JP3491036B2

JP3491036B2 - サイクリックヌクレオチドホスホジエステラーゼ阻害剤

Info

Publication number: JP3491036B2
Application number: JP2000192562A
Authority: JP
Inventors: 進丸山; 年昭市村; なほみ野田
Original assignee: National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST
Current assignee: National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST
Priority date: 2000-06-27
Filing date: 2000-06-27
Publication date: 2004-01-26
Anticipated expiration: 2020-06-27
Also published as: JP2002003394A

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、キノコあるいはそ
れを栽培した後の培地より抽出された水溶性リグニン、
穀類のフスマより抽出された水溶性リグニンのサイクリ
ックAMPホスホジエステラーゼ阻害作用に関する。

【０００２】

【従来の技術】リグニンは、セルロース、ヘミセルロー
スとともに、木材の主要成分として、自然界に最も豊富
に存在する有機物質の一つである。しかし、パルプ生産
時に副生される蒸解溶出液を原料として生産されるリグ
ニンスルホン酸が、主に工業用分散剤として利用されて
いるにすぎない未利用の天然資源である。また、リグニ
ンは穀類のフスマなどのほか、子嚢菌類、担子菌類から
も抽出することが可能であり、豊富な天然有機物質の有
効利用は大きな課題であった。また、ブナシメジなどは
オガクズなどを主成分とする培地で人工栽培されている
が、収穫後の培地の有効利用が課題であった。一方、松
かさ、各種のキノコの菌糸などの抽出液のリグニン画分
に抗HIV-1活性のあることが知られている。リグニン様
物質については他に末梢血単核細胞によるサイトカイン
の産生促進、マクロファージの活性化、培養細胞系での
インフルエンザウイルスや単純ヘルペスウイルスのプラ
ーク形成抑制などの生理活性が報告されている。更に、
リグニンの構成成分であるp-クマル酸、フェルラ酸、カ
フェー酸をH2O2の存在下、西洋ワサビペルオキシダーゼ
で脱水素重合させた高分子の合成リグニンも抗HIV-1活
性を有することが確認されている（日本臨床, Vol.51,
p.127 (1993)）。しかし、これらは未だ、実用化されて
おらず、サイクリックヌクレオチドホスホジエステラー
ゼ阻害の報告はされていない。サイクリックAMP（サイ
クリックアデノシン3', 5'- 一リン酸、環状AMP、cAM
P）は多くのホルモンや神経伝達物質の情報を細胞内の
標的分子に伝えるセカンドメッセンジャーであり、細胞
膜に存在するアデニル酸シクラーゼによって、ATPから
合成される。サイクリックAMPは細菌や動物界に広く存
在する。高等動物では、各種のホルモンが受容体・Ｇ蛋
白質・アデニル酸シクラーゼを活性化し、サイクリック
AMPの産生を促進する。動物におけるサイクリックAMPの
作用点はサイクリックAMP依存性プロテインキナーゼ（A
キナーゼ）であり、Aキナーゼは細胞内の多くの蛋白質
を基質とするため、サイクリックAMPは細胞の多彩な機
能を調節する。例えば、Aキナーゼは転写因子CREB（サ
イクリックAMP応答配列結合蛋白質）をリン酸化し、リ
ン酸化されたCREBがCRE（サイクリックAMP応答配列）に
結合し遺伝子の転写活性を制御することが知られてい
る。

【０００３】このような機能を有するサイクリックAMP
はサイクリックヌクレオチドホスホジエステラーゼによ
って5'-AMPに分解される。サイクリックヌクレオチドホ
スホジエステラーゼはアデニル酸シクラーゼとともに、
細胞内のサイクリックAMPの量的水準を調節していると
考えられている。サイクリックヌクレオチドホスホジエ
ステラーゼは脳、肺、肝臓、心臓など種々の組織中に存
在し、カルモジュリン（活性化因子）に対する結合性、
基質に対する親和性などが異なる数種類の酵素が存在す
る。このように、アデニル酸シクラーゼ、サイクリック
ヌクレオチドホスホジエステラーゼなどの活性を制御す
ることにより、サイクリックAMPの濃度を調節すること
により、様々な生体機能を調節することが可能と考えら
れる。例えば、肺の炎症過程では、体液性因子が血管内
皮細胞に働き、細胞間の隙間から血液中の蛋白質性の液
が間質に入り込みやすくなり、浮腫をもたらす。血管内
皮細胞のサイクリックAMP濃度上昇はこのような内皮透
過性を抑制することが報告されている（Am. J. Physio
l., Vol.275, p.L203 (1998）)。また、サイクリックヌ
クレオチドホスホジエステラーゼを阻害する物質として
はテオフィリンなどプリンアルカロイド系のものが多く
報告されているが、リグニン関連物質にそのような活性
は報告されていない。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、天然に豊
富に存在するリグニンを医薬品あるいは特定保健用食品
素材として有効利用、高度利用することを目的として、
動物細胞を用いて様々な生理活性を評価した結果、水溶
性リグニンなどにサイクリックヌクレオチドホスホジエ
ステラーゼ阻害作用のあることが判明し、本発明に至っ
た。すなわち本発明は（ａ）サイクリックヌクレオチドホスホジエステラーゼ
阻害作用を有する水溶性リグニンである。以下、本発明
を詳細に説明する。

【０００５】

【本発明の実施の形態】本発明に係る水溶性リグニン様
物質は、維管束植物の木部、子嚢菌類、担子菌類に特に
多量に含有され、p-クマリルアルコール、コニフェリル
アルコール、シナピルアルコールなどのフェニルプロペ
ノイドを構成単位とし、それが複雑に重縮合した不定形
ポリフェノールである。天然リグニンは非水溶性である
が、アルカリ処理などにより水溶性となるほか、子嚢菌
類、担子菌類はそれらが有する酵素の働きにより木質あ
るいは草本リグニンを低分子化、水溶性のリグニン様物
質に変換することが出来る。アルカリ処理による抽出は
例えばCereal Chem. Vol.66, p.289 (1989)に記載され
ている方法に準じて行うことができる。また、子嚢菌
類、担子菌類により変換されたリグニン様物質は例えば
100℃の熱水による抽出により回収することが出来る。
さらに、水溶性のリグニン様物質は、H2O2の存在下、西
洋ワサビペルオキシダーゼでフェルラ酸、p-クマル酸、
カフェー酸を脱水素重合させ合成することも可能であ
る。ペルオキシダーゼによる脱水素重合は、例えばChe
m. Pharm. Bull. Vol.39, p.950 (1991)に記載された方
法で行うことが出来る。以下に、本発明のサイクリック
AMPホスホジエステラーゼ阻害作用物質をブナシメジ栽
培後の培地より生産する方法を具体的に説明するが、か
かる物質は他の子嚢菌類又は担子菌類そのもの、あるい
はそれらの栽培後の培地からも同様に生産することがで
きる。このような菌類としてシイタケ、マツタケなどが
ある。また、このような菌類を栽培するための培地とし
ては、オガクズ、米ぬか、一般フスマ、オカラを主成分
とするものであればそれらの配合割合を問わない。ブナ
シメジ栽培後の培地に水を加え、80〜100℃で5〜60分加
熱処理した後に、遠心分離を行い、上清を回収する。こ
れに希塩酸等の無機酸を加えpH1〜２に調製し、生じた
沈殿物を水に懸濁し、アルカリ溶液を加えて中性にす
る。この溶液を低分子の限外濾過膜（例えばYM-1（アミ
コン社））にてろ過し、残留物を水でよく洗浄後、減圧
乾燥する。

【０００６】また、本発明に係るリグニン様物質を小麦
フフマから抽出するには、まず、上記のフスマはアセト
ン洗浄等による脱脂処理に付される。次に、α-アミラ
ーゼを添加したリン酸緩衝液中に脱脂フスマを加え、30
〜100℃で30分以上処理することにより、好ましくは70
〜90℃で１時間以上処理することにより行う糖分解処理
に付される。次に、プロテアーゼを添加した酢酸ナトリ
ウム緩衝液に糖分解処理フスマを加え、30〜90℃で１時
間以上処理、好ましくは、40〜60℃で５時間以上処理す
ることにより蛋白分解処理に付される。このようにして
酵素処理したフスマは、定法によりアルカリ抽出処理に
付される。例えば、水酸化ナトリウム溶液に酵素処理フ
スマを加え20〜50℃で30分以上抽出処理することによ
り、好ましくは、30〜40℃で１時間以上処理することに
より行う。抽出されたリグニンは、酸沈殿させ、遠心に
より回収される。本発明のサイクリックヌクレオチドホ
スホジエステラーゼ阻害剤は、そのままで、または通常
用いられる個体坦体、液体坦体、乳化分散剤等により錠
剤、粉剤、水和剤、乳剤、カプセル剤等の形に製剤化し
てサイクリックヌクレオチドホスホジエステラーゼ阻害
剤として使用することが出来る。上記坦体としては、
水、ゼラチン、澱粉、ステアリン酸マグネシウム、ラク
トース、植物油等が挙げられる。また、本発明の物質は
内皮透過性亢進を抑制する、あるいはサイクリックAMP
をセカンドメッセンジャーとするホルモンの代替をする
医薬としての利用の他、さまざまな食品中に添加して機
能性食品、特定保健用食品などとして用いることが出来
る。かかる食品として、清涼飲料、乳酸飲料、スープ、
チーズ、ハム、菓子類などが挙げられる。本発明の物質
はまた、ペットフード、飼料などに添加してペットや家
畜に対してホルモンの代替をして健康を改善する目的で
用いることが出来る。本発明のリグニン様物質を有効成
分として含有するサイクリックヌクレオチドホスホジエ
ステラーゼ阻害剤の使用形態としては、例えば静脈注
射、直腸投与等の非経口的投与、あるいは経口的投与が
例示される。サイクリックヌクレオチドホスホジエステ
ラーゼ阻害剤中における本発明のリグニン様物質の含有
量は、その投与経路、剤形によって適宜変更しうるが、
例えば、製剤全重量に対して本発明の物質を5〜90重量
％、好ましくは10〜60重量％含有させる。また、機能性
食品、特定保健用食品に添加して用いる場合には、例え
ば該食品中における本発明のリグニン様物質を0.01〜50
重量％含有させる。

【０００７】

【実施例】以下、本発明に係るサイクリックAMPホスホ
ジエステラーゼ阻害剤の実施例を説明する。ただし、本
発明は、このような実施例に限定されるものでなく、特
許請求の範囲の技術的事項の範囲内でさらにいろいろな
実施例があることは言うまでもない。実施例１（ブナシメジ栽培後の培地からのリグニンの抽
出）オガクズ、米ぬか、一般フスマ、オカラを主成分とする
ブナシメジ栽培用培地にて栽培したブナシメジを収穫し
た後、当該培地1.5kgに対し、水1.3リットルを加え、15
分間、100℃に保った。遠心分離を２回繰り返し、上清
を回収した。この溶液を希塩酸にてpH1に調製し、生じ
た沈殿物を少量の水に懸濁し、希水酸化ナトリウムにて
pH7付近に調製した。これにより沈殿物は完全に溶解し
た。この溶液を限外濾過膜YM-1（アミコン社）にてろ過
し、残留物を水でよく洗浄後、減圧乾燥した。これによ
りリグニン様物質を0.5g得た。

【０００８】実施例２（小麦フスマからのリグニンの抽
出） P.B.Schwarzら（Cereal Chem. Vol.66, p.289 (1989)）
の方法に準じて、小麦フスマからアルカリリグニンを抽
出、精製した。即ち、小麦フスマ30ｇにアセトン250ml
を加え脱脂した。この操作を更に２回繰り返し、減圧下
でフスマを乾燥させた。この脱脂小麦フスマを、フラス
コに入れ、リン酸緩衝液（50mM、pH7.5）700ml、α-ア
ミラーゼ（Bacillus licheniformis由来、シグマ社製）
300mgを添加し、撹拌しながら温度を90℃まで上昇させ
た。そしてリン酸緩衝液（50mM、pH7.5）150mlを加え、
85℃で１時間撹拌した。その後、45℃の水浴に移し、プ
ロテアーゼ（Streptomyces griseus由来、シグマ社製）
62mgを添加し、45℃で18時間撹拌した。反応後、8,000r
pmにて遠心分離し沈殿物を回収した。再度、沈殿物を水
中に分散させ、8,000rpmにて遠心分離し沈殿物を回収し
た。この洗浄操作を更に２回繰り返した。洗浄された沈
殿物に酢酸ナトリウム緩衝液（50mM、pH4.5）900mlを加
え、更にアミログルコシダーゼ（Rhizopus由来、シグマ
社製）120mgを添加し、45℃で20時間撹拌した。反応
後、前記と同様に洗浄し、沈殿物を得て減圧乾固した。
このように酵素処理した小麦フスマの全量に１N水酸化
ナトリウム450mlを加え、窒素ガス気流下で、30℃、２
時間撹拌した。そして、8,000rpmにて遠心分離して不溶
物を除去した。上澄液にpH1.0になるまで濃塩酸を徐々
に加えリグニンを沈殿させ、遠心分離してリグニンを回
収した。このリグニンにジオキサン70mlを加え、２日間
撹拌することによりジオキサン中にリグニンを溶解させ
た。12,000rpmの遠心分離により不溶物を除去し、上澄
液をロータリーエバポレーターにより10mlに濃縮した。
この液を１M酢酸120mlに滴下し沈殿物を得た。沈殿物を
減圧下で乾燥させ、酢酸及び水を除去した。得られた精
製リグニンはおよそ100mgの褐色粉末であった。この粉
末はフーリエ変換赤外分光法による測定の結果からリグ
ニンの構造を有していることが確認された。

【０００９】実施例３（サイクリックヌクレオチドホスホジエステラーゼ阻害
作用）サイクリックヌクレオチドホスホジエステラーゼ
阻害作用の測定は下記の方法により行った。シグマ社よ
り購入したウシ脳由来ホスホジエステラーゼアクチベー
タ（カルモジュリン）を緩衝液（62.5mMトリス塩酸緩衝
液、pH7.5、6.3mM塩化マグネシウム、3.8mM β-メルカ
プトエタノール、0.038mM塩化カルシウム）に溶解し、1
4.3ユニット/mlのアクチベータ溶液とした。また、シグ
マ社より購入したウシ脳由来ホスホジエステラーゼを上
記緩衝液に0.1ユニット/mlの濃度に溶解し、酵素溶液と
した。1mMのサイクリックAMP水溶液を基質溶液とした。
0.5ml容量のプラスチックチューブに、アクチベータ溶
液140μl、酵素溶液20μl、測定試料溶液20μlを入れ、
30℃で5分間保温した後、基質溶液20μlを加えよく混合
して、30℃で40分間反応を行った。その後、10％トリフ
ルオロ酢酸20μlを添加することにより反応を停止させ
た。反応停止後、生成したAMPを下記条件下で高速液体
クロマトグラフィーにより定量した。高速液体クロマトグラフィー測定条件カラム：μBondasphere 5μC₁₈ 300Å（ウォーターズ社
3.9 x 150 mm）溶出液：0.1％トリフルオロ酢酸を含む0〜63％のアセト
ニトリルの直線濃度勾配（20分）流速：１ml/min 検出：260nmの紫外部吸収このような実験を複数回行い、阻害率を次の式より算出
した。阻害率＝ (A - B) / A X 100 (％) ［式中、Ａ：阻害剤を含まない場合のAMPのピーク面
積、Ｂ：阻害剤添加の場合のAMPのピーク面積］また、
上記阻害率が50％になるペプチド濃度をIC₅₀値で表し
た。このようにして得られたIC₅₀値を表１に示す。

【００１０】

【表１】

【００１１】

【発明の効果】本発明のサイクリックヌクレオチドホス
ホジエステラーゼ阻害剤は下記の効果を奏する。（１）サイクリックヌクレオチドホスホジエステラーゼ
阻害作用を有する。（２）人のほか、犬、猫などのペット、牛、豚、馬など
の産業動物におけるサイクリックAMPをセカンドメッセ
ンジャーとするホルモンの代替をする、また、肺血管内
皮の炎症による内皮透過性亢進を抑制するなど、健康を
改善する目的で用いることが出来る。（３）本発明のサイクリックヌクレオチドホスホジエス
テラーゼ阻害剤は、自然界に豊富に存在する維管束植物
あるいは子嚢菌類、担子菌類より安価に生産することが
可能である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩＡ６１Ｐ 29/00 Ａ６１Ｐ 29/00 43/00 １１１ 43/00 １１１Ｃ１２Ｎ 9/99 Ｃ１２Ｎ 9/99 // Ｃ１２Ｎ 1/14 1/14 Ｇ (56)参考文献特開昭52−136193（ＪＰ，Ａ) Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．, 1981，Ｖｏｌ．29，Ｎｏ．12，ｐｐ. 3586−3592 (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) A61K 35/78 A61K 35/70 A61K 35/84

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】酵素処理した小麦フスマに水とアルカリ
を加え、不活性ガス気流下で撹拌した後、不溶物を除去
し、上澄液に無機酸を加えて沈殿させ、分子量１０００
以下のものを限外濾過し、遠心分離した水溶性化したリ
グニン様物質をさらに洗浄して得られるリグニン様物質
からなるサイクリックヌクレオチドホスホジエステラー
ゼ阻害剤。
【請求項２】酵素がα-アミラーゼ、プロテアーゼ、
アミログルコシダーゼのいずれか一種又は２種以上であ
る請求項１記載の水溶性化したリグニン様物質からなる
サイクリックヌクレオチドホスホジエステラーゼ阻害
剤。
【請求項３】子嚢菌類、担子菌類を、それらが有す
る酵素の働きにより木質あるいは草本リグニンを低分子
化し、分子量１０００以下のものを限外濾過し、水溶性
化したリグニン様物質をさらに洗浄して得られるリグニ
ン様物質からなるサイクリックヌクレオチドホスホジエ
ステラーゼ阻害剤。