JP3277200B2 - 成熟ポリペプチドの製法 - Google Patents
成熟ポリペプチドの製法Info
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Description
【０００１】本発明は、固状の不溶性支持体に不動化し
たファクターXaでの可溶性前駆体の酵素加水分解による
成熟ポリペプチドの製法の改良に係る。
たファクターXaでの可溶性前駆体の酵素加水分解による
成熟ポリペプチドの製法の改良に係る。
【０００２】酵素加水分解によりイン・ビトロで特異的
に分割されるアミノ酸配列と融合したポリペプチドの製
造に関して、当分野では組換DNA技術が公知である。特
に、酵素ファクターXa（Factor Xa）での加水分解によ
り可溶性前駆体から成熟（アミノ酸191個）ヒト成長ホ
ルモン（hGH）を製造する方法が開示されている（EPA−
211288)。この方法によれば、酵素加水分解を、精製hGH
用の前駆体を含有するタンパク質溶液にファクターXaを
添加することによって行い、このようにして得られた成
熟hGHを反応混合物から分離している。
に分割されるアミノ酸配列と融合したポリペプチドの製
造に関して、当分野では組換DNA技術が公知である。特
に、酵素ファクターXa（Factor Xa）での加水分解によ
り可溶性前駆体から成熟（アミノ酸191個）ヒト成長ホ
ルモン（hGH）を製造する方法が開示されている（EPA−
211288)。この方法によれば、酵素加水分解を、精製hGH
用の前駆体を含有するタンパク質溶液にファクターXaを
添加することによって行い、このようにして得られた成
熟hGHを反応混合物から分離している。
【０００３】しかしながら、この方法は、溶液中でその
ままのファクターXaを使用することによる欠点（たとえ
ば、反応終了時、酵素及びその劣化生成物又は動物性の
汚染物を除去する必要があること、成熟生成物の分離及
び精製に煩雑な手続を必要とする操作法であること等）
を有している。実際のところ、ファクターXaは室温にお
いて溶液中で必ずしも安定ではなく、劣化してフラグメ
ントを形成し、成熟生成物からの分離が困難であること
が知られている。
ままのファクターXaを使用することによる欠点（たとえ
ば、反応終了時、酵素及びその劣化生成物又は動物性の
汚染物を除去する必要があること、成熟生成物の分離及
び精製に煩雑な手続を必要とする操作法であること等）
を有している。実際のところ、ファクターXaは室温にお
いて溶液中で必ずしも安定ではなく、劣化してフラグメ
ントを形成し、成熟生成物からの分離が困難であること
が知られている。
【０００４】発明者らは、ファクターXaをその酵素特異
性を保持できる状態で固状の不溶性支持体に不動化さ
せ、この活性支持体を、所望生成物の可溶性前駆体の加
水分解に使用することにより上述の欠点を解消できるこ
とを見出し、本発明に至った。従って、本発明の目的
は、固状の不溶性支持体に不動化したファクターXaでの
可溶性前駆体の酵素加水分解による成熟ポリペプチドの
改良された製法にある。さらに詳述すれば、本発明の方
法は下記の工程を包含する。 ａ）酵素の特異性を変化させない状態でファクターXaを
固状の不溶性支持体に不動化させる工程； ｂ）得られた活性支持体を、所望ポリペプチドの配列 X−Ile−Glu−Gly−Arg−Y （ここで、ＸはMet又は前駆体に溶解性を付与するペプ
チドであり；Ile−Glu−Gly−Arg（配列番号：１）はフ
ァクターXaによって認識されるテトラペプチドであり；
Ｙは成熟ポリペプチドである）を有する可溶性前駆体を
含有するタンパク質溶液と接触させる工程； ｃ）加水分解反応終了後、成熟ポリペプチドを回収する
工程； ｄ）不動化ファクターXaを次の酵素加水分解反応で再使
用する工程。
性を保持できる状態で固状の不溶性支持体に不動化さ
せ、この活性支持体を、所望生成物の可溶性前駆体の加
水分解に使用することにより上述の欠点を解消できるこ
とを見出し、本発明に至った。従って、本発明の目的
は、固状の不溶性支持体に不動化したファクターXaでの
可溶性前駆体の酵素加水分解による成熟ポリペプチドの
改良された製法にある。さらに詳述すれば、本発明の方
法は下記の工程を包含する。 ａ）酵素の特異性を変化させない状態でファクターXaを
固状の不溶性支持体に不動化させる工程； ｂ）得られた活性支持体を、所望ポリペプチドの配列 X−Ile−Glu−Gly−Arg−Y （ここで、ＸはMet又は前駆体に溶解性を付与するペプ
チドであり；Ile−Glu−Gly−Arg（配列番号：１）はフ
ァクターXaによって認識されるテトラペプチドであり；
Ｙは成熟ポリペプチドである）を有する可溶性前駆体を
含有するタンパク質溶液と接触させる工程； ｃ）加水分解反応終了後、成熟ポリペプチドを回収する
工程； ｄ）不動化ファクターXaを次の酵素加水分解反応で再使
用する工程。
【０００５】固状支持体への酵素の不動化は、公知技術
の１つ（たとえば、酵素の反応基と支持体の反応基との
間での共有結合法（スペースを置いてもよい）、イオン
結合法及び物理的吸着法等）によって行われる。ファク
ターXaは、好ましくは活性化された固状支持体に共有結
合によって不動化される。本発明の目的に適する固状支
持体の例としては、市販の天然高分子（変性されていて
もよい）、合成高分子又は無機支持体（既に活性化され
ているもの又は不動化前に活性化されるもの）がある。
さらに詳述すれば、本発明の方法では、予めBrCNで活性
化されたPharmaciaからSepharose CL−4Bとして市販さ
れている支持体を使用している。ファクターXaは、酵素
上に存在する１以上のアミノ基と、支持体上に存在する
環状イミドカーボネートとを反応させ、下記のタイプの
誘導体を形成することによって不動化される。 ファクターXaの不動化は、活性化支持体を、pH7.0ない
し9.0、好ましくは7.5ないし8.0の緩衝液中で酵素と接
触させることによって行われる。接触時間は、酵素及び
支持体の反応基の間の結合反応が完了するに必要な程度
である。反応終了後、支持体を繰返し緩衝液で洗浄し
て、支持体に反応基がなお残留することを阻止する。本
発明の方法の別の具体例では、ファクターＸを固状の不
溶性支持体に不動化させ、ついでCa2+イオンの存在下、
ラッセルクサリヘビ（Russell's viper）の毒（RVV）に
含有されるタンパク質によって活性化してファクターXa
としている。
の１つ（たとえば、酵素の反応基と支持体の反応基との
間での共有結合法（スペースを置いてもよい）、イオン
結合法及び物理的吸着法等）によって行われる。ファク
ターXaは、好ましくは活性化された固状支持体に共有結
合によって不動化される。本発明の目的に適する固状支
持体の例としては、市販の天然高分子（変性されていて
もよい）、合成高分子又は無機支持体（既に活性化され
ているもの又は不動化前に活性化されるもの）がある。
さらに詳述すれば、本発明の方法では、予めBrCNで活性
化されたPharmaciaからSepharose CL−4Bとして市販さ
れている支持体を使用している。ファクターXaは、酵素
上に存在する１以上のアミノ基と、支持体上に存在する
環状イミドカーボネートとを反応させ、下記のタイプの
誘導体を形成することによって不動化される。 ファクターXaの不動化は、活性化支持体を、pH7.0ない
し9.0、好ましくは7.5ないし8.0の緩衝液中で酵素と接
触させることによって行われる。接触時間は、酵素及び
支持体の反応基の間の結合反応が完了するに必要な程度
である。反応終了後、支持体を繰返し緩衝液で洗浄し
て、支持体に反応基がなお残留することを阻止する。本
発明の方法の別の具体例では、ファクターＸを固状の不
溶性支持体に不動化させ、ついでCa2+イオンの存在下、
ラッセルクサリヘビ（Russell's viper）の毒（RVV）に
含有されるタンパク質によって活性化してファクターXa
としている。
【０００６】酵素加水分解は、前駆体を含有する溶液
を、活性支持体を充填したカラムに供給して行われる。
タンパク質溶液のpHは6.0ないし9.0、好ましくは7.5な
いし8.5である。前駆体の濃度は、単位時間当たり最高
の生産率を提供するように選択される。一般に、前駆体
の濃度は2.0ないし30.0mg／mlである。反応を所望の変
化率の達成時点で停止できるように一定の間隔で変化率
をチェックする。このチェックは、アニオン交換分析カ
ラム（たとえばMono−Q HR 5／5，Pharmacia）を前駆体
を成熟タンパク質から分離できる条件下で使用して、反
応混合物サンプルのFPLC（高速タンパク質液クロマトグ
ラフィー）分析によって行われる。溶出液からタンパク
質が完全に消失するまでpH約8.0の緩衝液で溶出するこ
とによってカラムから反応混合物を回収する。不動化酵
素の使用は、成熟生成物の製造を簡略化させ、酵素又は
その自己溶解生成物及び他の動物性タンパク質による汚
染の可能性を最小とし、同一の支持体を繰返し使用する
こと及び所望時に前駆体の加水分解を停止することを可
能にする。
を、活性支持体を充填したカラムに供給して行われる。
タンパク質溶液のpHは6.0ないし9.0、好ましくは7.5な
いし8.5である。前駆体の濃度は、単位時間当たり最高
の生産率を提供するように選択される。一般に、前駆体
の濃度は2.0ないし30.0mg／mlである。反応を所望の変
化率の達成時点で停止できるように一定の間隔で変化率
をチェックする。このチェックは、アニオン交換分析カ
ラム（たとえばMono−Q HR 5／5，Pharmacia）を前駆体
を成熟タンパク質から分離できる条件下で使用して、反
応混合物サンプルのFPLC（高速タンパク質液クロマトグ
ラフィー）分析によって行われる。溶出液からタンパク
質が完全に消失するまでpH約8.0の緩衝液で溶出するこ
とによってカラムから反応混合物を回収する。不動化酵
素の使用は、成熟生成物の製造を簡略化させ、酵素又は
その自己溶解生成物及び他の動物性タンパク質による汚
染の可能性を最小とし、同一の支持体を繰返し使用する
こと及び所望時に前駆体の加水分解を停止することを可
能にする。
【０００７】下記の実施例は本発明を説明するためのも
のであって、本発明を限定するものではない。 実施例１ファクターXaの不動化 予めガラスフィルターロート（90−150μ）において1N
HCl １リットル及び0.1M NaHCO3 0.5リットルで洗浄したBrCNで
活性化されたSepharose CL−4B（Pharmacia）５gをガラ
ス容器（300ml）に導入した。ついで、この支持体に、
ファクターXa 53mgを含有する0.1M NaHCO3溶液100mlを
添加した。懸濁液を、撹拌下（200rpm)、室温（20−25
℃）に30分間、ついで４℃に一夜維持した。ついで、活
性支持体を、ガラスフィルターロート（90／150μ）に
おいて、0.1M NaHCO3 500mlで、さらに0.5M NaClを含有
するpH8.0の0.2M Tris-HCl 500mlで少なくとも２時間洗
浄して、支持体になお存在する反応基をブロックした。
さらにpH8.0の20mM Tris-HCl（0.1M NaCl含有）500mlに
よる洗浄を行い、使用時まで４℃に維持した。別法で
は、汚染の危険を回避するため、支持体を0.02％ NaN3
中に維持し、繰返し洗浄して使用した。
のであって、本発明を限定するものではない。 実施例１ファクターXaの不動化 予めガラスフィルターロート（90−150μ）において1N
HCl １リットル及び0.1M NaHCO3 0.5リットルで洗浄したBrCNで
活性化されたSepharose CL−4B（Pharmacia）５gをガラ
ス容器（300ml）に導入した。ついで、この支持体に、
ファクターXa 53mgを含有する0.1M NaHCO3溶液100mlを
添加した。懸濁液を、撹拌下（200rpm)、室温（20−25
℃）に30分間、ついで４℃に一夜維持した。ついで、活
性支持体を、ガラスフィルターロート（90／150μ）に
おいて、0.1M NaHCO3 500mlで、さらに0.5M NaClを含有
するpH8.0の0.2M Tris-HCl 500mlで少なくとも２時間洗
浄して、支持体になお存在する反応基をブロックした。
さらにpH8.0の20mM Tris-HCl（0.1M NaCl含有）500mlに
よる洗浄を行い、使用時まで４℃に維持した。別法で
は、汚染の危険を回避するため、支持体を0.02％ NaN3
中に維持し、繰返し洗浄して使用した。
【０００８】実施例２hGH前駆体の不動化ファクターXaによる加水分解 20mM Tris-HCl−0.1M NaCl緩衝液（pH8.0）中に可溶性
前駆体（配列番号：２） Met−Glu−Glu−Leu−Met−Ile−Glu−Gly−Arg−hGH ８mg／mlを含有する溶液80mlを、実施例１に記載の如く
して不動化したファクターXaを使用する酵素加水分解に
供した。不溶性ファクターXaを収容するカラム（1.6×1
8cm）に溶液を流量50ml／cm2で循環させた。負荷中及び
循環開始後、カラムの容量の75％に相当する量の溶出液
を取出し、カラム自体内での反応混合物の液による希釈
を回避した。ついで、該酵素反応を所望の時点で停止さ
せるため、達成された変化率を一定時間毎にチェックし
た。このチェックは、下記の操作条件下で分析カラムMo
no−Q HR 5／5（Pharmacia）を使用して、反応混合物サ
ンプルをFPLC（高速タンパク質液クロマトグラフィー）
分析することによって実施した。 操作条件： 流速＝２ml／分 緩衝液Ａ＝20mM Tris／アセテート＋10mM NaCl，pH7.0 緩衝液Ｂ＝20mM Tris／アセテート＋80mM NaCl，pH5.0 サンプルを負荷した後、緩衝液Ａ中の緩衝液Ｂの濃度０
から50％のグラディエント（20ml）をカラムに供給し
た。ついで、操作を定組成条件下で続け（20mlから24ml
まで)、なお定組成条件下で緩衝液Ｂ100％（24mlから27
mlまで）を供給した。ついで、緩衝液Ｂの割合を100％
から０％とし（27mlから29mlまで)、サイクルを停止さ
せ、緩衝液Ａ（29mlから36mlまで）によりカラムを再度
平衡化させた。この時点で、カラムについて次の新たな
サイクルの準備が完了した。この方法では、ホルモン及
び前駆体の両方を分離及び定量できる。所望の変化率が
達成された後、タンパク質が溶出液から完全に消失する
（BIORADキットで測定される）まで20mM Tris-HCl−0.1
M NaCl（pH8.0）で置換することによって反応混合物を
カラムから回収した。図２は循環物用容器（図１）から
各種の時点で取出したサンプルについて行った電気泳動
テストの結果を示す。図３はFPLCによって得られた相当
する溶離パターン（elutogram）を示す。これらの図か
ら見られるように、前駆体の成熟形ホルモンへの変化が
時間の経過に伴って観察される。支持体に不動化された
ファクターXaは、その活性の低下を示すことなく数回使
用さえる。
前駆体（配列番号：２） Met−Glu−Glu−Leu−Met−Ile−Glu−Gly−Arg−hGH ８mg／mlを含有する溶液80mlを、実施例１に記載の如く
して不動化したファクターXaを使用する酵素加水分解に
供した。不溶性ファクターXaを収容するカラム（1.6×1
8cm）に溶液を流量50ml／cm2で循環させた。負荷中及び
循環開始後、カラムの容量の75％に相当する量の溶出液
を取出し、カラム自体内での反応混合物の液による希釈
を回避した。ついで、該酵素反応を所望の時点で停止さ
せるため、達成された変化率を一定時間毎にチェックし
た。このチェックは、下記の操作条件下で分析カラムMo
no−Q HR 5／5（Pharmacia）を使用して、反応混合物サ
ンプルをFPLC（高速タンパク質液クロマトグラフィー）
分析することによって実施した。 操作条件： 流速＝２ml／分 緩衝液Ａ＝20mM Tris／アセテート＋10mM NaCl，pH7.0 緩衝液Ｂ＝20mM Tris／アセテート＋80mM NaCl，pH5.0 サンプルを負荷した後、緩衝液Ａ中の緩衝液Ｂの濃度０
から50％のグラディエント（20ml）をカラムに供給し
た。ついで、操作を定組成条件下で続け（20mlから24ml
まで)、なお定組成条件下で緩衝液Ｂ100％（24mlから27
mlまで）を供給した。ついで、緩衝液Ｂの割合を100％
から０％とし（27mlから29mlまで)、サイクルを停止さ
せ、緩衝液Ａ（29mlから36mlまで）によりカラムを再度
平衡化させた。この時点で、カラムについて次の新たな
サイクルの準備が完了した。この方法では、ホルモン及
び前駆体の両方を分離及び定量できる。所望の変化率が
達成された後、タンパク質が溶出液から完全に消失する
（BIORADキットで測定される）まで20mM Tris-HCl−0.1
M NaCl（pH8.0）で置換することによって反応混合物を
カラムから回収した。図２は循環物用容器（図１）から
各種の時点で取出したサンプルについて行った電気泳動
テストの結果を示す。図３はFPLCによって得られた相当
する溶離パターン（elutogram）を示す。これらの図か
ら見られるように、前駆体の成熟形ホルモンへの変化が
時間の経過に伴って観察される。支持体に不動化された
ファクターXaは、その活性の低下を示すことなく数回使
用さえる。
【０００９】実施例３ファクターＸの不動化及びファクターXaへの活性化 予めガラスフィルターロート（90−150μ）において1N
HCl １リットル及び0.1M NaHCO3 0.5リットルで洗浄したBrCNで
活性化されたSepharose CL−4B（Pharmacia）５gをガラ
ス容器（300ml）に導入した。ついで、この支持体に、
ファクターＸ 60mgを含有する0.1M NaHCO3溶液100mlを
添加した。この懸濁液を、撹拌下（200rpm)、室温（20
−25℃）に30分間、ついで４℃に一夜維持した。ファク
ターＸを不動化させた支持体を、ガラスフィルターロー
ト（90−150μ）において、0.1M NaHCO3 500mlで洗浄
し、つづいて0.2M Tris-HCl（pH8.0)−0.5M NaCl 500ml
で少なくとも２時間洗浄して、支持体になお存在する反
応基をブロックした。ついで、支持体を20mM Tris-HCl
（pH8.0)−0.1M NaCl 500mlで再び洗浄し、カラム（1.6
×18cm）に充填した。このカラムにおいて、20mM Tris-
HCl（pH8.0)＋１mM CaCl2中にRVV（２mg／ml）を含有す
る溶液を循環させることによってファクターＸを活性化
してファクターXaとした。室温で４時間循環させた後、
溶出液からタンパク質が消失するまで20mM Tris-HCl（p
H8.0)−0.5M NaClで繰返し洗浄した。このようにして得
られた支持体を、前記実施例２に記載の可溶性のhGH前
駆体の加水分解に使用した。得られた結果は、この固状
の不溶性支持体が融合タンパク質に対して活性であるこ
とを示し、ファクターＸからファクターXaへの活性化が
確認された。
HCl １リットル及び0.1M NaHCO3 0.5リットルで洗浄したBrCNで
活性化されたSepharose CL−4B（Pharmacia）５gをガラ
ス容器（300ml）に導入した。ついで、この支持体に、
ファクターＸ 60mgを含有する0.1M NaHCO3溶液100mlを
添加した。この懸濁液を、撹拌下（200rpm)、室温（20
−25℃）に30分間、ついで４℃に一夜維持した。ファク
ターＸを不動化させた支持体を、ガラスフィルターロー
ト（90−150μ）において、0.1M NaHCO3 500mlで洗浄
し、つづいて0.2M Tris-HCl（pH8.0)−0.5M NaCl 500ml
で少なくとも２時間洗浄して、支持体になお存在する反
応基をブロックした。ついで、支持体を20mM Tris-HCl
（pH8.0)−0.1M NaCl 500mlで再び洗浄し、カラム（1.6
×18cm）に充填した。このカラムにおいて、20mM Tris-
HCl（pH8.0)＋１mM CaCl2中にRVV（２mg／ml）を含有す
る溶液を循環させることによってファクターＸを活性化
してファクターXaとした。室温で４時間循環させた後、
溶出液からタンパク質が消失するまで20mM Tris-HCl（p
H8.0)−0.5M NaClで繰返し洗浄した。このようにして得
られた支持体を、前記実施例２に記載の可溶性のhGH前
駆体の加水分解に使用した。得られた結果は、この固状
の不溶性支持体が融合タンパク質に対して活性であるこ
とを示し、ファクターＸからファクターXaへの活性化が
確認された。
配列番号：１ 配列の型 ：アミノ酸 配列の長さ ：４ トロポロジー：直鎖状 配列の種類 ：ペプチド 配列の特徴 ：ファクターXaによって認識されるテトラ
ペプチド 配列 Ile Glu Gly Arg 配列番号：２ 配列の型 ：アミノ酸 配列の長さ ：９ トロポロジー：直鎖状 配列の種類 ：ペプチド 配列の特徴 ：hGHに溶解性を付与するペプチド
ペプチド 配列 Ile Glu Gly Arg 配列番号：２ 配列の型 ：アミノ酸 配列の長さ ：９ トロポロジー：直鎖状 配列の種類 ：ペプチド 配列の特徴 ：hGHに溶解性を付与するペプチド
【図１】固状の不溶性支持体に不動化したファクターXa
での前駆体の加水分解によりhGHを製造する装置の概略
図である。
での前駆体の加水分解によりhGHを製造する装置の概略
図である。
【図２】前駆体からhGHへの加水分解の間に各種時間で
循環物用容器から取出したサンプルについて行った電気
泳動の結果を示す図である。
循環物用容器から取出したサンプルについて行った電気
泳動の結果を示す図である。
【図３】図２に示す反応混合物サンプルについて行った
FPLCの溶離パターンを示す図である。
FPLCの溶離パターンを示す図である。
フロントページの続き (73)特許権者 501474461 ＬＩＮＤＨＡＧＥＮＳＧＡＴＡＮ 133, ＳＥ−112 76 ＳＴＯＣＫＨＯＬＭ, ＳＷＥＤＥＮ (56)参考文献 特開 平２−2386（ＪＰ，Ａ) 特開 昭64−2583（ＪＰ，Ａ) 特開 平１−235598（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12P 21/00 - 21/06 C12N 11/10 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (8)
- 【請求項１】１位にMetを、及び成熟ポリペプチドの第
１の残基の前に、ファクターＸａによって認識されるテ
トラペプチド Ile−Glu−Gly−Arg を有する可溶性のポリペプチド前駆体をファクターＸａ
で酵素加水分解することからなる成熟ポリペプチドの製
法において、該酵素加水分解を、固状の不溶性支持体に
不動化させたファクターＸａを使用して行うことを特徴
とする、成熟ポリペプチドの製法。 - 【請求項２】成熟ポリペプチドが、ヒト成長ホルモン、
インターフェロン又はインターロイキンである、請求項
１記載の成熟ポリペプチドの製法。 - 【請求項３】固状の不溶性支持体が、天然高分子（変性
されていてもよい）、合成高分子又は無機支持体の中か
ら選ばれるものである、請求項１記載の成熟ポリペプチ
ドの製法。 - 【請求項４】固状の不溶性支持体が、変性させた天然高
分子支持体である、請求項３記載の成熟ポリペプチドの
製法。 - 【請求項５】固状の不溶性支持体が、BrCNで活性化させ
たSepharose CL-4Bである、請求項４記載の成熟ポリペ
プチドの製法。 - 【請求項６】ファクターＸａを、該ファクターの反応基
と固状の不溶性支持体の反応基との間の共有結合により
固状の不溶性支持体に不動化させる、請求項１記載の成
熟ポリペプチドの製法。 - 【請求項７】ファクターＸａを、１以上のアミノ基と固
状の不溶性支持体に存在する環状イミドカーボネートと
の間の反応によって不動化させる、請求項５記載の成熟
ポリペプチドの製法。 - 【請求項８】ファクターＸを固状の不溶性支持体に不動
化させ、つづいてＣａ２＋イオンの存在下、前記ファク
ターＸをラッセルクサリヘビの毒（RVV）で活性化して
ファクターＸａとすることによって得られた不動化ファ
クターＸａを使用する、請求項１記載の成熟ポリペプチ
ドの製法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| ITMI910861A IT1245385B (it) | 1991-03-28 | 1991-03-28 | Procedimento migliorato per la preparazione di polipeptidi maturi |
| IT91A000861 | 1991-03-28 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH05276980A JPH05276980A (ja) | 1993-10-26 |
| JP3277200B2 true JP3277200B2 (ja) | 2002-04-22 |
Family
ID=11359331
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP10018992A Expired - Fee Related JP3277200B2 (ja) | 1991-03-28 | 1992-03-27 | 成熟ポリペプチドの製法 |
Country Status (9)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5869278A (ja) |
| EP (1) | EP0505921B1 (ja) |
| JP (1) | JP3277200B2 (ja) |
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| DE (1) | DE69219658T2 (ja) |
| DK (1) | DK0505921T3 (ja) |
| ES (1) | ES2103846T3 (ja) |
| GR (1) | GR3024296T3 (ja) |
| IT (1) | IT1245385B (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101664856B (zh) * | 2009-08-21 | 2013-05-22 | 深圳翠涛自动化设备股份有限公司 | 一种带传感器的旋转轴限位装置 |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| PL213309B1 (pl) | 2006-02-09 | 2013-02-28 | Polska Akademia Nauk Inst Biochemii I Biofizyki | Sposób hydrolizy wiazania peptydowego |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4713449A (en) * | 1985-08-06 | 1987-12-15 | Getty Scientific Development Company | Polysaccharide polymer made by xanthomonas |
| IT1223577B (it) * | 1987-12-22 | 1990-09-19 | Eniricerche Spa | Procedimento migliorato per la preparazione dell'ormone della crescita umano naturale in forma pura |
| ES2062759T3 (es) * | 1990-01-24 | 1994-12-16 | Upjohn Co | Procedimiento de purificacion de polipeptidos recombinantes. |
-
1991
- 1991-03-28 IT ITMI910861A patent/IT1245385B/it active IP Right Grant
-
1992
- 1992-03-19 EP EP92104753A patent/EP0505921B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1992-03-19 DK DK92104753.6T patent/DK0505921T3/da active
- 1992-03-19 DE DE69219658T patent/DE69219658T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1992-03-19 ES ES92104753T patent/ES2103846T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1992-03-19 AT AT92104753T patent/ATE153070T1/de not_active IP Right Cessation
- 1992-03-27 JP JP10018992A patent/JP3277200B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
1994
- 1994-02-28 US US08/203,662 patent/US5869278A/en not_active Expired - Fee Related
-
1997
- 1997-07-30 GR GR970401945T patent/GR3024296T3/el unknown
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101664856B (zh) * | 2009-08-21 | 2013-05-22 | 深圳翠涛自动化设备股份有限公司 | 一种带传感器的旋转轴限位装置 |
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| DE69219658D1 (de) | 1997-06-19 |
| JPH05276980A (ja) | 1993-10-26 |
| GR3024296T3 (en) | 1997-10-31 |
| EP0505921A2 (en) | 1992-09-30 |
| EP0505921B1 (en) | 1997-05-14 |
| ATE153070T1 (de) | 1997-05-15 |
| DE69219658T2 (de) | 1997-10-02 |
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| ES2103846T3 (es) | 1997-10-01 |
| DK0505921T3 (da) | 1997-11-03 |
| US5869278A (en) | 1999-02-09 |
| ITMI910861A1 (it) | 1992-09-28 |
| IT1245385B (it) | 1994-09-20 |
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