JP3395905B2 - 遺伝子クローニングにおける試料外ヌクレオチドの使用 - Google Patents
遺伝子クローニングにおける試料外ヌクレオチドの使用Info
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Description
【発明の詳細な説明】
発明の分野
本発明は、遺伝子のクローニング及び発現において組
み替えDNAを操作するための改良法に関するものであ
る。より詳細には、本発明は、試料外ヌクレオチドを使
用して標的配列の核酸配列の3'または5'末端のいずれか
を変える方法を提供するものである。
み替えDNAを操作するための改良法に関するものであ
る。より詳細には、本発明は、試料外ヌクレオチドを使
用して標的配列の核酸配列の3'または5'末端のいずれか
を変える方法を提供するものである。
発明の背景：
精製された核酸フラグメントを増幅することのできる
組み換えDNA法は以前から知られている。典型的には、
係る方法論は、所望の核酸フラグメントのDNAまたはRNA
ベクター中への導入、該ベクターのクローニングによる
増幅、及び増幅された核酸フラグメントの回収を含む。
このような方法論の例は、コーエン等（米国特許第4237
224号）、T.マニアティス等、モレキュラー・クローニ
ング：ア・ラボラトリー・マニュアル（Molecular Clo
ning:A Laboratory Manual）、コールド・スプリング
・ハーバー・ラボラトリー、1982、等により供されてい
る。
組み換えDNA法は以前から知られている。典型的には、
係る方法論は、所望の核酸フラグメントのDNAまたはRNA
ベクター中への導入、該ベクターのクローニングによる
増幅、及び増幅された核酸フラグメントの回収を含む。
このような方法論の例は、コーエン等（米国特許第4237
224号）、T.マニアティス等、モレキュラー・クローニ
ング：ア・ラボラトリー・マニュアル（Molecular Clo
ning:A Laboratory Manual）、コールド・スプリング
・ハーバー・ラボラトリー、1982、等により供されてい
る。
幾つかの例においては、所望の核酸分子は供給材料か
ら容易に取得することができる。次いでこの分子を、
「リンカー分子」を添加［シェラー等、サイエンス（Sc
ience）196巻177−180頁（1977）］することにより、ま
たは所望分子を制限エンドヌクレアーゼで処理すること
により、適当なベクター中に挿入することができる。
ら容易に取得することができる。次いでこの分子を、
「リンカー分子」を添加［シェラー等、サイエンス（Sc
ience）196巻177−180頁（1977）］することにより、ま
たは所望分子を制限エンドヌクレアーゼで処理すること
により、適当なベクター中に挿入することができる。
しかしながら別の例においては、所望の核酸分子は、
遺伝子のクローニングをさせるに充分な濃度または量を
供給材料から得ることができない。このような状況にお
いては、その核酸分子を適当なベクター中に導入する前
に、例えば鋳型支配伸長によって増幅する必要がある。
プライマーの伸長は「ポリメラーゼ連鎖反応」（「PC
R」）または他の手段によって仲介され得る。
遺伝子のクローニングをさせるに充分な濃度または量を
供給材料から得ることができない。このような状況にお
いては、その核酸分子を適当なベクター中に導入する前
に、例えば鋳型支配伸長によって増幅する必要がある。
プライマーの伸長は「ポリメラーゼ連鎖反応」（「PC
R」）または他の手段によって仲介され得る。
「ポリメラーゼ連鎖反応」すなわち「PCR」におい
て、特定の核酸配列の増幅は、増幅されるべき配列の領
域に対し相補的な二つのオリゴヌクレオチドプライマー
を用いて達成される（図１）。
て、特定の核酸配列の増幅は、増幅されるべき配列の領
域に対し相補的な二つのオリゴヌクレオチドプライマー
を用いて達成される（図１）。
ポリメラーゼ連鎖反応は、その分子が前もって精製さ
れていなくとも、そして特定の試料中にただ一個のコピ
ーしか存在しなくとも、特定の配列を有する核酸分子の
濃度を選択的に増加させる方法を提供する。この方法は
一本鎖または二本鎖いずれのDNAの増幅にも使用するこ
とができる。
れていなくとも、そして特定の試料中にただ一個のコピ
ーしか存在しなくとも、特定の配列を有する核酸分子の
濃度を選択的に増加させる方法を提供する。この方法は
一本鎖または二本鎖いずれのDNAの増幅にも使用するこ
とができる。
ポリメラーゼ連鎖反応の総設は、K.B.ミュリス［コー
ルド・スプリング・ハーバー・シンポジア・オン・クウ
ォンティタティブ・バイオロジー（Cold Spring Harb
or Symp.Quant.Biol.）51巻263−273頁（1986）］;R.
K.サイキ等［バイオ／テクノロジー（Bio/Technology）
３巻1008−1012頁（1985）］;K.B.ミュリス等（メソッ
ズ・イン・エンザイモロジー（Met.Enzymol.）155巻335
−350頁（1987）;H.アーリッヒ等（EP50424;EP84796、E
P258017、EP237362）;K.ミュリス（EP201184）;K.ミュ
リス等（US4683202）;H.アーリッヒ（US4582788）；及
びR.サイキ等（US4683194）によって提供されており、
これらの記載は全て引用して本明細書の一部とする。
ルド・スプリング・ハーバー・シンポジア・オン・クウ
ォンティタティブ・バイオロジー（Cold Spring Harb
or Symp.Quant.Biol.）51巻263−273頁（1986）］;R.
K.サイキ等［バイオ／テクノロジー（Bio/Technology）
３巻1008−1012頁（1985）］;K.B.ミュリス等（メソッ
ズ・イン・エンザイモロジー（Met.Enzymol.）155巻335
−350頁（1987）;H.アーリッヒ等（EP50424;EP84796、E
P258017、EP237362）;K.ミュリス（EP201184）;K.ミュ
リス等（US4683202）;H.アーリッヒ（US4582788）；及
びR.サイキ等（US4683194）によって提供されており、
これらの記載は全て引用して本明細書の一部とする。
遺伝子配列を適当なベクター中に組み込む能力は典型
的には制限エンドヌクレアーゼを用いて実施する。即
ち、ベクター及び所望の遺伝子配列を、適合性の末端を
生成することのできる制限ヌクレアーゼで処理し、次い
でこれをライゲーションして、共有結合によって閉じた
ベクター分子を形成させる。好ましくは、この制限酵素
は、その認識サイトが所望の遺伝子配列中に存在しない
ものを選択する。
的には制限エンドヌクレアーゼを用いて実施する。即
ち、ベクター及び所望の遺伝子配列を、適合性の末端を
生成することのできる制限ヌクレアーゼで処理し、次い
でこれをライゲーションして、共有結合によって閉じた
ベクター分子を形成させる。好ましくは、この制限酵素
は、その認識サイトが所望の遺伝子配列中に存在しない
ものを選択する。
オリゴヌクレオチドリンカー／アダプターを使用せず
に、そして制限サイトの利用可能性または適合性に拘ら
ず、適当なベクター中に所望の標的配列をクローニング
させるためには、所望の標的配列のヌクレオチド配列を
普遍的に変えることができるということが望ましい。本
発明はこの目的を達成するために好適な方法を提供す
る。
に、そして制限サイトの利用可能性または適合性に拘ら
ず、適当なベクター中に所望の標的配列をクローニング
させるためには、所望の標的配列のヌクレオチド配列を
普遍的に変えることができるということが望ましい。本
発明はこの目的を達成するために好適な方法を提供す
る。
発明の要約
本発明は、遺伝子のクローニング及び発現において組
み替えDNAを操作するための改良法を提供するものであ
る。より詳細には、本発明は、標的配列の末端に存在す
る核酸配列を変えることのできる方法を提供する。
み替えDNAを操作するための改良法を提供するものであ
る。より詳細には、本発明は、標的配列の末端に存在す
る核酸配列を変えることのできる方法を提供する。
詳細には本発明は、
（Ａ）第一の鎖の少なくとも一方の末端に前もって選択
された配列の第一領域を有することを特徴とする、修飾
された所望核酸分子を形成させ［ここで、この配列は少
なくとも１個のdU残基を含んでいる］； （Ｂ）前もって選択された配列の第一領域を、dU残基の
うち少なくとも１個のウラシル塩基の除去をもたらすに
充分な条件下で処理し、それにより、修飾された所望分
子の少なくとも１個の鎖に、その鎖の相補的配列と水素
結合することのできる突出した末端を形成させ； （Ｃ）修飾された分子（Ｂ）を、少なくとも１個の突出
した一本鎖末端を有し、且つ修飾された所望DNA分子の
突出末端のうち少なくとも１個と水素結合することので
きる修飾されたベクターの存在下でインキュベートし、
それによりこの二本鎖線状所望核酸分子を二本鎖ベクタ
ー中に組み込む、 ことからなる、二本鎖線状所望核酸分子を二本鎖ベクタ
ー中に組み込む方法を提供する。
された配列の第一領域を有することを特徴とする、修飾
された所望核酸分子を形成させ［ここで、この配列は少
なくとも１個のdU残基を含んでいる］； （Ｂ）前もって選択された配列の第一領域を、dU残基の
うち少なくとも１個のウラシル塩基の除去をもたらすに
充分な条件下で処理し、それにより、修飾された所望分
子の少なくとも１個の鎖に、その鎖の相補的配列と水素
結合することのできる突出した末端を形成させ； （Ｃ）修飾された分子（Ｂ）を、少なくとも１個の突出
した一本鎖末端を有し、且つ修飾された所望DNA分子の
突出末端のうち少なくとも１個と水素結合することので
きる修飾されたベクターの存在下でインキュベートし、
それによりこの二本鎖線状所望核酸分子を二本鎖ベクタ
ー中に組み込む、 ことからなる、二本鎖線状所望核酸分子を二本鎖ベクタ
ー中に組み込む方法を提供する。
さらに本発明は、修飾された所望分子の一方の末端の
みがdU含有配列を含んでいる、上記方法の態様を提供す
る。
みがdU含有配列を含んでいる、上記方法の態様を提供す
る。
さらに本発明は、該末端が、修飾された所望分子の3'
末端または5'末端である、上記方法の態様を提供する。
末端または5'末端である、上記方法の態様を提供する。
さらに本発明は、修飾された所望分子の二つの末端が
dU含有配列を含んでいる、上記方法の態様を提供する。
さらに本発明は、末端の両方が3'末端である、または末
端の両方が修飾された所望分子の5'末端である、上記方
法の態様を提供する。
dU含有配列を含んでいる、上記方法の態様を提供する。
さらに本発明は、末端の両方が3'末端である、または末
端の両方が修飾された所望分子の5'末端である、上記方
法の態様を提供する。
さらに本発明は、所望DNA分子の第一の及び第二の鎖
の末端が複数のdU残基を含んでいる、上記方法の態様を
提供する。
の末端が複数のdU残基を含んでいる、上記方法の態様を
提供する。
さらに本発明は、工程（Ｂ）において、dU残基を、少
なくとも１個のdU残基のウラシル塩基を除去するに充分
な条件下においてUDGで処理し、それにより無塩基性サ
イトを形成させ、または工程（Ｂ）において、修飾され
た所望分子を無塩基性サイトで開裂させるに充分な条件
下で、この無塩基性サイトをエンドヌクレアーゼIVによ
り処理することをさらに含む、上記方法の態様を提供す
る。
なくとも１個のdU残基のウラシル塩基を除去するに充分
な条件下においてUDGで処理し、それにより無塩基性サ
イトを形成させ、または工程（Ｂ）において、修飾され
た所望分子を無塩基性サイトで開裂させるに充分な条件
下で、この無塩基性サイトをエンドヌクレアーゼIVによ
り処理することをさらに含む、上記方法の態様を提供す
る。
さらに本発明は、修飾された所望DNA分子の前もって
選択された配列の領域が同一である、上記方法の態様を
提供する。
選択された配列の領域が同一である、上記方法の態様を
提供する。
さらに本発明は、工程（Ｃ）において、制限エンドヌ
クレアーゼの作用により、または、該ベクターへのオリ
ゴヌクレオチドのライゲーションにより、または、 （Ｉ）該ベクターに、 （ｉ）第一の鎖の5'末端における、前もって選択され
た配列の第一の領域（ここで該配列は少なくとも１個の
dU残基を含む）； （ii）第二の鎖の5'末端における前もって選択された
配列の第二の領域（ここで該配列は少なくとも１個のdU
残基を含む）； を添加し、そして、 （II）前もって選択された配列の第一及び第二の領域
を、少なくとも１個のdU残基におけるウラシル塩基の除
去をもたらすに充分な条件の下で処理し、それにより、
突出する3'末端を有する修飾されたベクターを形成させ
る、 ことにより、二つの突出する一本鎖末端を生成させる、
上記方法の態様を提供する。
クレアーゼの作用により、または、該ベクターへのオリ
ゴヌクレオチドのライゲーションにより、または、 （Ｉ）該ベクターに、 （ｉ）第一の鎖の5'末端における、前もって選択され
た配列の第一の領域（ここで該配列は少なくとも１個の
dU残基を含む）； （ii）第二の鎖の5'末端における前もって選択された
配列の第二の領域（ここで該配列は少なくとも１個のdU
残基を含む）； を添加し、そして、 （II）前もって選択された配列の第一及び第二の領域
を、少なくとも１個のdU残基におけるウラシル塩基の除
去をもたらすに充分な条件の下で処理し、それにより、
突出する3'末端を有する修飾されたベクターを形成させ
る、 ことにより、二つの突出する一本鎖末端を生成させる、
上記方法の態様を提供する。
さらに本発明は、
（Ａ）前もって選択された配列の領域をそれぞれ有する
二つの末端Ａ及びＢを有する二本鎖線状または線状化さ
れたベクター分子、及び、 （Ｂ）前もって選択された配列の領域をそれぞれ有する
二つの末端Ｉ及びIIを有する二本鎖の所望核酸分子、 ［ここで、末端Ａにおけるベクター分子の第一の鎖の前
もって選択された配列の領域、及び、末端Ｉにおける所
望核酸分子の第二の鎖の前もって選択された配列の領域
は、互いにハイブリダイズし；そして、 末端Ｂにおけるベクター分子の第二の鎖の前もって選択
された配列の領域、及び、末端IIにおける所望核酸分子
の第一の鎖の前もって選択された配列の領域は、互いに
ハイブリダイズする］ からなる環状核酸分子を提供する。
二つの末端Ａ及びＢを有する二本鎖線状または線状化さ
れたベクター分子、及び、 （Ｂ）前もって選択された配列の領域をそれぞれ有する
二つの末端Ｉ及びIIを有する二本鎖の所望核酸分子、 ［ここで、末端Ａにおけるベクター分子の第一の鎖の前
もって選択された配列の領域、及び、末端Ｉにおける所
望核酸分子の第二の鎖の前もって選択された配列の領域
は、互いにハイブリダイズし；そして、 末端Ｂにおけるベクター分子の第二の鎖の前もって選択
された配列の領域、及び、末端IIにおける所望核酸分子
の第一の鎖の前もって選択された配列の領域は、互いに
ハイブリダイズする］ からなる環状核酸分子を提供する。
さらに本発明は、一方の鎖の末端に少なくとも１個の
dUヌクレオチドを有する二本鎖オリゴヌクレオチドの入
った第一の容器、及び、該dU残基のウラシル塩基を除去
することのできる酵素の入った第二の容器を、近接した
区分化の下に含むよう特に適合させたキットを提供す
る。
dUヌクレオチドを有する二本鎖オリゴヌクレオチドの入
った第一の容器、及び、該dU残基のウラシル塩基を除去
することのできる酵素の入った第二の容器を、近接した
区分化の下に含むよう特に適合させたキットを提供す
る。
さらに本発明は、少なくとも１個の突出した末端［こ
こでこの末端は、該オリゴヌクレオチドのdU含有鎖のヌ
クレオチド配列と実質的に同様の配列を有する］を有す
る線状化された二本鎖ベクターの入った第三の容器をさ
らに含む、上記キットの態様を提供する。
こでこの末端は、該オリゴヌクレオチドのdU含有鎖のヌ
クレオチド配列と実質的に同様の配列を有する］を有す
る線状化された二本鎖ベクターの入った第三の容器をさ
らに含む、上記キットの態様を提供する。
さらに本発明は、該末端が3'または5'末端である、ま
たは修飾された所望分子の二つの末端がdU含有配列を含
む、上記キットの態様を提供する。
たは修飾された所望分子の二つの末端がdU含有配列を含
む、上記キットの態様を提供する。
図面の簡単な説明
図１は、PCR増幅法で増幅されるべき配列の領域に対
し相補的な二つのオリゴヌクレオチドの使用を示す。
し相補的な二つのオリゴヌクレオチドの使用を示す。
図２は、試料外ヌクレオチドを二本鎖オリゴヌクレオ
チドの一方の鎖に組み込む態様を示す。標的分子は図2A
に示す。図2Bは、結果として分子の末端の変更をもたら
す所望分子の修飾を例示している。図2Cは、突出した3'
末端の生成を示す。
チドの一方の鎖に組み込む態様を示す。標的分子は図2A
に示す。図2Bは、結果として分子の末端の変更をもたら
す所望分子の修飾を例示している。図2Cは、突出した3'
末端の生成を示す。
図３は、エキソヌクレオチドが二本鎖分子の両鎖中に
組み込まれ、二つの修飾された末端を有する分子の生成
に使用される態様を示す。
組み込まれ、二つの修飾された末端を有する分子の生成
に使用される態様を示す。
図4Aは、試料外ヌクレオチドが二本鎖オリゴヌクレオ
チドの一方の鎖に組み込まれ、分子の5'末端を修飾する
態様を示す。標的分子は図2Aに示す。図4Bは、dU含有配
列の除去を例示している。
チドの一方の鎖に組み込まれ、分子の5'末端を修飾する
態様を示す。標的分子は図2Aに示す。図4Bは、dU含有配
列の除去を例示している。
図５は、エキソヌクレオチドが二本鎖分子の両鎖に組
み込まれ、二つの修飾された末端を有する分子を生成す
る態様を示す。
み込まれ、二つの修飾された末端を有する分子を生成す
る態様を示す。
図６はプライマーの描写を示す。
図７は、3'ハイブリダイズ領域と標的分子との間のホ
モロジーの故にプライマーと標的配列との間のハイブリ
ダイゼーションにより形成される構造を示す。
モロジーの故にプライマーと標的配列との間のハイブリ
ダイゼーションにより形成される構造を示す。
図8Aは、dU含有プライマーの描写を示す。図8Bは、プ
ライマー全体がエキソヌクレオチドを含む態様の描写を
示す。図8Cは、標的分子とプライマーとの間に形成され
るハイブリダイズされた構造の描写を示す。
ライマー全体がエキソヌクレオチドを含む態様の描写を
示す。図8Cは、標的分子とプライマーとの間に形成され
るハイブリダイズされた構造の描写を示す。
図９は、プラスミドまたは他のベクター中に容易に挿
入され得る形のエキソヌクレオチド含有分子の描写を示
す。
入され得る形のエキソヌクレオチド含有分子の描写を示
す。
図10は、突出した3'末端を有する線状化されたベクタ
ーを生成するためのリンカーの使用を示す。
ーを生成するためのリンカーの使用を示す。
図11は、突出した3'末端を有する線状化されたベクタ
ーを生成するためのPCR及び試料外ヌクレオチドの使用
を示す。
ーを生成するためのPCR及び試料外ヌクレオチドの使用
を示す。
図12は、修飾された分子からdU残基を除去した結果得
られる構造を示す。
られる構造を示す。
図13は、環状ベクター分子を形成させるための、開示
される方法の使用を示す。図13Aは、試料外ヌクレオチ
ドの破壊後の修飾された分子を示す。図13Bは、試料外
ヌクレオチドの破壊後の、前もって選択された配列の領
域の塩基対形成能の損失を例示している。図13Cは、修
飾された所望配列を含む環状ベクター分子の形成を例示
している。図13A及び13Bにおいて、上の図は修飾された
所望分子の構造を例示しており、下の図は修飾されたベ
クター分子の構造を例示している。
される方法の使用を示す。図13Aは、試料外ヌクレオチ
ドの破壊後の修飾された分子を示す。図13Bは、試料外
ヌクレオチドの破壊後の、前もって選択された配列の領
域の塩基対形成能の損失を例示している。図13Cは、修
飾された所望配列を含む環状ベクター分子の形成を例示
している。図13A及び13Bにおいて、上の図は修飾された
所望分子の構造を例示しており、下の図は修飾されたベ
クター分子の構造を例示している。
好ましい態様の説明
I.分子生物学で使用される用語
続く記載において、分子生物学及び核酸増幅技術で使
用される幾つかの用語が広範に利用される。このような
用語に与えられる範囲を含む本明細書及び請求項の明確
且つ首尾一貫した理解を提供するため、以下の定義を与
える。
用される幾つかの用語が広範に利用される。このような
用語に与えられる範囲を含む本明細書及び請求項の明確
且つ首尾一貫した理解を提供するため、以下の定義を与
える。
本明細書中使用される「増幅」とは、ヌクレオチド配
列のコピー数を増加させるための任意のインビトロの過
程を意味する。核酸の増幅は、ヌクレオチドのDNAまた
はRNA中への組み込みをもたらす。PCRはDNA増幅のため
の好適な方法の一例である。本明細書中使用される一つ
の増幅反応は、DNA複製の多くの循環より成り立ち得
る。例えば、一つのPCR反応は10−50「サイクル」の変
性及び複製から成り立ち得る。
列のコピー数を増加させるための任意のインビトロの過
程を意味する。核酸の増幅は、ヌクレオチドのDNAまた
はRNA中への組み込みをもたらす。PCRはDNA増幅のため
の好適な方法の一例である。本明細書中使用される一つ
の増幅反応は、DNA複製の多くの循環より成り立ち得
る。例えば、一つのPCR反応は10−50「サイクル」の変
性及び複製から成り立ち得る。
本明細書中使用される「ヌクレオチド」は、塩基−糖
−燐酸塩の組合せを意味する学術用語である。ヌクレオ
チドは核酸重合体、即ちDNA及びRNAの単量体単位であ
る。この語はrATP、rCTP、rGTP、またはrUTPのようなリ
ボヌクレオシド三燐酸、及びdATP、dCTP、dGTP、または
dTTPのようなデオキシリボヌクレオシド三燐酸を包含す
る。「ヌクレオチド」は塩基−糖の組合せ、即ち燐酸を
欠くヌクレオチドである。
−燐酸塩の組合せを意味する学術用語である。ヌクレオ
チドは核酸重合体、即ちDNA及びRNAの単量体単位であ
る。この語はrATP、rCTP、rGTP、またはrUTPのようなリ
ボヌクレオシド三燐酸、及びdATP、dCTP、dGTP、または
dTTPのようなデオキシリボヌクレオシド三燐酸を包含す
る。「ヌクレオチド」は塩基−糖の組合せ、即ち燐酸を
欠くヌクレオチドである。
本明細書中使用される「試料外ヌクレオチド」とは、
一般にDNAの配列中に見いだされないヌクレオチドを意
味する。殆どのDNA試料について、デオキシウリジンが
試料外ヌクレオチドの例である。デオキシウリジンの三
燐酸塩型dUTPは代謝中間体として生体中に存在するもの
の、これがDNA中に取り込まれることは稀である。dUTP
がDNA中に取り込まれると、得られるデオキシウリジン
は正常の過程、例えば酵素ウラシルDNAグリコシラーゼ
（UDG）を含む過程によってインビボで速やかに除去さ
れる［クンケル、U.S.4873192;B.K.ダンカン、ジ・エン
ザイムズ（The Enzymes）XIV、565−586頁（1981）、
どちらの記載もその全体を引用して本明細書の一部とす
る］。したがってデオキシウリジンは天然のDNA中には
殆どまたは決して存在しない。幾つかの生物はデオキシ
ウリジンをDNA中に自然に取り込み得るということが認
められている。これらの生物の核酸試料については、デ
オキシウリジンは試料外ヌクレオチドであるとは考えら
れない。その他の試料外ヌクレオチドの例は、ブロモデ
オキシウリジン、７−メチルグアニン、5,6−ジヒロ−
5,6 ジヒドロデオキシチミジン、３−メチルデオキシ
アデノシン等を包含する［B.K.ダンカン、ジ・エンザイ
ムズ（The Enzymes）XIV、565−586頁（1981）を参照
されたい］。その他の試料外ヌクレオチドは当業者には
明らかである。例えば、DNA増幅のために用いられるRNA
プライマーは、アルカリまたは適当なリボヌクレアーゼ
（RNアーゼ）によって容易に破壊され得る。RNアーゼＨ
はRNA:DNAハイブリッドのRNAを減成し、変性工程後の一
本鎖RNAの消化に有用な多数の一本鎖RNアーゼが知られ
ている。
一般にDNAの配列中に見いだされないヌクレオチドを意
味する。殆どのDNA試料について、デオキシウリジンが
試料外ヌクレオチドの例である。デオキシウリジンの三
燐酸塩型dUTPは代謝中間体として生体中に存在するもの
の、これがDNA中に取り込まれることは稀である。dUTP
がDNA中に取り込まれると、得られるデオキシウリジン
は正常の過程、例えば酵素ウラシルDNAグリコシラーゼ
（UDG）を含む過程によってインビボで速やかに除去さ
れる［クンケル、U.S.4873192;B.K.ダンカン、ジ・エン
ザイムズ（The Enzymes）XIV、565−586頁（1981）、
どちらの記載もその全体を引用して本明細書の一部とす
る］。したがってデオキシウリジンは天然のDNA中には
殆どまたは決して存在しない。幾つかの生物はデオキシ
ウリジンをDNA中に自然に取り込み得るということが認
められている。これらの生物の核酸試料については、デ
オキシウリジンは試料外ヌクレオチドであるとは考えら
れない。その他の試料外ヌクレオチドの例は、ブロモデ
オキシウリジン、７−メチルグアニン、5,6−ジヒロ−
5,6 ジヒドロデオキシチミジン、３−メチルデオキシ
アデノシン等を包含する［B.K.ダンカン、ジ・エンザイ
ムズ（The Enzymes）XIV、565−586頁（1981）を参照
されたい］。その他の試料外ヌクレオチドは当業者には
明らかである。例えば、DNA増幅のために用いられるRNA
プライマーは、アルカリまたは適当なリボヌクレアーゼ
（RNアーゼ）によって容易に破壊され得る。RNアーゼＨ
はRNA:DNAハイブリッドのRNAを減成し、変性工程後の一
本鎖RNAの消化に有用な多数の一本鎖RNアーゼが知られ
ている。
デオキシウリジンまたは他の任意の試料外ヌクレオチ
ドの存在は、当分野で良く知られる方法を用いて容易に
決定することができる。このような任意の試料外ヌクレ
オチドを含む核酸分子は、これがグリコシラーゼ消化と
いったような或る種の処理を特に受け易いことを除け
ば、dA、dC、dGまたはdT（dTは本明細書中Ｔと称する）
のみを含むDNAと全ての面で機能的に等価である。数多
くのDNAグリコシラーゼが当分野で知られている。化学
的にまたは酵素的にオリゴヌクレオチド中に取り込まれ
得る試料外ヌクレオチド、及びそれに働くDNAグリコシ
ラーゼを、この発明に使用することができる。試料外ヌ
クレオチドとしてブロモデオキシウリジンを含むDNA
は、既知の条件の下で光に暴露されることにより減成さ
れ得る。
ドの存在は、当分野で良く知られる方法を用いて容易に
決定することができる。このような任意の試料外ヌクレ
オチドを含む核酸分子は、これがグリコシラーゼ消化と
いったような或る種の処理を特に受け易いことを除け
ば、dA、dC、dGまたはdT（dTは本明細書中Ｔと称する）
のみを含むDNAと全ての面で機能的に等価である。数多
くのDNAグリコシラーゼが当分野で知られている。化学
的にまたは酵素的にオリゴヌクレオチド中に取り込まれ
得る試料外ヌクレオチド、及びそれに働くDNAグリコシ
ラーゼを、この発明に使用することができる。試料外ヌ
クレオチドとしてブロモデオキシウリジンを含むDNA
は、既知の条件の下で光に暴露されることにより減成さ
れ得る。
PCR増幅を受けている試料から存在するかも知れない
汚染物質を除くための試料外ヌクレオチドの使用は、M.
C.ロンゴ等［ジーン（Gene）93巻125−128頁（1990）、
ハートレイ、米国特許第5035966号］により開示されて
おり、これらの全体は引用して本明細書の一部とする。
この文献は、標的配列のPCR支配増幅におけるdU含有オ
リゴヌクレオチドまたはdUTPのいずれかの使用を開示し
ている。
汚染物質を除くための試料外ヌクレオチドの使用は、M.
C.ロンゴ等［ジーン（Gene）93巻125−128頁（1990）、
ハートレイ、米国特許第5035966号］により開示されて
おり、これらの全体は引用して本明細書の一部とする。
この文献は、標的配列のPCR支配増幅におけるdU含有オ
リゴヌクレオチドまたはdUTPのいずれかの使用を開示し
ている。
「所望の」または「標的」遺伝子配列または核酸分子
とは、本発明の目的を達成するために増幅されるべき、
またはベクター（これは環状または線状であってよい）
中に取り込まれるべき配列を指定するために用いられる
用語である。この配列はいかなる大きさまたは複雑さで
あってもよい。一般に、その末端の配列が確かめられる
といったように、所望配列について幾らかの情報が知ら
れている。PCRによって増幅され得る任意の分子、また
はその末端に制限サイトを有する任意の分子を、本発明
の所望または標的配列として使用することができる。
「キメラ分子とは、所望遺伝子配列を持つまたは含むよ
う修飾されたベクター（プラスミド、コスミド、ウイル
スの核酸等）である。
とは、本発明の目的を達成するために増幅されるべき、
またはベクター（これは環状または線状であってよい）
中に取り込まれるべき配列を指定するために用いられる
用語である。この配列はいかなる大きさまたは複雑さで
あってもよい。一般に、その末端の配列が確かめられる
といったように、所望配列について幾らかの情報が知ら
れている。PCRによって増幅され得る任意の分子、また
はその末端に制限サイトを有する任意の分子を、本発明
の所望または標的配列として使用することができる。
「キメラ分子とは、所望遺伝子配列を持つまたは含むよ
う修飾されたベクター（プラスミド、コスミド、ウイル
スの核酸等）である。
二つの配列は、もしそれらが共に同じオリゴヌクレオ
チドにハイブリダイズできるならば「配列において実質
的に類似である」という。
チドにハイブリダイズできるならば「配列において実質
的に類似である」という。
核酸分子の「末端」とは、その分子の端の領域を示
す。この語は本明細書中では線状分子の最後のヌクレオ
チドを表わす訳ではなく、線状または環状分子の末端ま
たはその付近にある大体の領域を表わすものである。
す。この語は本明細書中では線状分子の最後のヌクレオ
チドを表わす訳ではなく、線状または環状分子の末端ま
たはその付近にある大体の領域を表わすものである。
二つの核酸分子の二つの末端は、もしその両方の末端
がそれぞれの分子の3'末端、または両方の末端がそれぞ
れの分子のそれぞれの5'末端であるならば、「同じ名称
の末端」であると言われる。本明細書中使用される「同
じ名称の末端」という語は、比較される末端のヌクレオ
チド配列を指すことを意図している訳ではない。
がそれぞれの分子の3'末端、または両方の末端がそれぞ
れの分子のそれぞれの5'末端であるならば、「同じ名称
の末端」であると言われる。本明細書中使用される「同
じ名称の末端」という語は、比較される末端のヌクレオ
チド配列を指すことを意図している訳ではない。
本明細書中、DNA分子は、共有結合によって閉じた
環、または水素結合により結合した環のいずれかとして
描写できるならば、「環状」であると言う。したがっ
て、環状分子は、共有結合または水素結合を介して互い
に結合している１またはそれ以上のポリヌクレオチドか
ら成ることができる。各ポリヌクレオチドの末端ヌクレ
オチドは、一本鎖、または共有結合もしくは水素結合を
介してもう一つのポリヌクレオチドに結合していてもよ
い。
環、または水素結合により結合した環のいずれかとして
描写できるならば、「環状」であると言う。したがっ
て、環状分子は、共有結合または水素結合を介して互い
に結合している１またはそれ以上のポリヌクレオチドか
ら成ることができる。各ポリヌクレオチドの末端ヌクレ
オチドは、一本鎖、または共有結合もしくは水素結合を
介してもう一つのポリヌクレオチドに結合していてもよ
い。
学術用語「ウラシルDNAグリコシラーゼ」（UDG）は、
単量体ヌクレオチドdUTPがDNA分子中に組み込まれてい
る時にのみ、塩基ウラシルと糖デオキシリボースとの間
のグリコシド結合を開裂させてデオキシウリジン基の取
り込みをもたらす活性を意味する［B.ダンカン、ジ・エ
ンザイムズ（The Enzymes）14巻565頁（1981）、P.ボ
イヤー編］。この活性を有する酵素は遊離のdUTP、遊離
のデオキシウリジン、またはRNAには作用しない（ダン
カン、上記）。UDGの作用の結果「無塩基性」サイトが
生成される。しかしながらこの酵素は、核酸分子のホス
ホジエステルバックボーンは開裂させない。最も好まし
くは、無塩基性サイトにおけるホスホジエステルバック
ボーンは、このような基質に特異的なエンドヌクレアー
ゼの作用によって開裂させることができる。この目的の
ために好ましい酵素は大腸菌の酵素エンドヌクレアーゼ
IVである。最も好ましくは、エンドヌクレアーゼIVをUD
Gと組み合わせて使用して、核酸分子からdU残基を除去
する。
単量体ヌクレオチドdUTPがDNA分子中に組み込まれてい
る時にのみ、塩基ウラシルと糖デオキシリボースとの間
のグリコシド結合を開裂させてデオキシウリジン基の取
り込みをもたらす活性を意味する［B.ダンカン、ジ・エ
ンザイムズ（The Enzymes）14巻565頁（1981）、P.ボ
イヤー編］。この活性を有する酵素は遊離のdUTP、遊離
のデオキシウリジン、またはRNAには作用しない（ダン
カン、上記）。UDGの作用の結果「無塩基性」サイトが
生成される。しかしながらこの酵素は、核酸分子のホス
ホジエステルバックボーンは開裂させない。最も好まし
くは、無塩基性サイトにおけるホスホジエステルバック
ボーンは、このような基質に特異的なエンドヌクレアー
ゼの作用によって開裂させることができる。この目的の
ために好ましい酵素は大腸菌の酵素エンドヌクレアーゼ
IVである。最も好ましくは、エンドヌクレアーゼIVをUD
Gと組み合わせて使用して、核酸分子からdU残基を除去
する。
本明細書中使用される「組み込み」とは、核酸重合体
の一部となることを意味する。
の一部となることを意味する。
本明細書中使用される「停止」とは、ある処理の停止
を導くことを意味する。この語は永久的及び条件的停止
のいずれについての意味をも包含する。例えば、その処
理が酵素によるものである場合、永久的停止は熱変性で
あり；条件的停止は、例えばその酵素の活性範囲外の温
度の使用である。いずれの型の停止もこの語の範囲に含
まれることが意図されている。
を導くことを意味する。この語は永久的及び条件的停止
のいずれについての意味をも包含する。例えば、その処
理が酵素によるものである場合、永久的停止は熱変性で
あり；条件的停止は、例えばその酵素の活性範囲外の温
度の使用である。いずれの型の停止もこの語の範囲に含
まれることが意図されている。
本明細書中使用される「オリゴヌクレオチド」は、二
つの学術用語「オリゴヌクレオチド」及び「ポリヌクレ
オチド」を集合的に且つ互換的に意味している。オリゴ
ヌクレオチド及びポリヌクレオチドは別個の学術用語で
あるが、これらの間に正確な分割する線はなく、本明細
書中ではこれらは互換的に使用されることに留意された
い。オリゴヌクレオチドは、もしこれが所望の配列を前
もって定められたオリゴヌクレオチド上に据え付けるこ
とができるならば、アダプター、アダプター／リンカー
またはインスタレーションオリゴヌクレオチド（これら
の語は同義語である）のいずれかであると言われる。オ
リゴヌクレオチドはこれが「ブロックされて」いない限
りプライマーとして働くことができる。オリゴヌクレオ
チドは、その3'末端がプライマーとして働き得ないなら
ば、「ブロックされて」いると言う。
つの学術用語「オリゴヌクレオチド」及び「ポリヌクレ
オチド」を集合的に且つ互換的に意味している。オリゴ
ヌクレオチド及びポリヌクレオチドは別個の学術用語で
あるが、これらの間に正確な分割する線はなく、本明細
書中ではこれらは互換的に使用されることに留意された
い。オリゴヌクレオチドは、もしこれが所望の配列を前
もって定められたオリゴヌクレオチド上に据え付けるこ
とができるならば、アダプター、アダプター／リンカー
またはインスタレーションオリゴヌクレオチド（これら
の語は同義語である）のいずれかであると言われる。オ
リゴヌクレオチドはこれが「ブロックされて」いない限
りプライマーとして働くことができる。オリゴヌクレオ
チドは、その3'末端がプライマーとして働き得ないなら
ば、「ブロックされて」いると言う。
本明細書中使用される「オリゴヌクレオチド依存増
幅」は、核酸配列を増幅するためにオリゴヌクレオチド
またはポリヌクレオチドを使用する増幅を意味する。オ
リゴヌクレオチド依存増幅は、長さが２またはそれ以上
のモノヌクレオチドサブユニットであって、新たに形成
された増幅された核酸分子の一部で終わる１またはそれ
以上のオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの存
在を必要とする任意の増幅である。
幅」は、核酸配列を増幅するためにオリゴヌクレオチド
またはポリヌクレオチドを使用する増幅を意味する。オ
リゴヌクレオチド依存増幅は、長さが２またはそれ以上
のモノヌクレオチドサブユニットであって、新たに形成
された増幅された核酸分子の一部で終わる１またはそれ
以上のオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの存
在を必要とする任意の増幅である。
本明細書中使用される「プライマー」は、増幅の間に
共有結合によるヌクレオチド単量体の付加によって伸長
する一本鎖オリゴヌクレオチドまたは一本鎖ポリヌクレ
オチドを意味する。核酸の増幅はしばしば核酸ポリメラ
ーゼによる核酸の合成を基礎としている。これらポリメ
ラーゼの多くは、伸長してこのような核酸合成を開始す
ることのできるプライマーの存在を必要とする。プライ
マーは典型的には11またはそれ以上の塩基であり、最も
好ましくはプライマーは17またはそれ以上の塩基であ
る。しかしながら最低３個の塩基で充分である。
共有結合によるヌクレオチド単量体の付加によって伸長
する一本鎖オリゴヌクレオチドまたは一本鎖ポリヌクレ
オチドを意味する。核酸の増幅はしばしば核酸ポリメラ
ーゼによる核酸の合成を基礎としている。これらポリメ
ラーゼの多くは、伸長してこのような核酸合成を開始す
ることのできるプライマーの存在を必要とする。プライ
マーは典型的には11またはそれ以上の塩基であり、最も
好ましくはプライマーは17またはそれ以上の塩基であ
る。しかしながら最低３個の塩基で充分である。
「反応容量」とは、所望の反応（例えば増幅、ハイブ
リダイゼーション、cDNA合成等）の実施に適当な液体を
指す。
リダイゼーション、cDNA合成等）の実施に適当な液体を
指す。
「リガーゼ」とは、或る核酸分子の3'ヒドロキシ末端
を第二の核酸分子の5'燐酸末端に結合させて一つの分子
を形成させることのできる酵素である。リガーゼ酵素
は、J.D.ワトスン、モレキュラー・バイオロジー・オブ
・ザ・ジーン（Molecular Biology of the Gene）
３版、W.A.ベンジャミン、Inc.、メンロ・パーク、CA
（1977）、及び類似の教科書に記載されている。
を第二の核酸分子の5'燐酸末端に結合させて一つの分子
を形成させることのできる酵素である。リガーゼ酵素
は、J.D.ワトスン、モレキュラー・バイオロジー・オブ
・ザ・ジーン（Molecular Biology of the Gene）
３版、W.A.ベンジャミン、Inc.、メンロ・パーク、CA
（1977）、及び類似の教科書に記載されている。
ライゲーションまたは重合反応のような酵素反応が行
なわれる場合、このような反応に必要な成分を反応容器
に「過剰に」供するのが好ましい。増幅反応の構成成分
について言及する場合の「過剰に」とは、所望の増幅を
達成する能力がその成分の濃度によって限定されないよ
うな各成分の量を意味する。ライゲーションの後にリン
カー／アダプター分子を使用する場合は、反応中に存在
する過剰のリンカー／アダプターは好ましくは反応生成
物から分離、または反応混合物から除去し、その結果こ
れらが所望配列のクローニングと競合しないようにす
る。dU残基を含むリンカー／アダプターオリゴヌクレオ
チドの使用は、酵素的減成または他の手段による過剰の
リンカー／アダプター分子の破壊を可能にする。
なわれる場合、このような反応に必要な成分を反応容器
に「過剰に」供するのが好ましい。増幅反応の構成成分
について言及する場合の「過剰に」とは、所望の増幅を
達成する能力がその成分の濃度によって限定されないよ
うな各成分の量を意味する。ライゲーションの後にリン
カー／アダプター分子を使用する場合は、反応中に存在
する過剰のリンカー／アダプターは好ましくは反応生成
物から分離、または反応混合物から除去し、その結果こ
れらが所望配列のクローニングと競合しないようにす
る。dU残基を含むリンカー／アダプターオリゴヌクレオ
チドの使用は、酵素的減成または他の手段による過剰の
リンカー／アダプター分子の破壊を可能にする。
本発明の方法を、一部例示によって説明する。これら
の例示において、例えばＡ及びA'、Ｂ及びB'、Ｃ及び
C'、Ｘ及びX'、並びにＹ及びY'等といったような配列の
対はそれぞれ互いに相補的である。相補性は正確である
必要はなく、適正な機能、例えばアニーリング及びプラ
イミングに充分なホモロジーで充分である。
の例示において、例えばＡ及びA'、Ｂ及びB'、Ｃ及び
C'、Ｘ及びX'、並びにＹ及びY'等といったような配列の
対はそれぞれ互いに相補的である。相補性は正確である
必要はなく、適正な機能、例えばアニーリング及びプラ
イミングに充分なホモロジーで充分である。
II.本発明の方法および分子
本発明は、試料外ヌクレオチド、最も好ましくは、標
的核酸分子における突出する3'または5'の伸長を作り出
すためのヌクレオチドdUTP（ヌクレオチド配列中に組み
込まれた場合、これはdUと呼称される）を使用する。こ
の核酸分子はPCRもしくは他の方法から誘導されるか、
または適当な供給材料から直接分離することができる。
的核酸分子における突出する3'または5'の伸長を作り出
すためのヌクレオチドdUTP（ヌクレオチド配列中に組み
込まれた場合、これはdUと呼称される）を使用する。こ
の核酸分子はPCRもしくは他の方法から誘導されるか、
または適当な供給材料から直接分離することができる。
A.リンカー／アダプター分子を用いる所望核酸分子の3'
または5'いずれかの末端の修飾 本発明は、所望の核酸分子の3'または5'末端のいずれ
かを修飾して5'または3'一本鎖突出領域を作り出すこと
を可能にする。本発明はこの目的を試料外ヌクレオチ
ド、好ましくはdUの使用により達成する。第一の態様に
おいて、この試料外ヌクレオチドは二本鎖オリゴヌクレ
オチドの一方の鎖に組み込まれる。次いでこのオリゴヌ
クレオチドを所望分子の一つの末端または両末端にライ
ゲーションする。即ち、標的分子が図2Aのように示され
るならば、突出する3'末端を生成させるように所望分子
を修飾するためには、試料外ヌクレオチドをその末端に
ライゲーションする（図2B）。UDGによる処理はdU残基
のウラシル塩基の除去をもたらし、それにより無塩基性
サイトが生成される。この無塩基性サイトをエンドヌク
レアーゼIVまたは類似の酵素活性をもって開裂させ、所
望の修飾された分子を生成させることができる（図2
C）。
または5'いずれかの末端の修飾 本発明は、所望の核酸分子の3'または5'末端のいずれ
かを修飾して5'または3'一本鎖突出領域を作り出すこと
を可能にする。本発明はこの目的を試料外ヌクレオチ
ド、好ましくはdUの使用により達成する。第一の態様に
おいて、この試料外ヌクレオチドは二本鎖オリゴヌクレ
オチドの一方の鎖に組み込まれる。次いでこのオリゴヌ
クレオチドを所望分子の一つの末端または両末端にライ
ゲーションする。即ち、標的分子が図2Aのように示され
るならば、突出する3'末端を生成させるように所望分子
を修飾するためには、試料外ヌクレオチドをその末端に
ライゲーションする（図2B）。UDGによる処理はdU残基
のウラシル塩基の除去をもたらし、それにより無塩基性
サイトが生成される。この無塩基性サイトをエンドヌク
レアーゼIVまたは類似の酵素活性をもって開裂させ、所
望の修飾された分子を生成させることができる（図2
C）。
容易に認識されるように、dU含有オリゴヌクレオチド
を分子の両端にライゲーションすることにより、所望分
子の両末端を修飾することが可能である（図３）。
を分子の両端にライゲーションすることにより、所望分
子の両末端を修飾することが可能である（図３）。
突出する5'末端を生成させるよう所望分子を修飾する
ために、試料外ヌクレオチドをその末端にライゲーショ
ンする（図4A）。上の態様のように、UDGによる処理の
結果dU残基のウラシル塩基が除去され、それにより無塩
基性サイトが生成し、これをエンドヌクレアーゼIVまた
は類似の酵素活性によって開裂させて所望の修飾された
分子を生成させることができる（図4B）。さらに、上の
態様のように、dU含有オリゴヌクレオチドを分子の両端
にライゲーションすることにより、所望分子の両末端を
修飾することが可能である（図５）。
ために、試料外ヌクレオチドをその末端にライゲーショ
ンする（図4A）。上の態様のように、UDGによる処理の
結果dU残基のウラシル塩基が除去され、それにより無塩
基性サイトが生成し、これをエンドヌクレアーゼIVまた
は類似の酵素活性によって開裂させて所望の修飾された
分子を生成させることができる（図4B）。さらに、上の
態様のように、dU含有オリゴヌクレオチドを分子の両端
にライゲーションすることにより、所望分子の両末端を
修飾することが可能である（図５）。
しかしながら最も好ましい態様において、本発明は所
望分子の5'末端を修飾するためにPCRを使用する。
望分子の5'末端を修飾するためにPCRを使用する。
B.PCR増幅を使用する所望核酸分子の5'末端の修飾
所望分子の5'末端を修飾して、突出する3'末端を有す
る分子の生成をさせるための第二の態様において、PCR
増幅の変法を使用することができる。この態様において
は、本発明に係る所望または標的配列をPCRを用いて修
飾し、これらが少なくとも１個、好ましくは数個のエキ
ソヌクレオチド分子を含む5'末端を有するようにする。
この態様のためには特別なプライマーを使用する。この
特別なプライマーは、PCR反応の最初に、または増幅の
任意のサイクルの後に、いかなる段階で添加してもよ
い。PCRの１またはそれ以降のサイクルの後に添加され
る場合、増幅の最初のサイクルは常套のプライマーを用
いて実施する。
る分子の生成をさせるための第二の態様において、PCR
増幅の変法を使用することができる。この態様において
は、本発明に係る所望または標的配列をPCRを用いて修
飾し、これらが少なくとも１個、好ましくは数個のエキ
ソヌクレオチド分子を含む5'末端を有するようにする。
この態様のためには特別なプライマーを使用する。この
特別なプライマーは、PCR反応の最初に、または増幅の
任意のサイクルの後に、いかなる段階で添加してもよ
い。PCRの１またはそれ以降のサイクルの後に添加され
る場合、増幅の最初のサイクルは常套のプライマーを用
いて実施する。
C.本発明に係る特別なプライマー
所望分子の末端の修飾は、好ましくは二つの特別なプ
ライマーを用いるPCRを使用して実施する。
ライマーを用いるPCRを使用して実施する。
即ち、各々のプライマーは、それが所望のDNA分子の
一方の鎖の5'領域に対し相補的な3'ハイブリダイズ領域
を含むよう組み立てられるであろう。プライマーはさら
に前もって決定され前もって選択された配列の領域（そ
の長さは一般に該分子の3'ハイブリダイズ領域とほぼ同
じ大きさである）を含む。最も好ましくは、前もって選
択される配列の領域の長さはおよそ10−20塩基、最も好
ましくはおよそ12塩基である。プライマー分子の前もっ
て選択される領域のヌクレオチド配列に関する制約はな
い。この配列は反復性、パリンドローム性、または特異
なもののいずれであってもよい。したがって各々のプラ
イマーは図６に示すように描写することができる。
一方の鎖の5'領域に対し相補的な3'ハイブリダイズ領域
を含むよう組み立てられるであろう。プライマーはさら
に前もって決定され前もって選択された配列の領域（そ
の長さは一般に該分子の3'ハイブリダイズ領域とほぼ同
じ大きさである）を含む。最も好ましくは、前もって選
択される配列の領域の長さはおよそ10−20塩基、最も好
ましくはおよそ12塩基である。プライマー分子の前もっ
て選択される領域のヌクレオチド配列に関する制約はな
い。この配列は反復性、パリンドローム性、または特異
なもののいずれであってもよい。したがって各々のプラ
イマーは図６に示すように描写することができる。
指摘のようにプライマーは、3'ハイブリダイズ領域及
び標的分子の配列の間のホモロジーの故に、標的配列の
一方の鎖とハイブリダイズすることができる（図７）。
び標的分子の配列の間のホモロジーの故に、標的配列の
一方の鎖とハイブリダイズすることができる（図７）。
プライマー分子の3'ハイブリダイズ領域は、標的分子
の正確な末端に対し相補的である必要はない。事実、標
的分子は線状分子である必要はない。プライマー分子の
3'ハイブリダイズ領域が、クローニングされるべき配列
を含むかまたはこれに隣接する領域とハイブリダイズす
ることができるならば、本発明の目的は達せられるであ
ろう。
の正確な末端に対し相補的である必要はない。事実、標
的分子は線状分子である必要はない。プライマー分子の
3'ハイブリダイズ領域が、クローニングされるべき配列
を含むかまたはこれに隣接する領域とハイブリダイズす
ることができるならば、本発明の目的は達せられるであ
ろう。
前もって選択される配列の特徴は、これが幾つかの試
料外ヌクレオチドを含み、好ましくはこれらが全体に散
在していることである。好ましい態様において、前もっ
て選択される配列は12塩基の長さであり、且つ塩基３個
毎にdUがある。したがってプライマーは図8Aに示される
ように描写することができる。
料外ヌクレオチドを含み、好ましくはこれらが全体に散
在していることである。好ましい態様において、前もっ
て選択される配列は12塩基の長さであり、且つ塩基３個
毎にdUがある。したがってプライマーは図8Aに示される
ように描写することができる。
プライマーの3'ハイブリダイズ領域はさらに１または
それ以上の試料外ヌクレオチドを含む。事実、本発明の
一態様においては、プライマー全体が、全体に散在する
試料外ヌクレオチドを含んでいる（図8B）。したがっ
て、標的分子とプライマーとの間に形成されるハイブリ
ダイズされた構造は、図8Cに示されるように描写するこ
とができる。
それ以上の試料外ヌクレオチドを含む。事実、本発明の
一態様においては、プライマー全体が、全体に散在する
試料外ヌクレオチドを含んでいる（図8B）。したがっ
て、標的分子とプライマーとの間に形成されるハイブリ
ダイズされた構造は、図8Cに示されるように描写するこ
とができる。
したがって、プライマーは所望核酸分子を含むまたは
含むと思われる試料の存在下でインキュベートする。次
いでPCR、またはこれに代わる方法を上記のやり方で実
施する。少なくとも１増幅サイクルの後、プライマー−
伸長分子を自己ハイブリダイズさせることにより、所望
分子が生成される。理解されるように、得られた分子は
二つの面で最初の所望分子とは異なつている。第一に、
これは、その両末端に、前もって選択された配列領域に
対応するさらなる配列を含んでいる。第二に、増幅され
た鎖の両方の5'末端にある前もって選択された配列は、
プライマー分子の試料外ヌクレオチドを含んでいるであ
ろう。この分子は本発明方法にしたがってプラスミドま
たは他のベクター中に容易に挿入できる形である。この
分子は以下の図９に示されるように描写することができ
る。
含むと思われる試料の存在下でインキュベートする。次
いでPCR、またはこれに代わる方法を上記のやり方で実
施する。少なくとも１増幅サイクルの後、プライマー−
伸長分子を自己ハイブリダイズさせることにより、所望
分子が生成される。理解されるように、得られた分子は
二つの面で最初の所望分子とは異なつている。第一に、
これは、その両末端に、前もって選択された配列領域に
対応するさらなる配列を含んでいる。第二に、増幅され
た鎖の両方の5'末端にある前もって選択された配列は、
プライマー分子の試料外ヌクレオチドを含んでいるであ
ろう。この分子は本発明方法にしたがってプラスミドま
たは他のベクター中に容易に挿入できる形である。この
分子は以下の図９に示されるように描写することができ
る。
D.ベクター
任意の前核生物または真核生物のプラスミドまたはウ
イルスのベクターを本発明方法に従って使用できるよう
修飾することができる。ベクターが環状分子である場合
に、まずこれを、例えば制限エンドヌクレアーゼを用い
て線状化する。次いで線状化された分子の二つの末端
を、増幅された所望分子中に存在する前もって選択され
た配列の一方または両方に対し相補的な配列を含むよう
変える。上に述べたプライマーの場合、線状化されたベ
クター分子の末端は、様々な方法のうちいずれによって
も変えることができる。
イルスのベクターを本発明方法に従って使用できるよう
修飾することができる。ベクターが環状分子である場合
に、まずこれを、例えば制限エンドヌクレアーゼを用い
て線状化する。次いで線状化された分子の二つの末端
を、増幅された所望分子中に存在する前もって選択され
た配列の一方または両方に対し相補的な配列を含むよう
変える。上に述べたプライマーの場合、線状化されたベ
クター分子の末端は、様々な方法のうちいずれによって
も変えることができる。
好ましい態様において、リンカーを使用して線状化さ
れた分子の末端にライゲーションし、所望の突出した3'
末端を生成させることができる（図10）。
れた分子の末端にライゲーションし、所望の突出した3'
末端を生成させることができる（図10）。
別法として、PCRを用いて適当な末端を有する線状化
されたベクター分子を生成させることもできる。ベクタ
ーの末端は、修飾された所望分子の試料外ヌクレオチド
含有配列に対し相補的な試料外ヌクレオチド含有配列を
含むよう修飾することができる。即ち、修飾された所望
分子の試料外ヌクレオチド含有配列が配列「Ｘ」を有す
るとき、修飾されたベクターの試料外ヌクレオチド含有
配列は配列「X'」を有するであろう（図11）。
されたベクター分子を生成させることもできる。ベクタ
ーの末端は、修飾された所望分子の試料外ヌクレオチド
含有配列に対し相補的な試料外ヌクレオチド含有配列を
含むよう修飾することができる。即ち、修飾された所望
分子の試料外ヌクレオチド含有配列が配列「Ｘ」を有す
るとき、修飾されたベクターの試料外ヌクレオチド含有
配列は配列「X'」を有するであろう（図11）。
理解されるように、これらの操作の効果は、修飾され
た所望配列のどちらかまたは両方の末端に含まれる前も
って選択された配列に対し相補的な前もって選択された
配列を含む末端を有する線状化された分子を生成させる
ことである。
た所望配列のどちらかまたは両方の末端に含まれる前も
って選択された配列に対し相補的な前もって選択された
配列を含む末端を有する線状化された分子を生成させる
ことである。
E.修飾されたベクター中への修飾された所望配列のクロ
ーニング 上記の手法で修飾されたベクター分子及び所望分子
を、試料外ヌクレオチドの破壊をもたらす条件下でイン
キュベートする。即ち、例えば試料外ヌクレオチドがdU
である場合は、この分子を酵素UDGによる処理に付す。
得られた構造を下に示す（図12）。例示の通り、UDGに
よる処理は核酸分子のホスホジエステルバックボーンの
切断をもたらさない。むしろこれは、無塩基性サイトの
生成を導き、したがって相補的配列との塩基対形成がで
きない。これらの無塩基性サイト含有配列の存在または
不存在は、続く本発明方法の適用には無関係である。
ーニング 上記の手法で修飾されたベクター分子及び所望分子
を、試料外ヌクレオチドの破壊をもたらす条件下でイン
キュベートする。即ち、例えば試料外ヌクレオチドがdU
である場合は、この分子を酵素UDGによる処理に付す。
得られた構造を下に示す（図12）。例示の通り、UDGに
よる処理は核酸分子のホスホジエステルバックボーンの
切断をもたらさない。むしろこれは、無塩基性サイトの
生成を導き、したがって相補的配列との塩基対形成がで
きない。これらの無塩基性サイト含有配列の存在または
不存在は、続く本発明方法の適用には無関係である。
修飾されたベクター及び所望分子配列の相補性の故
に、試料外ヌクレオチドの破壊後の修飾されたベクター
と修飾された所望配列とのインキュベーションの継続
は、キメラ分子を形成させる（図13）。
に、試料外ヌクレオチドの破壊後の修飾されたベクター
と修飾された所望配列とのインキュベーションの継続
は、キメラ分子を形成させる（図13）。
理解されるように、修飾された所望分子の一方の端と
のみ相補的な配列の使用は、この配列の一方向性の挿入
を可能にする。即ち、例えばもし修飾された所望分子の
一端が前もって選択された配列の領域Ｘ及びX'を有し、
該分子の他端が前もって選択された配列の領域Ｙ及びY'
を有するならば、前もって選択された配列の領域X'及び
Ｘ並びにY'及びＹをそれぞれ有するベクターを使用する
ことにより、修飾されたベクターへの挿入の方向性を管
理することが可能であろう。
のみ相補的な配列の使用は、この配列の一方向性の挿入
を可能にする。即ち、例えばもし修飾された所望分子の
一端が前もって選択された配列の領域Ｘ及びX'を有し、
該分子の他端が前もって選択された配列の領域Ｙ及びY'
を有するならば、前もって選択された配列の領域X'及び
Ｘ並びにY'及びＹをそれぞれ有するベクターを使用する
ことにより、修飾されたベクターへの挿入の方向性を管
理することが可能であろう。
重要なことに、適当な微生物宿主への形質転換の前に
環状分子から無塩基性サイトを除去する必要はない。同
様に、二本鎖の共有結合により閉じた環状分子を生成さ
せるために、この環状分子をDNAリガーゼまたは他の試
薬で処理する必要はない。上記の環状分子は、受容細胞
の形質転換に直接使用することができる。
環状分子から無塩基性サイトを除去する必要はない。同
様に、二本鎖の共有結合により閉じた環状分子を生成さ
せるために、この環状分子をDNAリガーゼまたは他の試
薬で処理する必要はない。上記の環状分子は、受容細胞
の形質転換に直接使用することができる。
本発明方法は特に、特定の核酸配列を増幅する酵素を
利用するインビトロの方法、特にPCRにおける使用に従
う。
利用するインビトロの方法、特にPCRにおける使用に従
う。
本発明は、「キット」のような製造品を包含する。こ
のようなキットは、典型的には、使用説明書と、5'末端
が、少なくとも１個の試料外ヌクレオチドを含む前もっ
て選択された配列の領域を含む、環状、またはより好ま
しくは線状化されたベクター分子とを、近接した区分化
の下に含むよう特に適合させたものである。第二の態様
においてこのキットは、試料外ヌクレオチドが破壊され
て突出する（即ち突き出ている）3'末端、またはこれと
同義であるが、相補的配列と塩基対形成することのでき
ない非陥凹5'末端が生成された修飾されたベクター分子
を含んでいる。
のようなキットは、典型的には、使用説明書と、5'末端
が、少なくとも１個の試料外ヌクレオチドを含む前もっ
て選択された配列の領域を含む、環状、またはより好ま
しくは線状化されたベクター分子とを、近接した区分化
の下に含むよう特に適合させたものである。第二の態様
においてこのキットは、試料外ヌクレオチドが破壊され
て突出する（即ち突き出ている）3'末端、またはこれと
同義であるが、相補的配列と塩基対形成することのでき
ない非陥凹5'末端が生成された修飾されたベクター分子
を含んでいる。
上の態様の副態様において、このキットはさらに、所
望核酸分子の末端を修飾するためのプライマーとしての
使用に好適な試料外ヌクレオチド含有オリゴヌクレオチ
ドを入れた容器、及び／または試料外ヌクレオチドを含
むオリゴヌクレオチドを減成することのできる酵素を入
れた容器を含む。さらにこのキットは緩衝剤、酵素等を
含むことができる。
望核酸分子の末端を修飾するためのプライマーとしての
使用に好適な試料外ヌクレオチド含有オリゴヌクレオチ
ドを入れた容器、及び／または試料外ヌクレオチドを含
むオリゴヌクレオチドを減成することのできる酵素を入
れた容器を含む。さらにこのキットは緩衝剤、酵素等を
含むことができる。
ここに本発明を一般的に説明してきたが、本発明は以
下の実施例を参照することにより、より容易に理解され
るであろう。これらの実施例は例示のために供されるも
のであって、特記されない限り本発明を限定する意図は
ない。
下の実施例を参照することにより、より容易に理解され
るであろう。これらの実施例は例示のために供されるも
のであって、特記されない限り本発明を限定する意図は
ない。
実施例１
酵素及び試薬
TaqDNAポリメラーゼはパーキン・エルマー−シータス
から購入した;dNTPはベーリンガー・マンハイム由来の
ものである。コンピテントな細菌（DH10B）、プロテイ
ナーゼＫ及び制限酵素はBRL由来のものである。オリゴ
ヌクレオチドはABI−380A DNA合成機及びベクターの増
幅及びヒトコスミドDNAを用いて合成された。
から購入した;dNTPはベーリンガー・マンハイム由来の
ものである。コンピテントな細菌（DH10B）、プロテイ
ナーゼＫ及び制限酵素はBRL由来のものである。オリゴ
ヌクレオチドはABI−380A DNA合成機及びベクターの増
幅及びヒトコスミドDNAを用いて合成された。
全てのPCR反応液は、以下の最終緩衝液濃度:50mM KC
l、10mMトリスHCl（pH8.4）、1.5mM MgCl2、及び0.2mM
の各dNTP、を用い、鉱油で被覆した50μｌとした。Alu
−PCR産物の生成及びサブクローンからの挿入物の分析
にはパーキン・エルマー−シータス温度循環器を使用し
た。最初５分間93゜とした後、60゜で１分間、72゜で１
分間及び93゜で１分間の循環35回採用した。最後の循環
のためにさらに５分間72゜とした。四つのNot I−線状
化コスミドをそれぞれ20−30ng増幅した。Xba I−線状
化pUC119（５）1ngを上記のように増幅した。PCR反応か
らの生成物は、エチジウムブロミドを入れたTAE緩衝液
中１％アガロースゲル電気泳動によって分析した。
l、10mMトリスHCl（pH8.4）、1.5mM MgCl2、及び0.2mM
の各dNTP、を用い、鉱油で被覆した50μｌとした。Alu
−PCR産物の生成及びサブクローンからの挿入物の分析
にはパーキン・エルマー−シータス温度循環器を使用し
た。最初５分間93゜とした後、60゜で１分間、72゜で１
分間及び93゜で１分間の循環35回採用した。最後の循環
のためにさらに５分間72゜とした。四つのNot I−線状
化コスミドをそれぞれ20−30ng増幅した。Xba I−線状
化pUC119（５）1ngを上記のように増幅した。PCR反応か
らの生成物は、エチジウムブロミドを入れたTAE緩衝液
中１％アガロースゲル電気泳動によって分析した。
UDG処理
ベクター及びAlu−PCR産物をエタノールで沈澱させ、
以下の緩衝液［25mMトリスHCl（pH7.8）、10mM MgC
l2、4mM β−メルカプトエタノール、0.4mM ATP］に
溶解した。ベクター（225ng）及びAlu−PCR産物（110ng
ないし212ng）を各々別々に最終容量10μｌ中37゜で10
分間UDG（BRL）で処理することによって、ベクターにお
いては10ヌクレオチド、Alu−PCR産物においては11ヌク
レオチドからなる一本鎖3'突出部を作る。当初の実験は
16単位のUDGを使用したが、わずか１単位でも充分であ
ることがわかった。このUDG処理の後、65゜で10分間の
処理を行なった。
以下の緩衝液［25mMトリスHCl（pH7.8）、10mM MgC
l2、4mM β−メルカプトエタノール、0.4mM ATP］に
溶解した。ベクター（225ng）及びAlu−PCR産物（110ng
ないし212ng）を各々別々に最終容量10μｌ中37゜で10
分間UDG（BRL）で処理することによって、ベクターにお
いては10ヌクレオチド、Alu−PCR産物においては11ヌク
レオチドからなる一本鎖3'突出部を作る。当初の実験は
16単位のUDGを使用したが、わずか１単位でも充分であ
ることがわかった。このUDG処理の後、65゜で10分間の
処理を行なった。
クローニング及び形質転換
上のトリス、MgCl2、β−メルカプトエタノール、ATP
緩衝液の最終容量20μｌ中で、UDG処理ベクター（45n
g）をUDG処理Alu−PCR産物（45ngないし106ng）と室温
で１時間合した。製造者の指示に従って各混合物の５μ
ｌをDH10Bコンピテント細胞（BRL）50μｌに導入し、ア
ンピシリン、Ｘ−gal及びIPTGを含有するLB平板上に蒔
いた。
緩衝液の最終容量20μｌ中で、UDG処理ベクター（45n
g）をUDG処理Alu−PCR産物（45ngないし106ng）と室温
で１時間合した。製造者の指示に従って各混合物の５μ
ｌをDH10Bコンピテント細胞（BRL）50μｌに導入し、ア
ンピシリン、Ｘ−gal及びIPTGを含有するLB平板上に蒔
いた。
形質転換体のPCR分析
Aluプライマーを用いるPCRによりサブクローンを分析
した。単一の白色コロニーを、12μｌの10mMトリスHCl
（pH7.5）、1mM EDTA、50μg/mlプロテイナーゼＫに分
散させ、55゜で15分間、80゜で15分間インキュベート
し、そして氷上で冷却した。Aluプライマーを含むPCR構
成成分を添加し、上記方法を用いて30サイクル増幅し
た。各分析のうち５μｌを、サイズ分けのためアガロー
スゲルで分析した。
した。単一の白色コロニーを、12μｌの10mMトリスHCl
（pH7.5）、1mM EDTA、50μg/mlプロテイナーゼＫに分
散させ、55゜で15分間、80゜で15分間インキュベート
し、そして氷上で冷却した。Aluプライマーを含むPCR構
成成分を添加し、上記方法を用いて30サイクル増幅し
た。各分析のうち５μｌを、サイズ分けのためアガロー
スゲルで分析した。
得られた形質転換体のこの方法を用いた分析は、試料
外ヌクレオチドクローニング法を用いたPCR産物が有効
にクローニングされたことを示した。挿入DNA、または
ベクターDNAまたはUDG処理を割愛した対照反応からは形
質転換体が得られず、この事は、クローニング法が本出
願に概説され具体化されている方法に依存することを示
すものである。
外ヌクレオチドクローニング法を用いたPCR産物が有効
にクローニングされたことを示した。挿入DNA、または
ベクターDNAまたはUDG処理を割愛した対照反応からは形
質転換体が得られず、この事は、クローニング法が本出
願に概説され具体化されている方法に依存することを示
すものである。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(56)参考文献 特開 平３−91484（ＪＰ，Ａ)
Ｓｕｚｕｋｉ．ｅｔ ａｌ，Ａｎ Ｉ
ｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｇｅｎ
ｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｔｈｉｒ
ｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，（1986）ｐ．309
(58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名)
C12N 15/00 - 15/90
ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ)
ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (17)
- 【請求項１】（Ａ）第一の鎖の少なくとも一方の末端
に、少なくとも１個の試料外ヌクレオチド残基を含んで
いる前もって選択された配列の第一領域を有する、修飾
された所望核酸分子を形成させ； （Ｂ）上記前もって選択された配列の第一領域を、少な
くとも１個の上記試料外ヌクレオチド残基の除去をもた
らすに充分な条件下で処理し、それにより、上記修飾さ
れた所望分子の少なくとも１個の鎖に、相補的配列と水
素結合することのできる突出した末端を形成させ； （Ｃ）この修飾された分子（Ｂ）を、少なくとも１個の
突出した一本鎖末端を有し、且つ当該修飾された分子
（Ｂ）の当該突出した末端の少なくとも１個と水素結合
することのできる修飾されたベクターの存在下でインキ
ュベートし、それによりこの二本鎖線状所望核酸分子を
当該二本鎖ベクター中に組み込むことからなる、 二本鎖線状所望核酸分子を二本鎖ベクター中に組み込む
方法。 - 【請求項２】（Ａ）における試料外ヌクレオチド残基が
デオキシウリジン、ブロモデオキシウリジン、７−メチ
ルグアニン、5,6−ジヒドロ−5,6−ジヒドロキシデオキ
シチミジン、３−メチルデオキシアデノシン及びリボヌ
クレオチドから選択されたものである、請求項１記載の
方法。 - 【請求項３】（Ａ）における試料外ヌクレオチド残基が
dU残基である、請求項１記載の方法。 - 【請求項４】修飾された所望核酸分子の１個の末端のみ
が試料外ヌクレオチド残基含有配列を含む、請求項１〜
３のいずれか記載の方法。 - 【請求項５】当該末端が修飾された所望核酸分子の3'末
端である、請求項４記載の方法。 - 【請求項６】当該末端が修飾された所望核酸分子の5'末
端である、請求項４記載の方法。 - 【請求項７】修飾された所望核酸分子の二つの末端が試
料外ヌクレオチド残基含有配列を含む、請求項１〜３の
いずれか記載の方法。 - 【請求項８】当該末端の両者が修飾された所望核酸分子
の3'末端である、請求項７記載の方法。 - 【請求項９】当該末端の両者が修飾された所望核酸分子
の5'末端である、請求項７記載の方法。 - 【請求項１０】所望核酸分子の第一の鎖及び第二の鎖の
末端が複数の試料外ヌクレオチド残基を含む、請求項１
〜３のいずれか記載の方法。 - 【請求項１１】（Ａ）第一の鎖の少なくとも一方の末端
に、少なくとも１個のdU残基を含んでいる前もって選択
された配列の第一領域を有する、修飾された所望核酸分
子を形成させ； （Ｂ）上記前もって選択された配列の第一領域を、上記
少なくとも１個のdU残基のウラシル塩基の除去をもたら
すに充分な条件下で処理し、それにより、上記修飾され
た所望核酸分子の少なくとも１個の鎖に、相補的配列と
水素結合することのできる突出した末端を形成させ； （Ｃ）この修飾された分子（Ｂ）を、少なくとも１個の
突出した一本鎖末端を有し、且つ当該修飾された分子
（Ｂ）の当該突出した末端の少なくとも１個と水素結合
することのできる修飾されたベクターの存在下でインキ
ュベートし、それによりこの二本鎖線状所望核酸分子を
該二本鎖ベクター中に組み込むことからなる、 二本鎖線状所望核酸分子を二本鎖ベクター中に組み込む
方法。 - 【請求項１２】工程（Ｂ）において、当該dU残基を、少
なくとも１個の当該dU残基のウラシル塩基を除去するに
充分な条件下でUDGにより処理し、それにより無塩基性
部位を形成させる、請求項11記載の方法。 - 【請求項１３】工程（Ｂ）が、当該無塩基性部位を、修
飾された所望核酸分子を当該無塩基性部位において開裂
させるに充分な条件下でエンドヌクレアーゼIVにより処
理することをさらに含む、請求項12記載の方法。 - 【請求項１４】修飾された所望核酸分子の前もって選択
された配列の領域が同一である、請求項11記載の方法。 - 【請求項１５】工程（Ｃ）において、二つの突出した一
本鎖末端が制限エンドヌクレアーゼの作用により生成さ
れる、請求項11記載の方法。 - 【請求項１６】工程（Ｃ）において、二つの突出した一
本鎖末端がオリゴヌクレオチドの当該ベクターへのライ
ゲーションにより生成される、請求項11記載の方法。 - 【請求項１７】工程（Ｃ）において、二つの突出した一
本鎖末端が、 （Ｉ）該ベクターに、 （ｉ）第一の鎖の5'末端における、少なくとも１個のdU
残基を含む前もって選択された配列の第一の領域； （ii）第二の鎖の5'末端における、少なくとも１個のdU
残基を含む前もって選択された配列の第二の領域； を添加し、そして、 （II）前もって選択された配列の第一及び第二の領域
を、少なくとも１個の当該dU残基のウラシル塩基の除去
をもたらすに充分な条件の下で処理し、それにより、突
出した3'末端を有する修飾されたベクターを形成させる ことにより生成される、請求項11記載の方法。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US715,623 | 1991-06-14 | ||
| US07/715,623 US5137814A (en) | 1991-06-14 | 1991-06-14 | Use of exo-sample nucleotides in gene cloning |
| PCT/US1992/004922 WO1992022649A1 (en) | 1991-06-14 | 1992-06-12 | Use of exo-sample nucleotides in gene cloning |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH06500702A JPH06500702A (ja) | 1994-01-27 |
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Family
ID=24874814
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP50101693A Expired - Fee Related JP3395905B2 (ja) | 1991-06-14 | 1992-06-12 | 遺伝子クローニングにおける試料外ヌクレオチドの使用 |
Country Status (9)
| Country | Link |
|---|---|
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| EP (2) | EP0544894B1 (ja) |
| JP (1) | JP3395905B2 (ja) |
| AT (1) | ATE214095T1 (ja) |
| CA (1) | CA2088766A1 (ja) |
| DE (1) | DE69232457T2 (ja) |
| DK (1) | DK0544894T3 (ja) |
| ES (1) | ES2173867T3 (ja) |
| WO (1) | WO1992022649A1 (ja) |
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