JP3284565B2 - 赤血球増殖誘導剤 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、可溶性ＣＤ２３を有効
成分とする赤血球増殖誘導剤に関する。

【０００２】

【従来の技術】ＣＤ２３は、ヒトリンパ球上に存在する
ＩｇＥ低親和性レセプターＦｃεＲII型である。免疫応
答においてリンパ球の移動や活性化細胞の相互作用を調
節することが知られている細胞表面分子は、免疫におい
て重要な特徴となっている自己−非自己認識に関与する
分子とともに３つのファミリーに分けられている（Spri
nger, T., Nature 346, 425 (1990))。

【０００３】ＣＤ２３は、高親和性レセプターＦｃεＲ
Ｉ（α鎖はimmunoglobulin superfamily）と異なり、３
つのファミリーのうちintegrin family に属する分子の
リガンドの特徴であるＲＧＤ配列とselectin family の
特徴であるレクチン構造を有している。このことからＣ
Ｄ２３は、進化論的にはＩｇＥのレセプターとしてより
何らかの細胞表面接着分子としての機能を有する可能性
を秘めていると考えられている。

【０００４】低親和性ＩｇＥレセプターＣＤ２３は活性
化抗原でもあり、活性化Ｂ細胞や活性化マクロファージ
（ＩＬ４による）あるいは活性化好酸球（ＩＬ５によ
る）に発現（誘導）され、即時型アレルギーに深く係わ
っている。また、２次リンパ組織胚中心のfollicular d
endritic cellにおいて発現されているＣＤ２３は記憶
Ｂ細胞の維持に関与していることが示唆されている。さ
らに、酵素により切断された可溶性ＣＤ２３が生体内に
存在しているが、この可溶性ＣＤ２３もまたＩｇＥ結合
因子以外の活性、即ち、活性化Ｂ細胞に対するＢ細胞増
殖分化活性、ＮＫ細胞によるＩｇＥ抗体産生の調節活
性、ＩＬ１活性（胸腺細胞に対する増殖活性）及びマク
ロファージに対するMigration Inhibitory Factor 活性
等が報告されている。

【０００５】最近、この可溶性ＣＤ２３がインターロイ
キン１との相乗作用として、ＣＤ７陽性未分化胸腺細
胞、ＣＤ４陽性骨髄由来Ｔ細胞およびＣＤ３４陽性骨髄
前駆細胞に対して分化・増殖を誘導すること、また、リ
ンパ節胚中心のＢ細胞の生存および分化を誘導すること
が報告された。 参考文献 J. Exp. Med., 171, 959 (1990) Blood,75, 1924 (1990) Immunol. Today, 12, 206 (1991) Eur. J. Immunol., 21, 1073 (1991)

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、ＣＤ
２３の新規な用途を提供することである。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題
を解決すべく鋭意研究を行った結果、可溶性ＣＤ２３が
造血系幹細胞のうち赤血球前駆細胞に対してその増殖・
分化を誘導することを見出した。さらに、従来より赤血
球増殖を誘導することが知られているエリスロポエチン
と可溶性ＣＤ２３とを併用することによりエリスロポエ
チンの赤血球増殖誘導作用が増強されることを見出し
た。本発明は、かかる新知見に基づき完成されたもので
ある。

【０００８】即ち、本発明の要旨は次の通りである。 可溶性ＣＤ２３を有効成分とする赤血球増殖誘導剤。 エリスロポエチンと併用するためのに記載の赤血球
増殖誘導剤。

【０００９】以下に、本発明を詳述する。 （１）可溶性ＣＤ２３ 本発明で使用される可溶性ＣＤ２３は、ＣＤ２３の水溶
性領域からなる断片であって、ＩｇＥの低親和性レセプ
ターとしての活性を有するものであれば特に限定されな
い。ここでＣＤ２３とは膜結合型ＣＤ２３のことであ
り、３２１個のアミノ酸からなり、Ｎ末端を細胞質内
に、Ｃ末端を細胞外に持つオリエンテーションで発現す
る膜糖蛋白質の一種である。この膜結合型ＣＤ２３は、
（１）親水性のＮ末端細胞内部分（Ｎ末側１番目から２
１番目までのアミノ酸配列）、（２）疎水性の膜領域
（Ｎ末側２２番目から４７番目までのアミノ酸配列）お
よび（３）親水性のＣ末端細胞外部分（Ｎ末側４８番目
からＣ末端までのアミノ酸配列）の３つの領域に分ける
ことができる。上記水溶性領域とは（３）ＣＤ２３の細
胞外部分、すなわち、Ｃ末端親水性領域のことである。
従って、本発明で使用される可溶性ＣＤ２３は、このＣ
末端親水性領域の一部のアミノ酸配列を含んでいればよ
い。例えば、膜結合型ＣＤ２３のＮ末側５０番目〜１６
０番目のアミノ酸から始まり、２８２番目〜３２１番目
のアミノ酸で終わるアミノ酸配列などが例示される。こ
のような可溶性ＣＤ２３として具体的には配列表に示す
アミノ酸配列のものが例示される。

【００１０】可溶性ＣＤ２３の由来には特に制限はな
く、細胞培養法、遺伝子工学的手法などにより調製され
たものが例示される。細胞培養法は、特開昭６１−２８
９１００号、特開昭６３−９９０９９号などに開示され
ている。遺伝子工学的手法としては、大腸菌、酵母、動
物細胞を用いる方法（特開昭６４−２７４９６号、特開
昭６３−１９８９８８号）、dhfr欠損型動物細胞を用い
る方法（特開昭６３−６８０９７号、特開平２−４４３
号）等が報告されている。本発明においては、上記手法
により調製された可溶性ＣＤ２３を使用することができ
る。また可溶性ＣＤ２３の調製には、ウロキナーゼプロ
モーターとＤＨＦＲ遺伝子からなる発現系を用いること
もできる（特願平２−１２３５７３号など）。その他の
公知の一般的な発現方法を用いてもよい。

【００１１】（２）エリスロポエチン エリスロポエチン（ＥＰＯ）は、主に腎臓で産生される
糖蛋白質であり、赤血球の前駆細胞に働き赤芽球の分化
を促進させることにより生体内において赤血球の産生を
調節する役割を果たしていることが知られている。赤血
球の産生過程においてＥＰＯは、赤血球前駆細胞である
赤芽球コロニー形成細胞（colonyforming unit-erythro
id, CFU-E）の分化段階を促進する。

【００１２】本発明において使用されるＥＰＯは、赤血
球増殖誘導の活性を有するものであれば特に制限されな
い。ＥＰＯの由来には特に制限はなく、尿由来、血清由
来、遺伝子工学的手法により得られるもの、細胞培養に
よるものなどいずれも使用できる。分子量約３５，００
０〜４０，０００、糖鎖の末端にシアル酸残基を有する
ＥＰＯが例示される。ＥＰＯは貧血治療用の医薬品とし
て、既に遺伝子組換えにより調製された製剤が販売され
ており〔商品名：エスポー（キリンビール−三共）、商
品名：エポジン（中外製薬）など〕、本発明の赤血球増
殖誘導剤とＥＰＯとを併用する場合にはこれらを利用す
ることができる。

【００１３】（３）用法、用量 可溶性ＣＤ２３とＥＰＯとを併用する場合、両者が体内
に存在する状態で投与される限り、これらの製剤、投与
経路に特に制限はない。例えば、両者が混合された製剤
として投与してもよいし、別々の製剤として同時にまた
は別々に、同一経路または別個の経路で投与してもよ
い。

【００１４】本発明において、可溶性ＣＤ２３は単独
で、または担体（例えば、注射用蒸留水、生理食塩水、
ブドウ糖注射液など）、安定化剤（例えば、アルブミ
ン、クエン酸ナトリウム、アルギニン、デキストランな
ど）、ｐＨ調整剤（例えば、リン酸水素ナトリウム、リ
ン酸二水素ナトリウムなど）、その他の添加剤ととも
に、通常、経口剤あるいは非経口剤、例えば注射剤、点
滴剤、経皮剤、経鼻剤、外用剤、坐剤などとして調製さ
れる。当該製剤には、さらにＥＰＯを配合させてもよ
い。

【００１５】当該赤血球増殖誘導剤の投与量は、患者の
体重、性別、症状などより異なるが、一般に成人１回当
たり可溶性ＣＤ２３が1 〜1000μｇ／kg体重程度であ
る。また、ＥＰＯと併用する場合の投与量は、患者の体
重、性別、症状などより異なるが、一般に成人１回当た
りＥＰＯが100 〜3000Ｕに対して、可溶性ＣＤ２３が1
〜1000μｇ／kg体重程度である。

【００１６】当該赤血球増殖誘導剤の投与経路として
は、経口あるいは非経口、例えば静注、点滴静注、冠動
脈内投与、経皮、経鼻、直腸内投与などが挙げられる。
可溶性ＣＤ２３とＥＰＯは、別々または同時に、同一経
路または別個の経路により投与される。別々に投与する
場合、どちらを先に投与してもよい。別々に投与する場
合のＥＰＯの投与経路としては、例えば静注、点滴静
注、冠動脈内投与などが挙げられる。

【００１７】（４）用途 本発明の赤血球増殖誘導剤は、貧血、特に腎性貧血、再
生不良性貧血、人工透析患者の貧血、重症慢性腎不全患
者の貧血などの治療に有用である。特に、エリスロポエ
チンとの併用療法が好ましい。

【００１８】

〔動物細胞での発現を制御できるプロモーター（ＳＶ４０）を上流部に付加させた可溶性ＣＤ２３をコードするＤＮＡを組み込んでなるプラスミドの構築〕

ｐｃＤＬ−ＳＲα２９６（図１）にマウスＣＤ３２のリ
ーダー配列−ヒト可溶性ＣＤ２３遺伝子を組み込んだプ
ラスミドを構築した。尚、配列表に当該ヒト可溶性ＣＤ
２３遺伝子をコードするＤＮＡ配列およびそれに演繹さ
れるアミノ酸配列を示す。

【００１９】〔II〕ｐＴＴ０６の構築 〔ウロキナーゼ（ＵＫ）プロモーターを上流部に付加さ
せたジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ) をコードするＤ
ＮＡを組み込んでなるプラスミドの構築〕

【００２０】(i) ｐＵＫＰ−１の構築：ウロキナーゼ
（ＵＫ）プロモーターをコードするＤＮＡの調製

【００２１】 プローブの作製 ヒトウロキナーゼｃＤＮＡの一部を含むプラスミドｐＵ
Ｋ４（特開昭61-177987 号公報) をPstIで消化して、１
％アガロースゲルで電気泳動後、約400 bpの断片をエレ
クトロエリューションにより回収した。このＤＮＡ断片
0.4 μｇをマルチプライムにより〔α- ³²Ｐ]dCTP(アマ
ーシャム, PB10205)でラベルした。 目的分画を集めてCerenkov countを調べた結果、9.69×
10⁷cpmであった。ラベルの収率は41％ラベルの比放射活
性は2.4 ×10⁸ cpm/μｇと計算された。

【００２２】 ＨＫＧ細胞ＤＮＡのサザンハイブリダ
イゼーション Riccio et al.[(Nucl.Acids Res., 13, 2759-2771 (198
5)] の報告によれば、ヒトウロキナーゼプロモーター領
域はヒト染色体ＤＮＡの5.8 kb EcoRI断片及び12 kb の
BamHI 断片として得られる。ＨＫＧ細胞高分子ＤＮＡを
EcoRI 及びBamHI で消化し各10μg を０．８％アガロー
スゲルで電気泳動後、で調製したプローブを用いてサ
ザンハイブリダイゼーションによりこれを確認した。そ
の結果、それぞれのサイズに相当する位置にシグナルが
検出された。

【００２３】 5.8 kb EcoRI断片の調製 ＨＫＧ細胞高分子ＤＮＡ 200μg を1000ユニットのEcoR
I で37℃、一夜消化した。０．８％アガロースゲル（宝
酒造、HE-12 泳動装置）で電気泳動後、エチジウムブロ
マイド染色し、マーカーとして泳動した。λ−ＤＮＡ H
indIII消化物から求めた5.8 kbの位置を中心に２ｍｍ幅
でゲルを切り出し（ゲル２）、更にその上（ゲル１）下
（ゲル３）各３ｍｍ幅についてもゲルを切り出し、エレ
クトロエリューションによりＤＮＡ断片を抽出した。抽
出したＤＮＡの一部を０．８％アガロースゲルで電気泳
動し、サザンハイブリダイゼーションにより目的のＤＮ
Ａ断片が含まれているかどうか確認した。ゲル２から抽
出したＤＮＡ断片中に目的のウロキナーゼプロモーター
領域が存在すると推定された。

【００２４】 ＤＮＡライブラリーの作製とスクリー
ニング 前項で抽出したＤＮＡについてファージベクターλ_gt10
を用いてＤＮＡライブラリーを作製した。合計６．５×
１０⁵ 個の組み換えファージをプラークハイブリダイゼ
ーションにより一次スクリーニングした。一次スクリー
ニングで28個のポジティブクローンが得られた。これを
更にプラークハイブリダイゼーションによる二次スクリ
ーニングしたところ、５個のポジティブクローンに絞ら
れた。ポジティブクローンの組み換えファージより簡易
抽出法でＤＮＡを抽出し、EcoRI消化後、１％アガロー
スゲルで電気泳動し、サザンハイブリダイゼーションを
行った。その結果、２種類の組み換えファージがポジテ
ィブと判定された。クローン１，４，５は同じクローン
由来であり１種類とみなした。クローン１５はこれらと
は別のクローン由来である。

【００２５】 5.8kb EcoRI 断片のサブクローニング サザンハイブリダイゼーションでポジティブと判定され
たクローンよりファージＤＮＡを簡易抽出法にて調製
し、 EcoRI消化した。これをフェノールクロロホルム抽
出し、水相を更にクロロホルム抽出後エタノール沈澱し
た。プラスミドｐＵＣ９（Pharmacia 社）を EcoRI消化
後アルカリフォスファターゼ処理し、その一部（１μ
ｇ）と上記ファージＤＮＡの EcoRI消化物をライゲーシ
ョンし、 E.Coli HB101 を形質転換させた。形質転換菌
のいくつかについて簡易抽出法にてプラスミドＤＮＡを
抽出し、 EcoRI消化後１％アガロースゲルで電気泳動し
た。その結果、いくつかのサブクローンが5.8 kbに相当
するＤＮＡ断片を有していた。これらのクローン１と４
を更に各種制限酵素で消化後１％アガロースゲルで電気
泳動した。クローン１と４は切断様式は異なったもの
の、いくつかの共通する断片も見られたので5.8 kb断片
が逆方向に挿入されたものと推定された。それぞれのプ
ラスミドとｐＵＫＰ１（図２参照）及びｐＵＫＰ２と命
名した。

【００２６】 ｐＵＫＰ１の制限酵素処理 Riccio等（前述）が報告したヒトウロキナーゼ遺伝子の
塩基配列から推定した制限酵素切断部位地図を基に、こ
の図から推定される酵素断片が得られるかどうかを確認
した。ｐＵＫＰ１を有するE.coli HB101を40μｇ/ml ア
ンピシリン含有スパーブロス100 mlで37℃、一夜培養
後、アルカリ−ＳＤＳ法にてプラスミドＤＮＡを調製し
た。このＤＮＡについて各種制限酵素処理を行った。ま
た、表１にはプラスミドについて推定される制限酵素断
片のサイズとその有無について示した。表１に示したよ
うに推定される断片はすべて検出され、目的のヒトウロ
キナーゼプロモーター部位をコードするＤＮＡ断片がク
ローニングされたことが確認された。

【００２７】

【表１】

【００２８】 ｐＵＫＰ１の一部塩基配列の確認 前項で調製したプラスミドＤＮＡについてダイデオキシ
法にて塩基配列の一部を調べた結果、Riccio等の報告
（前述）と一致した。

【００２９】(ii) ｐＴＴ０６の構築 〔ＵＫプロモーター，dhfr cＤＮＡ, ＳＶ４０ポリＡを
含むプラスミドの構築〕 図３にプラスミド構築の概要を示した。pSV2-dhfr （特
開昭63-105675 号公報）をPvuII, PstI で処理して得た
ＳＶ４０エンハンサー・プロモーター、dhfr cＤＮＡ,
ＳＶ４０ late ポリＡ付加シグナルを含む2.5 KbのＤＮ
Ａ断片をさらにHindIII で切断しＳＶ４０エンハンサー
・プロモーターを除いた2.1 KbのＤＮＡ断片を得た。こ
のHindIII- PstIＤＮＡ断片をＴ４ＤＮＡポリメラーゼ
で平滑末端した後、ｐＵＣ１９（宝酒造）のSmaI切断部
位にクローニングした。その結果、dhfr cＤＮＡの５’
側（タンパクのＮ末側）がｐＵＣ１９のポリリンカーの
HindIII の方を向いたｐＴＴ０４が得られた。プラスミ
ドの確認はBamHI消化によりｐＵＣ１９のポリリンカー
中のBamHI とＳＶ４０ポリＡ付加シグナルの後ろにある
BamHI で切り出されるＤＮＡ断片の大きさにより行っ
た。ｐＴＴ０４からは1.6 kbのDNA 断片が得られた。次
に、ｐＵＫＰ−１をHpaIとSmaIで切断し、ウロキナーゼ
遺伝子転写開始点より下流約30 bp のSmaI認識部位と転
写開始点より上流約800 bpのHpaI認識部位より切り出さ
れる約800 bpのDNA 断片を回収した。このＵＫプロモー
ター部位を含むＤＮＡ断片をｐＴＴ０４のｄｈｆｒ cＤ
ＮＡの上流に挿入した。すなわちｐＴＴ０４をXbaIで消
化後、ＢＡＰ処理、Ｔ₄ ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端
化し、ＵＫプロモーターのHpaI−SmaI断片とライゲーシ
ョンを行った。トランスフォーメーション後、得られた
コロニーよりｄｈｆｒ遺伝子とＵＫプロモーターが同じ
転写方向を向いたクローンを選択した。ｐＴＴ０４から
はＵＫプロモーターＤＮＡ断片の５’近傍のEcoRV とｐ
ＵＣ１９のSalIでの切断で 280 bp のＤＮＡ断片を与え
るプラスミドを選び、ｐＴＴ０６とした。プラスミドは
さらに、 EcoRV＋SacI, EcoRV ＋BamHI の切断によりそ
の構造を確認した。ｐＴＴ０６の EcoRV, SacI消化で
は、0.9, 1.8, 2,9 kbの断片が、EcoRV,BamHI消化では
0.6, 1.6, 3.5 kbの断片が得られた。これらの断片のサ
イズは、目的とするプラスミドの制限酵素地図と一致し
た。

【００３０】[III] 動物細胞への導入 (i) 材料と方法 プラスミドＤＮＡ ｐＣＤｓＣＤ２３：ｐｃＤＬ−ＳＲα２９６にマウスＣ
Ｄ３２のリーダー配列−ヒトｓＣＤ２３遺伝子を組み込
んだプラスミド。 ｐＴＴ０６：ＵＫプロモーター（ウロキナーゼ遺伝子転
写開始点を含む上流約８０００ｂｐの５’調節領域）に
支配されるＤＨＦＲ遺伝子発現ユニットからなるプラス
ミド。

【００３１】 細胞 ＣＨＯ−Ｋ１細胞由来ＤＨＦＲ欠損株 Proc.Natl.Acad.Sci(USA) 77, 4216 (1980) に記載の方
法で調製、増殖させた。

【００３２】 メトトレキセート（ＭＴＸ） Sigma 社製（＋）Amethopterinを0.14 M NaCl, 0.02 M
HEPES （ナカライテスク）に溶解し、２mMストック液を
調製した。これを培地に、目的の濃度になるように添加
し使用した。

【００３３】 培地と血清 MEM-α（リボヌクレオシドとデオキシリボヌクレオシド
入り）（Gibco) MEM-α（リボヌクレオシドとデオキシリボヌクレオシド
無し）（Gibco) それぞれ、MEM-α（w)、MEM-α（w/o)と略す。血清は牛
胎児血清（FCS)を非働化し使用した。

【００３４】 ＤＮＡ導入とトランスフェクタントの
選択 MEM-α（w)，10％FCS で継代しているDHFR欠損CHO 細胞
をトリプシン(0.125%)処理により、ディッシュよりはが
し10⁷ cell/ml となるよう Hanks液に懸濁した。この懸
濁液0.5 ml，５×10⁶ 個の細胞にプラスミドＤＮＡ（１
μｇのｐＴＴ０６と４０μｇのｐＣＤｓＣＤ２３）を同
時にエレクトロポレーション法により導入した。この細
胞を10⁶cells/dish となるように５枚の10cm dish に播
いた。２日間、MEM-α（w)，10％FCS で培養後、選択培
地であるMEM-α（w/o)，10％FCSに交換した。２〜３日
毎に培地交換を行い、１０日間程培養するとコロニーの
形成が見られたので、各コロニーを96 wells Plateに移
し、さらに培養を続けた。96 wells Plate中で細胞がほ
ぼFull Sheetを形成したところで各種培養上清中の可溶
性ＣＤ２３活性を測定した。高い活性を与えた細胞をス
ケールアップし、ＭＴＸによるＤＮＡ増幅に供した。

【００３５】 ＭＴＸによる導入遺伝子の増幅 上記で得られたｓＣＤ２３産生細胞を５〜10×10⁵ cell
s/dishとなるように10nM MTX含有選択培地８〜10ml入り
10cmディッシュに植え込んだ。約３日毎に培地交換を行
い、２〜４週間培養を続けていると充分な細胞数の10nM
MTX耐性細胞が得られるので、次の段階のＭＴＸ濃度の
培地に継代した。このように10nM MTX濃度からスタート
して２μＭまで順次ＭＴＸ濃度を上げていった。各濃度
のＭＴＸ耐性細胞を10cm dish (Falcon, 3003)で培養
し、得られたヒトｓＣＤ２３高産生細胞を限界希釈法に
よりクローニングしてヒトｓＣＤ２３高産生細胞株を樹
立した。10⁶ 個の細胞を10mlの選択培地入りディッシ
ュ、Falcon 3003 に蒔き３日間培養して得られる上清の
ヒトｓＣＤ２３濃度をそのＭＴＸ濃度におけるｓＣＤ２
３産生量とした。

【００３６】 可溶性ＣＤ２３の定量 可溶性ＣＤ２３の濃度は、ＣＤ２３に対する二種の異な
るモノクローナル抗体を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡ
法(Enzyme Linked Immunoabsorbent Assay, ELISA)によ
り測定した。培養液当たりの産生量は0.3 〜30μg/mlで
あった。

【００３７】 精製 以下の操作はすべて４℃で行った。凍結保存しておいた
培養上清は融解遠心（10000 ×g, 10 分間) 後の上清に
0.02％sodium azide、1mM PMSF(phenylmethylsulfonyl
fluride)を添加したものを用いた。培養上清10mlに対
し、Sephadex G-100 100μl を用いて前処理した。即
ち、予め膨潤した後洗浄液Ａ（ダルベッコのリン酸緩衝
生理食塩水）で平衡化したSephadex G-100 100μl を添
加し、0.5 〜２時間反応させた(rocking) 。遠心(3000
×g, 50 秒間) した後、上清は免疫沈降反応を続けた。
即ち、抗ヒトＣＤ２３モノクローナル抗体Ｈ１０７結合
Sepharose 4B 40 μl を予め溶出液(0.1M 酢酸、1M NaC
l)1500μl で処理した後、洗浄液Ａ（同上) で平衡化
し、これを先の上清に添加し数時間放置した(rocking)
。遠心(3000 ×g, 50 秒間または10000 ×g, 15 秒間)
して得られた沈澱物は３mlの洗浄液Ａ（同上）、次い
で洗浄液Ｂ（ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水, 0.4M
NaCl ）でそれぞれ洗浄(10000×g, 15 秒間の遠心操
作) した後、溶出液（同上）３０μｌを用いて溶出し
た。得られた溶出画分(10000×g, 15 秒間の遠心操作後
の上清）に1.8 μl の中和液（２Ｍ Tris ）を速やかに
添加した。得られた可溶性ＣＤ２３の分子量は、ＳＤＳ
−電気泳動法によれば約25000 であった。

【００３８】実施例１ 参考例１で調製、精製した可溶性ＣＤ２３画分を等張リ
ン酸緩衝液にて透析した後に滅菌濾過して凍結乾燥し
た。用時、注射用水に溶解して注射剤とした。

【００３９】実験例１ 可溶性ＣＤ２３の赤血球前駆細胞に対する作用 赤血球前駆細胞としては、Krystal, G. が開発した、Ｅ
ＰＯのin vitroバイオアッセイで用いられるフェニルヒ
ドラジン投与マウスの脾細胞を使用した（Exp.Hemato
l.,11, 649 (1983)）。該脾細胞は、主にＣＦＵ−Ｅと
考えられ、エリスロポエチンにより前赤芽球（proeryth
roblast)に増殖・分化し、網状赤血球（reticulocyte）
を経て赤血球（erythrocyte)に至る。通常は骨髄中で行
われている赤血球増生（erythropoiesis）を脾臓で再現
できる点でこの方法は優れている。

【００４０】マウス（BALB/cまたはCBA/J マウス、メ
ス）の腹腔内にフェニルヒドラジン６０mg／kgを連続２
日間注射し、最初の注射の日より数えて５日目に脾臓を
摘出した。摘出した脾臓を培地中で細切し、得られた細
胞浮遊液をシャーレに移し、１〜３時間培養した。次い
で、細胞を回収、洗浄した後、新しい培地を用いて調製
した細胞浮遊液を最終濃度２×１０⁶ cell/ mlとなるよ
うに９６穴マイクロプレートに入れた。これに所定の濃
度の可溶性ＣＤ２３および／またはＥＰＯ加え、２０時
間培養し、さらに[³H]チミジンで４時間パルスした後、
細胞を回収し、その放射活性を液体シンチレーションカ
ウンターで測定した。なお、本実験において可溶性ＣＤ
２３は製造例１で得たものを、ＥＰＯは市販品（ベーリ
ンガーマンハイム社）を使用した。可溶性ＣＤ２３単独
使用時の結果を表２に、可溶性ＣＤ２３とＥＰＯの併用
時の結果を表３に示す。

【００４１】

【表２】

【００４２】

【表３】

【００４３】可溶性ＣＤ２３はフェニルヒドラジン腹腔
内投与マウスの脾細胞に対して単独でチミジンの取込み
を増加させた。さらに、フェニルヒドラジン腹腔内投与
マウスの脾細胞は用量依存的にＥＰＯに反応し、チミジ
ン取込みが増加したが、このＥＰＯの作用を可溶性ＣＤ
２３は増強した。この結果、可溶性ＣＤ２３は赤血球前
駆細胞が大部分であるフェニルヒドラジン腹腔内投与マ
ウスの脾細胞の増殖を単独またはヒトＥＰＯと相乗的に
誘導することが確認された。

【００４４】配列表 配列の長さ：９６７ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ 起源 生物名：ヒト 配列の特徴 特徴を示す記号：ＣＤＳ 存在位置： 448-964 特徴を決定した方法：Ｓ 配列 ATG GAG TTG CAG GTG TCC AGC GGC TTT GTG TGC AAC ACG TGC CCT GAA 496 Met Glu Leu Gln Val Ser Ser Gly Phe Val Cys Asn Thr Cys Pro Glu 5 10 15 AAG TGG ATC AAT TTC CAA CGG AAG TGC TAC TAC TTC GGC AAG GGC ACC 544 Lys Trp Ile Asn Phe Gln Arg Lys Cys Tyr Tyr Phe Gly Lys Gly Thr 20 25 30 AAG CAG TGG GTC CAC GCC CGG TAT GCC TGT GAC GAC ATG GAA GGG CAG 592 Lys Gln Trp Val His Ala Arg Tyr Ala Cys Asp Asp Met Glu Gly Gln 35 40 45 CTG GTC AGC ATC CAC AGC CCG GAG GAG CAG GAC TTC CTG ACC AAG CAT 640 Leu Val Ser Ile His Ser Pro Glu Glu Gln Asp Phe Leu Thr Lys His 50 55 60 GCC AGC CAC ACC GGC TCC TGG ATT GGC CTT CGG AAC TTG GAC CTG AAG 688 Ala Ser His Thr Gly Ser Trp Ile Gly Leu Arg Asn Leu Asp Leu Lys 65 70 75 80 GGA GAG TTT ATC TGG GTG GAT GGG AGC CAT GTG GAC TAC AGC AAC TGG 736 Gly Glu Phe Ile Trp Val Asp Gly Ser His Val Asp Tyr Ser Asn Trp 85 90 95 GCT CCA GGG GAG CCC ACC AGC CGG AGC CAG GGC GAG GAC TGC GTG ATG 784 Ala Pro Gly Glu Pro Thr Ser Arg Ser Gln Gly Glu Asp Cys Val Met 100 105 110 ATG CGG GGC TCC GGT CGC TGG AAC GAC GCC TTC TGC GAC CGT AAG CTG 832 Met Arg Gly Ser Gly Arg Trp Asn Asp Ala Phe Cys Asp Arg Lys Leu 115 120 125 GGC GCC TGG GTG TGC GAC CGG CTG GCC ACA TGC ACG CCG CCA GCC AGC 880 Gly Ala Trp Val Cys Asp Arg Leu Ala Thr Cys Thr Pro Pro Ala Ser 130 135 140 GAA GGT TCC GCG GAG TCC ATG GGA CCT GAT TCA AGA CCA GAC CCT GAC 928 Glu Gly Ser Ala Glu Ser Met Gly Pro Asp Ser Arg Pro Asp Pro Asp 145 150 155 160 GGC CGC CTG CCC ACC CCC TCT GCC CCT CTC CAC TCT TGA 967 Gly Arg Leu Pro Thr Pro Ser Ala Pro Leu His Ser 165 170

【図面の簡単な説明】

【図１】プラスミドｐｃＤＬ−ＳＲα２９６の構造を示
す。

【図２】サブクローンｐＵＫＰ１の構造を示す。

【図３】ｐＴＴ０６の調製工程を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 特開 昭62−149624（ＪＰ，Ａ) 特表 平１−503355（ＪＰ，Ａ) カナダ国特許発明第2034737号明細書 （1991年７月25日発行) (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) A61K 38/00 - 38/42 A61P 1/00 - 43/00 ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ) ＥＭＢＡＳＥ（ＳＴＮ) ＢＩＯＴＥＣＨＡＢＳ（ＳＴＮ) ＣＡ（ＳＴＮ) ＭＥＤＬＩＮＥ（ＳＴＮ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (3)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 可溶性ＣＤ２３を有効成分とする赤血球
   増殖誘導剤。
2. 【請求項２】 エリスロポエチンと併用するための請求
   項１記載の赤血球増殖誘導剤。
3. 【請求項３】 赤血球増殖誘導が赤芽球コロニー形成細
   胞を介したものである、請求項１記載の赤血球増殖誘導
   剤。