JP3276092B2 - 免疫学的凝集反応試薬及びその担体 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】本発明は、免疫学的凝集反応試薬用担体の
製造方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】臨床検査の分野では、近年種々の疾患を
血液学的に診断することが重要視されている。そして、
この診断のためには、検体中の抗原あるいは抗体を正
確、迅速且つ簡便に定量することがきわめて重要な課題
となっている。そこで、抗原（あるいは抗体）を不溶性
担体に感作して得られる感作粒子を使用して抗体（ある
いは抗原）を検出する方法、いわゆる免疫学的凝集反応
を利用する方法が、操作が簡単で迅速に結果を得られる
ことから臨床検査や研究分野で広く用いられている。

【０００３】上記の免疫学的凝集反応は検出法により分
類されるのが普通である。具体的には、ガラス板上の担
体の凝集を肉眼で検出するラテックス凝集反応法、反応
容器中の担体の凝集を溶液の吸光度の変化で検出するラ
テックス比濁法、反応容器中の担体の凝集を反応容器底
面の凝集像として肉眼で検出する管底凝集法（マイクロ
タイター法ともいう）などに分けられる。

【０００４】上記の免疫学的凝集反応試薬に用いる担体
としては、ラテックス、カオリン、炭末、有機無機複合
粒子などの非生物学的粒子、動物赤血球、細菌菌体など
の生物学的粒子等が用いられる。又、担体の分散媒とし
ては、ポリエチレングリコール、糖などの非生物学的溶
質、動物血清、菌体破砕物などの生物学的溶質等が用い
られる。更に、担体に担持される免疫反応物質として種
々の抗原、抗体も種々の物が使用される。

【０００５】これらを適宜選択して組み合わせることに
より、免疫学的凝集反応試薬は調製されるが、これらの
試薬の構成成分中最も重要なのは免疫反応物質である。
次に重要な要素は、これらの免疫反応物質を担持する担
体であり、それに求められる特性は、免疫反応物質の強
固な担持、免疫学的凝集反応時の鋭敏性（以下感度とい
う）、免疫学的凝集が起こっていないときの分散性（以
下特異性という）である。

【０００６】本発明者らは、免疫学的凝集反応試薬用の
担体について鋭意研究を行ってきた結果、平均粒子径が
０．５〜１０．０μｍで単粒子性が８０％であり、且つ
染料を含んでなる無機化合物が良好な担体となることを
見出しすでに提案した（特願昭６１−２７６８４３
号）。しかしながら、これらの担体では、感度が高くな
ると特異性が低下するため、高感度な試薬調製が困難と
いう欠点があった。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】しかしながら、医療技
術の高度化に伴い診断用試薬、特に免疫学的凝集反応試
薬の高感度化が望まれてきた。

【０００８】

【課題を解決するための手段】本発明者等は、上記課題
を解決するために鋭意研究を重ねた結果、無機化合物担
体粒子を、特定基により特定量修飾することにより高感
度な免疫学的凝集反応試薬が製造できることを見出し、
さらに研究を続け、本発明を完成しここに提案するに至
った。

【０００９】即ち、本発明は、無機化合物担体粒子に、
メルカプト基を有し、該無機化合物担体粒子の表面反応
基と反応するカップリング剤を反応させて、該担体粒子
１ｇあたり０．０１〜０．１μｍｏｌの量のメルカプト
基を固定することを特徴とする免疫学的凝集反応試薬用
担体の製造方法である。

【００１０】本発明で使用される無機化合物担体粒子を
構成する無機化合物としては、公知のものを限定なく用
いることができる。この無機化合物を例示すると、シリ
カ、アルミナ、チタニア、ジルコニア、酸化第二鉄、四
三酸化鉄、酸化コバルト、酸化ニッケル等の周期律表第
３族、第４属又は第８属の金属又は半金属の酸化物；水
酸化アルミニウム、水酸化第二鉄、水酸化クロム等の水
酸化物；臭化銀、塩化銀等のハロゲン化物；硫化カドミ
ウム等の硫化物；炭酸カルシウム、炭酸マグネシウム等
の炭酸塩；硫酸バリウム、硫酸ストロンチウム等の硫酸
塩などが挙げられる。

【００１１】これらの無機化合物を担体粒子に調製する
方法は公知の方法を限定なく用いることができる。例え
ば、ゾルゲル法、粉砕法、マイクロカプセル法、噴霧法
等が挙げられる。特に、無機化合物担体粒子の粒子径を
特定の値に容易に制御することができるゾルゲル法を採
用するのが好ましい。

【００１２】このような観点から、シリカ、アルミナ、
チタニア等を主な構成成分とする無機化合物、あるいは
シリカと結合可能な周期律表第I族、第II族、第III属お
よび第IV族からなる群より選ばれた少なくとも１種の金
属およびシリカを主な構成成分とする無機化合物は、ゾ
ルゲル法により粒子径を容易に制御して製造できるので
特に好適である。

【００１３】本発明で使用される無機化合物担体粒子の
形態については、粒子径は通常０．１〜５０．０μｍの
ものが用いられるが、好ましくは０．５〜１０．０μｍ
のものを用いると凝集像が明確となるため好ましい。ま
た単粒子性は通常６０％以上のものが用いられるが、好
ましくは８０％以上のものを用いると凝集像が明確とな
るため好ましい。

【００１４】さらに本発明で使用される無機化合物担体
粒子に着色を施すと免疫学的凝集試薬に用いたときに屈
折率が高く凝集像が鮮明になり好適である。この無機化
合物担体粒子に着色する方法は公知の方法を限定なく用
いることができる。例えば、染料を溶解した溶液中に無
機化合物担体粒子を浸漬する方法、あるいは無機化合物
の合成時に合成反応液中に染料を溶解させておき、無機
化合物担体粒子の成長とともに染料を含有させる方法等
が挙げられる。本発明においては、無機化合物中に含ま
れる染料の溶出を低く抑えるために後者の方法を採用す
るのが好ましい。

【００１５】この着色に用いる染料は公知のものを限定
なく用いることができる。例えば、カチオン染料、分散
染料、直接染料、酸性染料、含金属染料、反応染料、蛍
光増白染料等の染料を挙げることができる。これらの染
料の内、含金属染料、カチオン染料が染料の無機化合物
担体粒子よりの溶出が少ないため好適に用いられる。

【００１６】本発明の製造方法では、次の方法により無
機化合物担体粒子に特定量のメルカプト基を固定する。

【００１７】即ち、無機化合物担体粒子に、メルカプト
基を有し、該無機化合物担体粒子の表面反応基と反応す
るカップリング剤を反応させて固定する方法である。

【００１８】この方法は、無機化合物担体粒子とメルカ
プト基を有する化合物との結合が強固となり調製が容易
なため好ましい。

【００１９】このメルカプト基を持つカップリング剤
は、分子内にメルカプト基または乖離することによって
メルカプト基となる官能基を１個以上持っていれば、公
知のものを限定なく用いることができる。これらのカッ
プリング剤は固定される無機化合物担体粒子に合わせ、
シリコーン系カップリング剤、チタン系カップリング
剤、アルミネート系カップリング剤、ジルコアルミネー
ト化合物等の既知のものが適宜選択される。

【００２０】以下にシリカを主な構成成分とする無機化
合物担体粒子をシリコーン系カップリング剤で処理して
粒子にメルカプト基を固定する場合について具体的に説
明する。

【００２１】無機化合物担体粒子とメルカプト基を持つ
シリコーン系カップリング剤を溶媒中で中性下又はアル
カリ性下で加水分解することによってカップリング反応
を行い無機化合物担体粒子にメルカプト基を固定する方
法が好適に採用される。

【００２２】メルカプト基を持つシリコーン系カップリ
ング剤としては、加水分解によって前記のカップリング
反応が起こり得るもので有れば制限なく採用される。例
えば、（メルカプトメチル）ジメチルジエトキシシラ
ン、（メルカプトメチル）メチルジエトキシシラン、３
ーメルカプトプロピルメチルジメトキシシラン、３ーメ
ルカプトプロピルトリメトキシシラン、３ーメルカプト
プロピルトリエトキシシラン、ビス［３ー（トリエトキ
シシリル）プロピル］テトラスルフィド等のメルカプト
基を持つ、又は乖離してメルカプト基となる官能基を持
つシリコーン系カップリング剤を挙げることができる。

【００２３】カップリング反応の条件は、アンモニア、
水酸化アルカリ等を存在させたアルカリ性下で行うこと
が、最終的に得られるメルカプト基を固定した無機化合
物担体粒子の分散性が良好なため好ましい。

【００２４】カップリング反応を行う溶媒は前記の加水
分解が起こり得るもので有れば制限なく採用される。例
えば、メタノール、イソプロピルアルコール、イソブチ
ルアルコール等である。

【００２５】無機化合物担体粒子とカップリング剤とを
反応させるときの混合方法は、特に制限されるものでは
ないが、メルカプト基の固定を均一に行うため、無機化
合物担体粒子をカップリング反応を行う溶媒に分散して
おき、同じくカップリング剤をカップリング反応を行う
溶媒に分散したものを適々添加する方法が最適である。
カップリング反応終了後は溶媒を揮発させて処理を完
了させても良いし（乾式法）、反応時間を長くとり十分
に反応させた後洗浄溶媒による洗浄工程を経て余剰のカ
ップリング剤を除いて処理を完了させても良い（湿式
法）。

【００２６】本発明においては後者の湿式法が最終的に
得られるメルカプト基を固定した無機化合物担体粒子が
凝集せず分散性が良好なため好ましい。

【００２７】湿式法のときのカップリング剤の処理条件
は無機化合物担体粒子濃度については通常０．１％〜４
０重量％であるが、メルカプト基の固定を均一に行うた
め、１〜７重量％とするのが好ましい。処理温度は加水
分解を行う溶媒の凝固点から沸点までの温度内であれば
特に限定されないが、反応時に添加するアンモニア、水
酸化アルカリ等の凝固点、沸点と加水分解反応速度から
通常２℃〜４０℃であるが、特に７℃〜２０℃が良好で
ある。処理時間は、通常１時間〜５６時間であるが、カ
ップリング反応の速度から４〜２０時間とするのが好ま
しい。また洗浄に用いる溶媒は、メルカプト基を固定し
た無機化合物担体粒子が単分散する溶媒であれば制限な
く使用できるが、カップリング剤の溶解性よりカップリ
ング反応に用いた溶媒を用いるのが好適である。

【００２８】メルカプト基を固定した無機化合物担体粒
子の確認及び固定されたメルカプト基の定量は次の方法
によって行うことが出来る。メルカプチド生成反応によ
る定量、アルキル化又は二重結合への付加反応による定
量、メルカプト基とジスルフィド結合の交換反応による
定量、放射化学的定量等の公知の方法が採用されるが、
特にメルカプト基とジスルフィド結合の交換反応による
定量法が簡便である。以下この交換反応法による定量法
について詳しく説明する。

【００２９】メルカプト基とジスルフィド結合の交換反
応による定量に用いらる試薬としては、５，５’ージチ
オビス（２ーニトロ安息香酸）、２，２’ージチオピリ
ジン、２ーチオピリドン、４，４’ージチオピリジン、
４ーチオピリドン、６，６’ージチオニコチン酸、６ー
メルカプトニコチン酸等の公知の試薬を制限なく使用で
きる。このうち５，５’ージチオビス（２ーニトロ安息
香酸）が定量の再現性が良好である。

【００３０】この試薬による定量を行う時の反応溶媒
は、トリス塩酸緩衝液、リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液
等が用いられ、これらの緩衝液のｐＨは７〜８で使用さ
れる。

【００３１】これらの試薬を用いてメルカプト基を固定
した無機化合物担体粒子のメルカプト基の定量を行うと
きには、メルカプト基がジスルフィド結合していては測
定が困難なため、ジスルフィド結合を還元する必要があ
る。この還元を行う方法としては、チオールによる方
法、電解による方法、ナトリウムボロヒドリドによる方
法、亜硫酸塩による方法等が挙げられるが、チオールを
用いる方法が簡便である。このチオールを用いる方法に
採用されるチオールとしては、２ーメルカプトエタノー
ル、チオグリコール酸、２ーメルカプトエチルアミン、
ベンゼンチオールーパラチオクレゾール、ジチオスレイ
トール等が挙げられるが、ジチオスレイトールが還元反
応の平衡定数が高いため良好である。

【００３２】ジチオスレイトールによるメルカプト基の
還元を行う時の反応溶媒は、トリス塩酸緩衝液、リン酸
緩衝液、クエン酸緩衝液等が用いられる。これらの緩衝
液のｐＨは７〜８が還元に用いるチオールのｐｋから選
択される。還元を行う時のチオールの反応量はカップリ
ング反応に用いた処理剤のモル数と回収率を勘案して適
宜選択される。

【００３３】上記反応を行うときの容器は、密閉できる
容器を用い、反応時には窒素等の不活性ガスで封入する
必要がある。この反応時の反応温度は２５℃が反応を速
やかに進行させるために好ましい。このときの反応時間
は、１時間以上が定量の再現性を高めるために望まし
い。

【００３４】還元反応が終了した後の余剰のチオールの
除去には、メルカプト基を固定した無機化合物担体粒子
を遠心し、その上清を捨て、定量を行う溶媒にて洗浄す
る方法が簡便である。この洗浄時の遠心力は、無機化合
物担体粒子が定量を行う溶媒中で沈降するように調整す
る必要がある。また洗浄回数は、５回以上行うことが定
量の再現性を高めるために望ましい。この洗浄に用いら
れる溶媒は測定に用いる溶媒と同じことが、定量の再現
性が良好なため好ましい。

【００３５】前述の固定化方法にて無機化合物担体粒子
に固定されたメルカプト基量は、担体１ｇあたり０．０
１〜０．１μｍｏｌである。このメルカプト基量におい
て、担体としての感度と特異性の両方の性能が高くな
る。さらに好ましくは０．０２〜０．０７μｍｏｌが担
体の特異性性能がより高くなるため好ましい。

【００３６】無機化合物担体粒子にメルカプト基を固定
した担体に感作する物質としては免疫学的凝集反応を起
こすものであればよく、該物質として抗原及び抗体が挙
げられる。

【００３７】抗原は、抗体を産生させて、体液性免疫や
細胞性免疫を誘発する物質であれば特に制限されず、例
えば蛋白質、糖蛋白質、脂質蛋白質、脂質、核酸等が挙
げられる。

【００３８】抗体は、抗原と特異的に結合する活性を持
つものであれば特に制限されずＩｇＧ，ＩｇＭ，Ｉｇ
Ａ，ＩｇＤ，ＩｇＥ等が挙げられる。

【００３９】本発明において、まず上記した担体に抗原
又は抗体の感作を行って感作粒子を得る。

【００４０】抗原又は抗体を担体に感作する方法は、公
知の方法を限定なく採用しうる。代表的な方法を例示す
れば、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、グリシン緩衝液等
の緩衝液中に前記担体と、該担体１ｇ当り０．０１〜５
０ｍｇの抗原あるいは抗体とを配合して感作する方法等
が挙げられる。この抗原又は抗体の感作を行う時間は、
通常１時間以上である。また、感作温度は、通常４〜５
６℃であり、好ましくは室温である。

【００４１】感作後、上記緩衝液で洗浄し、次いで分散
媒と混合して免疫学的凝集反応試薬とする。かかる感作
粒子の分散媒としては、一般に、蒸留水、超純水、生理
食塩水や、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、グリシン緩衝
液等のｐＨ３〜９の緩衝液を用いる。このうち、ｐＨ３
〜９の緩衝液が、抗原抗体反応が速やかに進行しうるの
で好ましい。

【００４２】免疫学的凝集反応試薬中の感作粒子の濃度
は特に限定されないが、０．１〜１重量％とすると凝集
が鮮明となり、充分な検出感度を得ることができるため
に好ましい。

【００４３】又、免疫学的凝集反応試薬中には、凝集促
進や検体中の目的外の共存物質の影響を防ぐために、塩
化ナトリウム、塩化カルシウム、アジ化ナトリウム、グ
ルタミン酸ナトリウム等の塩類、ポリエチレングリコー
ル、フルクトース、サッカロース等の糖類などの非生物
学的添加物、ヤギ血清、ウサギ血清、牛血アルブミン、
スキムミルク、ゼラチン、菌体破砕物などの生物学的添
加物を通常含有させる。

【００４４】上記の免疫学的凝集反応試薬の感度と特異
性の測定方法は、公知の方法を限定なく採用しうる。例
えば、反応試薬２５μｌと、担体に感作した抗原又は抗
体に相対するところの種々の既知濃度の抗原又は抗体を
含む陽性標準検体２５μｌをガラス板上で混合し攪拌を
行い、凝集程度を目視にて判定し、明確な凝集を示す最
小の濃度をもって感度とし、陰性標準検体に対する凝集
の程度を目視にて判定し特異性とする方法（スライドラ
テックス凝集法）、感作粒子液１００μｌと担体に感作
した抗原又は抗体に相対するところの種々の既知濃度の
抗原又は抗体を含む標準検体１μｌと検体希釈液９９μ
ｌをガラスセル内で混合し攪拌を行い、凝集程度を吸光
度にて判定し、明確な凝集を示す最小の濃度をもって感
度とし、陰性標準検体に対する凝集の程度を吸光度にて
判定し特異性とする方法（ラテックス凝集法）、感作粒
子液と担体に感作した抗原又は抗体に相対するところの
種々の既知濃度の抗原又は抗体１０μｌに検体希釈液１
０μｌ以上を加え攪拌した検体液とする、この感作粒子
液２５μｌと検体液２５μｌをマイクロプレート内で混
合し攪拌を行い、凝集程度を目視にて判定し、明確な凝
集を示す最小の濃度を持って感度とし、陰性標準検体に
対する凝集の程度を目視にて判定し特異性とする法（マ
イクロタイター法）等が挙げられる。

【００４５】これらの測定法の操作条件としては、感作
粒子液と検体の攪拌時間は５秒以上必要であり、攪拌後
の反応時間は１０分以上、反応時の温度は通常、室温が
採用される。

【００４６】

【発明の効果】本発明の製造方法により得られる担体
は、従来の担体より特異性が高く、しかもより高感度な
免疫学的凝集反応試薬を調製することが可能になる。

【００４７】その理由は明確ではないが、担体を用いた
凝集反応試薬においては、試薬の反応の強さを抗原抗体
反応による凝集力と抗原又は抗体を担持した担体相互の
反発力で反応をコントロールするが、抗原又は抗体を担
持した担体間の反発力が担体に固定された官能基の性質
によって影響されているため、また抗原や抗体が担体に
担持された場合に、近傍のメルカプト基の存在によって
その構造が保たれるためと考えられる。

【００４８】

【実施例】本発明を以下に示す実施例により具体的に説
明するが、本発明は、その実施例により何ら限定される
ものではない。

【００４９】実施例１ (1)メルカプト基を固定してなる無機化合物担体粒子の
合成 染料を含有したシリカ粒子の合成 攪拌機付きガラス製フラスコ中にメタノール２８００ｍ
ｌ、２５重量％アンモニア水６１６ｍｌ、５ｍｏｌ／ｌ
水酸化ナトリウム水溶液２１ｍｌを加え１０℃に保った
後に、メタノールに２２重量％になるようにテトラエチ
ルシリケートを加えた溶液２５６ｍｌを２５．５ｍｌ／
ｈｒの速度で適々滴下してシリカ粒子を作った。このシ
リカ粒子を含む反応液中にさらにメタノールに４４重量
％になるようにテトラエチルシリケートを加えた溶液６
２４ｍｌとメタノールに１．２５重量％になるようにダ
イアクリルレッドＭＳ−Ｎ（三菱化成（株）製）を加え
た溶液４００ｍｌを同時に２５．５ｍｌ／ｈｒの速度で
適々滴下し、滴下終了後１６時間反応させた。これを大
量のメタノールでデカンテーションによる精製と洗浄を
繰り返して染料を含有したシリカ粒子（平均粒子径１．
７５μｍ、単粒子性９５．２％）を合成した。

【００５０】無機化合物担体粒子へのメルカプト基の
固定 攪拌機付き、ガラス製フラスコを２０℃に保温したもの
に、染料を含有した上記シリカ粒子１ｇとメタノール３
２ｍｌと２５重量％アンモニア水８ｍｌを加えよく混合
し、メタノール１ｍｌに表１に示す各種メルカプト基を
持つシリコーン系カップリング剤２００μｍｏｌを加え
たものを滴下速度６０ｍｌ／ｈで滴下し１６時間反応さ
せた。これを１７００ｇで３分間遠心し上清を除去した
後、メタノール４０ｍｌをくわえて分散させさらに１７
００ｇで３分間遠心し上清を除去した後、０．９重量％
の塩化ナトリウムを含む１５ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ
７．２）に１％になるように分散させメルカプト基を固
定してなる無機化合物担体粒子を得た。

【００５１】なお以下の実施例におけるメルカプト基の
定量は以下の方法にて行った。

【００５２】(i)ブランクの吸光度（Ｃ０）の測定 メルカプト基を固定化していない担体が０．０１Ｍリン
酸緩衝液（ｐＨ８）に１０重量％になるように分散させ
た担体分散液１０ｍｌにジチオスレイトール１５４．２
５ｍｇを０．０１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ８）１ｍｌに溶
かしたものを１００μｌ加え良く攪拌した後、密閉でき
る容器に入れ窒素封入して２５℃で１時間放置する。こ
れを１７００Ｇにて３分間遠心し、その上清を捨て、
０．０１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ８）を２０ｍｌ加えて良
く攪拌する。さらに１７００Ｇにて３分間遠心し、その
上清を捨て、０．０１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ８）を２０
ｍｌ加えて良く攪拌する操作を３回繰り返す。その後、
これを１７００Ｇにて３分間遠心し、その上清を捨て、
０．０１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ８）を１０ｍｌ加えて良
く攪拌する。これに５、５’ージチオビス（２ーニトロ
安息香酸）３９.６ｍｇを０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ
７）１０ｍｌに溶かした反応試液０．６７ｍｌを添加混
合し、２５℃で２分間放置後、１７００Ｇにて３分間遠
心し、その上清４ｍｌを採取、分光分析機にて４１２ｎ
ｍの吸光度（Ｃ０）を測定した。

【００５３】(ii)サンプルの吸光度（Ａ）測定 メルカプト基を固定化している担体をメルカプト基を固
定化していない担体の代わりに０．０１Ｍリン酸緩衝液
（ｐＨ８）に１０重量％になるように分散させた分散液
を試料として上記に準じて測定した（Ａ）。

【００５４】(iii)標準試料の吸光度（Ｃ１）の測定 メルカプト基を固定化していない担体が０．０１Ｍリン
酸緩衝液（ｐＨ８）に１０重量％になるように分散させ
た担体分散液１０ｍｌにジチオスレイトール１５４．２
５ｍｇを０．０１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ８）１ｍｌに溶
かしたものを１００μｌ加え良く攪拌した後、密閉でき
る容器に入れ窒素封入して２５℃で１時間放置する。こ
れを１７００Ｇにて３分間遠心し、その上清を捨て、
０．０１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ８）を２０ｍｌ加えて良
く攪拌する。さらに１７００Ｇにて３分間遠心し、その
上清を捨て、０．０１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ８）を２０
ｍｌ加えて良く攪拌する操作を３回繰り返す。その後、
これを１７００Ｇにて３分間遠心し、その上清を捨て、
０．０１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ８）にメルカプトを分子
内に１個だけ持った化合物を０．１μｍｏｌの濃度にな
るように溶かしたもの１０ｍｌ加えて良く攪拌する。こ
れに５，５’ージチオビス（２ーニトロ安息香酸）３
９.６ｍｇを０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７）１０ｍｌ
に溶かした反応試液０．６７ｍｌを混ぜ合わせ、２５℃
で２分間放置後、１７００Ｇにて３分間遠心し、その上
清４ｍｌを採取し、分光分析機にて４１２ｎｍの吸光度
（Ｃ１）を測定した。

【００５５】得られた各値から次式を用いメルカプト基
の結合量を求めた。結果を表１に示す。

【００５６】

【数１】

【００５７】(2)免疫学的凝集反応試薬の調製 トレポネーマ・パリダム１×１０⁹個を５０ｍｌの０．
１Ｍ塩化ナトリウム水溶液に分散させたものを超音波破
砕機により２００Ｗ３０分処理したもの１ｍｌとメルカ
プト基を固定してなる無機化合物担体粒子を０．９重量
％の塩化ナトリウムを含む１５ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ
７．２）に１％になるように分散させたものを攪拌しな
がら１時間混合した。ついで１７００ｇで３分間遠心し
上清を除去した後、０．０５重量％アジ化ナトリウム、
０．５重量％ウサギ血清、０．９重量％の塩化ナトリウ
ムを含む１５ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）に０．５
重量％になるように分散させ感作粒子液を調製した。次
に０．５重量％ウサギ血清、０．０５重量％アジ化ナト
リウム、０．５重量％の塩化ナトリウムを含む１５ｍＭ
リン酸緩衝液（ｐＨ７．２）からなる検体希釈液を調製
した。これら感作粒子液と検体希釈液より成る抗トレポ
ネーマ・パリダム抗体免疫学的凝集反応試薬を調製し
た。

【００５８】(3)免疫学的凝集反応試薬の感度と特異性
の検定（マイクロタイター法） この免疫学的凝集反応試薬の感度と特異性を以下に示す
ように測定した。他法で感度を検定した感度１２８０の
検体（標準検体）を検体希釈液で２倍連続希釈して検体
とした。次に感作粒子液２５μｌと検体２５μｌを室温
でマイクロプレート上にて混合し、１分間攪拌を行なっ
た後、３０分静置し凝集程度を肉眼にて判定した。

【００５９】感度は明確な凝集像を示す最小の検体の最
終的な希釈倍率の逆数で表した。

【００６０】特異性は、明確な凝集像を示す最小の次の
希釈倍率の管底像を目視で以下の五段階評価して求め
た。

【００６１】５点：粒子がスポット状に集まり外周部が
透明になる ４点：粒子はスポット状に集るが外周部にも粒子が存在
している ３点：粒子はボタン状になり外周部に粒子が存在してい
る ２点：粒子はリング状になり外周部に多くの粒子が存在
している １点：粒子は中央に集まらず管底に広がる。

【００６２】結果を表１に示す。

【００６３】

【表１】

【００６４】この結果より、無機化合物担体粒子上に担
体１ｇあたり０．０１〜０．１μｍｏｌのメルカプト基
をもつ化合物を固定してなる免疫学的凝集反応試薬試薬
用の担体を用いることにより感度、特異性が特に共に優
れる試薬が調製されることが判明した。

【００６５】比較例１ 実施例１で、(1)メルカプト基を固定してなる無機化合
物担体粒子の合成を行うときメルカプト基を持つシリコ
ーン系カップリング剤に代えてメルカプト基を有しない
シリコーン系カップリング剤を用いた、あるいはカップ
リング剤を使用しなかった以外はすべて同様に行った。
結果を表２に示す。

【００６６】

【表２】

【００６７】この結果より、無機化合物担体粒子上にメ
ルカプト基をもたない化合物を固定してなる免疫学的凝
集反応試薬試薬用担体及び無処理担体を用いると感度お
よび／または特異性が劣る試薬となる。

【００６８】実施例２ 実施例１で、(1)メルカプト基を固定してなる無機化合
物担体粒子の合成を行うときシリカに代えて表３に示す
無機化合物担体粒子用いる以外はすべて同様に行った。

【００６９】尚、アルミナは以下のようにして調製し
た。

【００７０】攪拌機付きガラス製フラスコ中にイソプロ
ピルアルコール２８００ｍｌを加え１０℃に保った後
に、イソプロピルアルコールに２０重量％になるように
トリ−ＳＥＣ−ブチルアルミネートを加えた溶液２８０
ｍｌを２２．５ｍｌ／ｈｒの速度で適々滴下してアルミ
ナ粒子を作った。

【００７１】このアルミナ粒子を含む反応液中にさらに
イソプロピルアルコールに４０重量％になるようにトリ
−ＳＥＣ−ブチルアルミネートを加えた溶液６２４ｍｌ
とイソプロピルアルコール１．２５重量％になるように
ダイアクリルレッドＭＳ−Ｎ（三菱化成（株）製）を加
えた溶液４５０ｍｌを同時に２２．５ｍｌ／ｈｒの速度
で適々滴下し、滴下終了後１６時間反応させた。これを
大量のイソプロピルアルコールでデカンテーションによ
る精製と洗浄を繰り返して染料を含有したアルミナ粒子
（平均粒子径１．７１μｍ、単粒子性９０．５％）を合
成した。

【００７２】さらに、チタニア（平均粒子径１．４２μ
ｍ、単粒子性９５．４％）は原料をテトラ−ｎ−ブチル
チタネートを用いて、ジルコニア（平均粒子径１．１２
μｍ、単粒子性９３．２％）は原料にテトラーｎーブチ
ルジルコネートをもちいて上述のアルミナと同じように
して調製した。

【００７３】結果を表３に示す。

【００７４】

【表３】

【００７５】この結果より、シリカ以外の無機化合物担
体粒子もメルカプト基を固定すると感度と特異性に優れ
る試薬となることがわかる。

【００７６】実施例３ 実施例１で、(3)免疫学的凝集反応試薬の感度と特異性
の検定を以下の方法（スライドラテックス凝集法）に代
えた以外はすべて同様に行った。

【００７７】この免疫学的凝集反応試薬の感度と特異性
を以下に示すように測定した。他法で感度を検定した感
度１２８０の検体（標準検体）を検体希釈液で２倍連続
希釈して検体とした。次に感作粒子液５０μｌと各濃度
の検体５０μｌを室温で容量７５０μｌを穴のあるガラ
ス板に滴下し回転半径１５ｃｍ、２５０ｒｐｍ、５分間
攪拌を行なった後、凝集程度を目視にて判定した。

【００７８】感度は明確な凝集像を示す最小の検体の最
終的な希釈倍率の逆数で表した。

【００７９】特異性は、明確な凝集像を示す最小の次の
希釈倍率の管底像を目視で以下の五段階評価して求め
た。

【００８０】５点：粒子が均一に浮遊している ４点：一部の粒子が小さな凝集塊をに粒子が作る ３点：大部分の粒子が小さな凝集塊を作る ２点：大部分の粒子が大きな凝集塊を作る １点：全ての粒子が大きな凝集塊を作り分散液が透明に
なる。

【００８１】結果を表４に示す。

【００８２】

【表４】

【００８３】この結果より、他の検定法を用いても感度
と特異性に優れる試薬が調製されたことが判る。

【００８４】実施例４ 実施例１と同様にして、(1)メルカプト基を固定してな
る無機化合物担体粒子の合成と同様に操作を行いメルカ
プト基を固定してなる無機化合物担体粒子を得た後、以
下のようにして抗体を感作して免疫学的凝集反応試薬の
調製を行った。

【００８５】１ｍｇ／ｍｌの濃度のカッペル社製抗ヒト
ヘモグロビン（ウサギ）抗体の１ｍｌとメルカプト基を
固定してなる無機化合物担体粒子を５ｍＭグリシン緩衝
液（ｐＨ８）に１％になるように分散させたものを攪拌
しながら１時間混合した。ついで１７００ｇで３分間遠
心し上清を除去した後、５ｍＭグリシン緩衝液（ｐＨ
８）に０．１２５重量％になるように牛血清アルブミン
を加えた溶液中に０．２５重量％になるように分散させ
感作粒子液を調製した。次に０．０５重量％のアジ化ナ
トリウム、０．０４重量％の塩化ナトリウムを含む５ｍ
Ｍグリシン緩衝液（ｐＨ８）からなる検体希釈液を調製
した。これら感作粒子液と検体希釈液より成るヒトヘモ
グロビン免疫学的凝集反応試薬を調製した。

【００８６】この免疫学的凝集反応試薬の感度を特異性
を以下に示すように測定した。ヒトヘモグロビン（シグ
マ社製）を検体希釈液に１μｇ／ｍｌなるように溶解し
た物を標準検体として、これを検体希釈液で２倍連続希
釈して検体とした。次に感作粒子液２５μｌと検体２５
μｌを室温でマイクロプレート上にて混合し、１分間攪
拌を行なった後、３０分静置し凝集程度を肉眼にて判定
した。

【００８７】感度は明確な凝集像を示す最小の検体の最
終的な希釈倍率の逆数で表した。

【００８８】特異性は、明確な凝集像を示す最小の次の
希釈倍率の管底像を目視で以下の五段階評価して求め
た。

【００８９】５点：粒子がスポット状に集まり外周部が
透明になる ４点：粒子はスポット状に集るが外周部にも粒子が存在
している ３点：粒子はボタン状になり外周部に粒子が存在してい
る ２点：粒子はリング状になり外周部に多くの粒子が存在
している １点：粒子は中央に集まらず管底に広がる 結果を表５に示す。

【００９０】

【表５】

【００９１】この結果より、免疫学的凝集反応試薬の調
製に抗原に代えて抗体を用いても感度と特異性に優れる
試薬が調製されることが判明した。

【００９２】比較例２ 実施例４で、(1)メルカプト基を固定してなる無機化合
物担体粒子の合成を行うときメルカプト基を持つシリコ
ーン系カップリング剤に代えてメルカプト基を有しない
シリコーン系カップリング剤を用いた、あるいはカップ
リング剤を使用しなかった以外はすべて同様に行った。
結果を表６に示す。

【００９３】

【表６】

【００９４】この結果より、無機化合物担体粒子上にメ
ルカプト基をもたない化合物を固定してなる免疫学的凝
集反応試薬試薬用担体及び無処理担体を用いると感度お
よび／または特異性が劣る試薬となることが判る。

Claims (1)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 無機化合物担体粒子に、メルカプト基を
   有し、該無機化合物担体粒子の表面反応基と反応するカ
   ップリング剤を反応させて、該担体粒子１ｇあたり０．
   ０１〜０．１μｍｏｌの量のメルカプト基を固定するこ
   とを特徴とする免疫学的凝集反応試薬用担体の製造方
   法。