JP3321293B2 - 赤血球の溶解方法 - Google Patents
赤血球の溶解方法Info
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は赤血球の溶解のための方
法及び調製品、血液の調製品、並びに赤血球分析の方法
に関する。
法及び調製品、血液の調製品、並びに赤血球分析の方法
に関する。
【０００２】
【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】血液は
いくつかの細胞集団を含む。最も多いのは赤血球及び血
小板であり、これは二酸化炭素と酸素の交換及び輸送を
担う。血小板は凝血に一役担っている。白血球は免疫系
のコントロールに関与する少数派の集団である。
いくつかの細胞集団を含む。最も多いのは赤血球及び血
小板であり、これは二酸化炭素と酸素の交換及び輸送を
担う。血小板は凝血に一役担っている。白血球は免疫系
のコントロールに関与する少数派の集団である。
【０００３】顕微鏡分析又はフローサイトメトリー分析
により、白血球の３つのサブ集団が認識されている：複
数の核を有する多核細胞及び１個のみの核を有する単核
細胞の単核細胞のうちで、リンパ球は小型の球状核を有
することにより、そして単球は大きめの月型核を有する
ことにより区別されうる。
により、白血球の３つのサブ集団が認識されている：複
数の核を有する多核細胞及び１個のみの核を有する単核
細胞の単核細胞のうちで、リンパ球は小型の球状核を有
することにより、そして単球は大きめの月型核を有する
ことにより区別されうる。
【０００４】これらの集団はサイトメトリーによりスキ
ャッターグラフにおいて区別されうる。白血球集団のう
ちで、約６０％が多核細胞であり、約３０％がリンパ球
であり、そして１０％が単球である。
ャッターグラフにおいて区別されうる。白血球集団のう
ちで、約６０％が多核細胞であり、約３０％がリンパ球
であり、そして１０％が単球である。
【０００５】リンパ球のパーセンテージにおける変動は
個体の健康状態の指標を供しうる。
個体の健康状態の指標を供しうる。
【０００６】蛍光マーカーにコンジュゲートせしめたモ
ノクローナル抗体による血液細胞の染色により、及び顕
微鏡又はフローサイトメトリーによる細胞の分析を経
て、血液細胞及びサブ集団は単なる光学的手段よりもよ
り正確に、且つより詳細に区別することができる。
ノクローナル抗体による血液細胞の染色により、及び顕
微鏡又はフローサイトメトリーによる細胞の分析を経
て、血液細胞及びサブ集団は単なる光学的手段よりもよ
り正確に、且つより詳細に区別することができる。
【０００７】例えば、マーカーＣＤ１９を利用すること
により、骨髄に由来するリンパ球集団におけるＢ−細胞
を同定することができる。同じ集団において、ＣＤ３マ
ーカーにより、胸腺に由来するＴ細胞を区別することが
できる。ＣＤ４及びＣＤ８マーカーにより、ヘルパー機
能又はサプレッサー／キラー機能を有するＴ細胞それぞ
れを区別することができる。
により、骨髄に由来するリンパ球集団におけるＢ−細胞
を同定することができる。同じ集団において、ＣＤ３マ
ーカーにより、胸腺に由来するＴ細胞を区別することが
できる。ＣＤ４及びＣＤ８マーカーにより、ヘルパー機
能又はサプレッサー／キラー機能を有するＴ細胞それぞ
れを区別することができる。
【０００８】リンパ球のサブクラスの同定は免疫系の診
断及びその疾患の処置にとって重要である。
断及びその疾患の処置にとって重要である。
【０００９】赤血球は血液中の多数派の集団であるた
め、それらは白血球をマスクしてしまうことがあり、従
ってフローサイトメトリーによるその分析を困難なもの
としてしまうことがある。慣用の免疫蛍光技術にはリン
パ球と赤血球の物理学的分離、例えば勾配密度遠心（Ｂ
ｏｙｅｍ，Ａ．１９６８，Ｓｃａｎｄ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．
Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．，２１ ｓｕｐｐｌ，９７）が
挙げられる。
め、それらは白血球をマスクしてしまうことがあり、従
ってフローサイトメトリーによるその分析を困難なもの
としてしまうことがある。慣用の免疫蛍光技術にはリン
パ球と赤血球の物理学的分離、例えば勾配密度遠心（Ｂ
ｏｙｅｍ，Ａ．１９６８，Ｓｃａｎｄ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．
Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．，２１ ｓｕｐｐｌ，９７）が
挙げられる。
【００１０】より迅速な他の方法は、全血における赤血
球溶解である。例えば、Ｈａｎｓｅｎの方法においては
（米国出願第４，２８４，４１２号、欧州出願０，０２
２，６７０号）、抗凝血剤で処理した血液サンプルを蛍
光抗体コンジュゲート調製品と混合している。赤血球の
インキュベーション及び溶解の後、サンプルをフローサ
イトメーターに通して、一定の抗体について陽性である
白血球集団を分析する。
球溶解である。例えば、Ｈａｎｓｅｎの方法においては
（米国出願第４，２８４，４１２号、欧州出願０，０２
２，６７０号）、抗凝血剤で処理した血液サンプルを蛍
光抗体コンジュゲート調製品と混合している。赤血球の
インキュベーション及び溶解の後、サンプルをフローサ
イトメーターに通して、一定の抗体について陽性である
白血球集団を分析する。
【００１１】適正なサイトメトリー分析を行うのに、全
ての赤血球を溶解することが必要なだけでなく、サイト
メーターが多核細胞、単球、リンパ球、及び細胞塊と血
小板との混合物を区別することができるように白血球が
全て形態学的な状態で保存されていることが必要でもあ
る。赤血球を溶解するのに多大なる様々な方法がある；
これらの方法は例えば酸処理、アルカリ処理、塩化アン
モニウム、多価アルコール、又は低緊張ショックの利用
を基礎とする処理を基礎としうる。これらの方法にかか
わる問題は、赤血球を溶解することにより、白血球の形
態学レベルに変化が導入されることにある。
ての赤血球を溶解することが必要なだけでなく、サイト
メーターが多核細胞、単球、リンパ球、及び細胞塊と血
小板との混合物を区別することができるように白血球が
全て形態学的な状態で保存されていることが必要でもあ
る。赤血球を溶解するのに多大なる様々な方法がある；
これらの方法は例えば酸処理、アルカリ処理、塩化アン
モニウム、多価アルコール、又は低緊張ショックの利用
を基礎とする処理を基礎としうる。これらの方法にかか
わる問題は、赤血球を溶解することにより、白血球の形
態学レベルに変化が導入されることにある。
【００１２】慣用の方法において、白血球分解は、例え
ば溶解直後に分析を行うことにより、又は酸及び低緊張
条件後の中和により、又は細胞を洗うことにより、又は
ホルムアルデヒドもしくはパラホルムアルデヒドの如き
の固定剤の添加により防がれている。
ば溶解直後に分析を行うことにより、又は酸及び低緊張
条件後の中和により、又は細胞を洗うことにより、又は
ホルムアルデヒドもしくはパラホルムアルデヒドの如き
の固定剤の添加により防がれている。
【００１３】サイトメーターの製造者により利用される
溶解方法は様々なサイトメーターの光学的特徴に適応さ
れている。Ｂｅｃｔｏｎ，Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ａｎｄ
Ｃｏ．のサイトメーターは白血球の形態学的変化に対
して比較的感度が悪い。やや低緊張条件のもとでの溶解
がこのタイプの装置について示されている（米国出願第
４，９０２，６１３号）。Ｃｏｕｌｔｅｒ社のサイトメ
ーターは白血球の形態学的変化に対してはるかに感受性
となっている。Ｃｏｕｌｔｅｒ由来の溶解系は約６秒間
にわたる低緊張及び酸溶解を利用し、そしてその後に混
合物の等張性値及びpHを正す。かかる系の不都合さは、
正確なる６秒という時間が、非自動操作条件のもとで成
し遂げるのに困難であることにある。
溶解方法は様々なサイトメーターの光学的特徴に適応さ
れている。Ｂｅｃｔｏｎ，Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ａｎｄ
Ｃｏ．のサイトメーターは白血球の形態学的変化に対
して比較的感度が悪い。やや低緊張条件のもとでの溶解
がこのタイプの装置について示されている（米国出願第
４，９０２，６１３号）。Ｃｏｕｌｔｅｒ社のサイトメ
ーターは白血球の形態学的変化に対してはるかに感受性
となっている。Ｃｏｕｌｔｅｒ由来の溶解系は約６秒間
にわたる低緊張及び酸溶解を利用し、そしてその後に混
合物の等張性値及びpHを正す。かかる系の不都合さは、
正確なる６秒という時間が、非自動操作条件のもとで成
し遂げるのに困難であることにある。
【００１４】別の方法は塩化アンモニウムの利用により
構成される。この方法においては、溶液のイオン強度は
生理的となっており、そして白血球の形態は短時間後に
はよく保存されている。この方法の欠点は塩化アンモニ
ウムが細胞内のpHの上昇をもたらすこと、及び細胞の洗
浄の後でさえもの白血球の連続分解をもたらすことにあ
り、これは固定剤で抑えることができない。
構成される。この方法においては、溶液のイオン強度は
生理的となっており、そして白血球の形態は短時間後に
はよく保存されている。この方法の欠点は塩化アンモニ
ウムが細胞内のpHの上昇をもたらすこと、及び細胞の洗
浄の後でさえもの白血球の連続分解をもたらすことにあ
り、これは固定剤で抑えることができない。
【００１５】サンプルの洗浄を回避する、それ故不正確
な白血球の計測を回避する白血球分析及び赤血球溶解の
方法を得ることが所望されるであろう。
な白血球の計測を回避する白血球分析及び赤血球溶解の
方法を得ることが所望されるであろう。
【００１６】
【課題を解決する手段】従って、本願の目的は、溶解中
の妨害赤血球塊の形成を伴うことなく、血液サンプルの
赤血球細胞を溶解するための調製品にある。本発明にか
かわる溶解方法は、フローサイトメトリーサイトグラフ
における白血球サブ集団の良好な分離を伴う、安定なサ
ンプル調製品を保障する。コンジュゲート抗体による染
色により得られたサブ集団の蛍光特性はこの手順の際に
完全に保存される。
の妨害赤血球塊の形成を伴うことなく、血液サンプルの
赤血球細胞を溶解するための調製品にある。本発明にか
かわる溶解方法は、フローサイトメトリーサイトグラフ
における白血球サブ集団の良好な分離を伴う、安定なサ
ンプル調製品を保障する。コンジュゲート抗体による染
色により得られたサブ集団の蛍光特性はこの手順の際に
完全に保存される。
【００１７】本願の目的は、予め抗凝血剤で、並びに脂
肪族アルデヒド；多価アルコール；及び強酸と、アルカ
リ金属又はアルカリ土類金属との塩を含む生理イオン強
度の水性調製で処理された血液サンプルの白血球の保護
を伴う赤血球の溶解を特徴とする方法である。
肪族アルデヒド；多価アルコール；及び強酸と、アルカ
リ金属又はアルカリ土類金属との塩を含む生理イオン強
度の水性調製で処理された血液サンプルの白血球の保護
を伴う赤血球の溶解を特徴とする方法である。
【００１８】上記の調製品を以降「溶解調製品」と呼
ぶ。
ぶ。
【００１９】十分な量における、且つ多価アルコールを
伴う脂肪族アルデヒドは、血液の白血球全ての固定及び
赤血球の溶解をもたらすであろう。この固定化は細胞壁
のタンパク質のアミノ末端基間の架橋により得られる。
伴う脂肪族アルデヒドは、血液の白血球全ての固定及び
赤血球の溶解をもたらすであろう。この固定化は細胞壁
のタンパク質のアミノ末端基間の架橋により得られる。
【００２０】脂肪族アルデヒドは例えばアセトアルデヒ
ド、ブチルアルデヒド、グリオキサール、そして特にホ
ルムアルデヒド及びパラホルムアルデヒドを意味する。
ド、ブチルアルデヒド、グリオキサール、そして特にホ
ルムアルデヒド及びパラホルムアルデヒドを意味する。
【００２１】血液と溶解調製品との混合物中の脂肪族ア
ルデヒドの濃度は好ましくは０．１４〜０．７２Ｍ、そ
して最も好ましくは０．３６〜０．５Ｍである；０．１
Ｍ未満及び０．７２Ｍを超えると、白血球の保護は十分
でありうるが、赤血球溶解は得られないであろう。
ルデヒドの濃度は好ましくは０．１４〜０．７２Ｍ、そ
して最も好ましくは０．３６〜０．５Ｍである；０．１
Ｍ未満及び０．７２Ｍを超えると、白血球の保護は十分
でありうるが、赤血球溶解は得られないであろう。
【００２２】本願において、脂肪族アルデヒド、特にホ
ルムアルデヒドの量は１０％のメタノール（３．１２
Ｍ）で安定化された３７％（Ｗ／Ｖ）（１３．３Ｍ）の
アルデヒドの溶液について示している。
ルムアルデヒドの量は１０％のメタノール（３．１２
Ｍ）で安定化された３７％（Ｗ／Ｖ）（１３．３Ｍ）の
アルデヒドの溶液について示している。
【００２３】該調製品、特に本発明にかかわる実質的に
生理イオン強度を有する調製品は多価アルコール、例え
ばエチレングリコール、ジエチレングリコール、ポリエ
チレングリコール及び好ましくはグリセロールも含む。
生理イオン強度を有する調製品は多価アルコール、例え
ばエチレングリコール、ジエチレングリコール、ポリエ
チレングリコール及び好ましくはグリセロールも含む。
【００２４】血液と溶解調製品との混合物中の多価アル
コールの最終濃度は好ましくは０．４４〜２．２Ｍであ
る。混合物中の好適な濃度は０．７６〜１．６３Ｍであ
る。０．４４Ｍの濃度未満では、赤血球溶解は不十分と
なる；約２．２Ｍを超えると、赤血球塊の体積が増大
し、そしてスキャッターグラフにおけるリンパ球集団を
妨害し始める。
コールの最終濃度は好ましくは０．４４〜２．２Ｍであ
る。混合物中の好適な濃度は０．７６〜１．６３Ｍであ
る。０．４４Ｍの濃度未満では、赤血球溶解は不十分と
なる；約２．２Ｍを超えると、赤血球塊の体積が増大
し、そしてスキャッターグラフにおけるリンパ球集団を
妨害し始める。
【００２５】実質的に生理的なイオン濃度を得るため、
強酸、例えば塩酸、硫酸、そして好ましくは過塩素酸の
塩を使用できる。
強酸、例えば塩酸、硫酸、そして好ましくは過塩素酸の
塩を使用できる。
【００２６】強酸に結合しているアルカリ金属又はアル
カリ土類金属はリチウム、ナトリウム、カリウム、マグ
ネシウム又はカルシウム、そして好ましくはナトリウム
である。
カリ土類金属はリチウム、ナトリウム、カリウム、マグ
ネシウム又はカルシウム、そして好ましくはナトリウム
である。
【００２７】本発明にかかわる血液と溶解調製品との混
合物中の過塩素酸塩の如きの強酸の濃度は、例えば２０
〜５００mM、そして好ましくは４０〜３００mMでありう
る。イオン強度の、実質的に生理学的な強度への調製は
従来技術である。
合物中の過塩素酸塩の如きの強酸の濃度は、例えば２０
〜５００mM、そして好ましくは４０〜３００mMでありう
る。イオン強度の、実質的に生理学的な強度への調製は
従来技術である。
【００２８】脂肪族アルデヒド、例えばホルムアルデヒ
ドが単独で白血球を固定すること、及び多価アルコー
ル、例えばグリセロールが赤血球を溶解せしめないこと
の事実の観点において驚くべきことに、この二つの化合
物の一体化は赤血球の有意義な溶解をもたらした。
ドが単独で白血球を固定すること、及び多価アルコー
ル、例えばグリセロールが赤血球を溶解せしめないこと
の事実の観点において驚くべきことに、この二つの化合
物の一体化は赤血球の有意義な溶解をもたらした。
【００２９】上記の方法の好適な利用条件のもとで、上
記の調製品は脂肪族アルコール、特に１〜６個の炭素原
子を有する、例えばエタノール、メタノール、プロパノ
ール、ｎ−ブタノール及び好ましくはイソブタノールも
含む。血液と試薬との混合物中の脂肪族アルコールの濃
度は好ましくは０．０１Ｍ〜０．５４Ｍ、そして最も好
ましくは０．０５Ｍ〜０．２２Ｍである。０．０１Ｍ未
満では、脂肪族アルコールは有効でない；０．５４Ｍを
超えると、赤血球塊の体積が、スキャッターグラフにお
けるリンパ球を妨害してしまうほどに増大してしまう。
記の調製品は脂肪族アルコール、特に１〜６個の炭素原
子を有する、例えばエタノール、メタノール、プロパノ
ール、ｎ−ブタノール及び好ましくはイソブタノールも
含む。血液と試薬との混合物中の脂肪族アルコールの濃
度は好ましくは０．０１Ｍ〜０．５４Ｍ、そして最も好
ましくは０．０５Ｍ〜０．２２Ｍである。０．０１Ｍ未
満では、脂肪族アルコールは有効でない；０．５４Ｍを
超えると、赤血球塊の体積が、スキャッターグラフにお
けるリンパ球を妨害してしまうほどに増大してしまう。
【００３０】多価アルコール、アルカリ金属又はアルカ
リ土類金属の塩は全て、赤血球塊の体積を増大してしま
う傾向を有する。
リ土類金属の塩は全て、赤血球塊の体積を増大してしま
う傾向を有する。
【００３１】白血球形態の最大の保存性を得るため、上
記の調製品のイオン強度は生理学的値を有することが好
ましい。約１５０mMの、例えば１５０mM±８０％の、好
ましくは１５０mM±３０％の、そして最も好ましくは１
５０mM±１０％の塩化ナトリウムに相当する濃度を利用
できうる。
記の調製品のイオン強度は生理学的値を有することが好
ましい。約１５０mMの、例えば１５０mM±８０％の、好
ましくは１５０mM±３０％の、そして最も好ましくは１
５０mM±１０％の塩化ナトリウムに相当する濃度を利用
できうる。
【００３２】上述の調製品は低比率の少なくとも一種の
弱酸を含むことが好ましい。それは好ましくは血液と溶
解調製品との混合物中で約１０〜１００mM、そして好ま
しくは２０〜６０mMの濃度で存在する。この弱酸は、例
えば下記の酸のいづれかでありうる；フマル酸、マロン
酸、シュウ酸、酢酸、コハク酸、ピルビン酸、乳酸、ア
コニチン酸、ギ酸、アスコルビン酸、リン酸、ポリリン
酸、炭酸、酒石酸、そして特にクエン酸。サイトグラフ
におけるそれらの位置により、単球は溶解試薬中のアル
カリ土類金属の存在に対して特に感受性である。これら
の成分の存在はスキャッターグラフにおける単球の分散
に有利な効果を有する。この効果を得るため、血液と調
製品との混合物中の、少量の金属、好ましくは２種のア
ルカリ土類金属の存在が好ましい。アルカリ土類金属の
例はマンガン、カルシウム及びマグネシウムである。好
ましくは、マグネシウムとカルシウム塩との混合物が利
用される。血液と試薬との混合物中のマグネシウムの濃
度は０．１mM〜１００mM、そして好ましくは３mM〜６０
mMでありうる。カルシウムの濃度は混合物中で特に０．
１〜１００mM、そして好ましくは３〜６０mMである。
弱酸を含むことが好ましい。それは好ましくは血液と溶
解調製品との混合物中で約１０〜１００mM、そして好ま
しくは２０〜６０mMの濃度で存在する。この弱酸は、例
えば下記の酸のいづれかでありうる；フマル酸、マロン
酸、シュウ酸、酢酸、コハク酸、ピルビン酸、乳酸、ア
コニチン酸、ギ酸、アスコルビン酸、リン酸、ポリリン
酸、炭酸、酒石酸、そして特にクエン酸。サイトグラフ
におけるそれらの位置により、単球は溶解試薬中のアル
カリ土類金属の存在に対して特に感受性である。これら
の成分の存在はスキャッターグラフにおける単球の分散
に有利な効果を有する。この効果を得るため、血液と調
製品との混合物中の、少量の金属、好ましくは２種のア
ルカリ土類金属の存在が好ましい。アルカリ土類金属の
例はマンガン、カルシウム及びマグネシウムである。好
ましくは、マグネシウムとカルシウム塩との混合物が利
用される。血液と試薬との混合物中のマグネシウムの濃
度は０．１mM〜１００mM、そして好ましくは３mM〜６０
mMでありうる。カルシウムの濃度は混合物中で特に０．
１〜１００mM、そして好ましくは３〜６０mMである。
【００３３】マグネシウム及びカルシウムの対イオンと
して、ハロゲン、好ましくは塩素が好適である。血液と
試薬との混合物のpHは５〜９、好ましくは６〜８であ
る。好ましいpHは約７である。
して、ハロゲン、好ましくは塩素が好適である。血液と
試薬との混合物のpHは５〜９、好ましくは６〜８であ
る。好ましいpHは約７である。
【００３４】サンプルを上述の調製品と少なくとも２
分、好ましくは少なくとも５分、そして特に約１０分接
触させる。分析の質を顕著に損うことなく接触を数時間
まで延長することが可能であり、このことは混合物中で
の優れた白血球安定化を示す。
分、好ましくは少なくとも５分、そして特に約１０分接
触させる。分析の質を顕著に損うことなく接触を数時間
まで延長することが可能であり、このことは混合物中で
の優れた白血球安定化を示す。
【００３５】本発明の目的は、赤血球の溶解及び白血球
の保護のための水性調製品でもあり、これは脂肪族アル
デヒド；多価アルコール；強酸とアルカリ金属又はアル
カリ土類金属との塩；を含むこと、及びそのイオン強度
が生理的であることを特徴とする。その生理イオン強度
は約１５０mMの塩化ナトリウムに相当する。
の保護のための水性調製品でもあり、これは脂肪族アル
デヒド；多価アルコール；強酸とアルカリ金属又はアル
カリ土類金属との塩；を含むこと、及びそのイオン強度
が生理的であることを特徴とする。その生理イオン強度
は約１５０mMの塩化ナトリウムに相当する。
【００３６】好適な調製品は好適な方法の範囲にある前
述のものである。
述のものである。
【００３７】好ましいのは、ホルムアルデヒドが約０．
５４Ｍ、グリセロールが約１．３６Ｍ、過塩素酸ナトリ
ウムが約１５０mM、イソブタノールが約０．１Ｍ、クエ
ン酸ナトリウムが約５０mM、塩化マグネシウムが約５m
M、塩化カルシウムが約５mM、そしてpHが約７．０であ
る水性溶液の調製品である。
５４Ｍ、グリセロールが約１．３６Ｍ、過塩素酸ナトリ
ウムが約１５０mM、イソブタノールが約０．１Ｍ、クエ
ン酸ナトリウムが約５０mM、塩化マグネシウムが約５m
M、塩化カルシウムが約５mM、そしてpHが約７．０であ
る水性溶液の調製品である。
【００３８】本発明にかかわる保護方法を利用する血液
サンプルの白血球分析は特に下記のものである。
サンプルの白血球分析は特に下記のものである。
【００３９】抗凝血剤で処理した血液サンプル０．１ml
を、好適にはインキュベーション後に２０μｌの容量に
おいて、１又は２種の蛍光コンジュゲート抗体の調製品
と混合し、その混合物を本発明にかかわる調製品と合わ
せる。この調製品は特に、約０．５４Ｍのホルムアルデ
ヒド、約１．３６Ｍのグリセロール、約１５０mMの過塩
素酸ナトリウム、約０．１Ｍのイソブタノール、約５０
mMのクエン酸ナトリウム、約５mMの塩化マグネシウム、
約６mMの塩化カルシウム、そして約７．０のpHの水性溶
液である。
を、好適にはインキュベーション後に２０μｌの容量に
おいて、１又は２種の蛍光コンジュゲート抗体の調製品
と混合し、その混合物を本発明にかかわる調製品と合わ
せる。この調製品は特に、約０．５４Ｍのホルムアルデ
ヒド、約１．３６Ｍのグリセロール、約１５０mMの過塩
素酸ナトリウム、約０．１Ｍのイソブタノール、約５０
mMのクエン酸ナトリウム、約５mMの塩化マグネシウム、
約６mMの塩化カルシウム、そして約７．０のpHの水性溶
液である。
【００４０】上記で用いる調製品の容量はサンプル０．
１mlに対して例えば０．２ml〜１ml、そして好ましくは
サンプル０．１mlに対して約０．５mlとする。
１mlに対して例えば０．２ml〜１ml、そして好ましくは
サンプル０．１mlに対して約０．５mlとする。
【００４１】混合直後、その混合物をボルテックスに付
し、そして室温で１０分間放置する。次に、溶解後の混
合物の全容量を、好ましくは、サンプルの容量を高める
ために、pH７．２に８mMのリン酸ナトリウムで緩衝され
た容量０．５mlの塩化ナトリウムの生理溶液（０．９％
（Ｗ／Ｖ）；即ち１５４mM）の添加により増やし、生理
条件で保つ。溶解は全部で１０分とし、それを経て、サ
ンプルはサイトメーター分析の用意がなされた。
し、そして室温で１０分間放置する。次に、溶解後の混
合物の全容量を、好ましくは、サンプルの容量を高める
ために、pH７．２に８mMのリン酸ナトリウムで緩衝され
た容量０．５mlの塩化ナトリウムの生理溶液（０．９％
（Ｗ／Ｖ）；即ち１５４mM）の添加により増やし、生理
条件で保つ。溶解は全部で１０分とし、それを経て、サ
ンプルはサイトメーター分析の用意がなされた。
【００４２】その全手順は好ましくは室温で行う（１８
〜２４℃）。
〜２４℃）。
【００４３】前述の通り、本発明にかかわる全血の溶解
方法は、本願の実験に従い、使用するサイトメトリー装
置に関して制約がある。Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｃｏｍｐａｎ
ｙのサイトメーター、例えばＥｐｉｃｓ（商標）、Ｐｒ
ｏｆｉｌｅ（商標）及びＥｐｉｃｓ Ｅｘｃｅｌ（商
標）、並びに同型の光学系を利用するものがこの種の溶
解によく合う。その他のサイトメーターは不都合な結果
をもたらしうる。
方法は、本願の実験に従い、使用するサイトメトリー装
置に関して制約がある。Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｃｏｍｐａｎ
ｙのサイトメーター、例えばＥｐｉｃｓ（商標）、Ｐｒ
ｏｆｉｌｅ（商標）及びＥｐｉｃｓ Ｅｘｃｅｌ（商
標）、並びに同型の光学系を利用するものがこの種の溶
解によく合う。その他のサイトメーターは不都合な結果
をもたらしうる。
【００４４】本願の目的は、血液の調製品であって、そ
の中の赤血球が溶解され、そして白血球が実質的に保存
された形態を有する、抗凝血剤で処理された血液サンプ
ルと、上述の溶解調製品との混合物を特徴とする血液の
調製品にもある。
の中の赤血球が溶解され、そして白血球が実質的に保存
された形態を有する、抗凝血剤で処理された血液サンプ
ルと、上述の溶解調製品との混合物を特徴とする血液の
調製品にもある。
【００４５】本発明の目的は、血液のサンプルの白血球
集団の分析でもあり、その方法においては、血液サンプ
ルを抗凝血剤、次いで所望するなら、少なくとも一種の
白血球の集団又はサブ集団に特異的な抗体、次いで赤血
球溶解剤で処理する。この方法は、抗血凝剤による、そ
して所望するならば少なくとも一種のラベル化抗体によ
る処理の後に、サンプルを脂肪族アルデヒド、多価アル
コール、強酸とアルカリ金属又はアルカリ土類金属との
塩、を含む生理イオン強度の水性調製品で処理し、その
後、好ましくは等張性希釈溶液、例えば１０mMのリン酸
ナトリウムpH７．２で緩衝された塩化ナトリウムの生理
溶液（０．９Ｗ／Ｖ％）（ＰＢＳ）を用いてのサンプル
の希釈後、そのサンプルをサイトメトリー分析に付する
ことを特徴とする。
集団の分析でもあり、その方法においては、血液サンプ
ルを抗凝血剤、次いで所望するなら、少なくとも一種の
白血球の集団又はサブ集団に特異的な抗体、次いで赤血
球溶解剤で処理する。この方法は、抗血凝剤による、そ
して所望するならば少なくとも一種のラベル化抗体によ
る処理の後に、サンプルを脂肪族アルデヒド、多価アル
コール、強酸とアルカリ金属又はアルカリ土類金属との
塩、を含む生理イオン強度の水性調製品で処理し、その
後、好ましくは等張性希釈溶液、例えば１０mMのリン酸
ナトリウムpH７．２で緩衝された塩化ナトリウムの生理
溶液（０．９Ｗ／Ｖ％）（ＰＢＳ）を用いてのサンプル
の希釈後、そのサンプルをサイトメトリー分析に付する
ことを特徴とする。
【００４６】上記の方法は上記の好適な条件のもとで特
に利用されうる。
に利用されうる。
【００４７】下記の実施例は、限定することなく本発明
を例証する。
を例証する。
【００４８】
【実施例】例１：溶解調製品 下記の組成の本発明にかかわる水性溶解調製品を調製し
た： ホルムアルデヒド* ０．５４Ｍ グリセロール １．３６Ｍ 過塩素酸ナトリウム ０．１５０Ｍ イソブタノール ０．１Ｍ 塩化マグネシウム ０．００５Ｍ 塩化カルシウム ０．００５Ｍ クエン酸ナトリウム ０．０５Ｍ 蒸留水 * ホルムアルデヒドはメタノールで安定化
た： ホルムアルデヒド* ０．５４Ｍ グリセロール １．３６Ｍ 過塩素酸ナトリウム ０．１５０Ｍ イソブタノール ０．１Ｍ 塩化マグネシウム ０．００５Ｍ 塩化カルシウム ０．００５Ｍ クエン酸ナトリウム ０．０５Ｍ 蒸留水 * ホルムアルデヒドはメタノールで安定化
【００４９】例２：溶解調製品 下記の組成を有する本発明にかかわる水性溶解調製品を
調製した： ホルムアルデヒド* ０．３６Ｍ グリセロール １．３６Ｍ 過塩素酸ナトリウム ０．１５０Ｍ イソブタノール ０．１Ｍ フマル酸ナトリウム ０．０５Ｍ * ホルムアルデヒドはメタノールで安定化
調製した： ホルムアルデヒド* ０．３６Ｍ グリセロール １．３６Ｍ 過塩素酸ナトリウム ０．１５０Ｍ イソブタノール ０．１Ｍ フマル酸ナトリウム ０．０５Ｍ * ホルムアルデヒドはメタノールで安定化
【００５０】例３：血液サンプルの分析 抗凝血剤で処理した０．１mlの血液サンプルを６本のチ
ューブに分注した。
ューブに分注した。
【００５１】チューブ１には、２０mlのＰＢＳを加え
た。
た。
【００５２】チューブ２には、２種類のモノクローナル
抗体（アイソトープコントロール）（無関係な特異性を
有し、一方はイソシアネート（ＦＩＴＣ）にコンジュゲ
ートされておりＣａｔ．Ｎｏ．０６３９（１０μｌ）、
他方はフィコエリトリンにコンジュゲートされているｃ
ａｔ＃０６７０（２μｌ））及びＰＢＳ（８μｌ）の混
合物を加えた。
抗体（アイソトープコントロール）（無関係な特異性を
有し、一方はイソシアネート（ＦＩＴＣ）にコンジュゲ
ートされておりＣａｔ．Ｎｏ．０６３９（１０μｌ）、
他方はフィコエリトリンにコンジュゲートされているｃ
ａｔ＃０６７０（２μｌ））及びＰＢＳ（８μｌ）の混
合物を加えた。
【００５３】チューブ３には、ＦＩＴＣにコンジュゲー
トされているＣＤ４５に特異的なｃａｔ＃０７８２（２
μｌ）及びフィコエリトリン（２．５μｌ）にコンジュ
ゲートされているＣＤ１４に特異的なｃａｔ＃０６５０
（２．５μｌ）モノクローナル抗体、並びにＰＢＳ（１
５．５μｌ）の混合物２０μｌを加えた。
トされているＣＤ４５に特異的なｃａｔ＃０７８２（２
μｌ）及びフィコエリトリン（２．５μｌ）にコンジュ
ゲートされているＣＤ１４に特異的なｃａｔ＃０６５０
（２．５μｌ）モノクローナル抗体、並びにＰＢＳ（１
５．５μｌ）の混合物２０μｌを加えた。
【００５４】チューブ４には、ＦＩＴＣにコンジュゲー
トされているＣＤ３に特異的なｃａｔ＃１２８１（２μ
ｌ）及びＰＥにコンジュゲートされているＣＤ４に特異
的なｃａｔ＃０４４９（１０μｌ）モノクローナル抗
体、並びにＰＢＳ（８μｌ）の混合物２０μｌを加え
た。
トされているＣＤ３に特異的なｃａｔ＃１２８１（２μ
ｌ）及びＰＥにコンジュゲートされているＣＤ４に特異
的なｃａｔ＃０４４９（１０μｌ）モノクローナル抗
体、並びにＰＢＳ（８μｌ）の混合物２０μｌを加え
た。
【００５５】チューブ５には、ＣＤ３−ＦＩＴＣ ｃａ
ｔ＃１２８１（２μｌ）及びＣＤ８−ＰＥ抗体ｃａｔ＃
０４５２（３．３μｌ）並びにＰＢＳ（１４．７μｌ）
の混合物２０μｌを加えた。
ｔ＃１２８１（２μｌ）及びＣＤ８−ＰＥ抗体ｃａｔ＃
０４５２（３．３μｌ）並びにＰＢＳ（１４．７μｌ）
の混合物２０μｌを加えた。
【００５６】チューブ６には、ＣＤ３−ＦＩＴＣ ｃａ
ｔ＃１２８１（２μｌ）、ＣＤ１９−ＰＥ抗体＃１２８
５（１０μｌ）の抗体及びＰＢＳ（８μｌ）の混合物２
０μｌを加えた。
ｔ＃１２８１（２μｌ）、ＣＤ１９−ＰＥ抗体＃１２８
５（１０μｌ）の抗体及びＰＢＳ（８μｌ）の混合物２
０μｌを加えた。
【００５７】上記の抗体はＩｍｍｕｎｏｔｅｃｈ ＳＡ
により、「ＩＯＴＥＳＴ」として市販されている。比較
用抗体は他の会社より市販されている。
により、「ＩＯＴＥＳＴ」として市販されている。比較
用抗体は他の会社より市販されている。
【００５８】抗体との２０分のインキュベーション後、
例１の調製品０．５mlを加え、そしてそのチューブを直
ちにボルテックスに付した。１０分の反応後、容量１ml
の蒸留水をチューブに加え、そしてそのチューブを直ち
にボルテックスに付した。
例１の調製品０．５mlを加え、そしてそのチューブを直
ちにボルテックスに付した。１０分の反応後、容量１ml
の蒸留水をチューブに加え、そしてそのチューブを直ち
にボルテックスに付した。
【００５９】室温で２時間後、それらのサンプルをＥｘ
ｃｅｌによるＥｐｉｃｓ Ｐｒｏｆｉｌｅ Ｉフローサ
イトメトリーにより分析した。スキャッター分析におい
て、塊及び血小板の計測を防ぐために域値を用いた。リ
ンパ球、単球及び顆粒球の集団を中心に領域ができた。
ＦＩＴＣコンジュゲートを検出する蛍光１分析、ＰＥ−
コンジュゲートを検出する蛍光２分析はその領域にある
リンパ球細胞について行った。ＣＤ４５に関する蛍光に
おいて陽性な細胞は白血球を表わし、白血球と、血小板
を有する塊との区別を可能とする。ＣＤ１４について陽
性な細胞は単球であり、単球とリンパ球との区別を可能
とする；ＣＤ３及びＣＤ４について陽性な細胞はヘルパ
ーＴ細胞である。ＣＤ３及びＣＤ４について陽性な細胞
は細胞障害性サプレッサーＴ−細胞である；ＣＤ１９に
ついて陽性な細胞はＢ−細胞である。
ｃｅｌによるＥｐｉｃｓ Ｐｒｏｆｉｌｅ Ｉフローサ
イトメトリーにより分析した。スキャッター分析におい
て、塊及び血小板の計測を防ぐために域値を用いた。リ
ンパ球、単球及び顆粒球の集団を中心に領域ができた。
ＦＩＴＣコンジュゲートを検出する蛍光１分析、ＰＥ−
コンジュゲートを検出する蛍光２分析はその領域にある
リンパ球細胞について行った。ＣＤ４５に関する蛍光に
おいて陽性な細胞は白血球を表わし、白血球と、血小板
を有する塊との区別を可能とする。ＣＤ１４について陽
性な細胞は単球であり、単球とリンパ球との区別を可能
とする；ＣＤ３及びＣＤ４について陽性な細胞はヘルパ
ーＴ細胞である。ＣＤ３及びＣＤ４について陽性な細胞
は細胞障害性サプレッサーＴ−細胞である；ＣＤ１９に
ついて陽性な細胞はＢ−細胞である。
【００６０】その結果を図１〜９に示している。
【００６１】リンパ球領域において、結果の９９％がリ
ンパ球、７０％がＴ−細胞、１７％がＢ−細胞、そして
１２％がＴでもＢ−細胞でもないものを示した。
ンパ球、７０％がＴ−細胞、１７％がＢ−細胞、そして
１２％がＴでもＢ−細胞でもないものを示した。
【００６２】７０％のＴ−細胞集団は、４９％のヘルパ
ー細胞と１９％の細胞障害性／サプレッサー細胞に分け
られた。
ー細胞と１９％の細胞障害性／サプレッサー細胞に分け
られた。
【００６３】単球領域においては、結果の９３％が単球
を示した。顆粒領域において、結果の９９％が顆粒球を
示した。
を示した。顆粒領域において、結果の９９％が顆粒球を
示した。
【図１】例１の調製品を用いて処理した全血サンプル
の、Ｅｘｃｅｌ Ｅｐｉｃｓ Ｐｒｏｆｉｌｅ Ｉ（商
標）を用いて得られた、スキャッター分析の結果。
の、Ｅｘｃｅｌ Ｅｐｉｃｓ Ｐｒｏｆｉｌｅ Ｉ（商
標）を用いて得られた、スキャッター分析の結果。
【図２】蛍光マーカーの非存在下での二重蛍光サイトグ
ラフ。スキャッターグラフの「領域」Ｒ1 からのリンパ
球を示す。
ラフ。スキャッターグラフの「領域」Ｒ1 からのリンパ
球を示す。
【図３】アイソトープコントロールの存在下での全血の
リンパ球のサイトグラフ。
リンパ球のサイトグラフ。
【図４】ＣＤ４５−ＦＩＴＣ及びＣＤ１４−ＰＥでラベ
ルした全血リンパ球のサイトグラフ。
ルした全血リンパ球のサイトグラフ。
【図５】ＣＤ４５−ＦＩＴＣ及びＣＤ１４−ＰＥでラベ
ルした全血単球（領域Ｒ2 ）のサイトグラフ。
ルした全血単球（領域Ｒ2 ）のサイトグラフ。
【図６】ＣＤ４５−ＦＩＴＣ及びＣＤ１４−ＰＥでラベ
ルした、全血顆粒球（領域Ｒ3）のサイトグラフ。
ルした、全血顆粒球（領域Ｒ3）のサイトグラフ。
【図７】ＣＤ３−ＦＩＴＣ及びＣＤ４−ＰＥでラベルし
た全血リンパ球のサイトグラフ。
た全血リンパ球のサイトグラフ。
【図８】ＣＤ３−ＦＩＴＣ及びＣＤ８−ＰＥでラベルし
た全血リンパ球のサイトグラフ。
た全血リンパ球のサイトグラフ。
【図９】ＣＤ３−ＦＩＴＣ及びＣＤ１９−ＰＥでラベル
した全血リンパ球のサイトグラフ。
した全血リンパ球のサイトグラフ。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) G01N 33/48 - 33/98 A01N 1/02 A61K 35/14
Claims (10)
- 【請求項１】 血液サンプルの赤血球の溶解及び白血球
の保護の方法であって、抗凝血剤で事前処理された血液
のサンプルを、 脂肪族アルデヒド、 多価アルコール、 強酸とアルカリ金属又はアルカリ土類金属との塩の混合
物を含む、実質的に生理的なイオン強度を有する水性調
製品で処理することを特徴とする方法。 - 【請求項２】 実質的に生理イオン強度の水性調製品を
用いる処理の前に、前記サンプルを少なくとも一種のリ
ンパ球のサブ集団に特異的な抗体で処理することを特徴
とする、請求項１に記載の方法。 - 【請求項３】 前記実質的に生理イオン強度の水性調製
品が脂肪族アルコールも含む、請求項１又は２に記載の
方法。 - 【請求項４】 脂肪族アルデヒド 多価アルコール及び強酸と、アルカリ金属又はアルカリ
土類金属との塩の混合物を含む実質的に生理イオン強度
を有している水性調製品である、赤血球を溶解する調製
品。 - 【請求項５】 脂肪族アルデヒドがホルムアルデヒドで
あり、多価アルコールがグリセロールである、ことを特
徴とする、請求項４に記載の調製品。 - 【請求項６】 強酸とアルカリ金属又はアルカリ土類金
属との塩が過塩素酸塩であることを特徴とする、請求項
４又は５に記載の調製品。 - 【請求項７】 脂肪族アルコールを更に含むことを特徴
とする、請求項４〜６のいづれか１項に記載の調製品。 - 【請求項８】 マグネシウム又はカルシウムのいづれか
の、少量の少なくとも一種のアルカリ土類金属を含むこ
とを特徴とする、請求項４〜７のいづれか１項に記載の
調製品。 - 【請求項９】 抗凝血剤で処理し、そして溶解せしめた
血液の調製品であって、抗凝血剤で処理した血液サンプ
ルと、 脂肪族アルデヒド、 多価アルコール及び強酸とアルカリ金属又はアルカリ土
類金属との塩、 の混合物を含む実質的に生理イオン強度の水性調製品と
の混合物を含むことを特徴とする調製品。 - 【請求項１０】 血液サンプルの白血球集団を分析する
方法であって、血液サンプルを抗凝血剤、そしてその
後、所望するのには、白血球集団又はサブ集団に特異的
な少なくとも一種の抗体を用いて処理し、ここでこの抗
凝血剤を用いる、及び所望するには少なくとも一種のラ
ベル化抗体を用いる処理の後に、そのサンプルを脂肪族
アルデヒド、 多価アルコール、 強酸とアルカリ金属又はアルカリ土類金属との塩を含む
実質的に生理イオン強度の調製品を用いて処理し、その
後に前記サンプルのサイトメトリー分析を行うことを特
徴とする、方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR9306333 | 1993-05-19 | ||
| FR9306333A FR2705360B1 (fr) | 1993-05-19 | 1993-05-19 | Méthode et composition pour la lyse des érythrocytes, composition de sang, et méthode d'analyse leucocytaire. |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0772144A JPH0772144A (ja) | 1995-03-17 |
| JP3321293B2 true JP3321293B2 (ja) | 2002-09-03 |
Family
ID=9447493
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP10390394A Expired - Lifetime JP3321293B2 (ja) | 1993-05-19 | 1994-05-18 | 赤血球の溶解方法 |
Country Status (9)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5627213A (ja) |
| EP (1) | EP0625707B1 (ja) |
| JP (1) | JP3321293B2 (ja) |
| AT (1) | ATE184107T1 (ja) |
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| ES (1) | ES2136716T3 (ja) |
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| FR2781055B1 (fr) * | 1998-07-09 | 2000-10-13 | Immunotech Sa | Reactif et methode pour la permeabilisation et l'identification des erythrocytes |
| FR2813891B1 (fr) * | 2000-09-14 | 2005-01-14 | Immunotech Sa | Reactif multifonctionnel pour erythrocytes mettant en jeu des carbamates et applications |
| EP1552276A1 (en) * | 2002-06-11 | 2005-07-13 | Chempaq A/S | A disposable cartridge for characterizing particles suspended in a liquid |
| CN110672499B (zh) * | 2019-09-29 | 2021-12-10 | 杭州联科生物技术股份有限公司 | 一种Annexin V凋亡检测的阳性质控液及其制备方法 |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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| US4902613A (en) * | 1984-05-14 | 1990-02-20 | Becton, Dickinson And Company | Lysing agent for analysis of peripheral blood cells |
| US4654312A (en) * | 1984-05-14 | 1987-03-31 | Becton, Dickinson And Company | Lysing agent for analysis of peripheral blood cells |
| JPS61502280A (ja) * | 1984-05-31 | 1986-10-09 | ク−ルタ−・エレクトロニクス・インコ−ポレ−テッド | 白血球のクラスおよびサブクラスの同定、計数並びに試験方法およびそれに用いる試薬系 |
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| US5030554A (en) * | 1987-12-04 | 1991-07-09 | Coulter Corporation | Conservative whole blood sample preparation technique |
| CA2070244A1 (en) * | 1991-08-07 | 1993-02-08 | Young Ran Kim | Method and reagent composition for subtyping lymphocytes in peripheral blood |
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1993
- 1993-05-19 FR FR9306333A patent/FR2705360B1/fr not_active Expired - Lifetime
-
1994
- 1994-05-18 DE DE69420311T patent/DE69420311T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1994-05-18 JP JP10390394A patent/JP3321293B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1994-05-18 AT AT94430003T patent/ATE184107T1/de not_active IP Right Cessation
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- 1994-05-18 EP EP94430003A patent/EP0625707B1/fr not_active Expired - Lifetime
- 1994-05-18 ES ES94430003T patent/ES2136716T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1994-05-19 US US08/246,240 patent/US5627213A/en not_active Expired - Lifetime
-
1999
- 1999-11-03 GR GR990402814T patent/GR3031722T3/el unknown
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