JP3370786B2 - 自己抗体の免疫学的測定法 - Google Patents
自己抗体の免疫学的測定法Info
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は全身性エリテマトーデス
（ＳＬＥ）に特徴的な抗体を免疫学的に測定する方法に
関するものである。
（ＳＬＥ）に特徴的な抗体を免疫学的に測定する方法に
関するものである。
【０００２】
【従来の技術】自己免疫疾患とは、免疫機構が正常に働
かず、自己の細胞や組織に対して液性あるいは細胞性免
疫応答が起こり、自己組織に対して反応する抗体（自己
抗体）が出現する疾患である。自己免疫疾患の代表例で
ある全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）では、細胞の核
成分、特にデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）に対する抗体
（抗ＤＮＡ抗体）、および、細胞膜成分、特にカルジオ
リピン（ＣＬ）に対する抗体（抗ＣＬ抗体）などの自己
抗体が体液中に出現するが、出現する自己抗体は病態と
関連があることが知られている。このような知見に基づ
き、臨床検査においてこれらの自己抗体の測定が行われ
てきた。
かず、自己の細胞や組織に対して液性あるいは細胞性免
疫応答が起こり、自己組織に対して反応する抗体（自己
抗体）が出現する疾患である。自己免疫疾患の代表例で
ある全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）では、細胞の核
成分、特にデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）に対する抗体
（抗ＤＮＡ抗体）、および、細胞膜成分、特にカルジオ
リピン（ＣＬ）に対する抗体（抗ＣＬ抗体）などの自己
抗体が体液中に出現するが、出現する自己抗体は病態と
関連があることが知られている。このような知見に基づ
き、臨床検査においてこれらの自己抗体の測定が行われ
てきた。
【０００３】自己抗体の測定方法としては、抗体の抗原
に対する親和性を考慮した方法、例えば、硫酸アンモニ
ウム塩析法によって求められた抗ＤＮＡ抗体価とポリエ
チレングリコール沈澱法によって求められた抗ＤＮＡ抗
体価との比をとる方法（A.J.G. Swaak, Protides of Bi
ological Fluids, 33巻, M.Peeters編, Pergamon Pres
s, New York, pp.317-320 (1985)）、抗原であるＤＮＡ
と抗ＤＮＡ抗体とを反応させた後、大量のＤＮＡまたは
塩を加え、解離したＤＮＡまたは抗ＤＮＡ抗体量から、
抗ＤＮＡ抗体の抗原に対する親和性を測定する方法（H.
Mcgrath. Jr.,Arthritis and Rheumatism, 28巻, 4号
pp.425-430 (1985)）などが知られている。
に対する親和性を考慮した方法、例えば、硫酸アンモニ
ウム塩析法によって求められた抗ＤＮＡ抗体価とポリエ
チレングリコール沈澱法によって求められた抗ＤＮＡ抗
体価との比をとる方法（A.J.G. Swaak, Protides of Bi
ological Fluids, 33巻, M.Peeters編, Pergamon Pres
s, New York, pp.317-320 (1985)）、抗原であるＤＮＡ
と抗ＤＮＡ抗体とを反応させた後、大量のＤＮＡまたは
塩を加え、解離したＤＮＡまたは抗ＤＮＡ抗体量から、
抗ＤＮＡ抗体の抗原に対する親和性を測定する方法（H.
Mcgrath. Jr.,Arthritis and Rheumatism, 28巻, 4号
pp.425-430 (1985)）などが知られている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】以上の方法はいずれ
も、一旦抗原と自己抗体の複合体を形成させた後、高塩
濃度、極端なｐＨ変化、過剰な抗原処理などにより、抗
原抗体間の結合平衡を崩し、解離される自己抗体を測定
するものである。しかし、これらの方法は、抗原と自己
抗体との結合に疎水結合または水素結合が関与している
場合、これらの結合が環境の塩濃度上昇に伴ってより強
固なものとなるため、抗原抗体複合体を解離させるため
の処理（例えば、高塩濃度処理）によって、生理的条件
下における親和性以上の評価が下される危険性がある。
例えば、図１に示すように、ＳＬＥの患者１（●）、２
（■）、および３（▲）の血清中の自己抗体量と緩衝液
のイオン強度との関係をみると、環境のイオン強度を上
昇させていくと、あるイオン強度の点（屈曲点）を境
に、抗原に結合する抗体の量が上昇する。そのため、抗
原抗体間の特異的結合条件を崩し、正確な結合量を評価
できない危険性もある。
も、一旦抗原と自己抗体の複合体を形成させた後、高塩
濃度、極端なｐＨ変化、過剰な抗原処理などにより、抗
原抗体間の結合平衡を崩し、解離される自己抗体を測定
するものである。しかし、これらの方法は、抗原と自己
抗体との結合に疎水結合または水素結合が関与している
場合、これらの結合が環境の塩濃度上昇に伴ってより強
固なものとなるため、抗原抗体複合体を解離させるため
の処理（例えば、高塩濃度処理）によって、生理的条件
下における親和性以上の評価が下される危険性がある。
例えば、図１に示すように、ＳＬＥの患者１（●）、２
（■）、および３（▲）の血清中の自己抗体量と緩衝液
のイオン強度との関係をみると、環境のイオン強度を上
昇させていくと、あるイオン強度の点（屈曲点）を境
に、抗原に結合する抗体の量が上昇する。そのため、抗
原抗体間の特異的結合条件を崩し、正確な結合量を評価
できない危険性もある。
【０００５】近年、自己抗体の種類、量、および抗体価
のみならず、抗体と抗原の結合強度が病態に関連してい
るとの報告がなされ、自己抗体の抗原に対する親和性と
病態との関連が注目されている。従って、病態を正確に
表す抗体の測定法が望まれている。これらの問題点を解
決する目的で、抗原であるＤＮＡと抗ＤＮＡ抗体との結
合活性を塩濃度が異なる２種の緩衝液条件下で測定し、
それぞれの条件下で測定された抗ＤＮＡ抗体結合活性の
比をとる方法（特願平1-290964号）が考案された。しか
し、この方法では、自己抗体の測定値と病態との相関は
十分ではなく、自己抗体の量が必ずしも病態を反映して
いない。従って、病態を反映した抗体の測定という問題
点は未だ解決されていない。
のみならず、抗体と抗原の結合強度が病態に関連してい
るとの報告がなされ、自己抗体の抗原に対する親和性と
病態との関連が注目されている。従って、病態を正確に
表す抗体の測定法が望まれている。これらの問題点を解
決する目的で、抗原であるＤＮＡと抗ＤＮＡ抗体との結
合活性を塩濃度が異なる２種の緩衝液条件下で測定し、
それぞれの条件下で測定された抗ＤＮＡ抗体結合活性の
比をとる方法（特願平1-290964号）が考案された。しか
し、この方法では、自己抗体の測定値と病態との相関は
十分ではなく、自己抗体の量が必ずしも病態を反映して
いない。従って、病態を反映した抗体の測定という問題
点は未だ解決されていない。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明者は、鋭意研究を
重ね、従来からＳＬＥの病態との関連が指摘されていた
自己抗体（例えば、抗ＤＮＡ抗体、抗ＣＬ抗体など）の
すべてが、あるいは抗原に対する親和性の強い自己抗体
のすべてが、病態に関連しているのではなく、主として
静電親和性により抗原と結合する自己抗体、特に陰性荷
電物質に対して静電親和性により結合する自己抗体が、
病態（特に腎障害）に関連していることを見いだした。
例えば、図２に示す腎障害の有無（＋および−で示す）
と抗ＤＮＡ抗体価との関係は、イオン強度が0.5（静電
親和性による結合がほぼ阻害される条件下）より大きく
なると、正常者と患者との抗ＤＮＡ抗体価に差異が生じ
ず、まったく病態との相関がないことを示している。
重ね、従来からＳＬＥの病態との関連が指摘されていた
自己抗体（例えば、抗ＤＮＡ抗体、抗ＣＬ抗体など）の
すべてが、あるいは抗原に対する親和性の強い自己抗体
のすべてが、病態に関連しているのではなく、主として
静電親和性により抗原と結合する自己抗体、特に陰性荷
電物質に対して静電親和性により結合する自己抗体が、
病態（特に腎障害）に関連していることを見いだした。
例えば、図２に示す腎障害の有無（＋および−で示す）
と抗ＤＮＡ抗体価との関係は、イオン強度が0.5（静電
親和性による結合がほぼ阻害される条件下）より大きく
なると、正常者と患者との抗ＤＮＡ抗体価に差異が生じ
ず、まったく病態との相関がないことを示している。
【０００７】そこで、静電親和性による結合が阻害され
ない条件下で、イオン強度が異なる少なくとも３種以上
の緩衝液中で体液と陰性荷電物質とを反応させて、それ
ぞれの緩衝液中における自己抗体の陰性荷電物質に対す
る結合量を測定し、その結合量の最低値と、この最低値
を示すイオン強度より低イオン強度側での結合量の最高
値との差をとり、静電親和性により陰性荷電物質と結合
する自己抗体の量を求めることによる自己抗体の測定法
を見いだし、本発明を完成した。本発明の方法は、ある
一定のイオン強度以下で測定することにより抗原−抗体
の非特異的結合を排除し得るので、病態に応じた自己抗
体量の測定を可能にする。従って、特願平1-290964号に
記載の方法で達成し得なかった病態と相関がある自己抗
体の測定方法を提供し得る。
ない条件下で、イオン強度が異なる少なくとも３種以上
の緩衝液中で体液と陰性荷電物質とを反応させて、それ
ぞれの緩衝液中における自己抗体の陰性荷電物質に対す
る結合量を測定し、その結合量の最低値と、この最低値
を示すイオン強度より低イオン強度側での結合量の最高
値との差をとり、静電親和性により陰性荷電物質と結合
する自己抗体の量を求めることによる自己抗体の測定法
を見いだし、本発明を完成した。本発明の方法は、ある
一定のイオン強度以下で測定することにより抗原−抗体
の非特異的結合を排除し得るので、病態に応じた自己抗
体量の測定を可能にする。従って、特願平1-290964号に
記載の方法で達成し得なかった病態と相関がある自己抗
体の測定方法を提供し得る。
【０００８】従って、本発明は、イオン強度が異なる少
なくとも３種以上の緩衝液中で体液と陰性荷電物質とを
反応させて、それぞれの緩衝液中における抗体の該陰性
荷電物質に対する結合量を測定する工程、および、該結
合量の最低値と、この最低値を示すイオン強度より低イ
オン強度側での結合量の最高値との差をとることによ
り、該陰性荷電物質と結合する抗体の量を求める工程、
を包含する、自己抗体の測定方法を提供する。
なくとも３種以上の緩衝液中で体液と陰性荷電物質とを
反応させて、それぞれの緩衝液中における抗体の該陰性
荷電物質に対する結合量を測定する工程、および、該結
合量の最低値と、この最低値を示すイオン強度より低イ
オン強度側での結合量の最高値との差をとることによ
り、該陰性荷電物質と結合する抗体の量を求める工程、
を包含する、自己抗体の測定方法を提供する。
【０００９】好ましい実施態様では、上記緩衝液のイオ
ン強度は0.50以下であり、イオン強度の差は0.01〜0.50
である。
ン強度は0.50以下であり、イオン強度の差は0.01〜0.50
である。
【００１０】好ましい実施態様では、上記体液は、血
液、血漿、血清、腹水、リンパ液、関節内液、髄液、ま
たはこれらから得られた分画成分である。
液、血漿、血清、腹水、リンパ液、関節内液、髄液、ま
たはこれらから得られた分画成分である。
【００１１】好ましい実施態様では、上記陰性荷電物質
は、ＤＮＡまたはカルジオリピン（ＣＬ）、あるいは、
硫酸エステル基、スルホン酸基、カルボキシル基、また
はリン酸エステル基を１種または２種以上含む化合物で
ある。
は、ＤＮＡまたはカルジオリピン（ＣＬ）、あるいは、
硫酸エステル基、スルホン酸基、カルボキシル基、また
はリン酸エステル基を１種または２種以上含む化合物で
ある。
【００１２】好ましい実施態様では、上記緩衝液に用い
る塩は、NaCl、KCl、またはCaCl2である。
る塩は、NaCl、KCl、またはCaCl2である。
【００１３】好ましい実施態様では、上記結合量の測定
は酵素免疫測定法で行われる。
は酵素免疫測定法で行われる。
【００１４】本発明はまた、イオン強度が異なる少なく
とも３種以上の緩衝液を含む、上記の測定方法を行うた
めの測定用キットを提供する。
とも３種以上の緩衝液を含む、上記の測定方法を行うた
めの測定用キットを提供する。
【００１５】以下に本発明を詳細に説明する。
【００１６】本発明の測定方法で測定され得る自己抗体
には、抗核抗体、抗ＤＮＡ抗体、抗ＣＬ抗体、抗糸球体
基底膜抗体、抗ヘパラン硫酸抗体などがあり、特に、全
身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）に特徴的な抗ＤＮＡ抗
体および抗ＣＬ抗体が好ましい。
には、抗核抗体、抗ＤＮＡ抗体、抗ＣＬ抗体、抗糸球体
基底膜抗体、抗ヘパラン硫酸抗体などがあり、特に、全
身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）に特徴的な抗ＤＮＡ抗
体および抗ＣＬ抗体が好ましい。
【００１７】本発明の測定方法に使用し得る体液として
は、血液、血漿、血清、腹水、リンパ液、関節内液、髄
液、および、これらをゲルクロマトグラフィー、硫安分
画などで分画することにより得られた分画成分、ならび
にその他の生体由来の液性成分など、いずれをも用い得
る。
は、血液、血漿、血清、腹水、リンパ液、関節内液、髄
液、および、これらをゲルクロマトグラフィー、硫安分
画などで分画することにより得られた分画成分、ならび
にその他の生体由来の液性成分など、いずれをも用い得
る。
【００１８】本発明の測定方法に使用し得る陰性荷電物
質は、従来よりＳＬＥの自己抗体の測定に用いられてい
るＤＮＡ、ＣＬなどの生体由来物質、または、硫酸エス
テル基、スルホン酸基、カルボキシル基、リン酸エステ
ル基などのpHが中性付近で負に帯電するような官能基を
１種または２種以上含む化合物が挙げられる。
質は、従来よりＳＬＥの自己抗体の測定に用いられてい
るＤＮＡ、ＣＬなどの生体由来物質、または、硫酸エス
テル基、スルホン酸基、カルボキシル基、リン酸エステ
ル基などのpHが中性付近で負に帯電するような官能基を
１種または２種以上含む化合物が挙げられる。
【００１９】また、上記緩衝液に用い得る塩は、水中で
完全に電離する強電解質であり、特に、NaCl、KCl、CaC
l2が好ましい。
完全に電離する強電解質であり、特に、NaCl、KCl、CaC
l2が好ましい。
【００２０】本発明に用い得るイオン強度緩衝液は、生
理的条件下では発生しない疎水結合などによる陰性荷電
物質−自己抗体間の非特異的結合が生じない強度であ
り、好ましくはイオン強度は0.50以下である。また、各
イオン強度緩衝液間のイオン強度の差は0.01〜0.5、好
ましくは0.1〜0.3である。
理的条件下では発生しない疎水結合などによる陰性荷電
物質−自己抗体間の非特異的結合が生じない強度であ
り、好ましくはイオン強度は0.50以下である。また、各
イオン強度緩衝液間のイオン強度の差は0.01〜0.5、好
ましくは0.1〜0.3である。
【００２１】本発明に用い得る抗体の測定法は、蛍光抗
体法、受身赤血球凝集反応、沈降反応、ラジオイムノア
ッセイ、酵素免疫測定法（ＥＩＡ法）などの公知の免疫
学的測定法を利用し得る。簡便さ、安全性、および定量
性の面からＥＩＡ法、特に酵素結合イムノソルベント検
定法（ＥＬＩＳＡ法）が好ましい。
体法、受身赤血球凝集反応、沈降反応、ラジオイムノア
ッセイ、酵素免疫測定法（ＥＩＡ法）などの公知の免疫
学的測定法を利用し得る。簡便さ、安全性、および定量
性の面からＥＩＡ法、特に酵素結合イムノソルベント検
定法（ＥＬＩＳＡ法）が好ましい。
【００２２】ＥＩＡ法により、例えば、以下のようにし
て抗体価を測定し得る。まず、抗原として用いるＤＮ
Ａ、ＣＬなどの陰性荷電物質を、固相に固定し、次い
で、ウシ血清アルブミンなどを用いて、抗原への非特異
的吸着を防ぐための処理を行う。次に、低イオン強度緩
衝液および高イオン強度緩衝液を調製し、それぞれに試
料（体液）を加えて、抗原抗体反応を行う。反応終了
後、固相に結合した抗体と酵素標識した抗体とをさらに
反応させ、固相に結合した酵素活性を測定することによ
り、抗体量が求められ得る。標識酵素としては、西洋ワ
サビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−
ガラクトシダーゼなどを用い得る。
て抗体価を測定し得る。まず、抗原として用いるＤＮ
Ａ、ＣＬなどの陰性荷電物質を、固相に固定し、次い
で、ウシ血清アルブミンなどを用いて、抗原への非特異
的吸着を防ぐための処理を行う。次に、低イオン強度緩
衝液および高イオン強度緩衝液を調製し、それぞれに試
料（体液）を加えて、抗原抗体反応を行う。反応終了
後、固相に結合した抗体と酵素標識した抗体とをさらに
反応させ、固相に結合した酵素活性を測定することによ
り、抗体量が求められ得る。標識酵素としては、西洋ワ
サビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−
ガラクトシダーゼなどを用い得る。
【００２３】少なくとも３種以上の緩衝液中で測定した
抗体量から、各測定試料において最低値を示す屈曲点を
求め、この屈曲点の抗体量と、屈曲点より低イオン強度
側の最高値の抗体量との差をとることにより、自己抗体
量を求め得る。一般に、屈曲点のイオン強度は、個体
差、病態差などがあるため一定ではないが、図１に示す
ように、イオン強度0.2〜0.5、特に0.3〜0.4であること
が多い。
抗体量から、各測定試料において最低値を示す屈曲点を
求め、この屈曲点の抗体量と、屈曲点より低イオン強度
側の最高値の抗体量との差をとることにより、自己抗体
量を求め得る。一般に、屈曲点のイオン強度は、個体
差、病態差などがあるため一定ではないが、図１に示す
ように、イオン強度0.2〜0.5、特に0.3〜0.4であること
が多い。
【００２４】本発明の自己抗体の測定方法を行うための
測定用キットは、イオン強度の異なる少なくとも３種以
上の緩衝液を含み、例えば、抗原を固定したマイクロタ
イタープレート、酵素標識抗体、酵素基質液、既知抗体
価の検量線用試料を含む。
測定用キットは、イオン強度の異なる少なくとも３種以
上の緩衝液を含み、例えば、抗原を固定したマイクロタ
イタープレート、酵素標識抗体、酵素基質液、既知抗体
価の検量線用試料を含む。
【００２５】
【実施例】次に、本発明を実施例に基づいて、具体的に
説明する。
説明する。
【００２６】〔実施例１〕９６穴マイクロタイタープレ
ート（Nunc社製）にトリスバッファー（0.15M Tris-HC
l、pH 7.6）で希釈したPoly-L-Lysine（10μg/ml、Sigm
a社製）を各ウエルに100μlずつ入れ、室温で30分間放
置した後、洗浄液（0.05％ Tween20含有0.015M Tris-HC
l＋0.135M NaCl、pH 7.6）で３回洗浄し、プレートをプ
レコーティングした。次に、トリスバッファーで希釈し
た二本鎖ＤＮＡ（10μg/ml）を、各ウエルに100μlずつ
入れ、室温で30分間静置した後、洗浄液で３回洗浄する
ことにより抗原を固定した。
ート（Nunc社製）にトリスバッファー（0.15M Tris-HC
l、pH 7.6）で希釈したPoly-L-Lysine（10μg/ml、Sigm
a社製）を各ウエルに100μlずつ入れ、室温で30分間放
置した後、洗浄液（0.05％ Tween20含有0.015M Tris-HC
l＋0.135M NaCl、pH 7.6）で３回洗浄し、プレートをプ
レコーティングした。次に、トリスバッファーで希釈し
た二本鎖ＤＮＡ（10μg/ml）を、各ウエルに100μlずつ
入れ、室温で30分間静置した後、洗浄液で３回洗浄する
ことにより抗原を固定した。
【００２７】この二本鎖ＤＮＡは、ウシ胸腺由来のＤＮ
Ａ（Boehringer Mannheim Gmbh社製）を酵素処理（Ｓ１
ヌクレアーゼ（１U/ml、0.5mM ZnSO4、0.1M 酢酸バッフ
ァー、pH 6.0、SANKYO社製）で37℃、30分処理）して得
たものである。
Ａ（Boehringer Mannheim Gmbh社製）を酵素処理（Ｓ１
ヌクレアーゼ（１U/ml、0.5mM ZnSO4、0.1M 酢酸バッフ
ァー、pH 6.0、SANKYO社製）で37℃、30分処理）して得
たものである。
【００２８】抗原を固定したプレートの各ウエルに１％
ウシ血清アルブミン（Sigma社製、以下ＢＳＡという）
含有トリスバッファー300μlを入れ、室温で１時間放置
して、ＤＮＡが固定されている部分以外の部分にＢＳＡ
を吸着させ、二本鎖ＤＮＡに結合する抗体以外の抗体が
非特異に吸着することを防ぐ処理を行った。イオン強度
0.2、0.3、および0.5の各イオン強度の緩衝液（１％Ｂ
ＳＡ、0.15M Tris-HCl、pH 7.6、NaClをそれぞれ0.2、
0.3、および0.5M含む）を調製し、それらを用いて、400
倍に希釈した５人のＳＬＥ患者血漿100μlをそれぞれ２
個のウエルに入れ４℃で一晩静置した。反応終了後、洗
浄液200μlで３回洗浄した。１％ＢＳＡ含有トリスバッ
ファーを用いて2000倍に希釈したペルオキシダーゼ標識
ウサギ抗ヒトIgG(Fc)抗体（Cappel社製）100μlを各ウ
エルに入れ、さらに室温で１時間反応させた。
ウシ血清アルブミン（Sigma社製、以下ＢＳＡという）
含有トリスバッファー300μlを入れ、室温で１時間放置
して、ＤＮＡが固定されている部分以外の部分にＢＳＡ
を吸着させ、二本鎖ＤＮＡに結合する抗体以外の抗体が
非特異に吸着することを防ぐ処理を行った。イオン強度
0.2、0.3、および0.5の各イオン強度の緩衝液（１％Ｂ
ＳＡ、0.15M Tris-HCl、pH 7.6、NaClをそれぞれ0.2、
0.3、および0.5M含む）を調製し、それらを用いて、400
倍に希釈した５人のＳＬＥ患者血漿100μlをそれぞれ２
個のウエルに入れ４℃で一晩静置した。反応終了後、洗
浄液200μlで３回洗浄した。１％ＢＳＡ含有トリスバッ
ファーを用いて2000倍に希釈したペルオキシダーゼ標識
ウサギ抗ヒトIgG(Fc)抗体（Cappel社製）100μlを各ウ
エルに入れ、さらに室温で１時間反応させた。
【００２９】免疫反応終了後、プレートを洗浄液200μl
で３回洗浄し、基質液（0.04％ο-フェニレンジアミ
ン、0.014％ H2O2、0.15M クエン酸−リン酸バッファ
ー、pH 4.2）100μlを入れ室温で４分間静置した後、2.
5M H2SO4 100μlを加えて発色反応を停止し、マイクロ
プレートリーダー（BioRad社製）で492nmの吸光度を測
定した。
で３回洗浄し、基質液（0.04％ο-フェニレンジアミ
ン、0.014％ H2O2、0.15M クエン酸−リン酸バッファ
ー、pH 4.2）100μlを入れ室温で４分間静置した後、2.
5M H2SO4 100μlを加えて発色反応を停止し、マイクロ
プレートリーダー（BioRad社製）で492nmの吸光度を測
定した。
【００３０】抗二本鎖ＤＮＡ抗体価100U/mlの標準血清
を１％ＢＳＡ含有トリスバッファーを用いて希釈し、作
成した検量線（0〜100U/ml）から、各イオン強度緩衝液
の、それぞれの環境下で抗原に結合した抗体価を求め
た。
を１％ＢＳＡ含有トリスバッファーを用いて希釈し、作
成した検量線（0〜100U/ml）から、各イオン強度緩衝液
の、それぞれの環境下で抗原に結合した抗体価を求め
た。
【００３１】このようにして求められた各試料における
屈曲点の抗体価と、屈曲点より低イオン強度での最高値
の抗体価との差を求め、静電親和力により二本鎖ＤＮＡ
と結合する抗体（Electro-static Affinity Antibody：
ＥＡＡ）を検出した。
屈曲点の抗体価と、屈曲点より低イオン強度での最高値
の抗体価との差を求め、静電親和力により二本鎖ＤＮＡ
と結合する抗体（Electro-static Affinity Antibody：
ＥＡＡ）を検出した。
【００３２】得られた結果を従来法と比較して表１に示
した。従来法として用いた抗ＤＮＡ抗体価は、一般に市
販されている日本DPC社製「リコンビジェンＥＬＩＳＡ
抗ｄｓＤＮＡキット」によって求めた。
した。従来法として用いた抗ＤＮＡ抗体価は、一般に市
販されている日本DPC社製「リコンビジェンＥＬＩＳＡ
抗ｄｓＤＮＡキット」によって求めた。
【００３３】表１に示すように、陰性荷電物質として二
本鎖ＤＮＡを用いて、静電親和性によりＤＮＡに結合す
る抗体（ＥＡＡ）を測定することができた。本願発明の
方法により測定したＥＡＡと、従来法で測定したＤＮＡ
への親和性の強度のみの抗ＤＮＡ抗体価とは異なるた
め、得られた値の大小関係は一部異なっていた。
本鎖ＤＮＡを用いて、静電親和性によりＤＮＡに結合す
る抗体（ＥＡＡ）を測定することができた。本願発明の
方法により測定したＥＡＡと、従来法で測定したＤＮＡ
への親和性の強度のみの抗ＤＮＡ抗体価とは異なるた
め、得られた値の大小関係は一部異なっていた。
【００３４】
【表１】
【００３５】〔実施例２〕９６穴マイクロタイタープレ
ート（Nunc社製）にトリスバッファー（0.15M Tris-HC
l、pH 7.6）で希釈したPoly-L-Lysine（10μg/ml、Sigm
a社製）を各ウエルに100μlずつ入れ、室温で30分間放
置した後、洗浄液（0.05% Tween20含有0.015M Tris-HCl
＋0.135M NaCl、pH 7.6）で３回洗浄し、プレートをプ
レコーティングした。次に、トリスバッファーで希釈し
た二本鎖ＤＮＡ（10μg/ml）を、各ウエルに100μlずつ
入れ、室温で30分間静置した後、洗浄液で３回洗浄する
ことにより抗原を固定した。
ート（Nunc社製）にトリスバッファー（0.15M Tris-HC
l、pH 7.6）で希釈したPoly-L-Lysine（10μg/ml、Sigm
a社製）を各ウエルに100μlずつ入れ、室温で30分間放
置した後、洗浄液（0.05% Tween20含有0.015M Tris-HCl
＋0.135M NaCl、pH 7.6）で３回洗浄し、プレートをプ
レコーティングした。次に、トリスバッファーで希釈し
た二本鎖ＤＮＡ（10μg/ml）を、各ウエルに100μlずつ
入れ、室温で30分間静置した後、洗浄液で３回洗浄する
ことにより抗原を固定した。
【００３６】この二本鎖ＤＮＡは、ウシ胸腺由来のＤＮ
Ａ（Boehringer Mannheim Gmbh社製）を酵素処理（Ｓ１
ヌクレアーゼ（１U/ml、0.5mM ZnSO4、0.1M 酢酸バッフ
ァー、pH 6.0、SANKYO社製）で37℃、30分処理）して得
たものである。
Ａ（Boehringer Mannheim Gmbh社製）を酵素処理（Ｓ１
ヌクレアーゼ（１U/ml、0.5mM ZnSO4、0.1M 酢酸バッフ
ァー、pH 6.0、SANKYO社製）で37℃、30分処理）して得
たものである。
【００３７】抗原を固定したプレートの各ウエルに１％
ＢＳＡ（Sigma社製）含有トリスバッファー300μlを入
れ、室温で１時間放置して、ＤＮＡが固定されている部
分以外の部分にＢＳＡを吸着させ、二本鎖ＤＮＡに結合
する抗体以外の抗体が非特異に吸着することを防ぐ処理
を行った。各イオン強度の緩衝液（１％ＢＳＡ、0.15M
Tris-HCl、pH 7.6、NaClを0.2、0.3、または0.5M含む）
を調製し、それらを用いて400倍に希釈したＳＬＥ患者
血漿（蛋白尿ありの群（＋）１２例、および蛋白尿なし
の群（−）１８例）100μlをそれぞれ２個のウエルに入
れ４℃で一晩静置した。反応終了後、洗浄液200μlで３
回洗浄した。１％ＢＳＡ含有トリスバッファーを用いて
2000倍に希釈したペルオキシダーゼ標識ウサギ抗ヒトIg
G(Fc)抗体（Cappel社製）100μlを各ウエルに入れ、さ
らに室温で１時間反応させた。
ＢＳＡ（Sigma社製）含有トリスバッファー300μlを入
れ、室温で１時間放置して、ＤＮＡが固定されている部
分以外の部分にＢＳＡを吸着させ、二本鎖ＤＮＡに結合
する抗体以外の抗体が非特異に吸着することを防ぐ処理
を行った。各イオン強度の緩衝液（１％ＢＳＡ、0.15M
Tris-HCl、pH 7.6、NaClを0.2、0.3、または0.5M含む）
を調製し、それらを用いて400倍に希釈したＳＬＥ患者
血漿（蛋白尿ありの群（＋）１２例、および蛋白尿なし
の群（−）１８例）100μlをそれぞれ２個のウエルに入
れ４℃で一晩静置した。反応終了後、洗浄液200μlで３
回洗浄した。１％ＢＳＡ含有トリスバッファーを用いて
2000倍に希釈したペルオキシダーゼ標識ウサギ抗ヒトIg
G(Fc)抗体（Cappel社製）100μlを各ウエルに入れ、さ
らに室温で１時間反応させた。
【００３８】免疫反応終了後、プレートを洗浄液200μl
で３回洗浄し、基質液（0.04％ο-フェニレンジアミ
ン、0.014％ H2O2、0.15M クエン酸−リン酸バッファ
ー、pH 4.2）100μlを入れ室温で４分間静置した後、2.
5M H2SO4 100μlを加えて発色反応を停止し、マイクロ
プレートリーダー（BioRad社製）で492nmの吸光度を測
定した。
で３回洗浄し、基質液（0.04％ο-フェニレンジアミ
ン、0.014％ H2O2、0.15M クエン酸−リン酸バッファ
ー、pH 4.2）100μlを入れ室温で４分間静置した後、2.
5M H2SO4 100μlを加えて発色反応を停止し、マイクロ
プレートリーダー（BioRad社製）で492nmの吸光度を測
定した。
【００３９】抗二本鎖ＤＮＡ抗体価100U/mlの標準血清
を１％ＢＳＡ含有トリスバッファーを用いて希釈し、作
成した検量線（0〜100U/ml）から、各イオン強度緩衝液
の、それぞれの環境下で抗原に結合した抗体価を求め
た。
を１％ＢＳＡ含有トリスバッファーを用いて希釈し、作
成した検量線（0〜100U/ml）から、各イオン強度緩衝液
の、それぞれの環境下で抗原に結合した抗体価を求め
た。
【００４０】このようにして求められた各試料における
屈曲点での抗体価と、屈曲点より低イオン強度側で最高
値の抗体価との差をとり、静電親和性により二本鎖ＤＮ
Ａと結合する抗体を検出した。
屈曲点での抗体価と、屈曲点より低イオン強度側で最高
値の抗体価との差をとり、静電親和性により二本鎖ＤＮ
Ａと結合する抗体を検出した。
【００４１】得られた結果を従来法と比較して図３に示
す。従来法として用いた抗ＤＮＡ抗体価は、一般に市販
されている日本DPC社製「リコンビジェンＥＬＩＳＡ抗
ｄｓＤＮＡキット」によって求めた。
す。従来法として用いた抗ＤＮＡ抗体価は、一般に市販
されている日本DPC社製「リコンビジェンＥＬＩＳＡ抗
ｄｓＤＮＡキット」によって求めた。
【００４２】図３に示すように、従来法である抗ＤＮＡ
抗体価に比べ、本発明の測定方法によるＥＡＡでは、よ
り病態に相関した評価が得られた。
抗体価に比べ、本発明の測定方法によるＥＡＡでは、よ
り病態に相関した評価が得られた。
【００４３】
【発明の効果】本発明の自己抗体の測定方法により、Ｓ
ＬＥの病態に深く関係していると考えられる静電親和性
により抗原に結合する自己抗体を特異的に、かつ簡便に
測定することができ、ＳＬＥの診断をより正確に行うこ
とが可能となった。
ＬＥの病態に深く関係していると考えられる静電親和性
により抗原に結合する自己抗体を特異的に、かつ簡便に
測定することができ、ＳＬＥの診断をより正確に行うこ
とが可能となった。
【図１】抗原抗体反応時の、緩衝液のイオン強度とＳＬ
Ｅ患者血清中の抗原に対して結合する抗体量との関係を
示す。
Ｅ患者血清中の抗原に対して結合する抗体量との関係を
示す。
【図２】従来法を用いた場合の、正常者（−）およびＳ
ＬＥ患者（＋）の抗ＤＮＡ抗体価と緩衝液のイオン強度
との関係を示す。
ＬＥ患者（＋）の抗ＤＮＡ抗体価と緩衝液のイオン強度
との関係を示す。
【図３】正常者（−）およびＳＬＥ患者（＋）の血漿
を、ＥＡＡで測定した結果または一般的な抗ＤＮＡ抗体
測定キットで測定した結果を示す。
を、ＥＡＡで測定した結果または一般的な抗ＤＮＡ抗体
測定キットで測定した結果を示す。
Claims (9)
- 【請求項１】 自己抗体の測定方法であって、 イオン強度が異なる少なくとも３種以上の緩衝液中で体
液と陰性荷電物質とを反応させて、該少なくとも３種以
上の緩衝液中における自己抗体の該陰性荷電物質に対す
る結合量を測定する工程、および、 該結合量の最低値と、該最低値を示すイオン強度より低
イオン強度側での結合量の最高値との差をとることによ
り、該陰性荷電物質と結合する自己抗体の量を求める工
程、を包含する方法。 - 【請求項２】 前記緩衝液のイオン強度が0.50以下であ
る、請求項１に記載の測定方法。 - 【請求項３】 前記緩衝液のイオン強度の差が0.01〜0.
50である、請求項１に記載の測定方法。 - 【請求項４】 前記体液が、血液、血漿、血清、腹水、
リンパ液、関節内液、髄液、または、これらから得られ
た分画成分である、請求項１に記載の測定方法。 - 【請求項５】 前記陰性荷電物質が、ＤＮＡまたはカル
ジオリピンである、請求項１に記載の測定方法。 - 【請求項６】 前記陰性荷電物質が、硫酸エステル基、
スルホン酸基、カルボキシル基、またはリン酸エステル
基を１種または２種以上含む化合物である、請求項１に
記載の測定方法。 - 【請求項７】 前記緩衝液に用いる塩が、NaCl、KCl、
またはCaCl2である、請求項１に記載の測定方法。 - 【請求項８】 前記結合量の測定が酵素免疫測定法で行
われる、請求項１に記載の測定方法。 - 【請求項９】 イオン強度が異なる少なくとも３種以上
の緩衝液を含む、請求項１に記載の測定方法を行うため
の測定用キット。
Priority Applications (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP17272694A JP3370786B2 (ja) | 1994-07-25 | 1994-07-25 | 自己抗体の免疫学的測定法 |
| EP95926015A EP0724158A4 (en) | 1994-07-25 | 1995-07-24 | IMMUNOLOGICAL ASSAY METHOD FOR SELF-ANTIBODIES |
| PCT/JP1995/001466 WO1996003654A1 (fr) | 1994-07-25 | 1995-07-24 | Procede de dosage immunologique d'auto-anticorps |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP17272694A JP3370786B2 (ja) | 1994-07-25 | 1994-07-25 | 自己抗体の免疫学的測定法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0835965A JPH0835965A (ja) | 1996-02-06 |
| JP3370786B2 true JP3370786B2 (ja) | 2003-01-27 |
Family
ID=15947196
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP17272694A Expired - Fee Related JP3370786B2 (ja) | 1994-07-25 | 1994-07-25 | 自己抗体の免疫学的測定法 |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0724158A4 (ja) |
| JP (1) | JP3370786B2 (ja) |
| WO (1) | WO1996003654A1 (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN113671195A (zh) * | 2021-09-13 | 2021-11-19 | 迈克生物股份有限公司 | 抗双链dna抗体检测试剂盒及其应用 |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH03167473A (ja) * | 1989-11-08 | 1991-07-19 | Nippon Dpc Corp | 抗ｄｎａ抗体結合活性測定法および測定用キット |
| EP0474849B1 (en) * | 1990-04-06 | 1995-09-13 | Yamasa Shoyu Co., Ltd. | Methods for determining antiphospholipid antibodies |
-
1994
- 1994-07-25 JP JP17272694A patent/JP3370786B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
1995
- 1995-07-24 WO PCT/JP1995/001466 patent/WO1996003654A1/ja not_active Application Discontinuation
- 1995-07-24 EP EP95926015A patent/EP0724158A4/en not_active Withdrawn
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0724158A1 (en) | 1996-07-31 |
| EP0724158A4 (en) | 1998-04-29 |
| WO1996003654A1 (fr) | 1996-02-08 |
| JPH0835965A (ja) | 1996-02-06 |
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Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20021031 |
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