JP3413970B2 - コンフォーカル顕微鏡 - Google Patents
コンフォーカル顕微鏡Info
- Publication number
- JP3413970B2 JP3413970B2 JP15637094A JP15637094A JP3413970B2 JP 3413970 B2 JP3413970 B2 JP 3413970B2 JP 15637094 A JP15637094 A JP 15637094A JP 15637094 A JP15637094 A JP 15637094A JP 3413970 B2 JP3413970 B2 JP 3413970B2
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- JP
- Japan
- Prior art keywords
- fluorescence
- scanning
- hole
- confocal microscope
- excitation light
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- Microscoopes, Condenser (AREA)
- Investigating, Analyzing Materials By Fluorescence Or Luminescence (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明はコンフォーカル顕微鏡に
関するものである。更に詳しくはレーザ走査型コンフォ
ーカル蛍光顕微鏡に関するものである。
関するものである。更に詳しくはレーザ走査型コンフォ
ーカル蛍光顕微鏡に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】コンフォーカル顕微鏡の光学的構成は図
６に示すようなものであった。励起光はダイクロイック
ミラー１で反射され、Ｘ−Ｙスキャナ２で走査された
後、対物レンズ３により焦点面４上に収束される。試料
５は蛍光色素で標識されている。試料５の焦点面４上の
点５ａで励起光の照射により励起された蛍光は、逆進し
て、対物レンズ３、Ｘ−Ｙスキャナ２を介し、ダイクロ
イックミラー１を透過して集光レンズ６によって集光さ
れる。点５ａから発生した蛍光が集光される結像面７に
は円形のピンホール８が配置されていて、点５ａから発
生した蛍光はピンホール８を通過して検出装置１１に入
射する。
６に示すようなものであった。励起光はダイクロイック
ミラー１で反射され、Ｘ−Ｙスキャナ２で走査された
後、対物レンズ３により焦点面４上に収束される。試料
５は蛍光色素で標識されている。試料５の焦点面４上の
点５ａで励起光の照射により励起された蛍光は、逆進し
て、対物レンズ３、Ｘ−Ｙスキャナ２を介し、ダイクロ
イックミラー１を透過して集光レンズ６によって集光さ
れる。点５ａから発生した蛍光が集光される結像面７に
は円形のピンホール８が配置されていて、点５ａから発
生した蛍光はピンホール８を通過して検出装置１１に入
射する。
【０００３】このような装置では、試料５の焦点面外の
点５ｂから発生した蛍光は結像面７外の点９に集光さ
れ、ピンホール８の置かれた結像面７では発散して広が
ってしまい、ピンホール８を通過する光の量は少なくな
る。また、試料５の焦点面外の点５ｃから発せられる蛍
光は結像面７外の点１０に集光されるので、結像面７で
は未だ集光が不充分で広がっており、ピンホール８を通
過する光の量は少ない。このため、検出装置１１に入射
する蛍光は、励起光が対物レンズ３により収束される点
５ａからの蛍光がほとんどである。
点５ｂから発生した蛍光は結像面７外の点９に集光さ
れ、ピンホール８の置かれた結像面７では発散して広が
ってしまい、ピンホール８を通過する光の量は少なくな
る。また、試料５の焦点面外の点５ｃから発せられる蛍
光は結像面７外の点１０に集光されるので、結像面７で
は未だ集光が不充分で広がっており、ピンホール８を通
過する光の量は少ない。このため、検出装置１１に入射
する蛍光は、励起光が対物レンズ３により収束される点
５ａからの蛍光がほとんどである。
【０００４】そして、ダイクロイックミラー１と対物レ
ンズ３との間に配置されたＸ−Ｙスキャナ２により、励
起光で焦点面４を走査し、焦点面４による断面上にある
試料５の部分の情報のみを取り出すことができるから、
対物レンズ３の光軸方向であるＺ方向の分解能は良好で
あり、またピンホールの大きさを適当に設定すると、通
過する光量と、Ｘ方向及びＹ方向の分解能とのバランス
を適切に確保することができる。
ンズ３との間に配置されたＸ−Ｙスキャナ２により、励
起光で焦点面４を走査し、焦点面４による断面上にある
試料５の部分の情報のみを取り出すことができるから、
対物レンズ３の光軸方向であるＺ方向の分解能は良好で
あり、またピンホールの大きさを適当に設定すると、通
過する光量と、Ｘ方向及びＹ方向の分解能とのバランス
を適切に確保することができる。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】従来のピンホールを用
いたコンフォーカル顕微鏡では、励起光で試料を走査
し、又発生した蛍光はピンホールで所望の物体面以外か
らの部分を通過させないために、検出される蛍光の強度
が小さいと言う問題があった。これを解決するために、
走査速度を遅くしたり、ピンホールの直径を大きくした
りして入射する蛍光の光量を増大して検出することが行
われていた。
いたコンフォーカル顕微鏡では、励起光で試料を走査
し、又発生した蛍光はピンホールで所望の物体面以外か
らの部分を通過させないために、検出される蛍光の強度
が小さいと言う問題があった。これを解決するために、
走査速度を遅くしたり、ピンホールの直径を大きくした
りして入射する蛍光の光量を増大して検出することが行
われていた。
【０００６】
【０００７】
【０００８】本発明はこのような従来の問題に鑑みてな
されたもので、コンフォーカル顕微鏡において、Ｚ方向
の分解能及び時間分解能を低下することなく、発生蛍光
量の検出器への入射効率を増大するものである。
されたもので、コンフォーカル顕微鏡において、Ｚ方向
の分解能及び時間分解能を低下することなく、発生蛍光
量の検出器への入射効率を増大するものである。
【０００９】
【課題を解決するための手段】本発明のコンフォーカル
顕微鏡は、光源から出射する励起光と前記励起光が標本
を照射して発生させる蛍光とを分離する光分離手段と、
前記光源から出射した励起光で前記標本の試料面を走査
する走査手段と、前記励起光を前記試料面に収束する対
物レンズと、前記試料面から発生し、前記対物レンズを
介し、前記光分離手段により分離された前記蛍光を点に
集光する集光レンズと、前記集光レンズの焦点面に配置
された孔と、前記孔を通過した前記蛍光を検出する検出
手段とを具備するコンフォーカル顕微鏡において、前記
孔は、前記蛍光の残光が通過可能な、前記走査手段の走
査方向に延伸した細長形状を有することを特徴とするも
のである。
顕微鏡は、光源から出射する励起光と前記励起光が標本
を照射して発生させる蛍光とを分離する光分離手段と、
前記光源から出射した励起光で前記標本の試料面を走査
する走査手段と、前記励起光を前記試料面に収束する対
物レンズと、前記試料面から発生し、前記対物レンズを
介し、前記光分離手段により分離された前記蛍光を点に
集光する集光レンズと、前記集光レンズの焦点面に配置
された孔と、前記孔を通過した前記蛍光を検出する検出
手段とを具備するコンフォーカル顕微鏡において、前記
孔は、前記蛍光の残光が通過可能な、前記走査手段の走
査方向に延伸した細長形状を有することを特徴とするも
のである。
【００１０】前記孔は、前記走査手段が第一の位置にあ
る時に、前記励起光により励起された前記蛍光を通過さ
せる孔と、前記走査手段が前記第一の位置から第二の位
置に移動する際に発生している前記蛍光の残光を通過さ
せる孔とから形成される細長形状の孔である。前記細長
形状は長円形状であることが好ましい。
る時に、前記励起光により励起された前記蛍光を通過さ
せる孔と、前記走査手段が前記第一の位置から第二の位
置に移動する際に発生している前記蛍光の残光を通過さ
せる孔とから形成される細長形状の孔である。前記細長
形状は長円形状であることが好ましい。
【００１１】前記細長形状は矩形であることが好まし
い。
い。
【００１２】前記細長形状の前記走査方向の長さは前記
走査手段の走査速度と標本から発生する蛍光物質の蛍光
寿命に応じて決定されることが好ましい。
走査手段の走査速度と標本から発生する蛍光物質の蛍光
寿命に応じて決定されることが好ましい。
【００１３】
【作用】集光レンズの焦点面に配置された細孔は、走査
手段の走査方向に延伸した細長形状を有し、走査手段が
所定の位置にある時標本から発生する蛍光、及び走査手
段が蛍光の所定の残光時間後に移動した位置にある時ま
での蛍光の残光が細孔を通過する。
手段の走査方向に延伸した細長形状を有し、走査手段が
所定の位置にある時標本から発生する蛍光、及び走査手
段が蛍光の所定の残光時間後に移動した位置にある時ま
での蛍光の残光が細孔を通過する。
【００１４】
【実施例】本発明の一実施例を図１〜図５により説明す
る。図１においてダイクロイックミラー１は、光源（不
図示）から出射する励起光を反射し、励起光の照射によ
り試料５から発生する蛍光を透過する波長分離器であ
る。Ｘ−Ｙスキャナ２は横のＸ方向及び縦のＹ方向に、
励起光及び蛍光を二次元走査するスキャナである。本実
施例においては、走査は先ず横のＸ方向に行われ、順次
縦のＹ方向に行われる。対物レンズ３は励起光を試料５
に収束して照射し、試料５から発生する蛍光をＸ−Ｙス
キャナ２に入射させる光学系である。集光レンズ６は蛍
光を集光する光学系であり、集光レンズ６による蛍光の
結像面７には細孔１６が配置され、細孔１６の後方には
蛍光を検出する検出装置１１が配置されている。
る。図１においてダイクロイックミラー１は、光源（不
図示）から出射する励起光を反射し、励起光の照射によ
り試料５から発生する蛍光を透過する波長分離器であ
る。Ｘ−Ｙスキャナ２は横のＸ方向及び縦のＹ方向に、
励起光及び蛍光を二次元走査するスキャナである。本実
施例においては、走査は先ず横のＸ方向に行われ、順次
縦のＹ方向に行われる。対物レンズ３は励起光を試料５
に収束して照射し、試料５から発生する蛍光をＸ−Ｙス
キャナ２に入射させる光学系である。集光レンズ６は蛍
光を集光する光学系であり、集光レンズ６による蛍光の
結像面７には細孔１６が配置され、細孔１６の後方には
蛍光を検出する検出装置１１が配置されている。
【００１５】光源（不図示）から出射された励起光はダ
イクロイックミラー１で反射され、Ｘ−Ｙスキャナ２で
走査されて、対物レンズ３により焦点面４に収束され
る。試料５の蛍光物質は励起光で照射されると励起され
て蛍光を発生する。蛍光は対物レンズ３を介し、Ｘ−Ｙ
スキャナ２で走査され、ダイクロイックミラー１を透過
し、集光レンズ６で結像面７上の１点に集光され、細孔
１６を通過して検出装置１１で検出され、検出装置１１
からはＸ方向の走査に対応する画像信号が順次出力す
る。
イクロイックミラー１で反射され、Ｘ−Ｙスキャナ２で
走査されて、対物レンズ３により焦点面４に収束され
る。試料５の蛍光物質は励起光で照射されると励起され
て蛍光を発生する。蛍光は対物レンズ３を介し、Ｘ−Ｙ
スキャナ２で走査され、ダイクロイックミラー１を透過
し、集光レンズ６で結像面７上の１点に集光され、細孔
１６を通過して検出装置１１で検出され、検出装置１１
からはＸ方向の走査に対応する画像信号が順次出力す
る。
【００１６】さて、蛍光は、試料５に含まれている蛍光
色素が励起光が照射して発生するが、照射終了して瞬間
的に消滅するものではなく、一般的に数ｎｓｅｃ〜数十
ｎｓｅｃの長さ減衰しながら持続している。発生した蛍
光の強度は、図２に示すように変化する。図２で横軸は
時間（ｔ）、縦軸は蛍光の強度（Ｉ）である。ある時間
ｔ１にパルス光を照射する時、蛍光色素が励起されて発
する蛍光の強度は、Ｉ１であり、時間の経過と共に減少
し、時間ｔ２では蛍光の強度はＩ２となる。蛍光の強度
の時間変化は、式Ｉ＝ｅｘｐ（−ｔ／τ）で表され、指
数関数的に減少する。尚ここに、τは蛍光寿命であり、
一般的に数ｎｓｅｃ〜数十ｎｓｅｃの大きさである。
色素が励起光が照射して発生するが、照射終了して瞬間
的に消滅するものではなく、一般的に数ｎｓｅｃ〜数十
ｎｓｅｃの長さ減衰しながら持続している。発生した蛍
光の強度は、図２に示すように変化する。図２で横軸は
時間（ｔ）、縦軸は蛍光の強度（Ｉ）である。ある時間
ｔ１にパルス光を照射する時、蛍光色素が励起されて発
する蛍光の強度は、Ｉ１であり、時間の経過と共に減少
し、時間ｔ２では蛍光の強度はＩ２となる。蛍光の強度
の時間変化は、式Ｉ＝ｅｘｐ（−ｔ／τ）で表され、指
数関数的に減少する。尚ここに、τは蛍光寿命であり、
一般的に数ｎｓｅｃ〜数十ｎｓｅｃの大きさである。
【００１７】今、Ｘ−Ｙスキャナ２の位置が図１の位置
２ａにある時、励起光が焦点面４上の点４ａに収束され
ているとすと、点４ａからの蛍光は結像面７の点７ａに
集光されている。時間ｔ２後には、図３に示すようにＸ
−Ｙスキャナ２の位置は位置２ｂに変化している。その
時、励起光が収束する点は点線で示した点４ｂに変化し
ている。点４ｂから発生する蛍光が点７ｂに集光するよ
うに変化したから、点４ａからの蛍光の残光は結像面７
の位置７ｂではなく位置７ａに集光するようになる。
２ａにある時、励起光が焦点面４上の点４ａに収束され
ているとすと、点４ａからの蛍光は結像面７の点７ａに
集光されている。時間ｔ２後には、図３に示すようにＸ
−Ｙスキャナ２の位置は位置２ｂに変化している。その
時、励起光が収束する点は点線で示した点４ｂに変化し
ている。点４ｂから発生する蛍光が点７ｂに集光するよ
うに変化したから、点４ａからの蛍光の残光は結像面７
の位置７ｂではなく位置７ａに集光するようになる。
【００１８】図４に示すよう点７ｂに対応して設けられ
た円孔１６ａは、Ｘ−Ｙスキャナ２が位置２ａにある
時、励起光により励起された蛍光が通過する孔であり、
点７ａに対応して設けられた円孔１６ｂは、Ｘ−Ｙスキ
ャナ２が位置２ｂにある時、蛍光の残光が通過する孔で
ある。細孔１６は円孔１６ａと円孔１６ｂとを２本の直
線で連結した長円であり、蛍光は、時間ｔ１で発生した
時から時間ｔ２までの残光を含み、細孔１６を通過した
検出装置１１で検出される。
た円孔１６ａは、Ｘ−Ｙスキャナ２が位置２ａにある
時、励起光により励起された蛍光が通過する孔であり、
点７ａに対応して設けられた円孔１６ｂは、Ｘ−Ｙスキ
ャナ２が位置２ｂにある時、蛍光の残光が通過する孔で
ある。細孔１６は円孔１６ａと円孔１６ｂとを２本の直
線で連結した長円であり、蛍光は、時間ｔ１で発生した
時から時間ｔ２までの残光を含み、細孔１６を通過した
検出装置１１で検出される。
【００１９】細孔の形状は長円に限られず、図５に示す
ような矩形１６ｃでも良い。
ような矩形１６ｃでも良い。
【００２０】上述したように本実施例では、Ｘ−Ｙスキ
ャナにより励起光で試料を二次元走査し、且つ蛍光も二
次元に走査されているから、時間分解能が低下すること
はないし、Ｚ方向の分解能は良好である。又細孔の長手
方向はＸ方向であるから、Ｙ方向の余計な光は細孔を通
過せず、Ｙ方向の分解能は良好である。
ャナにより励起光で試料を二次元走査し、且つ蛍光も二
次元に走査されているから、時間分解能が低下すること
はないし、Ｚ方向の分解能は良好である。又細孔の長手
方向はＸ方向であるから、Ｙ方向の余計な光は細孔を通
過せず、Ｙ方向の分解能は良好である。
【００２１】本実施例における細孔は細長形状を有して
いるが、蛍光寿命に対応する長さに限定された比較的短
いものであるから、Ｘ方向の分解能が大きく低下するこ
とはない。
いるが、蛍光寿命に対応する長さに限定された比較的短
いものであるから、Ｘ方向の分解能が大きく低下するこ
とはない。
【００２２】
【発明の効果】本発明のコンフォーカル顕微鏡により、
集光レンズの焦点面に配置された細孔が走査手段の走査
方向に延伸した細長形状を有し、走査手段が所定の位置
にある時標本から発生する蛍光、及び走査手段が蛍光の
所定の残光時間後に移動した位置にある時までの蛍光の
残光が細孔を通過するから、発生蛍光量の検出器への入
射効率が増大して、且つＺ方向の分解能及び時間分解能
を低下することなく、明るい蛍光像を観察することがで
きる。
集光レンズの焦点面に配置された細孔が走査手段の走査
方向に延伸した細長形状を有し、走査手段が所定の位置
にある時標本から発生する蛍光、及び走査手段が蛍光の
所定の残光時間後に移動した位置にある時までの蛍光の
残光が細孔を通過するから、発生蛍光量の検出器への入
射効率が増大して、且つＺ方向の分解能及び時間分解能
を低下することなく、明るい蛍光像を観察することがで
きる。
【図１】本発明の一実施例の光学構成図。
【図２】蛍光の強度の減衰を示す図。
【図３】本発明の一実施例の光学構成図。
【図４】本発明の一実施例にかかる細孔の平面図。
【図５】本発明の一実施例にかかる他の態様の細孔の平
面図。
面図。
【図６】従来の光学構成図。
Claims (4)
- 【請求項１】光源から出射する励起光と前記励起光が標
本を照射して発生させる蛍光とを分離する光分離手段
と、 前記光源から出射した励起光で前記標本の試料面を走査
する走査手段と、 前記励起光を前記試料面に収束する対物レンズと、前記試料面 から発生し、前記対物レンズを介し、前記光
分離手段により分離された前記蛍光を点に集光する集光
レンズと、 前記集光レンズの焦点面に配置された孔と、 前記孔を通過した前記蛍光を検出する検出手段とを具備
するコンフォーカル顕微鏡において、前記孔は、前記蛍光の残光が通過可能な、前記走査手段
の走査方向に延伸した細長形状 を有することを特徴とす
るコンフォーカル顕微鏡。 - 【請求項２】前記孔は、前記走査手段が第一の位置にあ
る時に、前記励起光により励起された前記蛍光を通過さ
せる孔と、前記走査手段が前記第一の位置から第二の位
置に移動する際に発生している前記蛍光の残光を通過さ
せる孔とから形成される細長形状の孔であることを特徴
とする請求項１に記載のコンフォーカル顕微鏡。 - 【請求項３】前記細長形状は長円形状又は矩形であるこ
とを特徴とする請求項１に記載のコンフォーカル顕微
鏡。 - 【請求項４】前記細長形状の前記走査方向の長さは前記
走査手段の走査速度と標本から発生する蛍光物質の蛍光
寿命に応じて決定されることを特徴とする請求項１、
２、または３に記載のコンフォーカル顕微鏡。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP15637094A JP3413970B2 (ja) | 1994-06-16 | 1994-06-16 | コンフォーカル顕微鏡 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP15637094A JP3413970B2 (ja) | 1994-06-16 | 1994-06-16 | コンフォーカル顕微鏡 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH085927A JPH085927A (ja) | 1996-01-12 |
| JP3413970B2 true JP3413970B2 (ja) | 2003-06-09 |
Family
ID=15626274
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP15637094A Expired - Lifetime JP3413970B2 (ja) | 1994-06-16 | 1994-06-16 | コンフォーカル顕微鏡 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3413970B2 (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP6205140B2 (ja) * | 2013-03-01 | 2017-09-27 | オリンパス株式会社 | 走査型レーザ顕微鏡装置 |
-
1994
- 1994-06-16 JP JP15637094A patent/JP3413970B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH085927A (ja) | 1996-01-12 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
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| EXPY | Cancellation because of completion of term |