PT904352E - Linha celular - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO "LINHA CELULAR" A presente invenção refere-se a linhas celulares Namalwa e sua utilização.

Os interferões alfa humanos (α-IFN) pertencem a uma família multigénica localizada num segmento de 400 kb do cromossoma humano 9. A família compreende, pelo menos, 13 genes codificando subtipos de α-IFN. Cada proteína α consiste em 165 ou 166 resíduos de aminoácidos com pesos moleculares de entre 18 e 26 kD (dependendo do grau de glicosilação). Embora quimicamente distintos, os subtipos estão proximamente relacionados com regiões de sequências de aminoácidos altamente conservadas.

Uma fonte de α-IFN comercialmente disponível é o IFN alfa linfoblastóide humano nl (IFN α nl) que é um α-IFN natural. É produzido pela estimulação de uma linha celular linfoblastóide humana de Namalwa com o vírus Sendai para produzir uma mistura de, pelo menos, 13 subtipos de a-IFN que são, depois, purificados por cromatografia (documentos US-A-4216203; EP-A-0000520; EP-A-0097353). Durante o processo de preparação, o número e quantidade de subtipos específicos são mantidos dentro de limites definidos.

Esta técnica de produção de α-IFN foi desenvolvida, de facto, no início dos anos 70. Foi durante esse período que a linha celular utilizada, agora, para produzir a totalidade do interferão linfoblastóide humano comercialmente disponível 1 actualmente, foi gerada a partir de um tumor do linfoma de Burkitt. Este tumor foi removido de um único indivíduo chamado Namalwa gerando, deste modo, a linha celular intitulada eponimamente (Strander H. et al., J. Clin. Microbiol. 1, 116 — 117, 1975 e Christofinis G.J. et al., J. Gen. Virol. 52, 169 — 171, 1981) . As células Namalwa estão disponíveis publicamente com o N° Depósito ATCC 00001432-CRL.

As células Namalwa foram igualmente utilizadas para a preparação de proteínas recombinantes (Yanagi H. et al., Gene 16, 19 - 26, 1989 e Okamoto M. et al., Bio/Technology 550 - 553, 1990) . As células Namalwa são atractivas para a produção de proteínas recombinantes de origem humana. Pode esperar-se o correcto processamento pós-tradução das proteínas humanas recombinantes. Adicionalmente, a produção à escala industrial de linhas celulares Namalwa está bem estabelecida, em virtude da sua utilização para a produção de a-IFN. A possibilidade de poderem existir contaminantes associados a produtos obtidos de uma linha celular de Namalwa foi extensamente investigada. As células Namalwa foram testadas relativamente a contaminação por bactérias, vírus e micoplasma. Foi detectado um certo nível de vírus de Epstein-Barr (EBV). Se bem que não se forma vírus infeccioso. Para além disso, o antigénio precoce de EBV não se consegue detectar, mesmo quando as células são tratadas com substâncias químicas, tal como bromodesoxiuridina que pode induzir a replicação de EBV.

Contudo, foi detectada a presença de genoma de retrovírus do macaco-esquilo (SMRV, um retrovírus de tipo D) (Middleton et al., Int. J. Câncer 52 451 - 454, 1992). O SMRV foi isolado pela primeira vez de uma cultura de pulmão de macaco-esquilo e exibe 2 uma alargada gama de hospedeiros in vitro incluindo canino, humano, chimpanzé, macaco-rhesus e células de marta. 0 vírus é de particular interesse, visto que foi identificado como contaminante de um certo número de linhas celulares. Foram identificadas até à data, duas estirpes do vírus, SMRV e SMRV-H, com base em diferenças nos padrões de endonucleases de restrição e variação de sequência. É possível garantir que nenhuma partícula de SMRV viável sobrevivem aos protocolos de produção que são empregues para obter produtos utilizando linhas celulares Namalwa. Contudo, é manifestamente preferível que não deve estar presente genoma de SMRV nas células Namalwa. Os genomas de SMRV foram detectados por Middleton et al. (supra) em todas as oito de uma selecção aleatória de oito linhas celulares Namalwa amostradas de vários laboratórios a nível mundial. Por este motivo, considera-se provável que todas as células Namalwa anteriores, disponíveis publicamente, contêm o genoma de SMRV.

Provar de forma conclusiva que determinadas células não têm um contaminante virai, está manifestamente dependente da sensibilidade do próprio sistema de ensaio utilizado. 0 ensaio directo para a presença de ADN virai por técnicas, tal como a reacção de polimerização em cadeia (PCR), pode permitir sensibilidades de detecção de até um genoma virai por 100 a 1000 células, até mesmo um genoma virai por 10000 células. Contudo, se uma nova linha celular for clonada a partir de uma única célula, esta irá, necessariamente, conter um ou mais genomas virais por célula, ou nenhum. Consequentemente, a possibilidade de obter um resultado de ensaio falso negativo, 3 será muito mais baixa para uma linha celular assim clonada, do que para células geneticamente heterogéneas.

Antes da presente invenção, considerava-se que a presença de SMRV era uma caracteristica inerente a uma linha celular de Namalwa. Como anteriormente mencionado, considera-se provável que todas as linhas celulares Namalwa anteriores, disponíveis publicamente, contêm o genoma de SMRV.

Inesperadamente, identificou-se uma linha celular de Namalwa isenta de SMRV. Verificou-se igualmente, inesperadamente que as linhas celulares Namalwa podiam ser clonadas com êxito pela utilização de culturas estáticas de alta densidade, em vez de baixa densidade. Verificou-se que as linhas celulares Namalwa clonadas resultantes estavam isentas de SMRV. Cada linha celular clonada derivou de uma única célula proporcionando, deste modo, uma garantia que toda a população celular da linha celular clonada estava isenta de SMRV.

Consequentemente, a presente invenção proporciona uma linha celular de Namalwa que está isenta de SMRV. Normalmente, a linha celular é capaz de produzir uma população heterogénea de subtipos de a-IFN. A linha celular é, de um modo preferido, uma linha celular clonada. Neste caso, os subtipos de oí-IFN são, geralmente, substancialmente os mesmos que aqueles produzidos por linhas celulares Namalwa existentes que são utilizadas para a produção de interferão linfoblastóide comercialmente disponível. Uma linha celular clonada da presente invenção é uma população geneticamente uniforme de células derivadas de uma única célula e é um clone, apesar da ocorrência de qualquer mutação aleatória 4 durante a formação da população clonal a partir da sua única célula parental.

De um modo preferido, os subtipos de α-IFN formados por uma linha celular da presente invenção contêm, pelo menos, os subtipos de α-IFN 2b, 7, 10, 17 e 21; de um modo mais preferido 1, 2b, 5, 7, 8, 10, 14, 17 e 21. Os subtipos de α-IFN são produzidos, de um modo vantajoso, nas gamas quantitativas relativas indicadas na Tabela 1 a seguir. Estas gamas definem os limites dentro dos quais se inserem, de um modo preferido, os subtipos de interferão linfoblastóide terapeuticamente aceitável. É muito preferido que uma linha celular gere um perfil de subtipo de α-IFN substancialmente equivalente ao produzido pelas células Namalwa utilizadas para a produção de Wellferon, por exemplo pelas células que formam o objecto do N° Depósito ATCC 00001432-CRL. Este depósito foi realizado no ATCC, Rockville, Maryland 20852, EUA no dia sete de Julho de 1978. TABELA 1

Subtipo % em peso 1 1-16 2b 19 - 37 5 4-13 7+17 11 - 20 8 2-14 10 8-21 14 2-13 21 8-20 5

Duas linhas celulares negativas para SMRV, em conformidade com a presente invenção foram objecto de depósito ao abrigo do Tratado de Budapeste na European Collection of Animal Cell Cultures, Porton Down, Salisbury SP4 OJG, GB, no dia oito de Dezembro de 1994 com os Nos de registo ECACC 94120840 e ECACC 94120841. Estas duas linhas celulares depositadas e linhas celulares derivadas destas são formas de realização particularmente preferidas da invenção. A descendência das linhas celulares depositadas forma, deste modo, um aspecto da invenção.

Linhas celulares úteis de acordo com a invenção, são linhas celulares isentas de SMRV, capazes de produzir uma população heterogénea de subtipos de α-IFN, subtipos que são substancialmente os mesmos que aqueles produzidos por uma das linhas celulares depositadas Nos ECACC 94120840 e ECACC 94120841. A população de subtipos, o perfil de subtipo de IFN, podem ser substancialmente os mesmos que o produzido por uma destas duas linhas celulares. As proporções relativas de cada subtipo de a-IFN podem ser, deste modo, substancialmente as mesmas que as proporções relativas de cada subtipo produzido por uma das linhas celulares depositadas.

Foi fortuitamente identificada uma linha celular de Namalwa negativa para SMRV. A linha celular da invenção pode ser, deste modo, uma linha celular de Namalwa isenta de SMRV de ocorrência natural. Uma tal linha celular pode estar na forma isolada. A linha celular pode ter sido clonada.

Uma linha celular clonada da invenção pode ser preparada por uma nova forma de clonagem por dupla diluição limite. Contrariamente a metodologias de clonagem por diluição 6 conhecidas, descobriu-se que, quando as células de viabilidade adequada eram subsequentemente plaqueadas em poços para obter colónias únicas, eram obtidos resultados vantajosos pela utilização de culturas estáticas de alta densidade (em vez da esperada baixa densidade)

Quando se gera uma linha celular clonada, é preferível realizar uma dupla série de clonagem por diluição, para obter uma probabilidade estatística muito alta de até 99,99% de que a linha celular resultante provém de uma única célula. As células Namalwa parentais isentas de SMRV são cultivadas em cultura estática até alta densidade num meio apropriado contendo um antibiótico adequado, divididas, diluídas e re-cultivadas até alta densidade, descartando aquelas culturas que não demonstram uma viabilidade a > 90% utilizando um ensaio de viabilidade, tal como a exclusão do azul de tripano. As células são depois divididas e diluídas novamente. A densidade celular deve ser, de um modo preferido, 1,8 x 106 células mL"1 ou mais, por exemplo, de 1,8 x 106 a 2,4 x 106 células mL"1 ou de 2,0 x 106 a 2,2 x 106 células mL-1. Uma densidade celular adequada é, por conseguinte, aproximadamente 2 milhões de células mL-1. A diluição é adequada até 0,2 milhões de células mL"1.

Contudo, uma cultura de células Namalwa negativa para SMRV, pode ser gerada de uma linha celular de Namalwa positiva para SMRV pela utilização da tecnologia do ADN recombinante. Deste modo, métodos, tal como recombinação homóloga dirigida podem ser utilizados para recombinar o genoma de SMRV integrado e substituí-lo por um fragmento de ADN não codificante. 7 É, assim, possível a delecção do genoma de SMRV do cromossoma relevante de uma linha celular de Namalwa positiva para SMRV. As sequências flanqueando o genoma de SMRV estão identificadas. É construído um vector que contém, pelo menos, 3 kb da sequência flanqueante para cada lado do genoma de SMRV. É preparada uma construção de marcação, na qual a região a delecionar é substituída por um marcador seleccionável positivo, tal como um que codifique a resistência a fármacos, deixando o ADN flanqueante inalterado.

Esta construção, normalmente um plasmídeo, é depois linearizada e introduzida nas células alvo positivas para SMRV. A recombinação ocorre como um evento natural de baixa frequência e, as células em que esta foi bem-sucedida podem ser seleccionadas pela sua capacidade para crescer no fármaco que deve ter sido introduzido pela construção de marcação. Os clones resistentes devem ser depois analisados para garantir que a resistência ao fármaco não ocorreu por intermédio de um mecanismo não específico e que o genoma de SMRV foi deleccionado com êxito. É possível manipular a construção de marcação num modo que seleccione contra recombinantes não específicos.

Quando esta estiver completa, uma cópia do gene foi deleccionada. Num organismo heterozigótico, a segunda cópia deve ser igualmente removida. 0 que é feito pelo mesmo processo, com uma construção de marcação que pode ser idêntica à primeira em todos os aspectos, excepto que contém um marcador seleccionável diferente, resistente a fármacos. Os recombinantes duplos que sejam resistentes a ambos os fármacos podem ser, então, seleccionados, em virtude da integração em ambos os cromossomas.

Alternativamente, é possível que uma subpopulação de células isentas de SMRV possa existir numa linha celular de Namalwa positiva para SMRV. Poderia ser, assim, clonada uma linha celular de Namalwa positiva para SMRV. Os clones de células isentas de SMRV poderiam, então, ser identificados. Pode ser utilizado o processo de clonagem por dupla diluição limite anterior. A presente invenção proporciona igualmente um processo para a produção de interferão alfa, processo que compreende a cultura de uma linha celular da presente invenção e o isolamento do interferão alfa assim produzido. É obtida, deste modo, uma população heteróloga de α-IFN. As linhas celulares da presente invenção podem ser cultivadas de acordo com qualquer método apropriado. Um indutor de interferão, tal como o vírus Sendai, pode ser adicionado à cultura. 0 interferão alfa pode ser isolado por cromatografia de afinidade utilizando anticorpos anti-IFN. Um anticorpo policlonal, adequado para utilização nessa geração, pode ser produzido por técnicas bem conhecidas na técnica (documento US-A-4216203).

Mais pormenorizadamente, uma amostra de uma linha celular de Namalwa de acordo com a invenção, pode ser descongelada do armazenamento em azoto líquido e cultivada em culturas de tamanho crescente, conduzindo a cultura em larga escala. Um meio de cultura adequado pode incluir RPMI 1640 suplementado com soro, tal como soro de bovino adulto irradiado com raios gama. Quando a população celular for óptima, pode ser adicionado butirato de sódio para abrandar a taxa de crescimento das células e optimizar o subsequente rendimento em IFN (documento US-A-4216203) . As células devem ser, em seguida, induzidas a produzir IFN, normalmente pela adição do vírus Sendai. O a-IFN 9 bruto é isolado e passado, em seguida, através de um processo de purificação envolvendo precipitações, extracção por solventes e cromatografia. A forma final tem uma pureza de, pelo menos, 95% e uma actividade especifica de, aproximadamente, 100 IU/mg de proteína e consiste, pelo menos, em 13 subtipos diferentes de α-IFN (Finter N.B. et al.r CSHSQB 101, 571 - 575, 1986).

As formulações farmacêuticas da presente invenção compreendem α-IFN produzido a partir de linhas celulares da presente invenção em mistura com um veículo farmaceuticamente aceitável. De um modo preferido, o veículo compreende uma mistura de cloreto de sódio, tris (Trimethamine US) , glicina e solução de albumina humana. De um modo mais preferido, o cloreto de sódio encontra-se presente a 8,5 mg mL’1, o Tris a 1,21 mg mL’ 1, a glicina a 0,75 mg mL-1 e o soro de albumina humana a uma concentração resultando numa concentração proteica final na formulação de 1,5 mg mL’1.

Os α-IFN produzidos de linhas celulares da presente invenção podem ser utilizados na terapia de qualquer estado responsivo a IFN linfoblastóide conhecido e podem ser administrados por vias e em quantidades bem conhecidas na técnica e substancialmente idênticas àquelas conhecidas de IFN linfoblastóides terapêuticos comerciais existentes.

Por exemplo, no tratamento da leucemia de tricoleucócitos, um regime de dosagem de três mega-unidades (3 MU) deve ser administrado, e. g., intravenosamente (iv) diariamente durante entre 12 e 16 semanas, seguido de 3 MU três vezes por semana, até que não sejam detectáveis tricoleucócitos na medula óssea. Na terapia da hepatite B, podem ser administradas 10 - 15 MU três vezes por semana durante entre 4 e 6 meses, ao passo que 10 para a hepatite C, podem ser administradas 3 MU durante até 6 meses. Os regimes de dosagem são aceites na técnica mas não excluem a utilização de regimes de dosagem alternativos ou superiores, no caso de serem estipulados por factores clinicos específicos.

Uma linha celular da invenção pode ser igualmente utilizada como sistema de expressão, dentro do qual podem ser produzidas proteínas recombinantes. Consequentemente, a presente invenção proporciona: - uma linha celular de acordo com a invenção que alberga uma sequência de ADN expressável exógena codificando um polipeptídeo de interesse; - um processo para a preparação de uma tal linha celular, processo que compreende a transfecção de uma linha celular de acordo com a invenção com uma sequência de ADN expressável codificando o polipeptídeo de interesse; e - um processo para a preparação de um polipeptídeo de interesse, processo que compreende a manutenção de uma linha celular, albergando uma sequência de ADN expressável exógena codificando o polipeptídeo de interesse sob condições tais que o polipeptídeo é expresso e recuperando o polipeptídeo expresso.

Uma linha celular capaz de expressar um polipeptídeo de interesse pode ser preparada utilizando um vector de expressão que compreende uma sequência de ADN codificando o polipeptídeo. 0 polipeptídeo é, normalmente, um polipeptídeo humano, por 11 exemplo, um factor de crescimento. 0 polipeptideo pode ser insulina, eritropoetina, hormona humana do crescimento, GCSF, GMCSF, activador do plasminogénio tecidular, urocinase, factor sanguíneo VIII, proteína C, etc. 0 vector de expressão é capaz de expressar o polipeptideo de interesse quando proporcionado em células isentas de SMRV de acordo com a invenção. São proporcionados elementos de controlo transcricionais e de tradução apropriados, incluindo um promotor ligado operacionalmente à sequência de ADN codificando o polipeptideo desejado. 0 promotor pode ser o promotor precoce de SV40 (vírus símio 40) . São proporcionados um estimulador, um sítio de terminação de transcrição e codões de terminação e iniciação de tradução. Podem estar presentes um ponto de excisão adequado e um sítio de poliadenilação. A sequência de ADN é proporcionada na fase correcta de forma a permitir que ocorra a expressão do polipeptideo. O vector de expressão é, deste modo, um vector que é compatível com células Namalwa isentas de SMRV. Se desejado, está presente um gene de marcação seleccionável. O vector de expressão é, normalmente, um plasmídeo. Compreende, geralmente, uma origem de replicação.

As células Namalwa isentas de SMRV são transfectadas com o vector de expressão. As células transfectadas são mantidas em seguida sob condições que permitem que ocorra a expressão do polipeptideo de interesse. As células transfectadas são cultivadas num meio apropriado para o efeito. O polipeptideo desejado que foi expresso é isolado. O polipeptideo é purificado conforme necessário. 12

As linhas celulares isentas de SMRV da invenção podem ser adicionalmente utilizadas como uma linha celular de empacotamento/crescimento complementar para vírus, por exemplo retrovírus ou adenovírus. Consequentemente, a presente invenção proporciona: — uma linha celular de acordo com a invenção que alberga genes virais expressáveis suficientes para permitir que um vector virai correspondente compreenda sinais de replicação, uma sequência de empacotamento e um gene de interesse para aí ser empacotado; — um processo para a preparação de uma tal linha celular, processo que compreende a transfecção de uma linha celular de acordo com a invenção com genes virais expressáveis suficientes para permitir que um vector virai correspondente compreenda sinais de replicação, uma sequência de empacotamento e um gene de interesse para aí ser empacotado; e — um processo para o empacotamento de vírus, processo que compreende a transfecção de uma linha celular que alberga genes virais expressáveis suficientes para permitir que um vector virai correspondente compreenda sinais de replicação, uma sequência de empacotamento e um gene de interesse para aí ser empacotado com o referido vector virai e recuperando o vírus empacotado resultante.

Os vírus empacotados podem ser utilizados em terapia génica. Os vírus são incapazes de se replicar autonomamente dentro de uma célula alvo mas podem distribuir um gene desejado para essa célula. 13 0 gene desejado é proporcionado, inicialmente, num vector virai que compreende, adicionalmente, os sinais de replicação virai e uma sequência de empacotamento, por vezes designada por sequência de empacotamento psi ou sequência de encapsidação. 0 vector virai não tem, deste modo, pelo menos, sequências funcionais que são necessárias para a replicação do vírus no interior de uma célula infectada. A linha celular pode ser utilizada para o empacotamento de um retrovírus, caso em que o vector virai é um vector retroviral. Retrovírus adequados que podem ser empacotados incluem o vírus da leucemia murina (MLV), vírus da leucemia do macaco gibão (GALV), vírus reticuloendotelial (REV), vírus da necrose do baço (SNV, tipo C de mamífero), vírus da leucose aviária (ALV, aviária C) e vírus espumoso humano (HFV spuma).

Quando a linha celular é utilizada para empacotar um retrovírus, o vector virai compreende longas sequências repetidas terminais (LTR) , o gene desejado e uma sequência de empacotamento. Por conseguinte, normalmente, o vector virai em tais circunstâncias não tem genes gag, pol e env funcionais. Estes genes podem estar, completamente ou em parte, ausentes ou podem estar presentes mas tornados não funcionais. 0 vector virai compreende, deste modo, geralmente, um genoma retroviral que não tem os genes funcionais apropriados mas que incorpora o gene de interesse. 0 gene desejado é proporcionado no vector virai ligado operacionalmente a um promotor. 0 gene pode ser um gene codificando uma linfocina ou uma citocina. Pode ser um gene que suprime um tumor, um gene correctivo ou um gene enzimático GDEPT (terapia génica dirigida com profármaco enzimático). 0 promotor 14 pode ser um antigénio carcinoembrionário (CEA), Muc-1, c-ErbB2, proteína de ligação folheada (FBP) ou promotor do factor de crescimento endotelial vascular (VEGF). As sequências de terminação podem ser proporcionadas conforme requerido. 0 vector virai é introduzido numa linha celular de acordo com a invenção que é proporcionada com as funções virais que permitem que ocorra a complementação de empacotamento/crescimento. Deste modo, a linha celular é proporcionada com os genes virais que podem complementar as funções do vector virai. Estes genes expressam as proteínas virais que permitem que ocorra a complementação de empacotamento/crescimento, normalmente proteínas estruturais, enzimas replicativas e factores reguladores.

Quando a linha celular é utilizada para empacotar um retrovírus, normalmente, os genes são os genes gag, pol e env. Em particular, estes são os genes virais funcionais que estão em falta no vector virai.

Os genes nec essários para a linha celular podem ser integrados de forma estável no genoma da célula. Os genes podem ser proporcionados na forma de ADN proviral. Pode ser utilizada qualquer técnica apropriada para introduzir os genes na linha celular.

Em utilização, uma linha celular albergando os genes virais requeridos para o empacotamento é infectada com um vector virai como anteriormente. 0 vírus empacotado resultante é, em seguida, recolhido da cultura de células. 0 vírus recolhido pode ser purificado conforme desejado antes da utilização em terapia génica. 15

Os Exemplos seguintes ilustram a invenção. Nos desenhos que a acompanham: A Figura 1 apresenta o perfil da cromatografia liquida de alta pressão de fase reversa (RPHPLC) determinado para a linha celular de Namalwa positiva para SMRV não clonada actualmente utilizada na produção de Wellferon (Marca Registada); e A Figura 2 apresenta o perfil determinado para a linha celular de Namalwa isenta de SMRV clonada ECACC 94120841.

Exemplo 1: Realização de testes à linha celular de Namalwa para a presença de SMRV 1. Geral

Uma linha celular de Namalwa X identificada foi testada para a presença do genoma de SMRV. Foi adoptado um processo de ensaio que utilizou uma sonda de SMRV genómico que detectará SMRV a menos de 1 cópia genómica por célula e detectará, de forma rotineira, 1 cópia genómica por célula. O ADN de teste foi cortado com endonucleases de restrição que produziram fragmentos de tamanho de diagnóstico que foram detectados por hibridizaçâo de ADN, seguida de auto-radiografia.

Adicionalmente, foi realizado um ensaio de reacção de polimerização em cadeia (PCR) utilizando dois amplimeros oligonucleotidicos específicos de SMRV/LTR. Qualquer sequência amplificada seria identificada por hibridizaçâo com uma sonda oligonucleotidica especifica para SMRV. Nas condições 16 utilizadas, o processo detectará, pelo menos, 1 cópia genómica por 2000 células ou melhor. Como o ensaio de PCR foi, de facto, negativo, foi utilizado um ensaio adicional com iniciadores internos dentro do genoma de SMRV. O conjunto de iniciadores internos pode detectar o SMRV até uma sensibilidade de 1 cópia genómica por 10000 células ou melhor. 2. Métodos

(a) Hibridização de ADN

Purificação de ADN

Um sedimento consistindo em aproximadamente 7 x 107 células de teste foi utilizado para a preparação de ADN. O sedimento celular foi ressuspenso em lise de proteinase K contendo 20 pg mL"1 de RNase e 100 pg mL-1 de proteinase K. A suspensão foi digerida durante 16 horas a 37 °C. O ADN desproteinizado foi extraído duas vezes com fenol e duas vezes com fenolclorofórmio e, finalmente, precipitado por etanol na presença de acetato de amónio. O ADN foi recuperado por centrifugação a 3000 g durante 30 minutos e o sobrenadante descartado. O sedimento foi lavado em etanol a 70% e deixado a secar ao ar durante 1 hora. O ADN foi deixado a redissolver em tampão de Tris EDTA (TE) e a purificação e concentração do ADN foi avaliada por espectrofotometria. A absorvência foi medida a 280 nm e 260 nm. A razão 260/280 foi de 1,82, indicando que a amostra de ADN era pura. O rendimento de ADN foi calculado em 315 pg. 17 ADN de Controlo 0 ADN de controlo negativo consistiu em ADN placentário humano purificado não contendo sequências de SMRV detectáveis. 0 ADN de controlo positivo de SMRV consistiu em ADN placentário humano com ADN recombinante adicionado, representando o genoma completo de SMRV, a 100, 10, 1 e 0,1 equivalentes genómicos. Os equivalentes genómicos (g. e.) foram calculados assumindo que o genoma eucariótico consiste em 3 x 109 pb e o genoma de SMRV é 8,4 x 103 pb. Em 10 yg de ADN, um equivalente genómico teria 28 pg de ADN de SMRV.

Controlos positivos adicionais consistiram em ADN de

Namalwa conhecido por albergar ADN de SMRV e CCL 194, uma célula de pulmão de marta contendo sequências de SMRV a, aproximadamente, 10 equivalentes genómicos por célula. A sonda consistiu no genoma de SMRV de comprimento completo, isolado a partir das sequências do vector plasmidico. (b) Preparação de ADN para hibridização

Amostras de 10 yg de ADN de teste, ADN placentário humano de controlo negativo, ADN de Namalwa positivo para SMRV e ADN de CCL 194 foram digeridos até à conclusão com as endonucleases BamHI, BglII, EcoRI e PstI. Os controlos positivos recombinantes foram construídos pela adição de 100, 10, 1 e 0,1 equivalentes genómicos de ADN plasmidico de SMRV recombinante a 10 yg de ADN placentário humano. Estes foram, em seguida, digeridos até à conclusão com a endonuclease EcoRI. 18

Os fragmentos de ADN resultantes foram separados por electroforese através de um gel de agarose a 0,8%. O ADN foi submetido a despurinação por um breve tratamento com HC1, desnaturado em alcali e neutralizado ín situ antes de ser transferido para uma membrana de nylon carregada por transferência por capilaridade. (c) Pré-hibridizagão e hibridizagão A membrana foi pré-hibridizada por incubação em tampão de hibridizagão contendo 50% de formamida em 4 x SSPE a 42 °C durante 2 horas.

Após a pré-hibridizagão, o tampão foi substituído por um tampão de hibridizagão fresco contendo ADN de SMRV desnaturado marcado para uma elevada actividade específica com 32P. A hibridizagão foi conduzida durante 16 horas a 42 °C. Após a hibridizagão, a membrana foi lavada durante 15 minutos à temperatura ambiente em 2 x SSC/0,1% SDS, a seguir durante 15 minutos a 65 °C em 2 x SSC/0,1% SDS seguida de lavagens de 3 x 30 minutos a 65 °C em 0,1 x SSC/0,1% SDS. A auto-radiografia da membrana foi realizada expondo-a a um filme de raios X durante 24 horas e 72 horas. 19 (d) Iniciadores oligonucleotídicos e sondas

Amplimeros oligonucleotídicos e sonda

Posição no genoma de SMRV: Foram utilizados os amplimeros abrangendo o sitio de ligação ao ARNt: o amplimero 1 corresponde aos nucleotídeos 805-825; o amplimero 2 corresponde aos nucleotideos 1006-990 e a sonda é interna aos oligonucleotideos 863-888. O sítio de ligação ao ARNt corresponde aos nucleotídeos 863-880.

Amplimeros oligonucleotídicos e sonda para PCR de iniciadores internos

Posição no genoma de SMRV: para o conjunto de iniciadores externos, o amplimero 3 corresponde aos nucleotídeos 367—384 e o amplimero 4 corresponde aos nucleotídeos 798—781. O conjunto de iniciadores internos consiste no amplimero 1 correspondente aos nucleotídeos 401—421 e o amplimero 2 corresponde aos nucleotídeos 604—588. A sonda é interna aos amplimeros correspondentes aos nucleotídeos 459—482.

Amplimeros de controlo interno

Os amplimeros de controlo interno utilizados eram provenientes do gene da β-globina e amplificavam um produto de ADN de 205 pb. 20 (e) Preparação da amostra

Uma alíquota de células de teste foi lisada, por ebulição, na presença de uma matriz que absorve eficazmente produtos de lise que interferem no processo de amplificação por PCR. A matriz foi sedimentada por microcentrifugação e o sobrenadante utilizado para amplificação. Em todos os casos foi utilizada uma pipeta de deslocamento positivo que foi destinada apenas para utilização com controlos negativos e ADN de teste.

(f) Preparação de reacções de PCR

Controlos sentinela

Foram preparados controlos sentinela em triplicado consistindo na mistura de reacção de SMRV sem ADN antes da preparação de ADN de teste e amostras de controlo negativo. Os tubos foram deixados abertos durante a duração do manuseamento da amostra para avaliar a possível contaminação.

Amostras de controlo negativo e amostras de artigos de teste

As amostras de controlo negativo consistiram em ADN placentário humano, em duplicado, equivalente a 2 x 105 células (aproximadamente 1 yg) .

As amostras de ADN de teste consistiram em ADN parcialmente purificado, em duplicado, equivalente a 2 x 105 células (aproximadamente 1 yg). 21

Controlos positivos Às alíquotas de ADN placentário humano foi adicionada uma diluição do SMRV equivalente a 1 cópia em 500 células (5,6 fg), 1 cópia em 1000 células (2,8 fg) e 1 cópia em 2000 células (1,4 fg) . Estas alíquotas foram depois adicionadas à mistura de reacção de SMRV. Um controlo positivo adicional consistindo em 1 yg de ADN de CCL194 purificado foi também adicionado à mistura de reacção de SMRV.

Controlo interno de β-qlobina

Foram preparados controlos sentinela em triplicado consistindo na mistura de reacção de β-globina e alíquotas de ADN de teste equivalentes a 2 x 105 células foram corridas em paralelo com as reacções de SMRV, para garantir que o ADN era passível de ser amplificado. (g) Preparação de reacções de PCR de iniciadores internos

Reacções primárias (Externas)

Controlos sentinela em triplicado, consistindo na mistura de reacção de SMRV primária (externa) sem ADN, foram preparados antes da preparação de ADN de teste e amostras de controlo negativo. Os tubos foram deixados abertos durante a duração do manuseamento da amostra para avaliar a possível contaminação. 22

As amostras de controlo negativo consistiram em ADN placentário humano em duplicado equivalente a 2 x 105 células (aproximadamente 1 pg).

As amostras de ADN de teste consistiram em ADN parcialmente purificado em duplicado equivalente a 2 x 105 células (aproximadamente 1 pg) . Às aliquotas de ADN placentário humano foi adicionada uma diluição do genoma de SMRV equivalente a 1 cópia em 500 células (5,6 fg), 1 cópia em 1000 células (2,7 fg) e 1 cópia em 2000 células (1,4 fg). Estas aliquotas foram depois adicionadas à mistura de reacção. Um controlo positivo adicional, consistindo em 1 pg de ADN de CCL 194 purificado, foi igualmente adicionado à mistura de reacção de SMRV primária (externa).

Reacções secundárias de iniciadores internos (Internas)

Após ter terminado a primeira série de PCR (Primária), 2 pL (1/20) de cada reacção foram removidos e adicionados à mistura de reacção de SMRV secundária (interna).

(h) Condições de reacção de PCR

As condições de reacção para PCR foram como se segue: PCR de β-globina e SMRV: 3 ciclos consistindo em desnaturação a 97 °C durante 1 minuto, hibridação a 55 °C durante 45 segundos e extensão a 68 °C durante 1 minuto. O que foi seguido de 30 ciclos consistindo em desnaturação a 95 °C durante 1 minuto, hibridação a 55 °C durante 45 segundos e extensão a 68 °C 23 durante 1 minuto. Uma extensão final do ADN foi efectuada durante 10 minutos a 68 °C após ciclização.

As condições de reacção para PCR com iniciadores internos foram como se segue:

Primeira reacção: 2 ciclos consistindo em desnaturação a 95 °C durante 3 min., hibridação a 55 °C durante 45 segundos e extensão a 72 °C durante 2 minutos. O que foi seguido de 25 ciclos consistindo em desnaturação a 95 °C durante 1 minuto, hibridação a 55 °C durante 45 segundos e extensão a 68 °C durante 1 minuto.

Segunda reacção: 3 ciclos consistindo em desnaturação a 97 °C durante 1 minuto, hibridação a 55 °C durante 45 segundos e extensão a 68 °C durante 1 minuto. O qual foi seguido de 30 ciclos consistindo em desnaturação a 95 °C durante 1 minuto, hibridação a 55 °C durante 45 segundos e extensão a 68 °C durante 1 minuto. Uma extensão final do ADN foi efectuada durante 10 minutos a 68 °C após ciclização. (i) Electroforese e hibridização

As aliquotas das reacções concluídas foram resolvidas por electroforese através de um gel de acrilamida a 5% (v/v) (produtos de PCR de SMRV) ou por um gel de agarose a 1,5% 24 (produtos de PCR de iniciadores internos), coradas com brometo de etidio e examinadas e fotografadas com luz UV. 0 ADN foi desnaturado, neutralizado in situ e transferido para membranas de nylon carregadas por electrotransferência (produtos de PCR de SMRV) ou por transferência por capilaridade (produtos de PCR de iniciadores internos). 0 ADN foi ligado às membranas por cozimento a 80 °C.

As membranas foram pré-hibridizadas por incubação em tampão de hibridização contendo 5 x SSC e 7% de SDS (p/v) a 50 °C durante 2 h. Após a pré-hibridização, o tampão foi substituído por tampão de hibridização contendo um oligonucleotideo marcado na extremidade 32P-5-'- especifico para SMRV. A hibridização continuou durante 16 h a 50 °C. Após a hibridização, as membranas foram lavadas durante 3x2 minutos em 5 x SSC/0,1% SDS (p/v) à temperatura ambiente, seguida de lavagens de 3 x 30 minutos em 5 x SSC/0,1% SDS (p/v) a 50 °C e uma lavagem final de 5 minutos a 68 °C (Tm - 4 °C) . A auto-radiografia da membrana foi realizada pela exposição dos filtros a um filme de raios X durante 16 h. 2. Validade e Resultados (a) Validade

Hibridização de ADN

Nas condições de hibridização utilizadas, a sonda de SMRV detectou até um equivalente genómico de SMRV num fundo de ADN placentário humano negativo para o virus. A sensibilidade de detecção para o virus seria na ordem de 0,1, g. e., por célula. 25

PCR

Um teste válido é definido como um teste onde a amplificação apropriada das sequências alvo é detectada no ADN de controlo positivo e está ausente na totalidade dos controlos negativos. Adicionalmente, a amplificação de uma sequência genómica alvo deve ser reconhecida em todas as amostras. 0 teste foi válido: a amplificação das sequências alvo foi detectada no ADN de controlo positivo e estava ausente nos controlos negativos. A amplificação do alvo genómico da β-globina foi detectada em todas as amostras.

(b) Resultados do teste: Hibridização de ADN

Ausência de sequências especificas de SMRV no teste de ADN: não ocorreu hibridização da sonda de SMRV marcada radioactivamente com o ADN de controlo negativo ou o ADN de teste sob condições estringentes de hibridização.

(c) Resultados do teste de PCR

Controlo interno de β-globina A análise dos controlos sentinela em triplicado não revelou bandas amplificadas visíveis. Contudo, cada mistura de reacção contendo ADN exibiu uma banda discreta do tamanho esperado de, aproximadamente, 205 pb indicando, assim que o ADN era adequado para amplificação por PCR. 26

Controlos negativos Não se verificaram fragmentos de ADN amplificado nos três controlos sentinela ou nas reacções de ADN de controlo negativo. Não foi detectada hibridização especifica da sonda marcada radioactivamente com os controlos sentinela ou com o ADN de controlo negativo.

Controlos positivos 0 tamanho esperado do fragmento amplificado a partir de ADN de SMRV seria de 201 pb (correspondente aos nucleotideos 805-1006). Foi detectada uma banda discreta de, aproximadamente, 201 pb nos três corredores do ADN de controlo positivo recombinante contendo quantidades de 5,6 fg, 2,8 fg e 1,4 fg de ADN de SMRV e no corredor do controlo positivo CCL 194. Estes 201 pb foram detectados pela sonda marcada radioactivamente, indicando que as reacções tinham amplificado os fragmentos esperados. A sensibilidade do ensaio é da ordem de 1 g. e. em 2000 células. ADN de teste Não foram detectados fragmentos específicos de ADN amplificado nos ADN de teste quer visualmente quer no seguimento da hibridização com a sonda marcada radioactivamente. 27 (d) Resultados do teste do PCR de iniciadores internos,

Reacções secundárias (internas)

Controlos negativos Não se verificaram fragmentos de ADN amplificado nos três controlos sentinela ou nas reacções de ADN de controlo negativo. Não foi detectada hibridização especifica da sonda marcada radioactivamente com os controlos sentinela ou com o ADN de controlo negativo.

Controlo positivo 0 tamanho esperado do fragmento amplificado a partir de ADN de SMRV seria de 203 pb (correspondente aos nucleotideos 401-604). Foi detectada uma banda discreta de, aproximadamente, 203 pb nos três corredores do ADN de controlo positivo recombinante contendo quantidades de 5,6 fg, 2,5 fg e 1,4 fg de ADN de SMRV e no corredor do controlo positivo CCL 194. Esta banda de 203 pb foi detectada pela sonda marcada radioactivamente, indicando que as reacções tinham amplificado os fragmentos esperados. A banda foi detectada em controlos positivos contendo 1,4 fg, 0,7 fg, 0,35 fg, 0,175 fg e 0,087 fg diluições de ADN. Estas amostras não foram submetidas a análise de hibridização de ADN. A sensibilidade do ensaio é inferior a 1 g. e. em 10000 células. 28 ADN de teste Não foram detectados fragmentos específicos de ADN amplificado nos ADN de teste quer visualmente quer no seguimento da hibridização com a sonda marcada radioactivamente. 3. Conclusão

Os resultados são consistentes, tanto com o ADN placentário humano de controlo negativo, como com o ADN de teste da linha celular de Namalwa X sendo isenta de SMRV.

Exemplo 2 Células Namalwa negativas para SMRV foram clonadas por dupla diluição limite para alcançar uma probabilidade estatística de 99,99% que o clone derivado era gerado a partir de uma única célula. Células parentais da linha celular de

Namalwa X foram cultivadas em cultura estática num meio compreendendo meio RPMI 1640 suplementado para 10% de soro bovino fetal, 100 U mL"1 de penicilina, 100 yg mL"1 de estreptomicina e glutamina a 4 mM. As células foram cultivadas em cultura estática e divididas a cada 2—3 dias; diluindo em meio de crescimento até 0,2 milhões de células mL"1 e mantendo apenas as culturas demonstrando viabilidade a > 90% conforme indicado por exclusão do azul de tripano.

Apenas as células apresentando crescimento de 0,2 a 2 milhões de células mL"1 num período de três dias foram seleccionadas para clonagem por diluição e verificou-se ser 29 essencial que a clonagem por diluição fosse efectuada em células que cresceram até uma densidade de cerca de 2 milhões de células mL"1. As células seleccionadas foram diluídas em placas de baixa evaporação de 96 poços; plaqueadas até entre 1 e 300 células/poço, cultivadas durante três semanas, embrulhadas em folha de alumínio.

As colónias individuais foram recolhidas a partir de placas tendo menos de 10% de poços com colónias individuais e foram submetidas a uma segunda série de clonagem por diluição. Os clones duplamente diluídos foram depois comparados por indução de IFN de pequena escala utilizando uma concentração celular de 1 milhão de células mL’1 em placas de 12 poços, tratando com butirato de sódio a 1 mM e adicionando, em seguida, 1 pL de vírus Sendai por poço. O IFN foi recolhido após 24 horas adicionais e ensaiado por ELISA. Aqueles clones relativamente aos quais o ELISA indicou uma expressão quantitativa satisfatória de IFN, foram adicionalmente amplificados em culturas/induções de maior escala e submetidos a análise quantitativa de perfil de subunidade de α-IFN por intermédio de cromatografia líquida de alta pressão de fase reversa (RPHPLC), para seleccionar aqueles clones A, B, C, D, etc., exibindo o perfil desejado.

Exemplo 3 O α-IFN produzido e purificado em conformidade com práticas de fabrico padrão (Lewis, W.G. e Finter, N.B. (1987), "The Production and Purity of a mixed human alpha interferon preparation (Wellferon) derived from lymphoblastoid cells" in The Interferon System (Eds. Baron, S., Dianzani, F., Stanton, 30 G.J. e Fleischmann, W.R. Jnr). Texas University Press) foi analisado quanto ao perfil de subtipo produzido por RPHPLC e conforme ilustrado na Figura 1.

Exemplo 4

Protocolo de purificação para o interferão produzido por células Namalwa clonadas depositadas com o N° de registo ECACC 94120841

Foi seleccionado um clone negativo para SMRV, ECACC 94120841, e foi cultivado em balões de agitação de 3 x 300 mL e foi induzido com o vírus Sendai após tratamento com butirato, de acordo com protocolos padrão (Lewis, W.G. e Finter, N.B., supra). 0 sobrenadante da cultura foi recolhido e purificado por duas passagens numa coluna de imunoafinidade de anticorpo anti-interferão purificado. O interferão foi concentrado e analisado por RPHPLC para determinar a composição de subtipo que está ilustrada na Tabela 2 e o perfil que é apresentado na Figura 2. Deve registar-se que a pureza do interferão alcançada numa preparação laboratorial de pequena escala não foi comparável àquela de um lote de produção de interferão (Exemplo 2 e Figura 1) e, por conseguinte, os valores do pico apresentados a seguir em percentagem podem ser influenciados pela presença de proteína que não seja interferão. 31 TABELA 2

Pico Subtipo de a-IFN % de área de pico Gama aceitável 1 14 5 2-13 2 + 3 2b 24 19 - 37 4 21 11 8-20 5 5 6 4-13 6 10 11 8-21 7 + 8 7 + 17 15 11 - 20 9 8 11 2-14 10 + 11 1 7 1-16 A Tabela 2 apresenta o número do pico de eluição de RPHPLC com o correspondente subtipo de α-lFN e a proporção relativa ("% de área de pico") de cada subtipo obtida a partir da linha celular clonada juntamente com, para comparação, a gama de cada subtipo em interferão linfoblastóide terapeuticamente aceitável.

Pela comparação das Figuras 1 e 2, pode ver-se um nível altamente significativo e suficiente de identidade entre os perfis de IFN para a linha celular de Namalwa positiva para SMRV actualmente utilizada na produção de Wellferon (Marca Registada) (Figura 1) e a linha celular de Namalwa negativa para SMRV ECACC 94120841. O interferão derivado a partir das linhas celulares pode ser considerado como sendo, substancialmente, equivalente. 32

Todas as referências aos presentes subtipos de α-IFN são consistentes com a nomenclatura de proteínas de interferão humano aprovadas pela International Society for Interferon and Cytokine Research e publicadas no Journal of Interferon Research 14:223-226 (1994).

Lisboa, 14 de Setembro de 2007 33

Claims (4)

1. REIVINDICAÇÕES 1. Linha celular Namalwa que está isenta de retrovirus de macaco-esquilo e que é a linha celular ECACC 94120840 ou ECACC 94120841 ou uma linha celular derivada de ECACC 94120840 ou de ECACC 94120841.
2. 2. Linha celular de acordo com a reivindicação 1 que é capaz de produzir uma população de subtipos de interferão alfa compreendendo os subtipos 2b, 7, 10, 17 e 21.
3. 3. Linha celular de acordo com a reivindicação 2, em que os subtipos compreendem os subtipos 1, 2b, 5, 7, 8, 10, 14, 17 e 21.
4. 4. Linha celular de acordo com a reivindicação 3, em que os subtipos de interferão alfa são produzidos nas quantidades seguintes: Subtipo % em peso 1 1-16 2b 19 - 37 5 4-13 7+17 11 - 20 8 2-14 10 8-21 14 2-13 21 8-20 Processo para a preparação de interferão alfa, processo que compreende a cultura de uma linha celular como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 4 e o isolamento do interferão alfa produzido deste modo. Lisboa, 14 de Setembro de 2007