレー系モルモット（Charles R
iver Breeding Laboratories,Kingston,NY）に、膣分泌
物を除去するために綿棒で拭き取って１時間後に、1.4
×10⁵プラーク形成単位のHSV−２を膣内に接種した。

C.モルモットの処理 10匹の感染モルモットのグループを、HSV−２で感染
させて６時間後又は24時間後に開始して、20mg/mL（最
大耐量）の各化合物で上記のようにして局所的に処理し
た。

D.試料捕集及びウイルスアッセイ 膣ウイルス複製への処理の効果を決定するために、膣
分泌物のスワブをHSV−２接種後１日、３日、５日、７
日及び10日に得て、2.0mLの媒体を含む管内に入れ、転
回し、HSV−２について滴定するまで−70℃で凍結させ
た。全ての試料を集めたとき、これらを溶かし、順次希
釈し、HSV−２力価をウサギ腎細胞を使用してマイクロ
タイター（microtiter）CPEアッセイで測定した。平均
極大ウイルス力価及びウイルス力価−日曲線下面積を算
出し分析した。

E.外性器病変の評点付け 外性器病変の発達及び展開に於ける治療の効果を決定
するために、病変酷度を一次感染（21日間）を通して０
〜５＋目盛りで評点を付けた。平均極大病変評価及び病
変評点−日曲線下面積を算出し分析した。

F.効能の評価 感染した動物の数／接種した動物の数、病変−日曲線
下面積及びウイルス力価−日面積、未処理動物と偽薬処
理動物との間の又は偽薬処理動物と薬物処理動物との間
の極大病変評点及び極大ウイルス力価を、Mann−Whitne
y Uランクサム試験（rank sum test）を使用して比較し
た。0.05又はこれより小さいｐ−値を有意であると考え
た。

結果 皮膚刺激への化合物23、化合物76又は化合物82による処
理の効果 三匹のモルモットのグループを、前記のように化合物
23、化合物76又は化合物82の20、10又は5mg/mLで処理し
た。これらの化合物によりこれらの濃度でどのような皮
膚刺激又は性器毒性の目に見える徴候も観察されなかっ
た。研究の間動物は外見上健康で正常であった。

II 膣ウイルス複製への化合物23、化合物76又は化合物
82による処理の効果 HSV−２接種した後、膣道に於けるウイルス複製は３
〜５日で極大に達し、次いで殆どの動物で徐々に減退し
10日に消失した。膣ウイルス力価への局所化合物23、化
合物76及び化合物82による治療の評価を表24に要約す
る。全ての三種の化合物による初期の処理は、HSV−２
で感染するようになった（少なくとも一スワブ日でウイ
ルスを単離した）動物の数を減少させた。感染６時間後
に開始して化合物23、化合物76又は化合物82を受けた動
物は50％の感染比率を有していた。全ての他のグループ
に於いて、接種した全ての動物（10％）は感染した。

ウイルス接種６時間後又は24時間後に開始した偽薬で
処理した動物は、未処理対照グループと同様であったウ
イルス力価−日曲線下面積（AUC）値及び平均極大ウイ
ルス力価を有していた。接種６時間後に開始して化合物
23、化合物76又は化合物82を受けた動物のウイルス力価
−日AUC値は、偽薬処理グループに比較したとき有意に
減少した（＜0.001のＰ−値）。＋６時間でのこれらの
化合物による処理も、偽薬処理動物と比較して平均極大
ウイルス力価を有意に減少させた（＜0.001のＰ−
値）。ウイルス接種24時間後に開始した化合物23又は化
合物76による治療もウイルス力価AUCを減少させた（＜
0.05P−値）。＋24時間での化合物82による処理はウイ
ルス力価AUCを変えることができず、＋24時間で与えた
ときどの化合物も平均極大ウイルス力価を減少させなか
った。

III. 病変発達への化合物23、化合物76又は化合物82に
よる処理の効果 HSV−２接種３〜４日後に、小嚢状の病変が外性器皮
膚に現れ始める。病変は７〜８日で潰瘍段階にまで進行
し、15〜21日で徐々に治癒する。病変発達及び酷度への
局所化合物23、化合物76及び化合物82治療の評価を表25
に示す。＋６時間及び＋24時間に偽薬で処理した動物
は、未処理対照グループと比較したとき病変評点−日AU
C値を有意に増加させた（＜0.001のＰ−値）。＋６時間
に与えた偽薬についての平均極大病変評点も、未処理対
照動物のそれよりも有意に大きかった（＜0.05のＰ−
値）。病変評点−日AUC値及び平均極大病変評点の両方
により決定した病変発達は、適当な偽薬処理した動物に
比較したとき、感染６時間後に開始したとき化合物23、
化合物76又は化合物82による処理により有意に減少した
（＜0.001のＰ−値）。また、感染＋24時間で投与した
化合物76は病変AUCを有意に変えた（＜0.01のＰ−値）
が、＋24時間偽薬処理グループと比較したときのみであ
った。この差異は未処理対照動物と比較したとき有意で
はなかった。

実施例７ 一連のウイルススクリーニング試験を化合物23、64、
67、93、96及び102について行った。化合物番号64及び6
7の構造は、米国特許第5,049,557号明細書の実験詳細部
のパラグラフ２及び３に記載されている。特に、化合物
64については、Ａはフェニルであり、Ｙは水素であり、
Ｂはメチルであり、Ｚ−は塩化物であり、そしてＸ及び
Ｘ′はNH₃である。化合物67について、Ａはメチルであ
り、Ｂはメチルであり、Ｙは塩素であり、Ｚ−は塩化物
であり、そしてＸ及びＸ′はNH₃である。化合物23、64
及び67は比較目的のためにスクリーニングした。その結
果を表26に示す。

抗ウイルス効能及び毒性を決定するために下記の方法
を使用した。

A.ヒト包皮線維芽細胞の調製 新生児のヒト包皮を、環状切除を行った後できるだけ
早く得て、バンコマイシン、フンギゾーン（fungizon
e）、ペニシリン、及びゲンタマイシンを通常の濃度で
含有する最少必須培地（MEM）に４時間置いた。次いで
この培地を除き、包皮を小片に細断し、赤色細胞がもは
や存在しなくなるまで繰り返して洗浄した。次いでこの
組織をCO₂インキュベーター内で37℃で15分間連続的に
攪拌しながら0.25％でトリプシンを使用してトリプシン
処理した。各15分間の終わりに、組織をフラスコの底に
沈殿させた。細胞を含む上澄み液を滅菌した寒冷紗を通
してMEM及び10％ウシ胎児血清が入っているフラスコに
注いだ。培地が入ったフラスコをトリプシン処理手順の
間中氷の上に保持した。各細胞の添加の後で、寒冷紗を
少量の血清含有MEMで洗浄した。新しいトリプシンを各
時点で包皮片に添加し、この手順をより以上の細胞が得
られなくなるまで繰り返した。次いで細胞含有培地を10
00RPMで４℃で10分間遠心分離した。上澄み液を捨て、1
0％FBSを含む少量のMEM中に細胞を再懸濁させた。次い
で細胞を、適当な数の25cm²組織培養フラスコに入れ
た。細胞は集密化しトリプシン処理を必要とするので、
これをより大きいフラスコに次第に広げた。細胞を継代
四までバンコマイシン及びフンギゾーン上に保持した。

B.細胞変性効果阻害アッセイ 低継代ヒト包皮線維芽細胞を、10％ウシ胎児血清（FB
S）で補足された（MEM）0.1mL中の2.5×10⁴細胞/mLの細
胞濃度で、使用する24時間前に96ウエル組織培養プレー
ト内に播種した。次いでこの細胞をCO₂インキュベータ
ー中で37℃で24時間インキュベーションした。インキュ
ベーションした後、培地を除去し、第一列以外の全てに
２％FBSを含むMEM100μＬを添加した。第一列に於て
は、実験薬物125μＬを三重ウエルに添加した。細胞ウ
エル及びウイルス対照ウエルの両方に培地単独を添加し
た。次いでウエルの第一列の薬物を、Cetus Liquid Han
dling Machineを使用して25μＬを移すことによって残
りのウエルに亘って順に1:5に希釈した。薬物を希釈し
た後、適当なウイルス濃度の100μＬを、MEM100μＬを
入れた対照ウエルを除いて各ウエルに添加した。HSV−
１及びHSV−２アッセイについては、使用したウイルス
濃度は1000PFU/ウエルであった。CMV及びVZVアッセイに
ついては、添加したウイルス濃度は2500PFU/ウエルであ
った。次いでプレートをCO₂インキュベーター中で37
℃、HSV−１及びHSV−２については３日間、VZVについ
ては10日間又はCMVについては14日間インキュベーショ
ンした。インキュベーション期間後、培地を吸引し、細
胞を0.1％クリスタルバイオレット溶液で30分間染色し
た。次いで染色物を取り出し、水道水を使用して全ての
過剰の染色物が除去されるまで洗浄した。プレートを24
時間乾燥し、次いでSkatron Plate Readerで620nmで読
み取った。

C.半固形オーバーレイを使用するHSV−１及びHSV−２に
ついてのプラーク減少アッセイ 使用する二日前に、HFF細胞を６ウエルプレートに入
れ、５％CO₂及び90％湿度で37℃でインキュベーション
する。アッセイの当日、薬物を二倍MEM中で所望濃度の
二倍に調製し、次いで６種の薬物濃縮物を使用して二倍
MEM中で1:5に順に希釈する。最初の出発濃度は普通200
μg/mLであり0.06μg/mLまで下げる。使用するウイルス
は、10％FBSを含有するMEM中で20〜30プラーク／ウエル
を与える所望の濃度にまで希釈する。次いで培地をウエ
ルから吸引し、0.2mLのウイルスを、薬物毒性ウエルに
添加する培地0.2mLと共に二通りで各ウエルに添加す
る。次いでプレートを15分毎に振盪させながら１時間イ
ンキュベーションする。インキュベーション期間の後、
等量の１％アガロースを等容積の各薬物希釈物に添加し
た。これにより100μg/mLで始まり0.03μg/mLで終わる
最終薬物濃度及び0.5％の最終アガロースオーバーレイ
濃度が得られる。薬物アガロース混合物を各ウエルに2m
Lの容積で適用し、次いでプレートを三日間インキュベ
ーションし、その後細胞をニュートラルレッドの1.5％
溶液で染色した。４〜６時間のインキュベーション期間
の後、染色物を吸引し、10倍の倍率で立体顕微鏡を使用
してプラークをカウントする。

D. VZVプラーク減少アッセイ−半固形オーバーレイ この手順は、下記の二点が異なる他は前記のHSVプラ
ークアッセイについてのものと基本的に同じである。

1. 薬物を使用した後、プレートを10日間インキュベー
ションした。

2. ３日目及び６日目に、等量の二倍MEM及び１％アガ
ロースを含むオーバーレイの追加の1mLを添加する。

E. CMVプラーク減少アッセイ−半固形オーバーレイ この手順は、下記の小さな変更を伴う他はHSV分析に
ついてのものと基本的に同じである。最初のオーバーレ
イ及び二個のオーバーレイについて使用したアガロース
は、１％ではなく0.8％である。アッセイは４日目及び
８日目に追加のオーバーレイ1mLを適用して14日間イン
キュベーションする。

F.液体培地オーバーレイを使用するプラーク減少アッセ
イ 液体オーバーレイプラークアッセイについての手順
は、アガロースオーバーレイを使用するものと同様であ
る。ウイルスを添加するための手順は、標準プラークを
添加する手順と同じである。薬物は、MEM中２％FBSの使
用濃度で調製する。薬物は前のアッセイに於けるように
二倍濃度で調製せず、所望の濃度で調製する。HSV−１
及びHSV−２アッセイについて、Baxter Health Care Co
rporationから入手した抗体標本を1:500に希釈し、薬物
が希釈されている培地に添加する。CMV及びVZVについ
て、オーバーレイ中に抗体は使用しない。CMVアッセイ
について、新規な薬物を含まない追加の培地を６日目に
添加し、全部で11日間インキュベーションする。VZVア
ッセイについて、追加の培地を５日目に添加し、全部で
８日間インキュベーションする。全てのアッセイについ
てインキュベーション期間の終わりに、培地を除去し、
細胞を洗浄し、次いで0.1％クリスタルバイオレット溶
液で10分間染色する。次いで細胞を数回すすいで過剰の
クリスタルバイオレットを除き、立体顕微鏡を使用して
プラークを数える。

G.細胞増殖アッセイ アッセイの24時間前に、HFF細胞を６ウエルプレート
に10％FBSを含有するMEM中ウエル当り2.5×10⁴細胞の濃
度で入れる。アッセイの当日、薬物を10％FBSを含有す
るMEM中で1:5の増分で順次希釈し、10μg/mLから0.03μ
g/mLまでの範囲をカバーする。DMSO中に溶解させる薬物
については、対照ウエルに10％DMSOを含有するMEMを入
れる。次いでウエルから培地を吸引し、次いで各薬物濃
度の2mLを各ウエルに添加する。次いで細胞をCO₂インキ
ュベーター中で37℃で72時間インキュベーションする。
この時間の終わりに、培地−薬物溶液をウエルから取り
出し、細胞を洗浄する。0.25％トリプシン1mLを各ウエ
ルに添加し、細胞がプレートから取れ始めるまでインキ
ュベーションする。次いで、細胞−培地混合物をピペッ
トで吸い上げそして激しく落として細胞懸濁液を壊し、
この混合物0.2mLをIsoton III 9.8mLに添加し、コール
ターカウンターを用いてカウントする。各試料は、一試
料当り三個の複製ウエルで三回カウントする。

H.細胞毒性のためのMTTアッセイ アッセイの24時間前に、HFF細胞を96ウエルプレート
にウエル当り2.5×10⁴細胞の濃度で入れる。24時間後
に、培地を吸引し、薬物1256μＬを第一列のウエルに添
加し、次いで自動Cetus Liquid Handling Systemを用い
てCPEアッセイで用いたものと同様の方法で順次1:5に希
釈する。次いでプレートをCO₂インキュベーター中で37
℃で７日間インキュベーションする。この時点で、各ウ
エルにダルベッコの燐酸塩緩衝食塩水中のMTTの１μg/m
L溶液50μＬを入れる。次いでプレートを更に４時間イ
ンキュベーションする。この時点で、培地を取り出し、
イソプロパノール中の0.04N塩酸100μＬで置き換える。
簡単に振盪した後、プレートをプレートリーダーで550n
mで読み取る。

I. EC50値も、公知の抗ウイルス剤について試験したウ
イルスのそれぞれについて測定した。比較化合物は、DH
PGが比較化合物であったHCMV以外の全てのウイルスにつ
いてACVであった。表26に於いて、これらの比較EC50値
を星印と共に示す。表27に於いて、対照として薬物FIAU
（２′−フルオロ−５−ヨード−アラビノシル−ウラシ
ル）を用いた。

実施例８ 本発明の化合物は下記の一般的な方法によって製造す
ることができる。コバルト−II錯体は、等モル量のN,
N′−ビスエチレンジイミン配位子、例えば、米国特許
第5,049,557号に開示されているようなL23及び類似物と
酢酸コバルトとをメタノール中で窒素下で混合すること
によって製造される。約2.2当量の所望のアキシアル配
位子を添加し、次いで酸化する。次いで塩化ナトリウム
又は臭化ナトリウムの飽和水溶液を添加することによっ
て所望の生成物を沈殿させ、次いでエタノール−水溶液
から再結晶させる。

化合物96（対イオンとして臭化物を有する）を下記の
ようにして合成した。

窒素バブラー及び２リットル滴下ロートを取り付けた
三ツ口フラスコに、純粋メタノール500mL中の配位子（L
23又はN,N′−ビス−（アセチルアセトン）エチレンジ
イミン）112g（0.5モル）を入れた。配位子溶液に、脱
気したメタノール1.5リットル中に溶解した酢酸コバル
ト四水和物125g（0.5モル）を添加する。反応混合物を
２時間攪拌し、次いで熱水浴上で15分間還流させる。オ
レンジ色の溶液が得られ、これにメタノール100mLに溶
解した２−メチルイミダゾール90g（1.1モル）を添加す
る。激しく攪拌しながら反応混合物を開放空気に曝す。
活性炭10gを攪拌した混合物に添加し、酸化を一夜続け
る。

次いで混合物を濾過し、最小量の水に溶解した臭化ナ
トリウム50gを、濾過した褐色溶液に添加する。得られ
た溶液を濃縮し、結晶化させる。粗生成物を熱エタノー
ル−水溶液から室温又はそれより低い温度で静置するこ
とによって再結晶化させる。生成物の純度を元素分析、
電子スペクトル及びNMRにより確認する。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ Ｃ０７Ｆ 15/06 Ｃ０７Ｆ 15/06 (56)参考文献 国際公開91／015212（ＷＯ，Ａ１) Ｐｏｌｉｓｈ Ｊ．Ｃｈｅｍ．，Ｖｏ ｌ．64，Ｎｏ．１−６，ｐ．305−316 （1990) Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ａｂｓｔｒａｃｔ ｓ，抄録番号112：15518（1990) Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ａｂｓｔｒａｃｔ ｓ，抄録番号98：171833（1983) (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C07D 213/20 C07D 235/20 ＣＡ（ＳＴＮ) ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ)

Claims (10)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】下記構造式を有する化合物： ［式中、各Ａは、同じか又は異なっていてよく、アルキ
   ル基、フェニル基、又は置換基として、ハロゲン原子、
   炭素原子数１〜５のアルキル基、もしくは構造式Ｒ−CO
   −（但し、Ｒは水素、炭素原子数１〜５のアルコキシド
   基、炭素原子数１〜５のアルキル基、もしくはOH基であ
   る）を有する置換フェニル基であり、 Ｙは、同じか又は異なっていてよく、水素、非分岐の炭
   素原子数１〜５のアルキル基、ハロゲン原子、又は構造
   式Ｒ−CO−（但し、Ｒは水素、炭素原子数１〜５のアル
   コキシド基、炭素原子数１〜５のアルキル基、又はOH基
   である）を有する基であり、 Ｂは同じか又は異なっていてよく、それぞれ水素又は炭
   素原子数１〜５のアルキル基であり、 Z^-は可溶性の、医薬的に受容し得る陰イオンであり、そ
   して Ｘは、同じか又は異なっていてよく、式： （式中、R¹、R²、R³及びR⁴は同じか又は異なっていてよ
   く、水素又は１〜４この炭素原子を有する低級アルキル
   基である）を有する単位である。］
2. 【請求項２】Ａが置換フェニル基であり、Ｙが、水素、
   非分岐の炭素原子数１〜５のアルキル基、ハロゲン原
   子、又は構造式Ｒ−CO−（但し、ＲはＨ、CH₃又はOH基
   である）を有する基であり、Ｂが水素又はC₁〜C₃のアル
   キル基であり、そしてZ^-がBr^-又はCl^-である請求項１に
   記載の化合物。
3. 【請求項３】Ａがメチル、エチル、ブチル、又はフェニ
   ルであり、Ｙが塩素、水素、又はC₁〜C₃のアルキル基で
   あり、ＢがC₁〜C₃のアルキル基である、請求項１に記載
   の化合物。
4. 【請求項４】Ｂがメチルであり、ＹがＨ又はClであり、
   Z^-がBr^-又はCl^-であり、Ａが−CH₃又はフェニルであ
   り、そしてＸが下記の群から選択される基である請求項
   １に記載の化合物。
5. 【請求項５】医薬的に受容し得る担体及び抗ウイルス的
   に有効量の請求項１乃至４から選ばれるいずれかの項に
   記載の化合物からなる抗ウイルス組成物。
6. 【請求項６】医薬的に受容し得る担体及び抗ヘルペスウ
   イルス有効量の請求項１乃至４から選ばれるいずれかの
   項に記載の化合物からなる抗ウイルス組成物。
7. 【請求項７】該化合物が、単純ヘルペスウイルス、サイ
   トメガウイルス、水痘帯状疱疹ヘルペスウイルス、及び
   エプスタイン・バールウイルスからなる群から選択され
   るウイルスに対して有効量で存在する、請求項５もしく
   は６に記載の組成物。
8. 【請求項８】医薬的に受容し得る担体及び抗ウイルス的
   に有効量の下記の化合物からなる抗ウイルス組成物。 ［式中、各Ａは、同じか又は異なっていてよく、アルキ
   ル基、フェニル基、又は置換基として、ハロゲン原子、
   炭素原子数１〜５のアルキル基、もしくは構造式Ｒ−CO
   −（但し、Ｒは水素、炭素原子数１〜５のアルコキシド
   基、炭素原子数１〜５のアルキル基、もしくはOH基であ
   る）を有する置換フェニル基であり、 Ｙは、同じか又は異なっていてよく、水素、非分岐の炭
   素原子数１〜５のアルキル基、ハロゲン原子、又は構造
   式Ｒ−CO−（但し、Ｒは水素、炭素原子数１〜５のアル
   コキシド基、炭素原子数１〜５のアルキル基、又はOH基
   である）を有する基であり、 Ｂは同じか又は異なっていてよく、それぞれ水素又は炭
   素原子数１〜５のアルキル基であり、 Z^-は可溶性の、医薬的に受容し得る陰イオンであり、そ
   して Ｘは、同じか又は異なっていてよく、式： ［式中、R⁵、R⁶、R⁷、R⁸及びR⁹は水素原子を表す］。
9. 【請求項９】該化合物が、抗ヘルペスウイルス有効量で
   存在する請求項８に記載の化合物からなる抗ウイルス組
   成物。
10. 【請求項１０】該化合物が、単純ヘルペスウイルス、サ
    イトメガウイルス、水痘帯状疱疹ヘルペスウイルス、及
    びエプスタイン・バールウイルスからなる群から選択さ
    れるウイルスに対して有効量で存在する、請求項８に記
    載の組成物。