JP3249134B2 - 細胞系 - Google Patents
細胞系Info
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- JP3249134B2 JP3249134B2 JP54142697A JP54142697A JP3249134B2 JP 3249134 B2 JP3249134 B2 JP 3249134B2 JP 54142697 A JP54142697 A JP 54142697A JP 54142697 A JP54142697 A JP 54142697A JP 3249134 B2 JP3249134 B2 JP 3249134B2
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- dna
- smrv
- cells
- gene
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- C07K14/555—Interferons [IFN]
- C07K14/56—IFN-alpha
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/86—Viral vectors
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
- C12N2740/00011—Details
- C12N2740/10011—Retroviridae
- C12N2740/13011—Gammaretrovirus, e.g. murine leukeamia virus
- C12N2740/13041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
- C12N2740/13043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
Description
【発明の詳細な説明】 本発明は、Namalwa細胞系およびその使用に関する。
ヒトα−インターフェロン（α−IFN）は、ヒト染色
体９の400kbセグメントに配置された多重遺伝子族に属
している。この族は、α−IFNサブタイプをコードする
少なくとも13個の遺伝子を含んでなる。それぞれのα−
タンパク質は、分子量が18〜26kD（グルコシル化の程度
によって変化する）の165または166個のアミノ酸からな
る。これらのサブタイプは、化学的には異なっている
が、高度の逆アミノ酸配列の領域と密接に関連してい
る。
体９の400kbセグメントに配置された多重遺伝子族に属
している。この族は、α−IFNサブタイプをコードする
少なくとも13個の遺伝子を含んでなる。それぞれのα−
タンパク質は、分子量が18〜26kD（グルコシル化の程度
によって変化する）の165または166個のアミノ酸からな
る。これらのサブタイプは、化学的には異なっている
が、高度の逆アミノ酸配列の領域と密接に関連してい
る。
α−IFNの１つの市販の供給源は、天然のα−IFNであ
るヒトリンパ芽球様α n1 IFNである。これは、Namal
waヒトリンパ芽球様細胞系をセンダイウイルスで刺激し
て、α−IFNの少なくとも13種類のサブタイプの混合物
を生成した後、これをクロマトグラフィーによって精製
することによって生成される（US−Ａ−4216203号明細
書、EP−Ａ−0000520号明細書、EP−Ａ−0097353号明細
書）。特定のサブタイプの数および品質は、製造工程中
の定義された限界内に保持される。
るヒトリンパ芽球様α n1 IFNである。これは、Namal
waヒトリンパ芽球様細胞系をセンダイウイルスで刺激し
て、α−IFNの少なくとも13種類のサブタイプの混合物
を生成した後、これをクロマトグラフィーによって精製
することによって生成される（US−Ａ−4216203号明細
書、EP−Ａ−0000520号明細書、EP−Ａ−0097353号明細
書）。特定のサブタイプの数および品質は、製造工程中
の定義された限界内に保持される。
α−IFNを生成するためのこの手法は、実際に1970年
代初頭に開発された。現在市販されている総てのヒトリ
ンパ芽球様インターフェロンを生成するのに現在用いら
れている細胞系をバーキットリンパ腫から生成したの
は、この期間中であった。この腫瘍は、Namalawという
名前の個人から採取したものであることから、冠名細胞
系を生じた（Strander H.et al.,J.Clin.Microbiol.,1,
116−117,1975、およびChristofinis G.J.et al.,J.Ge
n.Virol.,52,169−171,1981）。Namalwa細胞は、ATCC寄
託番号00001432−CRLの公共に利用されている。
代初頭に開発された。現在市販されている総てのヒトリ
ンパ芽球様インターフェロンを生成するのに現在用いら
れている細胞系をバーキットリンパ腫から生成したの
は、この期間中であった。この腫瘍は、Namalawという
名前の個人から採取したものであることから、冠名細胞
系を生じた（Strander H.et al.,J.Clin.Microbiol.,1,
116−117,1975、およびChristofinis G.J.et al.,J.Ge
n.Virol.,52,169−171,1981）。Namalwa細胞は、ATCC寄
託番号00001432−CRLの公共に利用されている。
Namalwa細胞は、組換えタンパク質の製造にも用いら
れている（Yanagi H.et al.,Gene,76,19−26,1989、お
よびOkamoto M.et al.,Bio/Technology,550−553,199
0）。Namalwa細胞は、ヒト起源の組換えタンパク質の産
生にとって魅力にとむものである。組換えヒトタンパク
質の正確な翻訳後加工を期待することができる。更に、
Namalwa細胞系の工業的規模での生産は、それらがα−I
FNを産生するのに用いられるため、十分に認められてい
る。
れている（Yanagi H.et al.,Gene,76,19−26,1989、お
よびOkamoto M.et al.,Bio/Technology,550−553,199
0）。Namalwa細胞は、ヒト起源の組換えタンパク質の産
生にとって魅力にとむものである。組換えヒトタンパク
質の正確な翻訳後加工を期待することができる。更に、
Namalwa細胞系の工業的規模での生産は、それらがα−I
FNを産生するのに用いられるため、十分に認められてい
る。
Namalwa細胞系から得られた生成物関して汚染菌があ
る可能性については、詳細に検討されてきた。Namalwa
細胞は、細菌、ウイルスおよびマイコプラズマによる汚
染について試験されてきた。幾つかのレベルのエプスタ
イン−バーウイルス（EBV）が検出されている。しかし
ながら、感染性ウイルスは形成されていない。更に、EB
Vの初期抗原は、細胞をEBVの複製を誘導することができ
るブロモデオキシウリジンのような化学薬品で処理して
も、検出することはできない。
る可能性については、詳細に検討されてきた。Namalwa
細胞は、細菌、ウイルスおよびマイコプラズマによる汚
染について試験されてきた。幾つかのレベルのエプスタ
イン−バーウイルス（EBV）が検出されている。しかし
ながら、感染性ウイルスは形成されていない。更に、EB
Vの初期抗原は、細胞をEBVの複製を誘導することができ
るブロモデオキシウリジンのような化学薬品で処理して
も、検出することはできない。
しかしながら、リスザルレトロウイルス（SMRV、Ｄ型
レトロウイルス）のゲノムが存在することは、見出ださ
れている（Middleton et al.,Int.J.Cancer,52,451−45
4,1992）。SMRVは、リスザルの肺培養物から最初に分離
されたものであり、イヌ、ヒト、チンパンジー、アカゲ
ザルおよびミンク細胞などのイン・ビトロでの広汎な宿
主範囲を示す。このウイルスは、多数の細胞系の汚染菌
として同定されているので、特に興味深い。今日までの
ところ、２株のウイルス、SMRVおよびSMRV−Ｈが、制限
エンドヌクレアーゼパターンと配列変更における差に基
づいて同定されている。
レトロウイルス）のゲノムが存在することは、見出ださ
れている（Middleton et al.,Int.J.Cancer,52,451−45
4,1992）。SMRVは、リスザルの肺培養物から最初に分離
されたものであり、イヌ、ヒト、チンパンジー、アカゲ
ザルおよびミンク細胞などのイン・ビトロでの広汎な宿
主範囲を示す。このウイルスは、多数の細胞系の汚染菌
として同定されているので、特に興味深い。今日までの
ところ、２株のウイルス、SMRVおよびSMRV−Ｈが、制限
エンドヌクレアーゼパターンと配列変更における差に基
づいて同定されている。
成育可能なSMRV粒子が、Namalwa細胞系を用いて生成
物を得るのに用いられる生成プロトコールでは、生き残
らないようにすることが可能である。しかしながら、Na
malwa細胞でSMRVゲノムが含まれていないことが好まし
いのは明らかである。Middleton et al.（上記）は、SM
RVゲノムを、ランダムに選択した世界中の実験室から入
手した８種類のNamalwa細胞系の８個総てにおいて検出
した。従って、総ての従来の公的に入手可能なNamalwa
細胞はSMRVゲノムを含んでいると思われる。
物を得るのに用いられる生成プロトコールでは、生き残
らないようにすることが可能である。しかしながら、Na
malwa細胞でSMRVゲノムが含まれていないことが好まし
いのは明らかである。Middleton et al.（上記）は、SM
RVゲノムを、ランダムに選択した世界中の実験室から入
手した８種類のNamalwa細胞系の８個総てにおいて検出
した。従って、総ての従来の公的に入手可能なNamalwa
細胞はSMRVゲノムを含んでいると思われる。
特定の細胞がウイルス性汚染物を欠いていることの証
明は、用いる特定の分析装置の感度によって変化するこ
とは明らかである。ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）のよ
うな手法によるウイルスDNAの存在の直接分析法では、1
00〜100個の細胞当たり１個までのウイルスゲノム、更
に10000個の細胞当たり１個までのウイルスゲノムの検
出感度を得ることができる。しかしながら、新しい細胞
系を単一細胞からクローニングするときには、これは、
１細胞または無細胞当たり１個以上のウイルスゲノムを
含む必要がある。従って、誤った負の分析結果を得る可
能性は、遺伝学的に異種細胞と比較してこのようなクロ
ーニングした細胞系については著しく低くなる。
明は、用いる特定の分析装置の感度によって変化するこ
とは明らかである。ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）のよ
うな手法によるウイルスDNAの存在の直接分析法では、1
00〜100個の細胞当たり１個までのウイルスゲノム、更
に10000個の細胞当たり１個までのウイルスゲノムの検
出感度を得ることができる。しかしながら、新しい細胞
系を単一細胞からクローニングするときには、これは、
１細胞または無細胞当たり１個以上のウイルスゲノムを
含む必要がある。従って、誤った負の分析結果を得る可
能性は、遺伝学的に異種細胞と比較してこのようなクロ
ーニングした細胞系については著しく低くなる。
本発明の前は、SMRVが含まれていることは、Namalwa
細胞系に固有の特徴と考えられていた。上記のように、
総ての従来の公知に入手可能なNamalwa細胞系はSMRVゲ
ノムを含むものと考えられていたと思われる。
細胞系に固有の特徴と考えられていた。上記のように、
総ての従来の公知に入手可能なNamalwa細胞系はSMRVゲ
ノムを含むものと考えられていたと思われる。
意外なことには、本発明者らは、SMRV不含Namalwa細
胞系を見出だした。また、本発明者らは、意外にもNama
lwa細胞系を低密度静止培養よりは高密度静止培養を用
いることによって連続的にクローニングすることができ
ることも見出だした。生成するクローニングしたNamalw
a細胞系は、SMRV不含であることが分かった。それぞれ
のクローニングした細胞系は単一細胞由来のものであっ
たので、クローニングした細胞系の総ての細胞個体数が
確実にSMRV不含となった。
胞系を見出だした。また、本発明者らは、意外にもNama
lwa細胞系を低密度静止培養よりは高密度静止培養を用
いることによって連続的にクローニングすることができ
ることも見出だした。生成するクローニングしたNamalw
a細胞系は、SMRV不含であることが分かった。それぞれ
のクローニングした細胞系は単一細胞由来のものであっ
たので、クローニングした細胞系の総ての細胞個体数が
確実にSMRV不含となった。
従って、本発明は、SMRV不含であるNamalwa細胞系を
提供する。典型的には、この細胞系は、α−IFNサブタ
イプの異種個体群を産生することができる。
提供する。典型的には、この細胞系は、α−IFNサブタ
イプの異種個体群を産生することができる。
細胞系は、クローニングした細胞系であるのが好まし
い。その場合には、α−IFNサブタイプは、通常は市販
のリンパ芽球様インターフェロンの産生に用いられる現
存するNamalwa細胞系によって産生されるものと実質的
に同じである。本発明のクローニングした細胞系は単一
細胞由来の細胞の遺伝学的に均一な個体群であり、その
単一の親細胞からのクローン個体群の発生中に任意のラ
ンダムな突然変異が起こってもクローンである。
い。その場合には、α−IFNサブタイプは、通常は市販
のリンパ芽球様インターフェロンの産生に用いられる現
存するNamalwa細胞系によって産生されるものと実質的
に同じである。本発明のクローニングした細胞系は単一
細胞由来の細胞の遺伝学的に均一な個体群であり、その
単一の親細胞からのクローン個体群の発生中に任意のラ
ンダムな突然変異が起こってもクローンである。
好ましくは、本発明の細胞系によって発生したα−IF
Nサブタイプは、少なくともα−IFNサブタイプ2b、７、
10、17および21を含み、更に好ましくは１、2b、５、
７、８、10、14、17および21を含む。α−IFNサブタイ
プは、下記の第１表に示される相対的量範囲で産生され
るのが有利である。これらの範囲は、治療上許容可能な
リンパ芽球様インターフェロンのサブタイプが位置する
限界を定義している。細胞系は、例えばATCC寄託番号00
001432−CRLの主体を形成する細胞によって産生される
ものと実質的に同等のα−IFNサブタイププロフィール
を生じるのが最も好ましい。この寄託は、1978年７月７
日にATCC、ロックビル、メリーランド、米国で行われ
た。
Nサブタイプは、少なくともα−IFNサブタイプ2b、７、
10、17および21を含み、更に好ましくは１、2b、５、
７、８、10、14、17および21を含む。α−IFNサブタイ
プは、下記の第１表に示される相対的量範囲で産生され
るのが有利である。これらの範囲は、治療上許容可能な
リンパ芽球様インターフェロンのサブタイプが位置する
限界を定義している。細胞系は、例えばATCC寄託番号00
001432−CRLの主体を形成する細胞によって産生される
ものと実質的に同等のα−IFNサブタイププロフィール
を生じるのが最も好ましい。この寄託は、1978年７月７
日にATCC、ロックビル、メリーランド、米国で行われ
た。
本発明による２種類のSMRV−ネガティブ細胞系を、19
94年12月８日にジ・ヨーロピアン・コレクション・オブ
・アニマル・セル、カルチャーズ（the European Colle
ction of Animal Cell Cultures）、ポートンダウン、
サリスバリー SP4 0JG、英国に、受託番号ECACC94120
840およびECACC94120841でブダペスト条約により寄託し
た。これらの２種類の寄託細胞系およびそれらから誘導
される細胞系は、本発明の特に好ましい態様である。従
って、この寄託細胞系の子孫は、本発明の一側面を形成
する。
94年12月８日にジ・ヨーロピアン・コレクション・オブ
・アニマル・セル、カルチャーズ（the European Colle
ction of Animal Cell Cultures）、ポートンダウン、
サリスバリー SP4 0JG、英国に、受託番号ECACC94120
840およびECACC94120841でブダペスト条約により寄託し
た。これらの２種類の寄託細胞系およびそれらから誘導
される細胞系は、本発明の特に好ましい態様である。従
って、この寄託細胞系の子孫は、本発明の一側面を形成
する。
本発明による有用な細胞系は、α−IFNサブタイプの
異種個体群を産生することができるSMRV不含細胞系であ
り、これらのサブタイプは寄託した細胞系ECACC9412084
0号およびECACC94120841号のいずれかによって産生され
るものと実質的に同じである。サブタイプの個体群、IF
Nサブタイププロフィールは、これらの２種類の細胞系
のいずれかによって産生されるものと実質的に同じであ
ることがある。それぞれのα−IFNサブタイプの相対比
は、寄託した細胞系のいずれかによって産生されるそれ
ぞれのサブタイプの相対比と実質的に同じであることが
ある。
異種個体群を産生することができるSMRV不含細胞系であ
り、これらのサブタイプは寄託した細胞系ECACC9412084
0号およびECACC94120841号のいずれかによって産生され
るものと実質的に同じである。サブタイプの個体群、IF
Nサブタイププロフィールは、これらの２種類の細胞系
のいずれかによって産生されるものと実質的に同じであ
ることがある。それぞれのα−IFNサブタイプの相対比
は、寄託した細胞系のいずれかによって産生されるそれ
ぞれのサブタイプの相対比と実質的に同じであることが
ある。
本発明者らは、偶然にもSMRV−ネガティブNamalwa細
胞系を見出だした。従って、本発明の細胞系は、天然に
存在するSMRV不含Namalwa細胞系であることができる。
このような細胞系は、単離した形態でもよい。この細胞
系は、クローニングされていてもよい。
胞系を見出だした。従って、本発明の細胞系は、天然に
存在するSMRV不含Namalwa細胞系であることができる。
このような細胞系は、単離した形態でもよい。この細胞
系は、クローニングされていてもよい。
本発明のクローニングした細胞系は、新規な形態の二
重限定希釈クローニング（double limiting dilution c
loning）によって調製することができる。既知の希釈ク
ローニング法とは異なり、単一コロニーを得る目的で、
適当な成育力を有する細胞を続いてウェルで培養する
と、（予想された低密度よりも）高密度静止培養を用い
ることによって有利な結果が得られることを見出だし
た。
重限定希釈クローニング（double limiting dilution c
loning）によって調製することができる。既知の希釈ク
ローニング法とは異なり、単一コロニーを得る目的で、
適当な成育力を有する細胞を続いてウェルで培養する
と、（予想された低密度よりも）高密度静止培養を用い
ることによって有利な結果が得られることを見出だし
た。
生成する細胞系が単一細胞に由来することの統計的確
率を99.99％までの極めて高い値とする目的で、クロー
ニングした細胞系を発生させるときには、２回の希釈ク
ローニングを行うのが好ましい。親のSMRV不含Namalwa
細胞を、適当な抗生物質を含む適当な培地で高密度にま
で静止培養で成育させ、分裂させ、希釈して、高密度に
再成育させ、トリパンブルー除外法のような成育力分析
法を用いて＞90％の成育力を示さない培養物を廃棄し
た。次に、細胞を分裂させ、再度希釈する。
率を99.99％までの極めて高い値とする目的で、クロー
ニングした細胞系を発生させるときには、２回の希釈ク
ローニングを行うのが好ましい。親のSMRV不含Namalwa
細胞を、適当な抗生物質を含む適当な培地で高密度にま
で静止培養で成育させ、分裂させ、希釈して、高密度に
再成育させ、トリパンブルー除外法のような成育力分析
法を用いて＞90％の成育力を示さない培養物を廃棄し
た。次に、細胞を分裂させ、再度希釈する。
細胞密度は、好ましくは1.8×106個ml-1以上であり、
例えば1.8×106〜2.4×106個ml-1または2.0〜2.2×106
個ml-1とすべきである。従って、適当な細胞密度は、約
2,000,000個ml-1である。0.2×1,000,000個ml-1までの
希釈が適当である。
例えば1.8×106〜2.4×106個ml-1または2.0〜2.2×106
個ml-1とすべきである。従って、適当な細胞密度は、約
2,000,000個ml-1である。0.2×1,000,000個ml-1までの
希釈が適当である。
しかしながら、SMRVネガティブのNamalwa細胞培養物
は、組換えDNA技術を用いてSMRVポジティブのNamalwa細
胞から得ることができる。従って、指定された相同組換
えのような方法を用いて、組込みSMRVゲノムを組換え、
これを非コードDNAの切片で置き換えることができる。
は、組換えDNA技術を用いてSMRVポジティブのNamalwa細
胞から得ることができる。従って、指定された相同組換
えのような方法を用いて、組込みSMRVゲノムを組換え、
これを非コードDNAの切片で置き換えることができる。
このようにして、SMRVポジティブNamalwa細胞系の関
連染色体からのSMRVゲノムの欠失が可能である。SMRVゲ
ノムに隣接する配列を同定する。SMRVゲノムのいずれか
の側の隣接配列の少なくとも3kbを含むベクターを構築
する。欠失を行う領域を、薬剤耐性をコードするような
ポジティブ選択可能マーカーで置換し、隣接DNAは変更
のないままの標的構築物を作成する。
連染色体からのSMRVゲノムの欠失が可能である。SMRVゲ
ノムに隣接する配列を同定する。SMRVゲノムのいずれか
の側の隣接配列の少なくとも3kbを含むベクターを構築
する。欠失を行う領域を、薬剤耐性をコードするような
ポジティブ選択可能マーカーで置換し、隣接DNAは変更
のないままの標的構築物を作成する。
この構築物、典型的にはプラスミドを、次に線形化
し、標的SMRVポジティブ細胞に導入する。組換えは低頻
度自然現象として起こり、これがうまく行われた細胞
を、標的構築物によって導入される薬剤中で成長する能
力を有することによって選択することができる。次に、
耐性クローンを分析して、薬剤耐性が非特異的機構によ
って起こらず、SMRVゲノムを欠失することができるよう
にしなければならない。標的構築物を、非特異的組替え
体に対して選択するような方法で操作することが可能で
ある。
し、標的SMRVポジティブ細胞に導入する。組換えは低頻
度自然現象として起こり、これがうまく行われた細胞
を、標的構築物によって導入される薬剤中で成長する能
力を有することによって選択することができる。次に、
耐性クローンを分析して、薬剤耐性が非特異的機構によ
って起こらず、SMRVゲノムを欠失することができるよう
にしなければならない。標的構築物を、非特異的組替え
体に対して選択するような方法で操作することが可能で
ある。
これが完了すると、ゲノムの１コピーが失われる。異
型接合生物では、第二のコピーも除かれなければならな
い。これは、異なる薬剤耐性を有する選択可能なマーカ
ーを含むことを除き、総ての面で最初のものと同一であ
ることができる標的構築物を用いて、同じ手続きによっ
て行われる。次に、両染色体への組み込みにより両薬剤
に耐性を有する二重組換え体を選択することができる。
型接合生物では、第二のコピーも除かれなければならな
い。これは、異なる薬剤耐性を有する選択可能なマーカ
ーを含むことを除き、総ての面で最初のものと同一であ
ることができる標的構築物を用いて、同じ手続きによっ
て行われる。次に、両染色体への組み込みにより両薬剤
に耐性を有する二重組換え体を選択することができる。
あるいは、SMRV不含細胞の副個体群がSMRVポジティブ
Namalwa細胞系に存在することが可能である。SMRVポジ
ティブNamalwa細胞系をこのようにしてクローニングす
ることができた。次に、SMRV不含細胞のクローンを同定
することができた。上記の二重限定希釈クローニング法
を用いることができる。
Namalwa細胞系に存在することが可能である。SMRVポジ
ティブNamalwa細胞系をこのようにしてクローニングす
ることができた。次に、SMRV不含細胞のクローンを同定
することができた。上記の二重限定希釈クローニング法
を用いることができる。
本発明は、α−インターフェロンの産生法であって、
本発明の細胞系を培養し、このようにして産生されたα
−インターフェロンを単離することを含んでなる方法も
提供する。このようにして、α−IFNの異種個体群が得
られる。本発明の細胞系を、任意の適当な方法によって
培養することができる。センダイウイルスのようなイン
ターフェロンインデューサーを、培養物に加えることが
できる。α−インターフェロンを、抗IFN抗体を用いる
アフィニエィークロマトグラフィーによって単離するこ
とができる。このような発生に用いるのに適当なポリク
ローナル抗体は、当該技術分野で周知の手法によって産
生することができる（US−Ａ−4216203号明細書）。
本発明の細胞系を培養し、このようにして産生されたα
−インターフェロンを単離することを含んでなる方法も
提供する。このようにして、α−IFNの異種個体群が得
られる。本発明の細胞系を、任意の適当な方法によって
培養することができる。センダイウイルスのようなイン
ターフェロンインデューサーを、培養物に加えることが
できる。α−インターフェロンを、抗IFN抗体を用いる
アフィニエィークロマトグラフィーによって単離するこ
とができる。このような発生に用いるのに適当なポリク
ローナル抗体は、当該技術分野で周知の手法によって産
生することができる（US−Ａ−4216203号明細書）。
更に詳細には、本発明によるNamalwa細胞系の試料
を、液体窒素中の保管から融解させ、大規模培養の端緒
となる量を増加させる培養により成育させることができ
る。適当な培地としては、γ線照射成熟ウシ血清のよう
な血清を補足したRPMI1640を挙げることができる。細胞
個体群が最適であるときには、酪酸ナトリウムを加え
て、細胞の成長速度を遅らせ、次のIFN収率を最適にす
ることができる（US−Ａ−4216203号明細書）。次に、
細胞を、典型的にはセンダイウイルスを添加することに
よってIFNの産生を誘導する。粗製のα−IFNを単離した
後、沈澱、溶媒抽出およびクロマトグラフィーなどの精
製手続きを通過させる。最終的形態の純度は少なくとも
95％であり、特異活性は約100IU/mgタンパク質であり、
少なくとも13種類の異なるサブタイプのα−IFNからな
っている（Finter N.B.et al.,CSHSQB,101,571−575,19
86）。
を、液体窒素中の保管から融解させ、大規模培養の端緒
となる量を増加させる培養により成育させることができ
る。適当な培地としては、γ線照射成熟ウシ血清のよう
な血清を補足したRPMI1640を挙げることができる。細胞
個体群が最適であるときには、酪酸ナトリウムを加え
て、細胞の成長速度を遅らせ、次のIFN収率を最適にす
ることができる（US−Ａ−4216203号明細書）。次に、
細胞を、典型的にはセンダイウイルスを添加することに
よってIFNの産生を誘導する。粗製のα−IFNを単離した
後、沈澱、溶媒抽出およびクロマトグラフィーなどの精
製手続きを通過させる。最終的形態の純度は少なくとも
95％であり、特異活性は約100IU/mgタンパク質であり、
少なくとも13種類の異なるサブタイプのα−IFNからな
っている（Finter N.B.et al.,CSHSQB,101,571−575,19
86）。
本発明の医薬処方物は、本発明の細胞系から産生した
α−IFNを薬学上許容可能なキャリヤーと混合して含ん
でなる。キャリヤーは、塩化ナトリウム、トリス（Trim
ethamine US）、グリシン、およびヒトアルブミン溶液
の混合物を含んでなるのが好ましい。更に好ましくは、
塩化ナトリウムは8.5mg・ml-1、トリスは1.21mg・m
l-1、グリシンは0.75mg・ml-1、およびヒト血清アルブ
ミンは、処方物の最終タンパク質濃度を1.5mg・ml-1と
する濃度で含まれる。
α−IFNを薬学上許容可能なキャリヤーと混合して含ん
でなる。キャリヤーは、塩化ナトリウム、トリス（Trim
ethamine US）、グリシン、およびヒトアルブミン溶液
の混合物を含んでなるのが好ましい。更に好ましくは、
塩化ナトリウムは8.5mg・ml-1、トリスは1.21mg・m
l-1、グリシンは0.75mg・ml-1、およびヒト血清アルブ
ミンは、処方物の最終タンパク質濃度を1.5mg・ml-1と
する濃度で含まれる。
本発明の細胞系から産生されたα−IFNは、任意の既
知リンパ芽球様IFN応答性症状の治療に用いることがで
き、当該技術分野で周知であり、現在発売されている治
療用リンパ芽球様IFNについて知られているものと実質
的に同じ経路および量で投与することができる。
知リンパ芽球様IFN応答性症状の治療に用いることがで
き、当該技術分野で周知であり、現在発売されている治
療用リンパ芽球様IFNについて知られているものと実質
的に同じ経路および量で投与することができる。
例えば、ヘアリー・セル白血病の治療では、３メガ単
位（3MU）の投与量を、例えば静脈内（iv）に毎日12〜1
6週間投与した後、骨髄にヘアリー・セルが検出されな
くなるまで3MUを３回／週で投与する。Ｂ型肝炎の治療
では、10〜15MUを毎週３回で４〜６か月間投与すること
ができるが、Ｃ型肝炎については、3MUを６か月まで投
与することができる。これらの投与量は当該技術分野で
許容されているものであるが、特定の臨床的要因により
指示される場合には、別のまたはより高投与量の使用を
除外するものではない。
位（3MU）の投与量を、例えば静脈内（iv）に毎日12〜1
6週間投与した後、骨髄にヘアリー・セルが検出されな
くなるまで3MUを３回／週で投与する。Ｂ型肝炎の治療
では、10〜15MUを毎週３回で４〜６か月間投与すること
ができるが、Ｃ型肝炎については、3MUを６か月まで投
与することができる。これらの投与量は当該技術分野で
許容されているものであるが、特定の臨床的要因により
指示される場合には、別のまたはより高投与量の使用を
除外するものではない。
本発明の細胞系は、組換えタンパク質を産生すること
ができる発現系として用いることもできる。従って、本
発明は、 目的とするポリペプチドをコードする外来発現可能な
DNAを固定する本発明による細胞系、 このような細胞系の製造法であって、本発明による細
胞系を、目的とするポリペプチドをコードする発現可能
なDNA配列でトランスフェクションすることを特徴とす
る方法、および 目的とするポリペプチドの製造法であって、目的とす
るポリペプチドをコードする外来性の発現可能なDNAを
固定する細胞系を、ポリペプチドが発現される条件下で
保持し、発現したポリペプチドを回収することを特徴と
する方法 を提供する。
ができる発現系として用いることもできる。従って、本
発明は、 目的とするポリペプチドをコードする外来発現可能な
DNAを固定する本発明による細胞系、 このような細胞系の製造法であって、本発明による細
胞系を、目的とするポリペプチドをコードする発現可能
なDNA配列でトランスフェクションすることを特徴とす
る方法、および 目的とするポリペプチドの製造法であって、目的とす
るポリペプチドをコードする外来性の発現可能なDNAを
固定する細胞系を、ポリペプチドが発現される条件下で
保持し、発現したポリペプチドを回収することを特徴と
する方法 を提供する。
目的とするポリペプチドを発現することができる細胞
系は、ポリペプチドをコードするDNA配列を含んでなる
発現ベクターを用いて調製することができる。ポリペプ
チドは、典型的にはヒトポリペプチド、例えば成長因子
である。ポリペプチドは、インシュリン、エリトロポエ
チン、ヒト成長ホルモン、GCSF、GMCSF、組織プラスミ
ノーゲン活性化因子、ウロキナーゼ、血液因子VIII、プ
ロテインＣなどであることができる。
系は、ポリペプチドをコードするDNA配列を含んでなる
発現ベクターを用いて調製することができる。ポリペプ
チドは、典型的にはヒトポリペプチド、例えば成長因子
である。ポリペプチドは、インシュリン、エリトロポエ
チン、ヒト成長ホルモン、GCSF、GMCSF、組織プラスミ
ノーゲン活性化因子、ウロキナーゼ、血液因子VIII、プ
ロテインＣなどであることができる。
発現ベクターは、本発明によるSMRV不含細胞に提供さ
れるときには、目的とするポリペプチドを発現すること
ができる。適当な転写および翻訳制御要素、例えば所望
なポリペプチドをコードするDNA配列操作可能に結合し
たプロモーターが提供される。プロモーターは、SV40
（シミアンウイルス40）初期プロモーターであることが
できる。エンハンサー、転写終結部位および翻訳停止お
よび開始コドンが提供される。適当なスプライス部位と
ポリアデニル化部位を含むことができる。DNA配列が、
ポリペプチドの発現を起こすことができる正確なフレー
ムで提供される。
れるときには、目的とするポリペプチドを発現すること
ができる。適当な転写および翻訳制御要素、例えば所望
なポリペプチドをコードするDNA配列操作可能に結合し
たプロモーターが提供される。プロモーターは、SV40
（シミアンウイルス40）初期プロモーターであることが
できる。エンハンサー、転写終結部位および翻訳停止お
よび開始コドンが提供される。適当なスプライス部位と
ポリアデニル化部位を含むことができる。DNA配列が、
ポリペプチドの発現を起こすことができる正確なフレー
ムで提供される。
従って、発現ベクターは、SMRV不含Namalwa細胞と適
合性であるベクターである。所望ならば、選択可能なマ
ーカー遺伝学が含まれている。発現ベクターは、典型的
にはプラスミドである。これは、一般的には複製の起源
を含んでなる。
合性であるベクターである。所望ならば、選択可能なマ
ーカー遺伝学が含まれている。発現ベクターは、典型的
にはプラスミドである。これは、一般的には複製の起源
を含んでなる。
SMRV不含Namalwa細胞を、発現ベクターでトランスフ
ェクションする。次に、トランスフェクションした細胞
を、所望なポリペプチドの発現を起こすことができる条
件下に保持する。トランスフェクションした細胞を、こ
の目的のために適当な培地で培養する。発現した所望な
ポリペプチドを単離する。このポリペプチドを、必要な
らば精製する。
ェクションする。次に、トランスフェクションした細胞
を、所望なポリペプチドの発現を起こすことができる条
件下に保持する。トランスフェクションした細胞を、こ
の目的のために適当な培地で培養する。発現した所望な
ポリペプチドを単離する。このポリペプチドを、必要な
らば精製する。
本発明のSMRV不含細胞系は、ウイルス、例えばレトロ
ウイルスまたはアデノウイルスのパッケージング／成長
補足細胞系として用いることもできる。従って、本発明
は、 本発明による細胞系であって、複製シグナル、パッケ
ージング配列および目的とする遺伝子を含んでなる相当
するウイルスベクターをパッケージするのに十分な発現
可能なウイルス遺伝子を固定するもの、 このような細胞系の製造法であって、本発明による細
胞系を、複製シグナル、パッケージング配列および目的
とする遺伝子を含んでなる相当するウイルスベクターを
パッケージするのに十分な発現可能なウイルス遺伝子で
トランスフェクションすることを特徴とする方法、およ
び ウイルスのパッケージする方法であって、複製シグナ
ル、パッケージング配列および目的とする遺伝子を含ん
でなる相当するウイルスベクターをパッケージするのに
十分な発現可能なウイルス遺伝子を固定する細胞系を、
上記ウイルスベクターでトランスフェクションし、精製
するパッケージングされたウイルスを回収することを特
徴とする方法 を提供する。
ウイルスまたはアデノウイルスのパッケージング／成長
補足細胞系として用いることもできる。従って、本発明
は、 本発明による細胞系であって、複製シグナル、パッケ
ージング配列および目的とする遺伝子を含んでなる相当
するウイルスベクターをパッケージするのに十分な発現
可能なウイルス遺伝子を固定するもの、 このような細胞系の製造法であって、本発明による細
胞系を、複製シグナル、パッケージング配列および目的
とする遺伝子を含んでなる相当するウイルスベクターを
パッケージするのに十分な発現可能なウイルス遺伝子で
トランスフェクションすることを特徴とする方法、およ
び ウイルスのパッケージする方法であって、複製シグナ
ル、パッケージング配列および目的とする遺伝子を含ん
でなる相当するウイルスベクターをパッケージするのに
十分な発現可能なウイルス遺伝子を固定する細胞系を、
上記ウイルスベクターでトランスフェクションし、精製
するパッケージングされたウイルスを回収することを特
徴とする方法 を提供する。
パッケージングされたウイルスは、遺伝子治療に用い
ることができる。これらのウイルスは、標的細胞内で自
律的に複製することはできないが、その細胞に所望な遺
伝子を送達することができる。
ることができる。これらのウイルスは、標的細胞内で自
律的に複製することはできないが、その細胞に所望な遺
伝子を送達することができる。
所望な遺伝子が、ウイルス複製シグナルと、psiパッ
ケージング配列またはキャプシド形成配列（encapsidat
ion sequence）とも呼ばれることがあるパッケージング
配列をも含んでなるウイルスベクターに最初に供給され
る。従って、ウイルスベクターは、少なくとも、感染細
胞内でウイルスの複製に必要な機能配列を欠いている。
ケージング配列またはキャプシド形成配列（encapsidat
ion sequence）とも呼ばれることがあるパッケージング
配列をも含んでなるウイルスベクターに最初に供給され
る。従って、ウイルスベクターは、少なくとも、感染細
胞内でウイルスの複製に必要な機能配列を欠いている。
細胞系は、レトロウイルスをパッケージングするのに
用いることができ、この場合にはウイルスベクターはレ
トロウイルスベクターである。パッケージングすること
ができる適当なレトロウイルスとしては、ネズミ白血病
ウイルス（MLV）、テナガザル白血病ウイルス（GAL
V）、網内細胞ウイルス（REV）、脾臓壊死ウイルス（SN
V、哺乳動物Ｃ型）、トリ白血病ウイルス（ALV、トリ
Ｃ）、およびヒト泡沫状ウイルス（HFVスプマ）が挙げ
られる。
用いることができ、この場合にはウイルスベクターはレ
トロウイルスベクターである。パッケージングすること
ができる適当なレトロウイルスとしては、ネズミ白血病
ウイルス（MLV）、テナガザル白血病ウイルス（GAL
V）、網内細胞ウイルス（REV）、脾臓壊死ウイルス（SN
V、哺乳動物Ｃ型）、トリ白血病ウイルス（ALV、トリ
Ｃ）、およびヒト泡沫状ウイルス（HFVスプマ）が挙げ
られる。
細胞系をレトロウイルスのパッケージングに用いると
きには、ウイルスベクターは長い末端反復（LTR）配
列、所望な遺伝子およびパッケージング配列を含んでな
る。従って、典型的には、ウイルスベクターは、このよ
うな場合には、機能的gag、polおよびenv遺伝子を欠い
ている。これらの遺伝子は、全くまたは部分的に脱落し
ていることがあり、または存在していても非機能性であ
ることがある。従って、ウイルスベクターは、一般的に
は適当な機能遺伝子を欠いているが目的とする遺伝子を
組込んでいるレトロウイルスゲノムを含んでなる。
きには、ウイルスベクターは長い末端反復（LTR）配
列、所望な遺伝子およびパッケージング配列を含んでな
る。従って、典型的には、ウイルスベクターは、このよ
うな場合には、機能的gag、polおよびenv遺伝子を欠い
ている。これらの遺伝子は、全くまたは部分的に脱落し
ていることがあり、または存在していても非機能性であ
ることがある。従って、ウイルスベクターは、一般的に
は適当な機能遺伝子を欠いているが目的とする遺伝子を
組込んでいるレトロウイルスゲノムを含んでなる。
所望な遺伝子は、プロモーターに操作可能に結合した
ウイルスベクターにおいて提供される。この遺伝子は、
リンホカインまたはサイトカインをコードする遺伝子で
あることがある。これは、腫瘍抑制遺伝子、中和遺伝子
（corrective gene）、GDEPT（遺伝子指定酵素プロドラ
ッグ治療）酵素遺伝子であることができる。プロモータ
ーは、癌胎児性抗原（CEA）、Muc−１、ｃ−ErbB2、葉
状体結合タンパク質（foliate binding protein）（FB
P）、または血管内皮増殖因子（VEGF）プロモーターで
あることができる。終結配列は、必要に応じて提供する
ことができる。
ウイルスベクターにおいて提供される。この遺伝子は、
リンホカインまたはサイトカインをコードする遺伝子で
あることがある。これは、腫瘍抑制遺伝子、中和遺伝子
（corrective gene）、GDEPT（遺伝子指定酵素プロドラ
ッグ治療）酵素遺伝子であることができる。プロモータ
ーは、癌胎児性抗原（CEA）、Muc−１、ｃ−ErbB2、葉
状体結合タンパク質（foliate binding protein）（FB
P）、または血管内皮増殖因子（VEGF）プロモーターで
あることができる。終結配列は、必要に応じて提供する
ことができる。
ウイルスベクターを、パッケージング／成長相補性を
起こすことができるウイルス機能を備えた本発明による
細胞系に導入する。従って、この細胞系は、ウイルスベ
クターの機能を補足することができるウイルス遺伝子を
備えている。これらの遺伝子は、パッケージング／成長
相補性を起こすことができるウイルスタンパク質、典型
的には構造遺伝子、複製酵素および制御因子を発現す
る。
起こすことができるウイルス機能を備えた本発明による
細胞系に導入する。従って、この細胞系は、ウイルスベ
クターの機能を補足することができるウイルス遺伝子を
備えている。これらの遺伝子は、パッケージング／成長
相補性を起こすことができるウイルスタンパク質、典型
的には構造遺伝子、複製酵素および制御因子を発現す
る。
細胞系をレトロウイルスのパッケージングに用いると
き、典型的には、これらの遺伝子はgag、polおよびenv
遺伝子である。特に、それらは、ウイルスベクターから
脱落している機能的ウイルス遺伝子である。
き、典型的には、これらの遺伝子はgag、polおよびenv
遺伝子である。特に、それらは、ウイルスベクターから
脱落している機能的ウイルス遺伝子である。
細胞系が必要とする遺伝子は、細胞ゲノムに安定に組
み込むことができる。この遺伝子は、プロウイルスDNA
の形態で提供することができる。任意の適当な手法を用
いて、遺伝子を細胞系に導入することができる。
み込むことができる。この遺伝子は、プロウイルスDNA
の形態で提供することができる。任意の適当な手法を用
いて、遺伝子を細胞系に導入することができる。
使用に当たっては、パッケージングに必要なウイルス
遺伝子を固定する細胞系を上記のようなウイルスベクタ
ーで感染させる。次に、生成するパッケージングされた
ウイルスを、細胞培養物から回収する。回収したウイル
スは、所望により遺伝子治療に用いる前に精製すること
ができる。
遺伝子を固定する細胞系を上記のようなウイルスベクタ
ーで感染させる。次に、生成するパッケージングされた
ウイルスを、細胞培養物から回収する。回収したウイル
スは、所望により遺伝子治療に用いる前に精製すること
ができる。
下記の実施例により、本発明を説明する。添付の図面
において、 第１図は、Wellferon（登録商標）の産生に現在用い
られている未クローニングSMRVポジティブのNamalwa細
胞系について測定した逆相高圧液体クロマトグラフィー
（RPHPLC）曲線を示し、 第２図は、クローニングしたSMRV不含Namalwa細胞系E
CACC94120841について測定した曲線である。
において、 第１図は、Wellferon（登録商標）の産生に現在用い
られている未クローニングSMRVポジティブのNamalwa細
胞系について測定した逆相高圧液体クロマトグラフィー
（RPHPLC）曲線を示し、 第２図は、クローニングしたSMRV不含Namalwa細胞系E
CACC94120841について測定した曲線である。
実施例1:SMRVの存在についてのNamalwa細胞系の試験 1. 総論 本発明者らが見出だしたNamalwa細胞系Ｘを、SMRVゲ
ノムの存在について試験した。SMRVを細胞当たり１未満
のゲノムコピーを検出しかつ細胞当たりおおよそ１ゲノ
ムコピーを検出するゲノムSMRVプローブを用いる分析法
を採用した。試験DNAを制限エンドヌクレアーゼで切断
して、診断用の大きさの断片を得て、これをDNAハイブ
リダイゼーションに続いてオートラジオグラフィーによ
って検出した。
ノムの存在について試験した。SMRVを細胞当たり１未満
のゲノムコピーを検出しかつ細胞当たりおおよそ１ゲノ
ムコピーを検出するゲノムSMRVプローブを用いる分析法
を採用した。試験DNAを制限エンドヌクレアーゼで切断
して、診断用の大きさの断片を得て、これをDNAハイブ
リダイゼーションに続いてオートラジオグラフィーによ
って検出した。
また、２個のSMRV/LTR特異的オリゴヌクレオチドアン
プリファイアーを用いて、ポリメラーゼ連鎖反応（PC
R）分析を行った。任意の増殖配列を、SMRVに特異的な
オリゴヌクレオチドプローブでハイブリダイゼーション
することによって同定した。使用条件下では、この手続
きにより、2000個の細胞当たり少なくとも１以上のゲノ
ムコピーが検出される。PCR分析法は実際にはネガティ
ブであったので、SMRVゲノム内でネステド・プライマー
（nested primer）を用いる追加分析法を用いた。ネス
テド・プライマーセットは、SMRVを10,000個の細胞当た
り１以上のゲノムコピーの感度まで検出することができ
る。
プリファイアーを用いて、ポリメラーゼ連鎖反応（PC
R）分析を行った。任意の増殖配列を、SMRVに特異的な
オリゴヌクレオチドプローブでハイブリダイゼーション
することによって同定した。使用条件下では、この手続
きにより、2000個の細胞当たり少なくとも１以上のゲノ
ムコピーが検出される。PCR分析法は実際にはネガティ
ブであったので、SMRVゲノム内でネステド・プライマー
（nested primer）を用いる追加分析法を用いた。ネス
テド・プライマーセットは、SMRVを10,000個の細胞当た
り１以上のゲノムコピーの感度まで検出することができ
る。
2. 方法 （ａ）DNAハイブリダイゼーション DAN精製 約７×107個の試験細胞からなるペレットを、DNA調製
に用いた。細胞ペレットを、20μｇ・ml-1のRNアーゼと
100μｇ・ml-1のプロテイナーゼ−Ｋを含むプロテイナ
ーゼ−Ｋリーシスに再懸濁した。脱タンパクDNAをフェ
ノールで２回、およびフェノール−クロロホルムで２回
抽出し、最後に酢酸アンモニウムの存在下でエタノール
により沈澱した。DNAを3000gで30分間遠心分離し、上清
を廃棄した。ペレットを70％エタノールで洗浄し、１時
間風乾した。
に用いた。細胞ペレットを、20μｇ・ml-1のRNアーゼと
100μｇ・ml-1のプロテイナーゼ−Ｋを含むプロテイナ
ーゼ−Ｋリーシスに再懸濁した。脱タンパクDNAをフェ
ノールで２回、およびフェノール−クロロホルムで２回
抽出し、最後に酢酸アンモニウムの存在下でエタノール
により沈澱した。DNAを3000gで30分間遠心分離し、上清
を廃棄した。ペレットを70％エタノールで洗浄し、１時
間風乾した。
DNAをトリスEDTA（TE）緩衝液に再溶解し、DNAの純度
および濃度を分校分析法によって評価した。吸光度は、
280nmおよび260nmで測定した。260/280比は1.82であ
り、試料DNAが純粋であることを示していた。DNAの収率
は、315μｇと計算された。
および濃度を分校分析法によって評価した。吸光度は、
280nmおよび260nmで測定した。260/280比は1.82であ
り、試料DNAが純粋であることを示していた。DNAの収率
は、315μｇと計算された。
コントロールDNA ネガティブコントロールDNAは、検出可能なSMRV配列
を含まない精製したヒト胎盤DNAからなっていた。
を含まない精製したヒト胎盤DNAからなっていた。
SMRVポジティブのコントロールDNAは、組換えDNAを加
えたヒト胎盤DNAからなり、完全なSMRVゲノムは100、1
0、１および0.1ゲノム当量であった。ゲノム当量（g.
e.）は、真核ゲノムが３×109bpからなり、SMRVゲノム
が8.4×103bpであると仮定して計算した。DNA10μｇ中
で、１ゲノム当量は、SMRVDNA28pgとなる。
えたヒト胎盤DNAからなり、完全なSMRVゲノムは100、1
0、１および0.1ゲノム当量であった。ゲノム当量（g.
e.）は、真核ゲノムが３×109bpからなり、SMRVゲノム
が8.4×103bpであると仮定して計算した。DNA10μｇ中
で、１ゲノム当量は、SMRVDNA28pgとなる。
他のポジティブコントロールは、SMRVを固定すること
が知られているNamalwaDNAおよびCCL194DNA、細胞当た
り約10ゲノム当量のSMRV配列を含むミンク肺細胞からな
っていた。
が知られているNamalwaDNAおよびCCL194DNA、細胞当た
り約10ゲノム当量のSMRV配列を含むミンク肺細胞からな
っていた。
プローブはプラスミドベクター配列から単離された全
長SMRVゲノムからなっていた。
長SMRVゲノムからなっていた。
（ｂ）ハイブリダイゼーションのためのDNAの調製 試験DNA、ネガティブコントロールのヒト胎盤DNA、SM
RVポジティブのNamalwaDNA、およびCCL194DNAの10μｇ
試料を、エンドヌクレアーゼBamH I、Bgl II、EcoR Iお
よびPst Iで完全に消化した。組替え体ポジティブコン
トロールは、10μｇのヒト胎盤DNAに組換え体SMRVプラ
スミドDNA100、10、１および0.1ゲノム当量加えること
によって構築した。次に、これらをエンドヌクレアーゼ
EcoR Iで完全に消化した。
RVポジティブのNamalwaDNA、およびCCL194DNAの10μｇ
試料を、エンドヌクレアーゼBamH I、Bgl II、EcoR Iお
よびPst Iで完全に消化した。組替え体ポジティブコン
トロールは、10μｇのヒト胎盤DNAに組換え体SMRVプラ
スミドDNA100、10、１および0.1ゲノム当量加えること
によって構築した。次に、これらをエンドヌクレアーゼ
EcoR Iで完全に消化した。
生成するDNA断片を、0.8％アガロースゲルで電気泳動
することによって分離した。DNAを、HClで短時間処理し
て脱プリン化し、アルカリで変性し、インシトゥで中和
した後、毛管ブロッティングによって帯電したナイロン
膜に移した。
することによって分離した。DNAを、HClで短時間処理し
て脱プリン化し、アルカリで変性し、インシトゥで中和
した後、毛管ブロッティングによって帯電したナイロン
膜に移した。
（ｃ）プレハイブリダイゼーションおよびハイブリダイ
ゼーション 膜を、50％ホルムアミド/4×SSPEを含むハイブリダイ
ゼーション緩衝液中で42℃で２時間インキュベーション
することによってプレハイブリダイゼーションした。
ゼーション 膜を、50％ホルムアミド/4×SSPEを含むハイブリダイ
ゼーション緩衝液中で42℃で２時間インキュベーション
することによってプレハイブリダイゼーションした。
プレハイブリダイゼーションの後、緩衝液を、32Pで
高特異活性まで標識した変性SMRV DNAを含む新たなハ
イブリダイゼーション緩衝液で置換した。
高特異活性まで標識した変性SMRV DNAを含む新たなハ
イブリダイゼーション緩衝液で置換した。
ハイブリダイゼーションは、42℃で16時間行った。ハ
イブリダイゼーションの後、膜を室温で２×SSC/0.1％S
DS中で15分間、次いで65℃で２×SSC/0.1SDS中で15分間
洗浄した後、65℃で0.1×SSC/0.1％SDS中で３×30分間
洗浄した。膜のオートラジオグラフィーは、膜をＸ線フ
ィルムに24時間および72時間暴露することによって行っ
た。
イブリダイゼーションの後、膜を室温で２×SSC/0.1％S
DS中で15分間、次いで65℃で２×SSC/0.1SDS中で15分間
洗浄した後、65℃で0.1×SSC/0.1％SDS中で３×30分間
洗浄した。膜のオートラジオグラフィーは、膜をＸ線フ
ィルムに24時間および72時間暴露することによって行っ
た。
（ｄ）オリゴヌクレオチドプライマーおよびプローブ オリゴヌクレオチド増幅産物およびプローブ SMRVゲノム上の位置:tRNA結合部位を包含する増幅産
物を用いた。増幅産物１はヌクレオチド805〜825由来の
ものであり、増幅産物２はヌクレオチド1006〜990由来
のものであり、プローブはオリゴヌクレオチド863〜888
にとって内部にある。tRNA結合部位は、ヌクレオチド86
3〜880由来のものである。
物を用いた。増幅産物１はヌクレオチド805〜825由来の
ものであり、増幅産物２はヌクレオチド1006〜990由来
のものであり、プローブはオリゴヌクレオチド863〜888
にとって内部にある。tRNA結合部位は、ヌクレオチド86
3〜880由来のものである。
ネステド（nested）PCRのオリゴヌクレオチド増幅産物
およびプローブ SMRVゲノム上の位置：外部プライマーセットについ
て、増幅産物３はヌクレオチド367〜384由来のものであ
り、増幅産物４はヌクレオチド798〜781由来ものであ
る。内部プライマーセットは、ヌクレオチド401〜421由
来の増幅産物１およびヌクレオチド604〜588由来の増幅
産物２からなっていた。プローブは、ヌクレオチド459
〜482由来の増幅産物にとって内部にある。
およびプローブ SMRVゲノム上の位置：外部プライマーセットについ
て、増幅産物３はヌクレオチド367〜384由来のものであ
り、増幅産物４はヌクレオチド798〜781由来ものであ
る。内部プライマーセットは、ヌクレオチド401〜421由
来の増幅産物１およびヌクレオチド604〜588由来の増幅
産物２からなっていた。プローブは、ヌクレオチド459
〜482由来の増幅産物にとって内部にある。
内部コントロール増幅産物 用いた内部コントロール増幅産物は、β−グロブリン
遺伝子由来であり、205bpのDNA生成物を増幅する。
遺伝子由来であり、205bpのDNA生成物を増幅する。
（ｅ）試料調製 試験細胞の一部を、PCR増幅工程を妨害するリーシス
生成物を効率的に吸収するマトリックスの存在下で煮沸
することによってリーシスした。マトリックスをマイク
ロ遠心分離によってペレット化し、上清を用いて増幅し
た。総ての場合に、ネガティブコントロールおよび試験
DNAだけで使用するように指示されたポジティブ置換ピ
ペットを用いた。
生成物を効率的に吸収するマトリックスの存在下で煮沸
することによってリーシスした。マトリックスをマイク
ロ遠心分離によってペレット化し、上清を用いて増幅し
た。総ての場合に、ネガティブコントロールおよび試験
DNAだけで使用するように指示されたポジティブ置換ピ
ペットを用いた。
（ｆ）PCR反応の調製 試験DNAおよびネガティブコントロール試料の調製の
前に、DNAを含まないSMRV反応混合物からなる３個のセ
ンティネル・コントロール（sentinel controls）を調
製した。試料処理の期間中、試験管を空けたままにし、
汚染の可能性を評価した。
前に、DNAを含まないSMRV反応混合物からなる３個のセ
ンティネル・コントロール（sentinel controls）を調
製した。試料処理の期間中、試験管を空けたままにし、
汚染の可能性を評価した。
ネガティブコントロール試料および試験製品試料 ネガティブコントロール試料は、２×105個の細胞
（約１μｇ）と同等な２個のヒト胎盤DNAからなってい
た。
（約１μｇ）と同等な２個のヒト胎盤DNAからなってい
た。
試験試料は、２×105個の細胞（約１μｇ）と同等な
２個の部分精製したDNAからなっていた。
２個の部分精製したDNAからなっていた。
ポジティブコントロール ヒト胎盤DNAの一部を、500個の細胞中１個（5.6f
g）、1000個の細胞中１個（2.8fg）、2000個の細胞中１
個（1.4fg）と同等なSMRVの希釈物を加えた。次に、こ
れらの試料を、SMRV反応混合物に加えた。精製したCCL1
94DNA １μｇからなる追加のポジティブコントロール
も、SMRV反応混合物に加えた。
g）、1000個の細胞中１個（2.8fg）、2000個の細胞中１
個（1.4fg）と同等なSMRVの希釈物を加えた。次に、こ
れらの試料を、SMRV反応混合物に加えた。精製したCCL1
94DNA １μｇからなる追加のポジティブコントロール
も、SMRV反応混合物に加えた。
β−グロブリン内部コントロール β−グロブリン反応混合物からなる３個のセンティネ
ルコントロールを調製し、２×105個の細胞と同等な試
験DNAの一部をSMRV反応と平行して実験し、DNAを増幅し
得ることを確認した。
ルコントロールを調製し、２×105個の細胞と同等な試
験DNAの一部をSMRV反応と平行して実験し、DNAを増幅し
得ることを確認した。
（ｇ）ネステドPCR反応の調製 主（外部）反応 試験DNAおよびネガティブコントロール試料の調製の
前に、DNAを含まない主（外部）SMRV反応混合物からな
る３個のセンティネル・コントロール（sentinel contr
ols）を調製した。試料処理の期間中、試験管を空けた
ままにし、汚染の可能性を評価した。
前に、DNAを含まない主（外部）SMRV反応混合物からな
る３個のセンティネル・コントロール（sentinel contr
ols）を調製した。試料処理の期間中、試験管を空けた
ままにし、汚染の可能性を評価した。
ネガティブコントロール試料は、２×105個の細胞
（約１μｇ）と同等な２個のヒト胎盤DNAからなってい
た。
（約１μｇ）と同等な２個のヒト胎盤DNAからなってい
た。
試験試料は、２×105個の細胞（約１μｇ）と同等な
２個の部分精製したDNAからなっていた。
２個の部分精製したDNAからなっていた。
ヒト胎盤DNAの一部を、500個の細胞中１個（5.6f
g）、1000個の細胞中１個（2.7fg）、2000個の細胞中１
個（1.4fg）と同等なSMRVの希釈物を加えた。次に、こ
れらの試料を、反応混合物に加えた。精製したCCL194DN
A １μｇからなる追加のポジティブコントロールも、
主（外部）SMRV反応混合物に加えた。
g）、1000個の細胞中１個（2.7fg）、2000個の細胞中１
個（1.4fg）と同等なSMRVの希釈物を加えた。次に、こ
れらの試料を、反応混合物に加えた。精製したCCL194DN
A １μｇからなる追加のポジティブコントロールも、
主（外部）SMRV反応混合物に加えた。
二次（内部）ネステド反応 １回のPCR（主反応）が終了した後、それぞれの反応
の２μｌを採取し、二次（内部）SMRV反応混合物に加え
た。
の２μｌを採取し、二次（内部）SMRV反応混合物に加え
た。
（ｈ）PCR反応条件 PCRの反応条件は、下記の通りであった。β−グロブ
リンおよびSMRV PCR:97℃１分間の変性、55℃45秒間の
アニーリング、および68℃１分間の伸長からなる３サイ
クル。この後に、95℃１分間の変性、55℃45秒間のアニ
ーリング、および68℃１分間の伸長からなる30サイクル
を行った。最後のDNAの伸長は、サイクリングの後68℃
で10分間行った。
リンおよびSMRV PCR:97℃１分間の変性、55℃45秒間の
アニーリング、および68℃１分間の伸長からなる３サイ
クル。この後に、95℃１分間の変性、55℃45秒間のアニ
ーリング、および68℃１分間の伸長からなる30サイクル
を行った。最後のDNAの伸長は、サイクリングの後68℃
で10分間行った。
ネステドプライマーを用いるPCRとの反応条件は、下
記の通りであった。
記の通りであった。
第一反応： 95℃３分間の変性、55℃45秒間のアニーリング、およ
び72℃２分間の伸長からなる２サイクル。この後に、95
℃１分間の変性、55℃45秒間のアニーリング、および68
℃１分間の伸長からなる25サイクルを行った。
び72℃２分間の伸長からなる２サイクル。この後に、95
℃１分間の変性、55℃45秒間のアニーリング、および68
℃１分間の伸長からなる25サイクルを行った。
第二反応： 97℃１分間の変性、55℃45秒間のアニーリング、およ
び68℃１分間の伸長からなる３サイクル。この後に、95
℃１分間の変性、55℃45秒間のアニーリング、および68
℃１分間の伸長からなる30サイクルを行った。最後のDN
Aの伸長は、サイクリングの後68℃で10分間行った。
び68℃１分間の伸長からなる３サイクル。この後に、95
℃１分間の変性、55℃45秒間のアニーリング、および68
℃１分間の伸長からなる30サイクルを行った。最後のDN
Aの伸長は、サイクリングの後68℃で10分間行った。
（ｉ）電気泳動およびハイブリダイゼーション 終了した反応物の一部を、５％（容量／容量）アクリ
ルアミドゲル（SMRV PCR生成物）または1.5％アガロー
スゲル（ネステドPCR生成物）中で電気泳動し、臭化エ
チリジウムで染色し、UV光線下で検討して、写真撮影し
た。DNAを変性し、インシトゥで中和して、電気ブロッ
ティング（SMRV PCR生成物）または毛管ブロッティン
グ（ネステドPCR生成物）によって帯電したナイロン膜
に移した。DNAを80℃で加熱することによって膜に結合
した。
ルアミドゲル（SMRV PCR生成物）または1.5％アガロー
スゲル（ネステドPCR生成物）中で電気泳動し、臭化エ
チリジウムで染色し、UV光線下で検討して、写真撮影し
た。DNAを変性し、インシトゥで中和して、電気ブロッ
ティング（SMRV PCR生成物）または毛管ブロッティン
グ（ネステドPCR生成物）によって帯電したナイロン膜
に移した。DNAを80℃で加熱することによって膜に結合
した。
膜を、５×SSCおよび７％SDS（重量／容量）を含むハ
イブリダイゼーション緩衝液中で50℃で２時間インキュ
ベーションすることによって予備ハイブリダイゼーショ
ンした。予備ハイブリダイゼーションの後、緩衝液をSM
RVに特異的な32P−５−′−末端標識したオリゴヌクレ
オチドを含むハイブリダイゼーション緩衝液に代えた。
ハイブリダイゼーションを、50℃で16時間継続した。ハ
イブリダイゼーションの後、膜を周囲温度で５×SSC/0.
1％SDS（重量／容量）中で３×２分間洗浄した後、50℃
で５×SSC/0.1SDS（重量／容量）中で３×30分間洗浄
し、最後に68℃で５分間洗浄した（Tm−４℃）。膜のオ
ートラジオグラフィーは、フィルターをＸセンフィルム
に16時間暴露することによって行った。
イブリダイゼーション緩衝液中で50℃で２時間インキュ
ベーションすることによって予備ハイブリダイゼーショ
ンした。予備ハイブリダイゼーションの後、緩衝液をSM
RVに特異的な32P−５−′−末端標識したオリゴヌクレ
オチドを含むハイブリダイゼーション緩衝液に代えた。
ハイブリダイゼーションを、50℃で16時間継続した。ハ
イブリダイゼーションの後、膜を周囲温度で５×SSC/0.
1％SDS（重量／容量）中で３×２分間洗浄した後、50℃
で５×SSC/0.1SDS（重量／容量）中で３×30分間洗浄
し、最後に68℃で５分間洗浄した（Tm−４℃）。膜のオ
ートラジオグラフィーは、フィルターをＸセンフィルム
に16時間暴露することによって行った。
2.有効性および結果 （ａ）有効性 DNAハイブリダイゼーション 用いたハイブリダイゼーション条件下で、SMRVプロー
ブは、ウイルスにネガティブなヒト胎盤DNAのバックグ
ラウンド中でSMRVK1ゲノム当量にまで低下して検出され
た。ウイルスについての検出の感度は、細胞当たり0.1
g.e.の程度である。
ブは、ウイルスにネガティブなヒト胎盤DNAのバックグ
ラウンド中でSMRVK1ゲノム当量にまで低下して検出され
た。ウイルスについての検出の感度は、細胞当たり0.1
g.e.の程度である。
PCR 有効性試験は、標的配列の適当な増幅がポジティブコ
ントロールDNAで検出され、総てのネガティブコントロ
ールについては検出されない試験として定義される。ま
た、ゲノム標的配列の増幅は、総ての試料で見られなけ
ればならない。試験は有効であり、標的配列の増幅は、
ポジティブコントロールDNAで検出され、ネガティブコ
ントロールでは検出されなかった。β−グロブリンゲノ
ム標的の増幅は、総ての試料で検出された。
ントロールDNAで検出され、総てのネガティブコントロ
ールについては検出されない試験として定義される。ま
た、ゲノム標的配列の増幅は、総ての試料で見られなけ
ればならない。試験は有効であり、標的配列の増幅は、
ポジティブコントロールDNAで検出され、ネガティブコ
ントロールでは検出されなかった。β−グロブリンゲノ
ム標的の増幅は、総ての試料で検出された。
（ｂ）試験結果:DNAハイブリダイゼーション 試験DNAにおけるSMRV特異配列の非存在：ハイブリダ
イゼーションのストリンジェント条件下では、放射能標
識したSMRVプローブのネガティブコントロールDNAまた
は試験DNAへのハイブリダイゼーションは見られなかっ
た。
イゼーションのストリンジェント条件下では、放射能標
識したSMRVプローブのネガティブコントロールDNAまた
は試験DNAへのハイブリダイゼーションは見られなかっ
た。
（ｃ）試験結果PCR β−グロブリン内部コントロール ３個のセンティネルコントロールの分析では、目に見
える増幅バンドは見られなかった。しかしながら、DNA
を含むそれぞれの反応混合物では、約205bpの予想した
大きさの不連続バンドが見られ、DNAがPCR増幅に適して
いたことを示していた。
える増幅バンドは見られなかった。しかしながら、DNA
を含むそれぞれの反応混合物では、約205bpの予想した
大きさの不連続バンドが見られ、DNAがPCR増幅に適して
いたことを示していた。
ネガティブコントロール 増幅したDNA断片は、３個のセンティネルコントロー
ルでも、ネガティブコントロールDNA反応でも見られな
かった。放射能標識したプローブのセンティネルコント
ロールまたはネガティブコントロールDNAへの特異的ハ
イブリダイゼーションは見られなかった。
ルでも、ネガティブコントロールDNA反応でも見られな
かった。放射能標識したプローブのセンティネルコント
ロールまたはネガティブコントロールDNAへの特異的ハ
イブリダイゼーションは見られなかった。
ポジティブコントロール SMRV DNA由来の増幅断片の予想される大きさは、201
bp（ヌクレオチド805〜1006から）となる。約201bpの不
連続バンドは、SMRV DNA5.6fg、2.8fgおよび1.4fgの量
を含む３種類の組換え体ポジティブコントロールDNAレ
ーン、およびCCL194ポジティブコントロールレーンで検
出された。この201bpは、反応が予想断片を増幅したこ
とを示す放射能標識したプローブによって検出された。
この分析法の感度は、2000個の細胞中1g.e.程度であ
る。
bp（ヌクレオチド805〜1006から）となる。約201bpの不
連続バンドは、SMRV DNA5.6fg、2.8fgおよび1.4fgの量
を含む３種類の組換え体ポジティブコントロールDNAレ
ーン、およびCCL194ポジティブコントロールレーンで検
出された。この201bpは、反応が予想断片を増幅したこ
とを示す放射能標識したプローブによって検出された。
この分析法の感度は、2000個の細胞中1g.e.程度であ
る。
試験DNA 特異的な増幅DNA断片は、試験DNA中で視覚的にまたは
放射能標識したプローブとハイブリダイゼーションした
後に検出されなかった。
放射能標識したプローブとハイブリダイゼーションした
後に検出されなかった。
（ｄ）試験結果ネステドPCR、二次（内部）反応 ネガティブコントロール 増幅したDNA断片は、３個のセンティネルコントロー
ルでも、ネガティブコントロールDNA反応でも見られな
かった。放射能標識したプローブのセンティネルコント
ロールまたはネガティブコントロールDNAへの特異的ハ
イブリダイゼーションは見られなかった。
ルでも、ネガティブコントロールDNA反応でも見られな
かった。放射能標識したプローブのセンティネルコント
ロールまたはネガティブコントロールDNAへの特異的ハ
イブリダイゼーションは見られなかった。
ポジティブコントロール SMRV DNAからの増幅断片の予想される大きさは、203
bp（ヌクレオチド401〜604から）となら。約203bpの不
連続バンドは、SMRV DNA5.6fg、2.5fgおよび1.4fgの量
を含む３種類の組換え体ポジティブコントロールDNAレ
ーン、およびCCL194ポジティブコントロールレーンで検
出された。この203bpバンドは、反応が予想断片を増幅
したことを示す放射能標識したプローブによって検出さ
れた。バンドは、DNAの1.4fg、0.7fg、0.35fg、0.175fg
および0.087fgの希釈物を含むポジティブコントロール
で検出された。これらの試料は、DNAハイブリダイゼー
ション分析を行わなかった。この分析法の感度は、10,0
00個の細胞中1g.e.未満である。
bp（ヌクレオチド401〜604から）となら。約203bpの不
連続バンドは、SMRV DNA5.6fg、2.5fgおよび1.4fgの量
を含む３種類の組換え体ポジティブコントロールDNAレ
ーン、およびCCL194ポジティブコントロールレーンで検
出された。この203bpバンドは、反応が予想断片を増幅
したことを示す放射能標識したプローブによって検出さ
れた。バンドは、DNAの1.4fg、0.7fg、0.35fg、0.175fg
および0.087fgの希釈物を含むポジティブコントロール
で検出された。これらの試料は、DNAハイブリダイゼー
ション分析を行わなかった。この分析法の感度は、10,0
00個の細胞中1g.e.未満である。
試験DNA 特異的な増幅DNA断片は、試験DNA中で視覚的にまたは
放射能標識したプローブとハイブリダイゼーションした
後に検出されなかった。
放射能標識したプローブとハイブリダイゼーションした
後に検出されなかった。
3.結論 結果は、SMRVを含まないNamalwa細胞系Ｘ由来のネガ
ティブコントロールヒト胎盤DNAおよび試験DNAのいずれ
とも一致している。
ティブコントロールヒト胎盤DNAおよび試験DNAのいずれ
とも一致している。
実施例２ SMRVネガティブNamalwa細胞を二重限定希釈によりク
ローニングして、99.99％の統計学的確率で誘導された
クローンを単一細胞から発生させた。Namalwa細胞系Ｘ
からの親細胞を、10％ウシ胎児血清、100U・ml-1ペニシ
リン、100μｇ・ml-1ストレプトマイシン、および4mMグ
ルタミンを補足したRPMI1640培地を含んでなる培地で整
地培養で成育した。細胞を整地培養で成育し、２〜３日
毎に分裂させ、成長培地で希釈して0.2×106個・ml-1の
細胞とし、トリパンブルー除外法によって示されるよう
に＞90％の成育力を示す培養物だけを保持した。
ローニングして、99.99％の統計学的確率で誘導された
クローンを単一細胞から発生させた。Namalwa細胞系Ｘ
からの親細胞を、10％ウシ胎児血清、100U・ml-1ペニシ
リン、100μｇ・ml-1ストレプトマイシン、および4mMグ
ルタミンを補足したRPMI1640培地を含んでなる培地で整
地培養で成育した。細胞を整地培養で成育し、２〜３日
毎に分裂させ、成長培地で希釈して0.2×106個・ml-1の
細胞とし、トリパンブルー除外法によって示されるよう
に＞90％の成育力を示す培養物だけを保持した。
３日間で0.2〜2,000,000個・ml-1の細胞の成育を示す
細胞だけを選択して希釈クローニングし、希釈クローニ
ングを約２×106個・ml-1の細胞の密度にまで成長した
細胞で行うのが本質的であることを見出だした。選択し
た細胞を、96穴の低蒸発トレーに希釈し、１〜300個の
細胞／ウェルで３週間培養成長させ、アルミニウム箔に
包んだ。
細胞だけを選択して希釈クローニングし、希釈クローニ
ングを約２×106個・ml-1の細胞の密度にまで成長した
細胞で行うのが本質的であることを見出だした。選択し
た細胞を、96穴の低蒸発トレーに希釈し、１〜300個の
細胞／ウェルで３週間培養成長させ、アルミニウム箔に
包んだ。
単一コロニーを、単一コロニーを有するウェルが10％
未満のプレートから採取し、２回目の希釈クローニング
を行った。次に、二重希釈したクローンを、12穴トレー
の１×106個・ml-1の細胞の細胞濃度を用い、1mM酪酸ナ
トリウムで処理した後、センダイウイルスを１μl/ウェ
ル加える小規模IFN誘導によって比較した。更に24時間
後、IFNを回収して、ELISAによって分析した。ELISAがI
FNの十分な定量的発現を示したクローンを、大規模培養
／誘導で更に増幅し、逆相高圧液体クロマトグラフィー
（RPHPLC）によりα−IFNサブユニットプロフィールの
定性分析を行い、所望なプロフィールを示すクローン
Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄなどを選択した。
未満のプレートから採取し、２回目の希釈クローニング
を行った。次に、二重希釈したクローンを、12穴トレー
の１×106個・ml-1の細胞の細胞濃度を用い、1mM酪酸ナ
トリウムで処理した後、センダイウイルスを１μl/ウェ
ル加える小規模IFN誘導によって比較した。更に24時間
後、IFNを回収して、ELISAによって分析した。ELISAがI
FNの十分な定量的発現を示したクローンを、大規模培養
／誘導で更に増幅し、逆相高圧液体クロマトグラフィー
（RPHPLC）によりα−IFNサブユニットプロフィールの
定性分析を行い、所望なプロフィールを示すクローン
Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄなどを選択した。
実施例３ 標準的な製造法によって産生して精製したα−IFN（L
ewis,W.G.and Finter,N.B.（1987），「リンパ芽球様細
胞由来の混合ヒトαインターフェロン製剤（Wellfero
n）の産生および精製」，ザ・インターフェロン・シス
テム（The Interferon System）（Baron,S.,Dianzani,
F.,Stanton,G.J.and Fleischmann,W.R.Jnr.監修）,Texa
s University Press）を、RPHPLCで得られたサブタイプ
曲線について分析し、第１図に示した。
ewis,W.G.and Finter,N.B.（1987），「リンパ芽球様細
胞由来の混合ヒトαインターフェロン製剤（Wellfero
n）の産生および精製」，ザ・インターフェロン・シス
テム（The Interferon System）（Baron,S.,Dianzani,
F.,Stanton,G.J.and Fleischmann,W.R.Jnr.監修）,Texa
s University Press）を、RPHPLCで得られたサブタイプ
曲線について分析し、第１図に示した。
実施例４ クローニングしたNamalwa細胞受託番号ECACC94120841に
よって産生されたインターフェロンについての精製プロ
トコール SMRVネガティブなクローンを選択し（ECACC9412084
1）、３×300ml振盪フラスコで成育し、標準的プロトコ
ールに従ってブチレート処理を行った後、センダイウイ
ルスで誘導した（Lewis,W.G.and Finter,N.B.,上記）。
培養上清を回収し、精製した抗インターフェロン抗体イ
ムノアフィニティーカラム上で２回通過させることによ
って精製した。インターフェロンを濃縮し、RPHPLCによ
って分析して、第２表に示されているサブタイプ組成
と、第２図に示されている曲線を測定した。小規模実験
室での調製で得られたインターフェロンの純度は、イン
ターフェロンの製造バッチ（実施例２および第１図）の
それに匹敵するものではなく、下記に示される百分率で
のピークについての値はインターフェロン以外のタンパ
ク質の存在によって影響される可能性があることに留意
しなければならない。
よって産生されたインターフェロンについての精製プロ
トコール SMRVネガティブなクローンを選択し（ECACC9412084
1）、３×300ml振盪フラスコで成育し、標準的プロトコ
ールに従ってブチレート処理を行った後、センダイウイ
ルスで誘導した（Lewis,W.G.and Finter,N.B.,上記）。
培養上清を回収し、精製した抗インターフェロン抗体イ
ムノアフィニティーカラム上で２回通過させることによ
って精製した。インターフェロンを濃縮し、RPHPLCによ
って分析して、第２表に示されているサブタイプ組成
と、第２図に示されている曲線を測定した。小規模実験
室での調製で得られたインターフェロンの純度は、イン
ターフェロンの製造バッチ（実施例２および第１図）の
それに匹敵するものではなく、下記に示される百分率で
のピークについての値はインターフェロン以外のタンパ
ク質の存在によって影響される可能性があることに留意
しなければならない。
第２表は、RPHPLCでの溶出ピーク番号と、相当するα
−IFNサブタイプ、およびクローニングした細胞系から
得たそれぞれのサブタイプの相対比（「ピーク面積
（％）」、並びに比較のための、治療上許容可能なリン
パ芽球様インターフェロンにおけるそれぞれのサブタイ
プの範囲を示している。
−IFNサブタイプ、およびクローニングした細胞系から
得たそれぞれのサブタイプの相対比（「ピーク面積
（％）」、並びに比較のための、治療上許容可能なリン
パ芽球様インターフェロンにおけるそれぞれのサブタイ
プの範囲を示している。
第１図および第２図を比較することによって、Wellfe
ron（登録商標）の産生に現在用いられているSMRVポジ
ティブNamalwa細胞系についてのIFN曲線（第１図）とSM
RVネガティブNamalwa細胞系ECACC94120841との間に、極
めて有意かつ十分な水準の同一性が見られる。これらの
細胞系由来のインターフェロンは、実質的に同等である
と考えることができる。
ron（登録商標）の産生に現在用いられているSMRVポジ
ティブNamalwa細胞系についてのIFN曲線（第１図）とSM
RVネガティブNamalwa細胞系ECACC94120841との間に、極
めて有意かつ十分な水準の同一性が見られる。これらの
細胞系由来のインターフェロンは、実質的に同等である
と考えることができる。
本明細書におけるα−IFNサブタイプに関する総ての
表現は、ザ・インターナショナル・ソサイエティー・フ
ォー・インターフェロン・アンド・サイトカイン・リサ
ーチ（the International Society for Interferon and
Cytokine Research）によって承認され、the Journal
of Interferon Research,14:223−226（1994）に公表さ
れたヒトインターフェロンタンパク質の名称と一致して
いる。
表現は、ザ・インターナショナル・ソサイエティー・フ
ォー・インターフェロン・アンド・サイトカイン・リサ
ーチ（the International Society for Interferon and
Cytokine Research）によって承認され、the Journal
of Interferon Research,14:223−226（1994）に公表さ
れたヒトインターフェロンタンパク質の名称と一致して
いる。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｒ 1:91） Ａ６１Ｋ 37/66 Ｂ (72)発明者 コーネリア、ロスマン スエーデン国ルンド、シーレス、２アス トラ−ドラコ、アクチボラグ (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12N 15/09 A61K 38/21 C12N 5/10 C12P 21/02 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＭＥＤＬＩＮＥ（ＳＴＮ)
Claims (15)
- 【請求項１】リスザルレトロウイルスを含まないNamalw
a細胞系。 - 【請求項２】サブタイプ2b、７、10、17および21を含ん
でなるα−インターフェロンサブタイプの個体群を産生
することができる、請求項１に記載の細胞系。 - 【請求項３】サブタイプが、サブタイプ１、2b、５、
７、８、10、14、17および21を含んでなる、請求項２に
記載の細胞系。 - 【請求項４】α−インターフェロンサブタイプが、下記
の量で産生される、請求項３に記載の細胞系。 - 【請求項５】天然には、リスザルレトロウイルスを含ま
ない、請求項１〜４のいずれか１項に記載の細胞系。 - 【請求項６】細胞系ECACC94120840またはECACC94120841
によって産生されるものと実質的に同じα−インターフ
ェロンサブタイプの個体群を産生することができる、請
求項１に記載の細胞系。 - 【請求項７】サブタイプの個体群が、細胞系ECACC94120
840またはECACC94120841によって産生されるものと実質
的に同じである、請求項６に記載の細胞系。 - 【請求項８】細胞系ECACC94120840またはECACC9412084
1、またはそれらから誘導される細胞系である、請求項
１に記載の細胞系。 - 【請求項９】目的とするポリペプチドをコードする外来
の発現可能なDNA配列を固定する、請求項１〜８のいず
れか１項に記載の細胞系。 - 【請求項１０】複製シグナル、パッケージング配列およ
び目的とする遺伝子を含んでなる相当するウイルスベク
ターをパッケージングするのに十分な発現可能なウイル
ス遺伝子を固定する、請求項１〜８のいずれか１項に記
載の細胞系。 - 【請求項１１】α−インターフェロンの製造法であっ
て、請求項１〜８のいずれか１項に記載の細胞系を培養
し、このようにして産生されたα−インターフェロンを
単離することを特徴とする、方法。 - 【請求項１２】請求項１〜８のいずれか１項に記載の細
胞系を、目的とするポリペプチドをコードする発現可能
なDNA配列でトランスフェクションすることを含んでな
る、請求項９に記載の細胞系の製造法。 - 【請求項１３】目的とするポリペプチドの製造法であっ
て、請求項９に記載の細胞系を、上記ポリペプチドが発
現される条件下に保持し、発現したポリペプチドを回収
することを特徴とする、方法。 - 【請求項１４】請求項１〜８のいずれか１項に記載の細
胞系を、複製シグナル、パッケージング配列および目的
とする遺伝子を含んでなる相当するウイルスベクターを
パッケージングするのに十分な発現可能なウイルス遺伝
子でトランスフェクションすることを含んでなる、請求
項10に記載の細胞系の製造法。 - 【請求項１５】ウイルスのパッケージング法であって、
請求項10に記載の細胞系を、複製シグナル、パッケージ
ング配列および目的とする遺伝子を含んでなる相当する
ウイルスベクターでトランスフェクションすることを含
んでなる、方法。
Applications Claiming Priority (1)
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|---|---|---|---|
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