JPH0772144A - 赤血球の溶解方法 - Google Patents
赤血球の溶解方法Info
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Abstract
して、白血球を分析する方法の提供を目的とする。 【構成】 本発明は血液サンプルの赤血球の溶解及び白
血球の保護の方法であって、抗凝血剤で事前処理された
血液のサンプルを、脂肪族アルデヒド、多価アルコー
ル、強酸とアルカリ金属又はアルカリ土類金属との塩の
混合物を含む、実質的に生理的なイオン強度を有する水
性調製品で処理することを特徴とする方法を提供する。
Description
法及び調製品、血液の調製品、並びに赤血球分析の方法
に関する。
いくつかの細胞集団を含む。最も多いのは赤血球及び血
小板であり、これは二酸化炭素と酸素の交換及び輸送を
担う。血小板は凝血に一役担っている。白血球は免疫系
のコントロールに関与する少数派の集団である。
により、白血球の3つのサブ集団が認識されている:複
数の核を有する多核細胞及び1個のみの核を有する単核
細胞の単核細胞のうちで、リンパ球は小型の球状核を有
することにより、そして単球は大きめの月型核を有する
ことにより区別されうる。
ャッターグラフにおいて区別されうる。白血球集団のう
ちで、約60%が多核細胞であり、約30%がリンパ球
であり、そして10%が単球である。
個体の健康状態の指標を供しうる。
ノクローナル抗体による血液細胞の染色により、及び顕
微鏡又はフローサイトメトリーによる細胞の分析を経
て、血液細胞及びサブ集団は単なる光学的手段よりもよ
り正確に、且つより詳細に区別することができる。
により、骨髄に由来するリンパ球集団におけるB−細胞
を同定することができる。同じ集団において、CD3マ
ーカーにより、胸腺に由来するT細胞を区別することが
できる。CD4及びCD8マーカーにより、ヘルパー機
能又はサプレッサー/キラー機能を有するT細胞それぞ
れを区別することができる。
断及びその疾患の処置にとって重要である。
め、それらは白血球をマスクしてしまうことがあり、従
ってフローサイトメトリーによるその分析を困難なもの
としてしまうことがある。慣用の免疫蛍光技術にはリン
パ球と赤血球の物理学的分離、例えば勾配密度遠心(B
oyem,A.1968,Scand.J.Clin.
Lab.Invest.,21 suppl,97)が
挙げられる。
球溶解である。例えば、Hansenの方法においては
(米国出願第4,284,412号、欧州出願0,02
2,670号)、抗凝血剤で処理した血液サンプルを蛍
光抗体コンジュゲート調製品と混合している。赤血球の
インキュベーション及び溶解の後、サンプルをフローサ
イトメーターに通して、一定の抗体について陽性である
白血球集団を分析する。
ての赤血球を溶解することが必要なだけでなく、サイト
メーターが多核細胞、単球、リンパ球、及び細胞塊と血
小板との混合物を区別することができるように白血球が
全て形態学的な状態で保存されていることが必要でもあ
る。赤血球を溶解するのに多大なる様々な方法がある;
これらの方法は例えば酸処理、アルカリ処理、塩化アン
モニウム、多価アルコール、又は低緊張ショックの利用
を基礎とする処理を基礎としうる。これらの方法にかか
わる問題は、赤血球を溶解することにより、白血球の形
態学レベルに変化が導入されることにある。
ば溶解直後に分析を行うことにより、又は酸及び低緊張
条件後の中和により、又は細胞を洗うことにより、又は
ホルムアルデヒドもしくはパラホルムアルデヒドの如き
の固定剤の添加により防がれている。
溶解方法は様々なサイトメーターの光学的特徴に適応さ
れている。Becton,Dickinson and
Co.のサイトメーターは白血球の形態学的変化に対
して比較的感度が悪い。やや低緊張条件のもとでの溶解
がこのタイプの装置について示されている(米国出願第
4,902,613号)。Coulter社のサイトメ
ーターは白血球の形態学的変化に対してはるかに感受性
となっている。Coulter由来の溶解系は約6秒間
にわたる低緊張及び酸溶解を利用し、そしてその後に混
合物の等張性値及びpHを正す。かかる系の不都合さは、
正確なる6秒という時間が、非自動操作条件のもとで成
し遂げるのに困難であることにある。
構成される。この方法においては、溶液のイオン強度は
生理的となっており、そして白血球の形態は短時間後に
はよく保存されている。この方法の欠点は塩化アンモニ
ウムが細胞内のpHの上昇をもたらすこと、及び細胞の洗
浄の後でさえもの白血球の連続分解をもたらすことにあ
り、これは固定剤で抑えることができない。
な白血球の計測を回避する白血球分析及び赤血球溶解の
方法を得ることが所望されるであろう。
の妨害赤血球塊の形成を伴うことなく、血液サンプルの
赤血球細胞を溶解するための調製品にある。本発明にか
かわる溶解方法は、フローサイトメトリーサイトグラフ
における白血球サブ集団の良好な分離を伴う、安定なサ
ンプル調製品を保障する。コンジュゲート抗体による染
色により得られたサブ集団の蛍光特性はこの手順の際に
完全に保存される。
肪族アルデヒド;多価アルコール;及び強酸と、アルカ
リ金属又はアルカリ土類金属との塩を含む生理イオン強
度の水性調製で処理された血液サンプルの白血球の保護
を伴う赤血球の溶解を特徴とする方法である。
ぶ。
伴う脂肪族アルデヒドは、血液の白血球全ての固定及び
赤血球の溶解をもたらすであろう。この固定化は細胞壁
のタンパク質のアミノ末端基間の架橋により得られる。
ド、ブチルアルデヒド、グリオキサール、そして特にホ
ルムアルデヒド及びパラホルムアルデヒドを意味する。
ルデヒドの濃度は好ましくは0.14〜0.72M、そ
して最も好ましくは0.36〜0.5Mである;0.1
M未満及び0.72Mを超えると、白血球の保護は十分
でありうるが、赤血球溶解は得られないであろう。
ルムアルデヒドの量は10%のメタノール(3.12
M)で安定化された37%(W/V)(13.3M)の
アルデヒドの溶液について示している。
生理イオン強度を有する調製品は多価アルコール、例え
ばエチレングリコール、ジエチレングリコール、ポリエ
チレングリコール及び好ましくはグリセロールも含む。
コールの最終濃度は好ましくは0.44〜2.2Mであ
る。混合物中の好適な濃度は0.76〜1.63Mであ
る。0.44Mの濃度未満では、赤血球溶解は不十分と
なる;約2.2Mを超えると、赤血球塊の体積が増大
し、そしてスキャッターグラフにおけるリンパ球集団を
妨害し始める。
強酸、例えば塩酸、硫酸、そして好ましくは過塩素酸の
塩を使用できる。
カリ土類金属はリチウム、ナトリウム、カリウム、マグ
ネシウム又はカルシウム、そして好ましくはナトリウム
である。
合物中の過塩素酸塩の如きの強酸の濃度は、例えば20
〜500mM、そして好ましくは40〜300mMでありう
る。イオン強度の、実質的に生理学的な強度への調製は
従来技術である。
ドが単独で白血球を固定すること、及び多価アルコー
ル、例えばグリセロールが赤血球を溶解せしめないこと
の事実の観点において驚くべきことに、この二つの化合
物の一体化は赤血球の有意義な溶解をもたらした。
記の調製品は脂肪族アルコール、特に1〜6個の炭素原
子を有する、例えばエタノール、メタノール、プロパノ
ール、n−ブタノール及び好ましくはイソブタノールも
含む。血液と試薬との混合物中の脂肪族アルコールの濃
度は好ましくは0.01M〜0.54M、そして最も好
ましくは0.05M〜0.22Mである。0.01M未
満では、脂肪族アルコールは有効でない;0.54Mを
超えると、赤血球塊の体積が、スキャッターグラフにお
けるリンパ球を妨害してしまうほどに増大してしまう。
リ土類金属の塩は全て、赤血球塊の体積を増大してしま
う傾向を有する。
記の調製品のイオン強度は生理学的値を有することが好
ましい。約150mMの、例えば150mM±80%の、好
ましくは150mM±30%の、そして最も好ましくは1
50mM±10%の塩化ナトリウムに相当する濃度を利用
できうる。
弱酸を含むことが好ましい。それは好ましくは血液と溶
解調製品との混合物中で約10〜100mM、そして好ま
しくは20〜60mMの濃度で存在する。この弱酸は、例
えば下記の酸のいづれかでありうる;フマル酸、マロン
酸、シュウ酸、酢酸、コハク酸、ピルビン酸、乳酸、ア
コニチン酸、ギ酸、アスコルビン酸、リン酸、ポリリン
酸、炭酸、酒石酸、そして特にクエン酸。サイトグラフ
におけるそれらの位置により、単球は溶解試薬中のアル
カリ土類金属の存在に対して特に感受性である。これら
の成分の存在はスキャッターグラフにおける単球の分散
に有利な効果を有する。この効果を得るため、血液と調
製品との混合物中の、少量の金属、好ましくは2種のア
ルカリ土類金属の存在が好ましい。アルカリ土類金属の
例はマンガン、カルシウム及びマグネシウムである。好
ましくは、マグネシウムとカルシウム塩との混合物が利
用される。血液と試薬との混合物中のマグネシウムの濃
度は0.1mM〜100mM、そして好ましくは3mM〜60
mMでありうる。カルシウムの濃度は混合物中で特に0.
1〜100mM、そして好ましくは3〜60mMである。
して、ハロゲン、好ましくは塩素が好適である。血液と
試薬との混合物のpHは5〜9、好ましくは6〜8であ
る。好ましいpHは約7である。
分、好ましくは少なくとも5分、そして特に約10分接
触させる。分析の質を顕著に損うことなく接触を数時間
まで延長することが可能であり、このことは混合物中で
の優れた白血球安定化を示す。
の保護のための水性調製品でもあり、これは脂肪族アル
デヒド;多価アルコール;強酸とアルカリ金属又はアル
カリ土類金属との塩;を含むこと、及びそのイオン強度
が生理的であることを特徴とする。その生理イオン強度
は約150mMの塩化ナトリウムに相当する。
述のものである。
54M、グリセロールが約1.36M、過塩素酸ナトリ
ウムが約150mM、イソブタノールが約0.1M、クエ
ン酸ナトリウムが約50mM、塩化マグネシウムが約5m
M、塩化カルシウムが約5mM、そしてpHが約7.0であ
る水性溶液の調製品である。
サンプルの白血球分析は特に下記のものである。
を、好適にはインキュベーション後に20μlの容量に
おいて、1又は2種の蛍光コンジュゲート抗体の調製品
と混合し、その混合物を本発明にかかわる調製品と合わ
せる。この調製品は特に、約0.54Mのホルムアルデ
ヒド、約1.36Mのグリセロール、約150mMの過塩
素酸ナトリウム、約0.1Mのイソブタノール、約50
mMのクエン酸ナトリウム、約5mMの塩化マグネシウム、
約6mMの塩化カルシウム、そして約7.0のpHの水性溶
液である。
1mlに対して例えば0.2ml〜1ml、そして好ましくは
サンプル0.1mlに対して約0.5mlとする。
し、そして室温で10分間放置する。次に、溶解後の混
合物の全容量を、好ましくは、サンプルの容量を高める
ために、pH7.2に8mMのリン酸ナトリウムで緩衝され
た容量0.5mlの塩化ナトリウムの生理溶液(0.9%
(W/V);即ち154mM)の添加により増やし、生理
条件で保つ。溶解は全部で10分とし、それを経て、サ
ンプルはサイトメーター分析の用意がなされた。
〜24℃)。
方法は、本願の実験に従い、使用するサイトメトリー装
置に関して制約がある。Coulter Compan
yのサイトメーター、例えばEpics(商標)、Pr
ofile(商標)及びEpics Excel(商
標)、並びに同型の光学系を利用するものがこの種の溶
解によく合う。その他のサイトメーターは不都合な結果
をもたらしうる。
の中の赤血球が溶解され、そして白血球が実質的に保存
された形態を有する、抗凝血剤で処理された血液サンプ
ルと、上述の溶解調製品との混合物を特徴とする血液の
調製品にもある。
集団の分析でもあり、その方法においては、血液サンプ
ルを抗凝血剤、次いで所望するなら、少なくとも一種の
白血球の集団又はサブ集団に特異的な抗体、次いで赤血
球溶解剤で処理する。この方法は、抗血凝剤による、そ
して所望するならば少なくとも一種のラベル化抗体によ
る処理の後に、サンプルを脂肪族アルデヒド、多価アル
コール、強酸とアルカリ金属又はアルカリ土類金属との
塩、を含む生理イオン強度の水性調製品で処理し、その
後、好ましくは等張性希釈溶液、例えば10mMのリン酸
ナトリウムpH7.2で緩衝された塩化ナトリウムの生理
溶液(0.9W/V%)(PBS)を用いてのサンプル
の希釈後、そのサンプルをサイトメトリー分析に付する
ことを特徴とする。
に利用されうる。
を例証する。
た: ホルムアルデヒド* 0.54M グリセロール 1.36M 過塩素酸ナトリウム 0.150M イソブタノール 0.1M 塩化マグネシウム 0.005M 塩化カルシウム 0.005M クエン酸ナトリウム 0.05M 蒸留水 * ホルムアルデヒドはメタノールで安定化
調製した: ホルムアルデヒド* 0.36M グリセロール 1.36M 過塩素酸ナトリウム 0.150M イソブタノール 0.1M フマル酸ナトリウム 0.05M * ホルムアルデヒドはメタノールで安定化
ューブに分注した。
た。
抗体(アイソトープコントロール)(無関係な特異性を
有し、一方はイソシアネート(FITC)にコンジュゲ
ートされておりCat.No.0639(10μl)、
他方はフィコエリトリンにコンジュゲートされているc
at#0670(2μl))及びPBS(8μl)の混
合物を加えた。
トされているCD45に特異的なcat#0782(2
μl)及びフィコエリトリン(2.5μl)にコンジュ
ゲートされているCD14に特異的なcat#0650
(2.5μl)モノクローナル抗体、並びにPBS(1
5.5μl)の混合物20μlを加えた。
トされているCD3に特異的なcat#1281(2μ
l)及びPEにコンジュゲートされているCD4に特異
的なcat#0449(10μl)モノクローナル抗
体、並びにPBS(8μl)の混合物20μlを加え
た。
t#1281(2μl)及びCD8−PE抗体cat#
0452(3.3μl)並びにPBS(14.7μl)
の混合物20μlを加えた。
t#1281(2μl)、CD19−PE抗体#128
5(10μl)の抗体及びPBS(8μl)の混合物2
0μlを加えた。
により、「IOTEST」として市販されている。比較
用抗体は他の会社より市販されている。
例1の調製品0.5mlを加え、そしてそのチューブを直
ちにボルテックスに付した。10分の反応後、容量1ml
の蒸留水をチューブに加え、そしてそのチューブを直ち
にボルテックスに付した。
celによるEpics Profile Iフローサ
イトメトリーにより分析した。スキャッター分析におい
て、塊及び血小板の計測を防ぐために域値を用いた。リ
ンパ球、単球及び顆粒球の集団を中心に領域ができた。
FITCコンジュゲートを検出する蛍光1分析、PE−
コンジュゲートを検出する蛍光2分析はその領域にある
リンパ球細胞について行った。CD45に関する蛍光に
おいて陽性な細胞は白血球を表わし、白血球と、血小板
を有する塊との区別を可能とする。CD14について陽
性な細胞は単球であり、単球とリンパ球との区別を可能
とする;CD3及びCD4について陽性な細胞はヘルパ
ーT細胞である。CD3及びCD4について陽性な細胞
は細胞障害性サプレッサーT−細胞である;CD19に
ついて陽性な細胞はB−細胞である。
ンパ球、70%がT−細胞、17%がB−細胞、そして
12%がTでもB−細胞でもないものを示した。
ー細胞と19%の細胞障害性/サプレッサー細胞に分け
られた。
を示した。顆粒領域において、結果の99%が顆粒球を
示した。
の、Excel Epics Profile I(商
標)を用いて得られた、スキャッター分析の結果。
ラフ。スキャッターグラフの「領域」R1 からのリンパ
球を示す。
リンパ球のサイトグラフ。
ルした全血リンパ球のサイトグラフ。
ルした全血単球(領域R2 )のサイトグラフ。
ルした、全血顆粒球(領域R3)のサイトグラフ。
た全血リンパ球のサイトグラフ。
た全血リンパ球のサイトグラフ。
した全血リンパ球のサイトグラフ。
Claims (10)
- 【請求項1】 血液サンプルの赤血球の溶解及び白血球
の保護の方法であって、抗凝血剤で事前処理された血液
のサンプルを、 脂肪族アルデヒド、 多価アルコール、 強酸とアルカリ金属又はアルカリ土類金属との塩の混合
物を含む、実質的に生理的なイオン強度を有する水性調
製品で処理することを特徴とする方法。 - 【請求項2】 実質的に生理イオン強度の水性調製品を
用いる処理の前に、前記サンプルを少なくとも一種のリ
ンパ球のサブ集団に特異的な抗体で処理することを特徴
とする、請求項1に記載の方法。 - 【請求項3】 前記実質的に生理イオン強度の水性調製
品が脂肪族アルコールも含む、請求項1又は2に記載の
方法。 - 【請求項4】 脂肪族アルデヒド 多価アルコール及び強酸と、アルカリ金属又はアルカリ
土類金属との塩の混合物を含む実質的に生理イオン強度
を有している水性調製品である、赤血球を溶解する調製
品。 - 【請求項5】 脂肪族アルデヒドがホルムアルデヒドで
あり、多価アルコールがグリセロールである、ことを特
徴とする、請求項4に記載の調製品。 - 【請求項6】 強酸とアルカリ金属又はアルカリ土類金
属との塩が過塩素酸塩であることを特徴とする、請求項
4又は5に記載の調製品。 - 【請求項7】 脂肪族アルコールを更に含むことを特徴
とする、請求項4〜6のいづれか1項に記載の調製品。 - 【請求項8】 マグネシウム又はカルシウムのいづれか
の、少量の少なくとも一種のアルカリ土類金属を含むこ
とを特徴とする、請求項4〜7のいづれか1項に記載の
調製品。 - 【請求項9】 抗凝血剤で処理し、そして溶解せしめた
血液の調製品であって、抗凝血剤で処理した血液サンプ
ルと、 脂肪族アルデヒド、 多価アルコール及び強酸とアルカリ金属又はアルカリ土
類金属との塩、 の混合物を含む実質的に生理イオン強度の水性調製品と
の混合物を含むことを特徴とする調製品。 - 【請求項10】 血液サンプルの白血球集団を分析する
方法であって、血液サンプルを抗凝血剤、そしてその
後、所望するのには、白血球集団又はサブ集団に特異的
な少なくとも一種の抗体を用いて処理し、ここでこの抗
凝血剤を用いる、及び所望するには少なくとも一種のラ
ベル化抗体を用いる処理の後に、そのサンプルを脂肪族
アルデヒド、 多価アルコール、 強酸とアルカリ金属又はアルカリ土類金属との塩を含む
実質的に生理イオン強度の調製品を用いて処理し、その
後に前記サンプルのサイトメトリー分析を行うことを特
徴とする、方法。
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