ES2288755T3 - Linea celular. - Google Patents
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Abstract
LA INVENCION SE REFIERE A UNA LINEA CELULAR DE NAMALWA QUE ESTA EXENTA DEL RETROVIRUS DEL SAIMIRI (MONO ARDILLA) Y ES UTIL PARA LA PRODUCCION DE INTERFERON ALFA. DICHA LINEA CELULAR SE PUEDE UTILIZAR PARA LA EXPRESION DE POLIPEPTIDOS RECOMBINANTES Y PARA EL EMPAQUETAMIENTO DE VIRUS DESTINADOS A SER UTILIZADOS EN TERAPIA GENICA.
Description
Línea celular.
La presente invención se refiere a líneas de
células Namalwa y a su uso.
Los interferones alfa
(IFN-\alpha) pertenecen a una familia multigénica
localizada en un segmento de 400 kb del cromosoma 9 humano. La
familia comprende al menos 13 genes que codifican subtipos del
IFN-\alpha. Cada proteína alfa consta de 165 ó
166 residuos aminoácido con pesos moleculares de entre 18 y 26 kDa
(dependiendo del grado de glucosilación). Aunque químicamente
diferentes, los subtipos están estrechamente relacionados con
regiones de secuencias de aminoácidos muy opuestas.
Una fuente disponible comercialmente de
IFN-\alpha es el IFN alfa n1 (IFN \alpha n1) de
linfoblastoide humano que es un IFN-\alpha
natural. Se produce estimulando una línea celular linfoblastoide
humana Namalwa con el virus de Sendai para producir una mezcla de
al menos 13 subtipos de IFN-\alpha, que a
continuación se purifica por cromatografía (documentos
US-A-4216203;
EP-A-0000520;
EP-A-0097353). El número y la
cantidad de subtipos particulares se mantienen dentro de límites
definidos durante el proceso de fabricación.
Esta técnica para producir
IFN-\alpha de hecho fue desarrollada a principios
de los años 70. Fue durante ese periodo en el cual se generó la
línea celular usada actualmente para producir todo el interferón de
linfoblastoide humano disponible comercialmente en la actualidad a
partir de un tumor de linfoma de Burkitt. Este tumor se extrajo de
un individuo llamado Namalwa, generando así la línea celular
denominada de forma epónima (Strander H. y col., J. Clin. Microbiol.
1, 116-117, 1975 y Christofinis G. J. y col., J.
Gen. Virol. 52, 169-171, 1981). Las células Namalwa
están disponibles públicamente con el número de depósito del ATCC
00001432-CRL.
Las células Namalwa también se han usado para la
preparación de proteínas recombinantes (Yanagi H. y col., Gene 76,
19-26, 1989 y Okamoto M. y col., Bio/Technology
550-553, 1990). Las células Namalwa son atractivas
para la producción de proteínas recombinantes de origen humano. Se
puede esperar el procesamiento post-traduccional
correcto de las proteínas humanas recombinantes. Además, la
producción a escala industrial de líneas de células Namalwa está
bien establecida debido a su uso para producir
IFN-\alpha.
La posibilidad de que pueda haber contaminantes
asociados a los productos obtenidos a partir de una línea de
células Namalwa se ha investigado de manera exhaustiva. Las células
Namalwa se han probado respecto a la contaminación con bacterias,
virus y micoplasmas. Se han detectado algunos niveles del virus de
Epstein-Barr (EBV). No obstante, no se forma el
virus infeccioso. Además, no se puede detectar el antígeno temprano
del EBV incluso cuando las células se tratan con productos químicos
tales como bromodeoxiuridina que pueden inducir la replicación del
EBV.
No obstante, se ha detectado la presencia de
genoma del retrovirus del mono ardilla (SMRV, un retrovirus del
tipo D) (Middleton y col., Int. J. Cancer 52,
451-454, 1992). El SMRV se aisló por primera vez a
partir de un cultivo de pulmón de mono ardilla y presenta un
intervalo amplio de hospedadores in vitro incluyendo células
caninas, humanas, de chimpancés, de mono rhesus y de visón. El virus
es de interés particular puesto que se ha identificado como
contaminante de una serie de líneas celulares. Hasta la fecha, se
han identificado dos cepas del virus, SMRV y
SMRV-H, sobre la base de diferencias en los moldes
de la endonucleasa de restricción y la variación de secuencia.
Es posible asegurar que no sobreviven partículas
de SMRV viables en los protocolos de producción que se emplean para
obtener los productos que usan líneas de células Namalwa. No
obstante, claramente es preferible que no esté presente genoma del
SMRV en células Namalwa. Los genomas de SMRV fueron detectados por
Middleton y col. (citado anteriormente) en las 8 muestras de una
selección aleatoria de muestras de 8 líneas de células Namalwa de
laboratorios de todo el mundo. Por tanto se considera probable que
todas las células Namalwa previas, disponibles públicamente,
contengan el genoma de SMRV.
La prueba concluyente de que células
particulares carecen de contaminante vírico depende claramente de la
sensibilidad del sistema de ensayo particular empleado. El ensayo
directo para la presencia de ADN vírico mediante técnicas tales
como la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) puede permitir
sensibilidades de detección de hasta un genoma vírico por 100 a
1000 células, incluso hasta un genoma vírico por 10.000 células. No
obstante si una nueva línea celular se clona a partir de una única
célula, ésta contendrá necesariamente bien uno o más genomas
víricos por célula o ninguno. En consecuencia la posibilidad de
obtener un resultado de ensayo con un falso negativo será muy
inferior para esa línea celular clonada que para células
genéticamente heterogéneas.
Antes de la presente invención, se consideraba
que la presencia de SMRV era una característica inherente de la
línea de células Namalwa. Como se ha mencionado anteriormente, se
considera probable que todas las líneas de células Namalwa previas
disponibles públicamente contengan el genoma de SMRV.
De manera inesperada, se ha localizado una línea
de células Namalwa exenta de SMRV. También se h a encontrado de
manera inesperada que líneas de células Namalwa se podían clonar con
éxito usando cultivos estáticos de densidad elevada, en lugar de
baja densidad. Se demostró que las líneas de células Namalwa
clonadas resultantes estaban exentas de SMRV. Cada línea celular
clonada procedía de una única célula, proporcionando así una
garantía de que toda la población celular de la línea celular
clonada estaba exenta de SMRV.
Por consiguiente, la presente invención
proporciona una línea de células Namalwa que está exenta de SMRV.
Normalmente, la línea de células Namalwa es capaz de producir una
población heterogénea de subtipos de
IFN-\alpha.
La línea celular es preferentemente una línea
celular clonada. En ese caso, los subtipos de
IFN-\alpha generalmente son sustancialmente los
mismos que aquellos producidos por líneas de células Namalwa
existentes que se usan para la producción de interferón de
linfoblastoide disponible comercialmente. Una línea celular clonada
de la presente invención es una población genéticamente uniforme de
células procedentes de una única célula y es un clon a pesar de la
aparición de cualquier mutación aleatoria durante la generación de
la población clonal a partir de su única célula parental.
Preferentemente los subtipos de
IFN-\alpha generados mediante una línea celular de
la presente invención contienen al menos los subtipos de
IFN-\alpha 2b, 7, 10, 17 y 21; más preferentemente
1, 2b, 5, 7, 8, 10, 14, 17 y 21. Los subtipos de
IFN-\alpha se producen de manera ventajosa en los
intervalos cuantitativos relativos indicados en la Tabla 1 a
continuación. Estos intervalos definen los límites dentro de los
cuales caen preferentemente los subtipos de interferón de
linfoblastoide terapéuticamente aceptables. Es más preferido que
una línea celular genere un perfil de subtipos de
IFN-\alpha sustancialmente equivalente a aquel producido mediante las células Namalwa usadas para la producción de Wellferon, por ejemplo, mediante las células que forman el objeto del número de depósito ATCC 00001432-CRL. Este depósito se preparó en el ATCC, Rockville, Md. 20852, EE.UU. el 7 de julio de 1978.
IFN-\alpha sustancialmente equivalente a aquel producido mediante las células Namalwa usadas para la producción de Wellferon, por ejemplo, mediante las células que forman el objeto del número de depósito ATCC 00001432-CRL. Este depósito se preparó en el ATCC, Rockville, Md. 20852, EE.UU. el 7 de julio de 1978.
Dos líneas celulares SMRV negativas de acuerdo
con la presente invención se han hecho el objeto de los depósitos
del tratado de Budapest en la colección europea de cultivos de
células animales (European Collection of Animal Cell
Cultures), Porton Down, Salisbury SP4 0JG, GB el 8 de diciembre
de 1994 con los números de registro ECACC 94120840 y ECACC
94120841. Aquellas dos líneas celulares depositadas y las líneas
celulares derivadas de ellas son formas de realización
particularmente preferidas de la invención. La progenie de las
líneas celulares depositadas así forma un aspecto de la
invención.
Líneas celulares útiles según la invención son
líneas celulares exentas de SMRV capaces de producir una población
heterogénea de subtipos de IFN-\alpha, siendo los
subtipos sustancialmente los mismos que aquellos producidos por
cualquiera de las líneas celulares depositadas Nº ECACC 94120840 y
ECACC 94120841. La población de subtipos, el perfil de subtipos de
IFN-\alpha, puede ser sustancialmente la misma que
aquella producida por cualquiera de estas dos líneas celulares. Las
proporciones relativas de cada subtipo de
IFN-\alpha así pueden ser sustancialmente las
mismas que las proporciones relativas de cada subtipo producidas por
cualquiera de las líneas celulares depositadas.
Se ha localizado de manera fortuita una línea de
células Namalwa SMRV negativa. La línea celular de la invención así
puede ser una línea de células Namalwa exenta de SMRV de origen
natural. Esa línea celular puede estar en forma aislada. La línea
celular se puede haber clonado.
Una línea celular clonada de la invención se
puede preparar mediante una nueva forma de clonación por dilución
doble limitante. Al contrario que las metodologías de clonación por
dilución conocidas, se descubrió que, cuando células de una
viabilidad adecuada posteriormente se disponían en placas en
pocillos para obtener colonias individuales, se obtuvieron
resultados ventajosos usando cultivos estáticos de densidad elevada
(en lugar de la baja densidad esperada).
Es preferible realizar una ronda doble de
clonación por dilución cuando se genera una línea celular clonada
para obtener una probabilidad estadística muy elevada de hasta el
99,99% de que la línea celular resultante se origina a partir de
una única célula. Las células Namalwa exentas de SMRV parentales se
cultivan en un cultivo estático hasta una densidad elevada en un
medio apropiado que contiene un antibiótico adecuado, se dividen,
se diluyen y se vuelven a cultivar hasta una densidad elevada,
descartando aquellos cultivos que no demuestran una viabilidad >
90% usando un ensayo de viabilidad tal como exclusión en azul de
Tripano. A continuación las células se dividen y se diluyen de
nuevo.
La densidad celular debe ser preferentemente de
1,8 x 10^{6} células/ml o superior, por ejemplo de 1,8 x 10^{6}
a
2,4 x 10^{6} células/ml o de 2,0 x 10^{6} a 2,2 x 10^{6} células/ml. Una densidad celular adecuada es por tanto de 2 millones de células/ml aproximadamente. Es adecuada la dilución hasta 0,2 millones de células/ml.
2,4 x 10^{6} células/ml o de 2,0 x 10^{6} a 2,2 x 10^{6} células/ml. Una densidad celular adecuada es por tanto de 2 millones de células/ml aproximadamente. Es adecuada la dilución hasta 0,2 millones de células/ml.
No obstante, se puede generar un cultivo de
células Namalwa SMRV negativo a partir de una línea de células
Namalwa SMRV positiva usando tecnología de ADN recombinante. Así, se
pueden usar procedimientos tales como recombinación homóloga
directa para recombinar el genoma de SMRV integrado y sustituirlo
con un trozo de ADN no codificante.
Así es posible la deleción del genoma de SMRV
del cromosoma relevante de una línea de células Namalwa SMRV
positiva. Se identifican las secuencias que flanquean el genoma de
SMRV. Se construye un vector que contiene al menos 3 kb de la
secuencia flanqueadora en cualquiera de los lados del genoma de
SMRV. Se prepara una construcción diana en la que la región que se
va a suprimir se sustituye por un marcador seleccionable positivo
tal como una región codificante de resistencia a fármacos, dejando
el ADN flanqueador sin alterar.
Esta construcción, normalmente un plásmido, a
continuación se linealiza y se introduce en las células SMRV
positivas diana. La recombinación se produce como un acontecimiento
natural de baja frecuencia, y las células en las que esto se ha
producido con éxito se pueden seleccionar por su capacidad para
crecer en el fármaco que se debe haber introducido mediante la
construcción diana. A continuación los clones resistentes se deben
analizar para asegurarse de que la resistencia al fármaco no se ha
producido mediante un mecanismo no específico, y que el genoma de
SMRV se ha suprimido con éxito. Es posible modificar genéticamente
la construcción diana de tal forma como para seleccionarla frente a
recombinantes no específicos.
Una vez esto se haya completado, se ha suprimido
una copia del genoma. En un organismo heterocigótico también se
debe eliminar la segunda copia. Esto se realiza mediante el mismo
procedimiento, con una construcción diana que puede ser idéntica a
la primera en todos los aspectos, excepto porque contiene un
marcador seleccionable resistente a fármacos diferente. A
continuación se pueden seleccionar recombinantes dobles que son
resistentes a ambos fármacos, debido a la integración en ambos
cromosomas.
Alternativamente, es posible que una
sub-población de células exentas de SMRV pueda
existir en una línea de células Namalwa SMRV positiva. Así se
podría clonar una línea de células Namalwa SMRV positiva. A
continuación se pueden identificar los clones de células exentas de
SMRV. Se puede emplear el procedimiento de clonación por dilución
doble limitante anterior.
La presente invención también proporciona un
procedimiento para producir interferón alfa, comprendiendo el
procedimiento el cultivo de una línea celular de la presente
invención y el aislamiento del interferón alfa así producido. Así
se obtiene una población heteróloga de IFN-\alpha.
Las líneas celulares de la presente invención se pueden cultivar
según cualquier procedimiento apropiado. Se puede añadir al cultivo
un inductor de interferón tal como el virus de Sendai. El
interferón alfa se puede aislar por cromatografía de afinidad
usando anticuerpos anti-IFN. Un anticuerpo
policlonal adecuado para su uso en esa generación se puede producir
mediante técnicas muy conocidas en la materia (documento
US-A-4216203).
En más detalle, una muestra de una línea de
células Namalwa según la invención se puede descongelar del
almacenamiento en nitrógeno líquido y se puede cultivar en cultivos
de tamaño creciente dando lugar a un cultivo a gran escala. Un
medio de cultivo adecuado puede incluir RPMI 1640 suplementado con
suero, tal como suelo bovino adulto irradiado con rayos gamma.
Cuando la población celular es óptima, se puede añadir butirato
sódico para reducir la velocidad de crecimiento de las células y
optimizar el rendimiento de IFN posterior (documento
US-A-4216203). A continuación las
células se deben inducir para producir IFN, normalmente mediante la
adición del virus de Sendai. El IFN-\alpha en
bruto se aísla y a continuación se pasa a través de un proceso de
purificación que supone precipitaciones, extracción del disolvente
y cromatografía. La forma final tiene una pureza de al menos el 95%
y una actividad específica de 100 UI/mg de proteína aproximadamente
y consta de al menos 13 subtipos diferentes de
IFN-\alpha (Finter N. B. y col., CSHSQB 101,
571-575, 1986).
Las formulaciones farmacéuticas de la presente
invención comprenden IFN-\alpha producido a partir
de líneas celulares de la presente invención en mezcla con un
vehículo farmacéuticamente aceptable. Preferentemente el vehículo
comprende una mezcla de cloruro sódico, tris(trimetamina US),
glicina y solución de albúmina humana. Más preferentemente el
cloruro sódico está presente a 8,5 mg/ml, el Tris a 1,21 mg/ml, la
glicina a 0,75 mg/ml y la seroalbúmina humana a una concentración
que resulta en una concentración de proteína final de la formulación
de 1,5 mg/ml.
Los IFN-\alpha producidos a
partir de líneas celulares de la presente invención se pueden usar
en terapia de cualquier dolencia sensible a IFN linfoblastoide y se
pueden administrar por vías y en cantidades bien conocidas en la
técnica y sustancialmente idénticas a aquellas conocidas para IFN
linfoblastoides terapéuticos comerciales existentes.
\newpage
Por ejemplo, en el tratamiento de leucemia de
células pilosas, se debe administrar un régimen de dosificación de
tres megaunidades (3 MU), por ejemplo, intravenosamente (iv) al día
durante entre 12 y 16 semanas seguido de 3 MU tres veces por semana
hasta que no son detectables células pilosas en la médula ósea. En
terapia de hepatitis B, se pueden administrar 10-15
MU tres veces por semana durante entre 4 y 6 meses mientras que,
para la hepatitis C, se pueden administrar 3 MU durante hasta 6
meses. Estos regímenes de dosificación se aceptan en la materia
pero no impiden el uso de regímenes de dosificación alternativos o
superiores que dicten los factores clínicos particulares.
Una línea celular de la invención también se
puede usar como sistema de expresión dentro del cual se pueden
producir proteínas recombinantes. Por consiguiente, la presente
invención proporciona:
- una línea celular según la invención que
alberga una secuencia de ADN expresable exógena que codifica un
polipéptido de interés;
- un procedimiento para la preparación de esa
línea celular, comprendiendo el procedimiento la transfección de
una línea celular según la invención con una secuencia de ADN
expresable que codifica el polipéptido de interés; y
- un procedimiento para la preparación de un
polipéptido de interés, comprendiendo el procedimiento el
mantenimiento de una línea celular que alberga una secuencia de ADN
expresable exógena que codifica el polipéptido de interés en
condiciones tales que el polipéptido se expresa y se recupera el
polipéptido expresado.
Una línea celular capaz de expresar un
polipéptido de interés se puede preparar utilizando un vector de
expresión que comprende una secuencia de ADN que codifica el
polipéptido. El polipéptido normalmente es un polipéptido humano,
por ejemplo un factor de crecimiento. El polipéptido puede ser
insulina, eritropoyetina, hormona del crecimiento humana, GCSF,
GMCSF, activador del plasminógeno tisular, urocinasa, factor
sanguíneo VIII, proteína C, etc.
El vector de expresión es capaz de expresar el
polipéptido de interés cuando se proporciona en células exentas de
SMRV según la invención. Se proporcionan elementos de control
transcripcional y traduccional apropiados, incluyendo un promotor
unido de manera operable a la secuencia de ADN que codifica el
polipéptido deseado. El promotor puede ser el promotor temprano de
SV40 (virus del simio 40). Se proporcionan un potenciador, un sitio
de terminación de la transcripción y codones de inicio y detención
de la traducción. Pueden estar presentes una unión de empalme y un
sitio de poliadenilación adecuados. La secuencia de ADN se
proporciona en el marco de lectura correcto de manera que permite
que se produzca la expresión de polipéptido.
Así el vector de expresión es un vector que es
compatible con células Namalwa exentas de SMRV. Si se desea, está
presente un gen marcador seleccionable. El vector de expresión
normalmente es un plásmido. Generalmente comprende un origen de
replicación.
Las células Namalwa exentas de SMRV se
transfectan con el vector de expresión. A continuación las células
transfectadas se mantienen en condiciones que permiten que se
produzca la expresión del polipéptido deseado. Las células
transfectadas se cultivan en un medio apropiado para este propósito.
El polipéptido deseado que se ha expresado se aísla. El polipéptido
se purifica según sea necesario.
Las líneas celulares exentas de SMRV de la
invención se pueden usar adicionalmente como líneas celulares
complementarias para el empaquetamiento/cultivo de virus, por
ejemplo retrovirus o adenovirus. Por consiguiente, la presente
invención proporciona:
- una línea celular según la invención que
alberga suficientes genes víricos expresables para permitir a un
vector vírico correspondiente que comprende señales de replicación,
una secuencia de empaquetamiento y un gen de interés ser
empaquetado en ella;
- un procedimiento para la preparación de esa
línea celular, comprendiendo el procedimiento la transfección de
una línea celular según la invención con suficientes genes víricos
expresables para permitir a un vector vírico correspondiente que
comprende señales de replicación, una secuencia de empaquetamiento y
un gen de interés ser empaquetado en ella; y
- un procedimiento para el empaquetamiento de
virus, comprendiendo el procedimiento la transfección de una línea
celular que alberga suficientes genes víricos expresables para
permitir a un vector vírico correspondiente que comprende señales
de replicación, una secuencia de empaquetamiento y un gen de interés
ser empaquetado en ella con dicho vector vírico y la recuperación
del virus empaquetado resultante.
Los virus empaquetados se pueden usar en terapia
génica. Estos virus son incapaces de replicarse autónomamente
dentro de una célula diana pero pueden administrar un gen deseado a
esa célula.
El gen deseado se proporciona inicialmente en un
vector vírico que adicionalmente comprende las señales de
replicación víricas y una secuencia de empaquetamiento, a veces
denominada secuencia de empaquetamiento psi o secuencia de
encapsidación. Así el vector vírico carece, al menos, de secuencias
funcionales que son necesarias para la replicación del virus dentro
de una célula infectada.
Se puede emplear la línea celular para el
empaquetamiento de un retrovirus, en cuyo caso el vector vírico es
un vector retrovírico. Los retrovirus adecuados que se pueden
empaquetar incluyen el virus de la leucemia murina (MLV), virus de
la leucemia del gibón (GALV), virus reticuloendotelial (REV), virus
de esplenonecrosis (SNV, mamífero tipo C), virus de la leucosis
aviar (ALV, aviar C) y el virus espumoso humano (espuma HFV).
Cuando la línea celular se emplea para el
empaquetamiento de un retrovirus, el vector vírico comprende
secuencias de repetición terminal larga (LTR), el gen deseado y una
secuencia de empaquetamiento. Por tanto, normalmente el vector
vírico en esas circunstancias carece de los genes funcionales
gag, pol y env. Estos genes pueden faltar
completamente o en parte o pueden estar presentes pero ser no
funcionales. Así el vector vírico generalmente comprende un genoma
retroviral que carece de los genes funcionales apropiados pero que
incorpora el gen de interés.
El gen deseado se proporciona en el vector
vírico unido de manera operable a un promotor. El gen puede ser un
gen que codifica una linfoquina o una citoquina. Puede ser un gen
supresor de tumores, un gen corrector o un gen enzimático de GDEPT
(terapia de profármaco de enzima dirigida a genes). El promotor
puede ser un promotor del antígeno carcinoembriónico (CEA),
Muc-1, c-ErbB2, proteína de unión a
foliáceas (FBP) o el factor de crecimiento endotelial vascular
(VEGF). Las secuencias de terminación se pueden proporcionar según
sea necesario.
El vector vírico se introduce en una línea
celular según la invención que se proporciona con las funciones
víricas que permiten que se produzca la complementación del
empaquetamiento/cultivo. Así, la línea celular se proporciona con
los genes víricos que son capaces de complementar las funciones del
vector vírico. Estos genes expresan las proteínas víricas que
permiten que se produzca la complementación del
empaquetamiento/cultivo, normalmente proteínas estructurales,
enzimas de replicación y factores reguladores.
Cuando la línea celular se usa para empaquetar
un retrovirus, normalmente, los genes son los genes gag,
pol y env. En particular, son los genes víricos
funcionales que faltan en el vector vírico.
Los genes necesarios para la línea celular se
pueden integrar de manera estable en el genoma celular. Los genes
se pueden proporcionar en forma de ADN proviral. Se puede emplear
cualquier técnica apropiada para introducir los genes en la línea
celular.
Durante su uso, una línea celular que alberga
los genes virales necesarios para el empaquetamiento se infecta con
un vector vírico como anteriormente. A continuación el virus
empaquetado resultante se recoge del cultivo celular. El virus
recogido se puede purificar según se desee antes de su uso en
terapia génica.
Los siguientes Ejemplos ilustran la invención.
En los dibujos acompañantes:
La Figura 1 muestra el perfil de la
cromatografía líquida de alta presión en fase inversa (RPHPLC)
determinado para la línea de células Namalwa SMRV positiva sin
clonar usada actualmente en la producción de Wellferon (marca
comercial registrada); y
la Figura 2 muestra el perfil determinado para
la línea de células Namalwa exenta de SMRV clonadas ECACC
94120841.
Una línea de células Namalwa X que se había
localizado se probó respecto a la presencia del genoma de SMRV. Se
adoptó un procedimiento de ensayo que usa una sonda de SMRV genómica
que detectaría SMRV a menos de 1 copia de genoma por célula y
detectaría rutinariamente 1 copia de genoma por célula. El ADN de
prueba se cortó con endonucleasas de restricción que dieron
fragmentos de tamaño para el diagnóstico que se detectaron por
hibridación de ADN seguido de autorradiografía.
Además, se realizó un ensayo de reacción en
cadena de la polimerasa (PCR) usando dos amplímeros de
oligonucleótidos específicos de SMRV/LTR. Cualquier secuencia
amplificada sería identificada por hibridación con un
oligonucleótido sonda específico para SMRV. En las condiciones
usadas, el procedimiento detectaría al menos 1 copia de genoma por
2000 células o mejor. Puesto que el ensayo de PCR de hecho fue
negativo, se usó un ensayo adicional que emplea cebadores anidados
dentro del genoma de SMRV. El grupo de cebadores anidados puede
detectar SMRV hasta una sensibilidad de 1 copia de genoma por
10.000 células o mejor.
Se usó una pella que consta de 7 x 10^{7}
células de prueba aproximadamente para la preparación de ADN. La
pella celular se resuspendió en tampón de lisis de proteinasa K que
contiene 20 \mul/ml de RNasa y 100 \mug/ml de proteinasa K. La
suspensión se digirió durante 16 horas a 37ºC. El ADN
desproteinizado se extrajo dos veces con fenol y dos veces con
fenolcloroformo y finalmente se precipitó con etanol en presencia de
acetato de amonio. El ADN se recuperó por centrifugación a 3000 g
durante 30 minutos y se desechó el sobrenadante. La pella se lavó
en etanol al 70% y se dejó secar al aire durante 1 hora.
El ADN se dejó redisolver en tampón Tris EDTA
(TE) y la pureza y concentración del ADN se valoró por
espectrofotometría. La absorbancia se midió a 280 nm y 260 nm. La
relación 260/280 fue de 1,82 que indica que la muestra de ADN era
pura. El rendimiento de ADN se estimó que era de 315 \mug.
El ADN control negativo consistía en ADN de
placenta humana purificado que no contiene secuencias de SMRV
detectables.
El ADN control positivo de SMRV consistía en ADN
de placenta humana con ADN recombinante añadido, que representa el
genoma de SMRV completo, a 100, 10, 1 y 0,1 equivalentes de genoma.
Los equivalentes de genoma (e.g.) se calcularon asumiendo que el
genoma eucariota consta de 3 x 10^{9} pb y el genoma de SMRV es
8,4 x 10^{3} pb. En 10 \mug de ADN un equivalente de genoma
serían 28 pg de ADN de SMRV.
Controles positivos adicionales consistían en
ADN de Namalwa conocidos por albergar ADN de SMRV y CCL 194, un
tipo de célula pulmonar de visón que contiene secuencias de SMRV a
10 equivalentes de genoma por célula aproximadamente.
La sonda consiste en el genoma de SMRV de
longitud completa aislado de secuencias del vector plásmido.
Muestras de 10 \mug de ADN de prueba, ADN de
placenta humana control negativo, ADN de Namalwa SMRV positiva y
ADN CCL 194 se digirieron completamente con las endonucleasas BamHI,
BglII, EcoRI y PstI. Los controles positivos recombinantes se
construyeron añadiendo 100, 10, 1 y 0,1 equivalentes de genoma de
ADN de plásmido de SMRV recombinante a 10 \mug de ADN de placenta
humana. A continuación éstos se digirieron completamente con la
endonucleasa EcoRI.
Los fragmentos de ADN resultantes se separaron
por electroforesis a través de un gel de agarosa al 0,8%. El ADN se
despurinizó por un tratamiento breve con HCl, se desnaturalizó en
medio alcalino y se neutralizó in situ antes de ser
transferido por transferencia capilar a una membrana de nailon
cargada.
La membrana se prehibridó en tampón de
hibridación que contiene formamida al 50% en 4 x SSPE a 42ºC durante
2 horas.
Después de la prehibridación el tampón se
sustituyó con tampón de hibridación fresco que contiene ADN de SMRV
desnaturalizado marcado para una actividad específica elevada con
^{32}P.
La hibridación se llevó a cabo durante 16 horas
a 42ºC. Después de la hibridación, la membrana se lavó durante 15
minutos a temperatura ambiente en 2 x SSC/SDS al 0,1%, a
continuación durante 15 minutos a 65ºC en 2 x SSC/SDS al 0,1%
seguido de lavados de 3 x 30 minutos a 65ºC en 0,1 x SSC/SDS al
0,1%. La autorradiografía de la membrana se realizó exponiéndola a
una película de rayos X durante 24 horas y 72 horas.
Posición sobre el genoma de SMRV: Se usaron
amplímeros que abarcan el sitio de unión del ARNt: el amplímero 1
está entre los nucleótidos 805-825; el amplímero 2
está entre los nucleótidos 1006-990 y la sonda es
interna en los oligonucleótidos 863-888. El sitio
de unión del ARNt está entre los nucleótidos
863-880.
Posición sobre el genoma de SMRV: para el grupo
de cebadores exterior, el amplímero 3 está entre los nucleótidos
367-364 y el amplímero 4 está entre los nucleótidos
798-781. El grupo de cebadores internos consta del
amplímero 1 entre los nucleótidos 401-421 y del
amplímero 2 entre los nucleótidos 604-588. La sonda
es interna en los amplímeros entre los nucleótidos
459-482.
Los amplímeros de control internos usados
procedían del gen de la \beta-globina y
amplificarían un producto de ADN de 205 pb.
Una alícuota de células de prueba se lisó por
ebullición en presencia de una matriz que absorbe eficientemente
los productos de lisis que interfieren con el proceso de
amplificación por PCR. La matriz se sedimentó por
microcentrifugación y el sobrenadante se usó para la amplificación.
En todos los casos se usó una pipeta de desplazamiento positivo que
estaba diseñada para su uso exclusivo con controles negativos y el
ADN de prueba.
Se prepararon controles centinela por triplicado
que consisten en la mezcla de reacción de SMRV sin ADN antes de la
preparación del ADN de prueba y las muestras control negativo. Los
tubos se dejaron al aire durante la duración de la manipulación de
las muestras para valorar una posible contaminación.
Las muestras control negativo consisten en ADN
de placenta humana por duplicado equivalente a 2 x 10^{5} células
(1 \mug aproximadamente).
Las muestras de ADN de prueba consisten en ADN
parcialmente purificado por duplicado equivalente a 2 x 10^{5}
células (1 \mug aproximadamente).
Alícuotas de ADN de placenta humana se
pipetearon con una dilución del genoma de SMRV equivalente a 1 copia
en 500 células (5,6 fg), 1 copia en 1000 células (2,8 fg) y 1 copia
en 2000 células (1,4 fg). A continuación estas alícuotas se
añadieron a la mezcla de reacción de SMRV. También se añadió un
control positivo adicional que consiste en 1 \mug de ADN de CCL
194 purificado a la mezcla de reacción de SMRV.
Se prepararon controles centinela por triplicado
que consisten en una mezcla de reacción de
\beta-globina y se corrieron en paralelo
alícuotas del ADN de prueba equivalente a 2 x 10^{5} células con
las reacciones de SMRV para asegurar que se podía amplificar el
ADN.
Se prepararon controles centinela por triplicado
que consisten en una mezcla de reacción de SMRV primaria (externo)
sin ADN antes de la preparación del ADN de prueba y las muestras
control negativo. Los tubos se dejaron al aire durante la duración
de la manipulación de las muestras para valorar una posible
contaminación.
Las muestras control negativo consisten en ADN
de placenta humana por duplicado equivalente a 2 x 10^{5} células
(1 \mug aproximadamente).
Las muestras de ADN de prueba consisten en ADN
parcialmente purificado por duplicado equivalente a 2 x 10^{5}
células (1 \mug aproximadamente).
Alícuotas de ADN de placenta humana se
pipetearon con una dilución del genoma de SMRV equivalente a 1 copia
en 500 células (5,6 fg), 1 copia en 1000 células (2,8 fg) y 1 copia
en 2000 células (1,4 fg). A continuación estas alícuotas se
añadieron a la mezcla de reacción de SMRV. También se añadió un
control positivo adicional que consiste en 1 \mug de ADN de CCL
194 purificado a la mezcla de reacción de SMRV primaria
(externa).
Después de que hubo finalizado la primera ronda
de PCR (primaria), se extrajeron 2 \mul (1/20) de cada reacción y
se añadieron a la mezcla de reacción de SMRV secundaria
(interna).
Las condiciones de reacción para la PCR fueron
las siguientes: \beta-globina y PCR de SMRV: 3
ciclos que consisten en la desnaturalización a 97ºC durante 1
minuto, hibridación a 55ºC durante 45 segundos y extensión a 68ºC
durante 1 minuto. A esto le siguió 30 ciclos que consisten en la
desnaturalización a 95ºC durante 1 minuto, hibridación a 55ºC
durante 45 segundos y extensión a 68ºC durante 1 minuto. Se realizó
una extensión final del ADN durante 10 minutos a 68ºC después de
los ciclos.
Las condiciones de reacción para la PCR con
cebadores anidados fueron las siguientes:
Primera
reacción
2 ciclos que consisten en la desnaturalización a
95ºC durante 3 minutos, hibridación a 55ºC durante 45 segundos y
extensión a 72ºC durante 2 minutos. A esto le siguió 25 ciclos que
consisten en la desnaturalización a 95ºC durante 1 minuto,
hibridación a 55ºC durante 45 segundos y extensión a 68ºC durante 1
minuto.
Segunda
reacción
3 ciclos que consisten en la desnaturalización a
97ºC durante 1 minuto, hibridación a 55ºC durante 45 segundos y
extensión a 68ºC durante 1 minuto. A esto le siguió 30 ciclos que
consisten en la desnaturalización a 95ºC durante 1 minuto,
hibridación a 55ºC durante 45 segundos y extensión a 68ºC durante 1
minuto. Se realizó una extensión final del ADN durante 10 minutos a
68ºC después de los ciclos.
Alícuotas de las reacciones finalizadas se
sometieron a electroforesis a través de un gel de acrilamida al 5%
(v/v) (productos de la PCR de SMRV) o un gel de agarosa al 1,5%
(productos de la PCR anidados), se tiñeron en bromuro de etidio y
se examinaron y fotografiaron bajo luz UV. El ADN se desnaturalizó,
se neutralizó in situ y se transfirió a membranas de nailon
cargadas por electrotransferencia (productos de la PCR de SMRV) o
por transferencia capilar (productos de la PCR anidados). El ADN se
unió a las membranas calentando a 80ºC.
Las membranas se pre-hibridaron
por incubación en tampón de hibridación que contiene 5 x SSC, y SDS
al 7% (p/v) a 50ºC durante 2 h. Después de la
pre-hibridación el tampón se sustituyó con tampón de
hibridación que contiene un oligonucleótido marcado en el extremo
5' con ^{32}P específico para el SMRV. Se prosiguió con la
hibridación durante 16 h a 50ºC. Después de la hibridación las
membranas se lavaron durante 3 x 2 minutos de 5 x SSC/SDS al 0,1%
(p/v) a temperatura ambiente seguido de lavados de 3 x 30 minutos en
5 x SSC/SDS al 0,1% (p/v) a 50ºC y un lavado final de 5 minutos a
68ºC (Tm - 4ºC). La autorradiografía de la membrana se llevó a cabo
exponiendo los filtros a una película de rayos X durante 16 h.
En las condiciones de hibridación usadas, la
sonda de SMRV detecta hasta un equivalente de genoma de SMRV en un
fondo de ADN de placenta humana virus negativo. La sensibilidad de
detección para el virus sería del orden de 0,1 e.g. por célula.
Una prueba válida se define como una prueba en
la que se detecta una amplificación apropiada de las secuencias
diana en el ADN control positivo y la ausencia para todos los
controles negativos. Además, se debe observar la amplificación de
una secuencia diana genómica en todas las muestras. La prueba era
válida: se detectó la amplificación de las secuencias diana en el
ADN control positivo y estaba ausente en los controles negativos.
La amplificación de la diana genómica
\beta-globina se detectó en todas las
muestras.
Ausencia de secuencias específicas de SMRV en el
ADN de prueba: no hubo hibridación de la sonda de SMRV radiomarcada
al ADN control negativo o al ADN de prueba en condiciones de
hibridación rigurosas.
\global\parskip0.900000\baselineskip
El análisis de los controles centinela por
triplicado no mostraron bandas amplificadas visibles. No obstante,
cada mezcla de reacción que contiene ADN presentaba una banda
discreta del tamaño esperado de 205 pb aproximadamente indicando
así que el ADN era adecuado para la amplificación por PCR.
No se pudieron observar fragmentos de ADN
amplificados en los tres controles centinela o en las reacciones de
ADN control negativo. No se detectó hibridación específica de la
sonda radiomarcada a los controles centinela o el ADN control
negativo.
El tamaño esperado del fragmento amplificado del
ADN de SMRV sería de 201 pb (entre los nucleótidos
805-1006). Se detectó una banda discreta de 201 pb
aproximadamente en los tres carriles de ADN del control positivo
recombinante que contienen cantidades de 5,6 fg, 2,8 fg y 1,4 fg de
ADN de SMRV y en el carril control positivo de CCL 194. Estos 201
pb se detectaron mediante la sonda radiomarcada que indica que las
reacciones habían amplificado los fragmentos esperados. La
sensibilidad del ensayo es del orden de 1 e.g. en 2000 células.
No se detectaron fragmentos de ADN amplificados
específicos en los ADN de prueba ya sea visualmente o después de la
hibridación con la sonda radiomarcada.
No se pudieron observar fragmentos de ADN
amplificados en los tres controles centinela o en las reacciones de
ADN control negativo. No se detectó hibridación específica de la
sonda radiomarcada ya sea a los controles centinela o al ADN
control negativo.
El tamaño esperado del fragmento amplificado de
ADN de SMRV sería de 203 pb (entre los nucleótidos
401-604). Se detectó una banda discreta de 203 pb
aproximadamente en los tres carriles de ADN control positivo
recombinante que contienen cantidades de 5,6 fg, 2,8 fg y 1,4 fg de
ADN de SMRV y en el carril control positivo de CCL 194. Esta banda
de 203 pb se detectó mediante la sonda radiomarcada que indica que
las reacciones habían amplificado los fragmentos esperados. La
banda se detectó en los controles positivos que contienen diluciones
de ADN de 1,4 fg, 0,7 fg, 0,35 fg, 0,175 fg y 0,087 fg. Estas
muestras no se sometieron a análisis por hibridación de ADN. La
sensibilidad del ensayo es inferior a 1 e.g. en 10.000 células.
No se detectaron fragmentos de ADN amplificados
específicos en los ADN de prueba ya sea visualmente o después de la
hibridación con la sonda radiomarcada.
Los resultados son coherentes tanto con el ADN
de placenta humana control negativo como con el ADN de prueba de la
línea de células Namalwa X que están exentos de SMRV.
Se clonaron células Namalwa SMRV negativas por
dilución doble limitante para conseguir una probabilidad estadística
del 99,99% de que el clon derivado se generó a partir de una única
célula. Se cultivaron células parentales de la línea de células
Namalwa X en cultivo estático en un medio que comprende medio RPMI
1640 suplementado hasta el 10% con suero fetal bovino, 100 U/ml de
penicilina, 100 \mug/ml de estreptomicina y glutamina 4 mM. Las
células se cultivaron en cultivo estático y se dividieron cada
2-3 días; diluyendo en medio de cultivo hasta 0,2
millones de células/ml y manteniendo sólo los cultivos que
demuestran una viabilidad > 90% como se indica mediante la
exclusión en azul de Tripano.
Sólo se seleccionaron las células que presentan
un crecimiento de 0,2 a 2 millones de células/ml en un periodo de
tres días por clonación por dilución y se encontró que es esencial
que la clonación por dilución se llevase a cabo sobre células que
habían crecido hasta una densidad de 2 millones de células/ml
aproximadamente. Las células seleccionadas se diluyeron en placas
de baja evaporación de 96 pocillos; se plaqueó entre 1 y 300
células/pocillo cultivadas durante tres semanas, envueltas en papel
de aluminio.
\global\parskip1.000000\baselineskip
Se tomaron colonias individuales de las placas
con menos del 10% de los pocillos con colonias individuales y se
sometieron a una segunda ronda de clonación por dilución. A
continuación los clones diluidos dos veces se compararon por
inducción de IFN a pequeña escala usando una concentración de
células de 1 millón de células/ml en placas de 12 pocillos,
tratando con butirato sódico 1 mM y a continuación añadiendo 1
\mul de virus de Sendai por pocillo. El IFN se recogió después de
24 horas más y se sometió a ensayo en ELISA. Aquellos clones para
los cuales el ELISA indicaba una expresión cuantitativa
satisfactoria de IFN se amplificaron posteriormente en
cultivos/inducciones a gran escala y se sometieron al análisis
cuantitativo del perfil de la subunidad
IFN-\alpha por cromatografía líquida de alta
presión en fase inversa (RPHPLC) para seleccionar aquellos clones A,
B, C, D, etc. que presentan el perfil deseado.
El IFN-\alpha producido y
purificado de acuerdo con la práctica de fabricación habitual
(Lewis, W. G. y Finter, N. B. (1987), "The Production and Purity
of a mixed human alpha interferon preparation (Wellferon) derived
from lymphoblastoid cells" en The Interferon System (Eds. Baron,
S., Dianzani, F., Stanton, G. J. y Fleischmann, W. R. Jnr). Texas
University Press) se analizó para el perfil del subtipo generado por
RPHPLC y como se ilustra en la Figura 1.
Se seleccionó un clon SMRV negativo, ECACC
94120841, y se cultivó en 3 matraces de agitación de 300 ml, y se
indujo con el virus de Sendai después del tratamiento con butirato
según protocolos clásicos (Lewis, W. G. y Finter, N. B.,
supra). El sobrenadante del cultivo se recogió y se purificó
mediante dos pasadas sobre una columna de inmunoafinidad de
anticuerpo anti-interferón purificada. El interferón
se concentró y se analizó por RPHPLC para determinar la composición
subtipo que se ilustra en la Tabla 2 y el perfil que se muestra en
la Figura 2. Nótese que la pureza del interferón conseguida en una
preparación de laboratorio a pequeña escala no era comparable a
aquella de un lote de producción de interferón (Ejemplo 2 y Figura
1) y por tanto los valores para el pico son porcentajes que se
muestran a continuación y pueden estar influidos por la presencia
de proteína no interferón.
La Tabla 2 muestra el número de pico de la
elución de la RPHPLC con el subtipo de IFN-\alpha
correspondiente y la proporción relativa ("% del área de
pico") de cada subtipo obtenido de la línea celular clonada junto
con, para su comparación, el intervalo de cada subtipo en
interferón de linfoblastoide terapéuticamente aceptable.
Comparando las Figuras 1 y 2, se puede observar
un nivel de identidad significativamente elevado y suficiente entre
los perfiles del IFN para la línea de células Namalwa SMRV positivas
usadas actualmente para la producción de Wellferon (marca comercial
registrada) (Figura 1) y la línea de células Namalwa SMRV negativas
ECACC 94120841. El interferón procedente de las líneas celulares se
puede considerar que es sustancialmente equivalente.
Todas las referencias a los subtipos de
IFN-\alpha en el presente documento son coherentes
con la nomenclatura de las proteínas interferón humanas aprobadas
por la sociedad internacional para la investigación sobre interferón
y citocinas (International Society for Interferon and Cytokine
Research) y publicadas en Journal of Inteferon Research
14:223-226 (1994).
Claims (5)
1. Una línea de células Namalwa que está exenta
del retrovirus del mono ardilla y que es la línea de células ECACC
94120840 o ECACC 94120841 o una línea de células procedente bien de
ECACC 94120840 o bien de ECACC 94120841.
2. Una línea celular según la reivindicación 1
que es capaz de producir una población de subtipos de
interferón-alfa que comprende los subtipos 2b, 7,
10, 17 y 21.
3. Una línea celular según la reivindicación 2,
en la que los subtipos comprenden los subtipos 1, 2b, 5, 7, 8, 10,
14, 17 y 21.
4. Una línea celular según la reivindicación 3,
en la que los subtipos de interferón-alfa se
producen en las siguientes cantidades:
5. Un procedimiento para la preparación de
interferón-alfa, comprendiendo el procedimiento el
cultivo de una línea celular como se ha definido en una cualquiera
de las reivindicaciones 1 a 4 y el aislamiento del
interferón-alfa así producido.
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