JP3220080B2 - ヒト乳頭腫ウイルスの核酸のハイブリダイゼーシヨンプローブおよびそれを使用する方法 - Google Patents

ヒト乳頭腫ウイルスの核酸のハイブリダイゼーシヨンプローブおよびそれを使用する方法

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JP3220080B2 JP36932697A JP36932697A JP3220080B2 JP 3220080 B2 JP3220080 B2 JP 3220080B2 JP 36932697 A JP36932697 A JP 36932697A JP 36932697 A JP36932697 A JP 36932697A JP 3220080 B2 JP3220080 B2 JP 3220080B2
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Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】本発明は、ヒト乳頭腫ウイルスのタイプ、
とくにヒト乳頭腫ウイルスのタイプ３５（以後「ＨＰＶ
３５」）、ヒト乳頭腫ウイルスのタイプ４３（以後
「ＨＰＶ ４３」）、ヒト乳頭腫ウイルスのタイプ４４
（以後「ＨＰＶ ４４」）およびヒト乳頭腫ウイルスの
タイプＣ５７（以後「ＨＰＶ Ｃ５７」）のための核酸
ハイブリダイゼーションプローブ、およびそれを使用す
る方法に関する。
【０００２】（Ａ）ヒト乳頭腫ウイルスのタイプ ヒト乳頭腫ウイルス（以後「ＨＶＰ」）は、種々の上皮
の病変、例えば、いぼ、コンジロームおよび異形性の原
因であるとして認められている［参照、ギッスマン（Ｇ
issman）、Ｌ．、キャンサー・サーベイズ（Ｃancer
Ｓurv.）、３：１６１（１９８４）；プフィスター（Ｐ
fister）、Ｈ．バイオケルミカル・ファーマコロジー
（Ｂiochem． Ｐharmacol.）、９９：１１１（１９８
３）；ダースト（Ｄurst）、Ｍ．ら、プロシーディング
ス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシ
ズ（Ｐroc． Ｎatl． Ａcad． Ｓci.）ＵＳＡ、８
０：３８１２（１９８３）およびボシャート（Ｂoshar
t）、Ｍ．ら、ＥＭＢＯ Ｊ.、３：１１５１（１９８
４）］。頚（cervix）の異形性［頚の上皮内新形成（Ｃ
ＩＮ）としても知られている］は、頚の癌への進行；穏
和な異形性（ＣＩＮ Ｉ）から、中程度の異形性（ＣＩ
Ｎ ＩＩ）、重度の異形性、その場の癌（集合的にＣＩ
Ｎ ＩＩＩ）、および侵入性の癌への進行において、早
期の事象であると信じられている。
【０００３】ＨＰＶのタイプと頚の異形性および頚の癌
との関連を検査する研究は、ＨＰＶのタイプ６、１１、
１６、１８、３１および３３が性器の病変と関連するこ
とを示した[参照、ギッスマン(Ｇissman）、Ｌ.、キャン
サー・サーベイズ(ＣancerＳurv.)、３：１６１（１９
８４）；プフィスター（Ｐfister）、Ｈ．バイオケルミ
カル・ファーマコロジー（Ｂiochem．Ｐharmacol.）、
９９：１１１（１９８３）；ダースト（Ｄurst）、Ｍ．
ら、プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミ
ー・オブ・サイエンシズ（Ｐroc． Ｎatl． Ａcad．
Ｓci．）ＵＳＡ、８０：３８１２（１９８３）；ボシ
ャート（Ｂoshart）、Ｍ．ら、ＥＭＢＯ Ｊ．、３：１
１５１（１９８４）；デ・ヴィリアース（de Ｖillier
s）、Ｅ．−Ｍ．ら、ウイルス学誌（Ｊ．Ｖirol.）、４
０：９３２（１９８１）；ギッスマン（Ｇissman）、
Ｌ．ら、ウイルス学誌（Ｊ．Ｖirol.）、５８：２２５
（１９８６）およびベウデノン（Ｂeaudenon）、Ｓ．、
ネイチャー（Ｎature）、３２１、２４６（１９８
６）］。
【０００４】ＨＰＶはそれらのＤＮＡ配列の類似性に基
づいてタイプに分けられる。２つのＨＰＶは、それらの
ＤＮＡが５０％より多く交差ハイブリダイゼーションす
る場合、同一のタイプであると分類学的に分類される。
その測定は、適度にストリンジェントなハイブリダイゼ
ーション条件下に溶液中でハイブリダイゼーションし、
引続いてヒドロキシアパタイトのクロマトグラフィーに
よって前記ＤＮＡから二本鎖ＤＮＡを分離することによ
って実施し、前記条件は完全に塩基対の二本鎖ＤＮＡの
融点よりほぼ２５℃低い（便利にはＴm−２５℃と記載
される）と定義される。完全に塩基対の二本鎖ＤＮＡの
融点（Ｔm）は、次のよく確立された式を使用して精確
に予測することができる： Ｔm＝１６．６×log［Ｎa+］＋０．４ １×％Ｇ：Ｃ＋８１．５−０．７２×（％） （v／v）ホルムアルデヒド 上の式は、各ハイブリダイゼーションの条件において各
個々のＤＮＡのためのＴmを実験的に測定する必要なし
に、変化する塩およびホルムアルデヒドの濃度を有する
溶液中の種々のＤＮＡについて、ストリンジェントでな
いハイブリダイゼーション条件およびストリンジェント
なハイブリダイゼーション条件を決定するための酸焦点
を設定する、便利な手段を提供する。
【０００５】それぞれのＨＰＶ ＤＮＡの５０％より少
なくが、ヒドロキシアパタイトへ結合する能力によって
測定しかつ定義して、溶液中で適度のストリンジェント
な条件下に交差ハイブリダイゼーションして完全にまた
は部分的に二本鎖の構造を形成することができる場合、
ＨＰＶ ＤＮＡは同一のタイプであると分類学的に分離
するために十分な関連性をもたない。この方法を用いる
５０％の交差ハイブリダイゼーションのカットオフは、
命名の目的で新規なＨＰＶのタイプの割当てについての
コンセンサスな基準として用いられる。ＨＰＶ ＤＮＡ
の間の交差ハイブリダイゼーションの程度を測定するこ
の方法は、２つのＨＰＶ ＤＮＡが共通のタイプの異な
る分離物を表わすか、あるいは異なるタイプの分離物を
表わすかどうかを決定するために使用される方法とし
て、歴史的に応用されてきている。この基準の使用は、
ＨＰＶのタイプを決定および定義するための臨床的基準
の確立に先行する。下により詳述するように、ＨＰＶの
タイプを決定および定義するための臨床的基準(gevifa
l)は性器の病変の間のＨＰＶのタイプの疫学的分布に基
づく。
【０００６】交差ハイブリダイゼーションの程度を測定
する前述の方法は、ハイブリダイゼーション反応後、完
全にまたは部分的に二本鎖のＤＮＡ分子の形成の程度を
評価することに基づく。しかしながら、完全にまたは部
分的に二本鎖のＤＮＡ分子へのＤＮＡの５０％の転化
は、ＤＮＡのヌクレオチド配列が５０％相同性であるこ
とを意味しなことに注意すべきである。
【０００７】前述のように、ＨＰＶは、また、臨床的基
準に基づいてタイプに分けることができる。すなわち、
前述の交差ハイブリダイゼーションの基準によって定義
して、異なるタイプのＨＰＶが、異なる厳しさの性器の
病変の間および異なる配置的な固体数の間の明確な疫学
的分布を示すことが観測された。
【０００８】例えば、ＨＶＰ ６およびＨＶＰ １１
は、両性の病変、例えば、外方に増殖するコンジローム
におよび少ない程度に平担なコンジロームと主として関
連づけられる［参照、ギッスマン（Ｇissman）、Ｌ．
ら、プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミ
ー・オブ・サイエンシズ（Ｐroc． Ｎatl． Ａcad．
Ｓci．）ＵＳＡ、８０：５６０（１９８３）］。ＨＶＰ
６およびＨＶＰ １１は、また、悪性の上皮の癌のあ
る種の稀なタイプにおいて検出される［参照、ザショウ
（Ｚachow）、Ｋ．Ｒ．ら、ウイルス学誌(Ｊ. Ｖiro
l.)、５７：３５３（１９８６）］。対照的に、ＨＶＰ
１６、ＨＶＰ ３１およびＨＶＰ ３３は、頚の癌お
よび他の肛門性器の癌ならびにそれらの前駆体病変にお
いて変化する頻度で検出される［参照、ダースト（Ｄur
st）、Ｍ．ら、プロシーディングス・オブ・ナショナル
・アカデミー・オブ・サイエンシズ（Ｐroc． Ｎatl．
Ａcad． Ｓci．）ＵＳＡ、８０：３８１２（１９８
３）、ボシャート（Ｂoshart）、Ｍ．ら、ＥＭＢＯ
Ｊ．、３：１１５(１９８４)、ロリンクズ（Ｌorinc
z）、Ａ．Ｔ．ら、ウイルス学誌（Ｊ． Ｖirol．）、
５８：２２５（１９８６）およびベウデノン（Ｂeauden
on）、Ｓ．、ネイチャー（Ｎature）、３２１、２４６
（１９８６）］。ＨＶＰ １６、ＨＶＰ １８、ＨＶＰ
３１およびＨＶＰ ３３のこの分布は、ＨＶＰ ６お
よびＨＶＰ １１で感染された病変に比較して、ＨＶＰ
１６、ＨＶＰ １８、ＨＶＰ ３１およびＨＶＰ ３
３で感染した頚の癌のより大きい危険またはより急速な
それへの進行を反映すると信じられる。結局、ＨＰＶの
タイプの決定は臨床的−診断的価値を有する。すなわ
ち、それは、ＨＰＶの感染の証拠を示す患者における癌
の発生の危険の評価において、重要な因子である。評価
された癌の発生の危険に基づいて、適当は治療的処置を
選択することができる。
【０００９】さらに、ＨＶＰ １６はアフリカよりヨー
ロッパにおいて広く流布し［ダースト（Ｄurst）、Ｍ．
ら、プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミ
ー・オブ・サイエンシズ（Ｐroc． Ｎatl． Ａcad．
Ｓci．）ＵＳＡ、８０：３８１２（１９８３）］、こ
れに対してＨＶＰ １８はヨーロッパよりアフリカにお
いて広く流布する［ボシャート（Ｂoshart）、Ｍ．ら、
ＥＭＢＯ Ｊ．、３：１１１５（１９８４）］。
【００１０】したがって、本発明の関係する範囲内で、
２つのＨＰＶは、（１）それらが前述の交差ハイブリダ
イゼーションの程度についての基準を満足する場合、あ
るいは（２）それらが性器の病変の間で交差ハイブリダ
イゼーションの実質的に同一の疫学的分布を示しかつ、
疫学的分布を構成する同一の性器の病変と、両者とも、
交差ハイブリダイゼーションする場合、同一のタイプで
あると考えられる。
【００１１】頚の癌および頚の癌に進行する可能性を有
する性器の病変の有意のパーセントが、既知のＨＰＶの
タイプのいずれにも相当しない「新しい」ＨＰＶのタイ
プを含有することが発見された。こうして、特定のＨＰ
Ｖのタイプと、頚の癌への進行の高い危険を有する性器
の病変との既知の関連に照して、これらの「新しい」Ｈ
ＰＶのタイプを検出しかつ分類することができることに
よって、ＨＰＶの感染の証拠を有しかつこれらの「新し
い」ＨＰＶのタイプで感染しうる患者において、これら
の「新しい」ＨＰＶのタイプと関連する頚の癌の危険を
確証することができる。
【００１２】（Ｂ）ＨＰＶのタイプのクローニング この分野における長い停滞した努力にかかわらず、ＨＰ
Ｖを生体外で細胞培養において増殖することは不可能で
あった。しかしながら、組換えＤＮＡクローニング技術
は、多くのＨＰＶのタイプ、例えば、ＨＰＶのタイプ
６、１１、１６、１８、３１および３３、のＤＮＡを分
離しかつ精製することを可能にした［参照、ダースト
（Ｄurst）、Ｍ．ら、プロシーディングス・オブ・ナシ
ョナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ（Ｐroc．Ｎa
tl． Ａcad． Ｓci．）ＵＳＡ、８０：３８１２（１
９８３）、ボシャート（Ｂoshart）、Ｍ．ら、ＥＭＢＯ
Ｊ．、３：１１５１（１９８４）、デ・ヴィリアース
（de Ｖilliers）、Ｅ．−Ｍ．ら、ウイルス学誌
（Ｊ． Ｖirol．）、４０：９３２（１９８１）、ギッ
スマン（Ｇissman）、Ｌ．ら、ウイルス学誌（Ｊ． Ｖ
irol．）、５８：２２５（１９８６）、ロリンクズ（Ｌ
orincz）、Ａ．Ｔ．ら、ウイルス学誌（Ｊ． Ｖiro
l．）、５８：２２５（１９８６）、およびベウデノン
（Ｂeaudenon）、Ｓ．、ネイチャー（Ｎature）、３２
１、２４６（１９８６）］。ＨＰＶに関する知識の大部
分は、このような組換えＤＮＡにおけるＤＮＡ配列の研
究および組織の試料中のＨＰＶの検出のために、核酸の
ハイブリダイゼーションプローブを調製するために、こ
れらのＤＮＡ配列を使用することによって誘導された。
【００１３】（Ｃ）ハイブリダイゼーションプローブ 前述のように、ＨＰＶ ＤＮＡは異なるＨＰＶのタイプ
に対するハイブリダイゼーションプローブとして使用さ
れた。異なるタイプの２つのＨＰＶ ＤＮＡは、このよ
うなハイブリダイゼーションプローブを使用する、スト
リンジェントなハイブリダイゼーション条件下のハイブ
リダイゼーションによって容易に区別することができ、
そしてストリンジェントなハイブリダイゼーション条件
は完全に塩基対の二本鎖ＤＮＡ雑種の融点よりほぼ１０
℃低い（便利にはＴm−１０℃と記載される）と定義さ
れる。同様に、このようなハイブリダイゼーションプロ
ーブを使用する、ストリンジェントなハイブリダイゼー
ション条件下のハイブリダイゼーションによって容易に
区別することができ、そしてストリンジェントなハイブ
リダイゼーション条件は完全に塩基対の二本鎖ＤＮＡ−
ＲＮＡ雑種の融点よりほぼ１０℃低い（便利にはＴm−
１０℃と記載される）と定義される。さらに、異なるタ
イプの２つのＨＰＶ ＲＮＡは、このようなハイブリダ
イゼーションプローブを使用する、ストリンジェントな
ハイブリダイゼーション条件下のハイブリダイゼーショ
ンによって容易に区別することができ、そしてストリン
ジェントなハイブリダイゼーション条件は完全に塩基対
の二本鎖ＲＮＡ−ＲＮＡ雑種の融点よりほぼ１０℃低い
（便利にはＴm−１０℃と記載される）と定義される。
上の基準を使用して異なるタイプとして表示されるＨＰ
Ｖ ＤＮＡまたはＲＮＡは、事実、それらのヌクレオチ
ド配列の８０％程度に多くが共通しうることに注意すべ
きである。
【００１４】さらに、２つの異なるタイプのＨＰＶ Ｄ
ＮＡは、このようなハイブリダイゼーションプローブを
使用して、ストリンジェントでないハイブリダイゼーシ
ョン条件に交差ハイブリダイゼーションすることがで
き、そしてストリンジェントでないハイブリダイゼーシ
ョン条件は完全に塩基対の二本鎖ＤＮＡ−ＤＮＡ雑種の
融点よりほぼ３５℃以上低い（便利にはＴm−３５℃以
上と記載される）と定義される。同様に、１つのタイプ
のＨＰＶ ＤＮＡは、このようなハイブリダイゼーショ
ンプローブを使用して、ストリンジェントでないハイブ
リダイゼーション条件に、他のタイプのＨＰＶ ＲＮＡ
と交差ハイブリダイゼーションすることができ、そして
ストリンジェントでないハイブリダイゼーション条件は
完全に塩基対の二本鎖ＤＮＡ−ＲＮＡ雑種の融点よりほ
ぼ３５℃以上低い（便利にはＴm−３５℃以上と記載さ
れる）と定義される。さらに、２つの異なるタイプのＨ
ＰＶＲＮＡは、このようなハイブリダイゼーションプロ
ーブを使用して、ストリンジェントでないハイブリダイ
ゼーション条件に交差ハイブリダイゼーションすること
ができ、そしてストリンジェントでないハイブリダイゼ
ーション条件は完全に塩基対の二本鎖ＲＮＡ−ＲＮＡ雑
種の融点よりほぼ３５℃以上低い（便利にはＴm−３５
℃以上と記載される）と定義される。［参照、アンダー
ソン（Ａnderson）、Ｌ．Ｍ．ら、核酸のハイブリダイ
ゼーション（Ｎucleic Ａcid Ｈybridization）、７
３−１１１ページ、Ｂ．Ｄ．ヘイムス（Ｈames）および
Ｓ．Ｊ．ヒギンス（Ｈiggins）編、Ｉ．Ｒ．Ｌ．プレス
（Ｐress）、オクスフォード、英国およびワシントン、
Ｄ．Ｃ．、米国（１９８５）］。
【００１５】同一ヌクレオチド配列のＤＮＡ−ＤＮＡ、
ＤＮＡ−ＲＮＡおよびＲＮＡ−ＲＮＡの融点は、種々の
化学的環境において異なることがありる。これらの種々
の雑種の関連する融点への種々の化合物の作用は、いく
つかの試薬について研究された。例えば、ホルムアルデ
ヒドの濃度を増加するとＤＮＡ−ＤＮＡ雑種はＤＮＡ−
ＲＮＡよりも示差的に不安定化されるので、ホルムアル
デヒドの高い濃度、例えば、８０％（v／v）において、
ＤＮＡ−ＲＮＡは同一ヌクレオチド配列のＤＮＡ−ＤＮ
Ａ雑種より有意に高い融点を有しうることはよく知られ
ている。
【００１６】前述のように、ＤＮＡ−ＤＮＡ雑種の融点
は、アンダーソン（Ａnderson）、Ｌ．Ｍ．ら、核酸の
ハイブリダイゼーション（Ｎucleic Ａcid Ｈybridiz
ation）、７３−１１１ページ、Ｂ．Ｄ．ヘイムス（Ｈa
mes）およびＳ．Ｊ．ヒギンス（Ｈiggins）編、Ｉ．
Ｒ．Ｌ．プレス（Ｐress）、オクスフォード、英国およ
びワシントン、Ｄ．Ｃ．、米国（１９８５）に記載され
ているＹとうに、予測することができる。さらに、ＤＮ
Ａ−ＤＮＡ雑種の融点は、ホウレイ（Ｈowley）、Ｐ．
ら、ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｊ．Ｂio
chem．）、２５４：４８７６（１９７９）に記載されて
いるように、実験的に決定することができる。ＤＮＡ−
ＲＮＡ雑種の融点は、また、この分野においてよく知ら
れた手段によって決定することができる。
【００１７】こうして、組織の試料を、一般にＨＰＶ
ＤＮＡまたはＲＮＡおよび／またはとくにＨＰＶ ＤＮ
ＡまたはＲＮＡのタイプの存在について、条件、すなわ
ち、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件ま
たはストリンジェントでないハイブリダイゼーション条
件のどちらをハイブリダイゼーションのために使用する
かに依存して、核酸のハイブリダイゼーションによって
試験することが可能である。
【００１８】したがって、本発明の１つの目的は、頚の
癌および頚の癌へ進行する可能性を有する性器の病変が
「新規な」ＨＰＶのタイプを含有するかどうかを確証
し、そして含有する場合、仮定した「新規な」ＨＰＶの
タイプをクローニングすることである。
【００１９】本発明の他の目的は、一般にＨＰＶのタイ
プに対しておよびとくに「新規な」ＨＰＶのタイプに対
して特異的である、核酸のハイブリダイゼーションプロ
ーブを提供することである。
【００２０】本発明のなお他の目的は、ＤＮＡまたはＲ
ＮＡの未知の試料、とくに性器の病変から誘導されたＤ
ＮＡまたはＲＮＡの未知の試料中の、一般にＨＰＶのＤ
ＮＡまたはＲＮＡおよびとくに「新規な」ＨＰＶのＤＮ
ＡまたはＲＮＡを検出して、頚の癌の発生の危険を決定
する方法を提供することである。
【００２１】本発明のこれらの目的および他の目的は、
以下の本発明の詳細な説明から明らかであろう。
【００２２】本発明において、本発明においてクローニ
ングした「新しい」ＨＰＶのタイプは新規なＨＰＶのタ
イプであることが発見され、これらをＨＰＶ ３５、Ｈ
ＰＶ４３、ＨＰＶ ４４およびＨＰＶ Ｃ５７と表示す
る。
【００２３】こうして、１つの実施態様において、本発
明の前述の目的は、クローニングベクターおよび、それ
ぞれ、ＨＰＶ ３５ ＤＮＡまたはその断片の実質的に
すべて、ＨＰＶ ４３ ＤＮＡまたはその断片の実質的
にすべて、ＨＰＶ ４４ ＤＮＡまたはその断片の実質
的にすべて、またはＨＰＶ Ｃ５７ ＤＮＡまたはその
断片の実質的にすべてを含んでなることを特徴とするＨ
ＰＶ ３５、ＨＰＶ４３、ＨＰＶ ４４またはＨＰＶ
Ｃ５７の組換えＤＮＡによって満足された。
【００２４】他の実施態様において、本発明の前述の目
的は、本質的に純粋なＨＰＶ ３５ＤＮＡまたはその断
片、本質的に純粋なＨＰＶ ４３ ＤＮＡまたはその断
片、本質的に純粋なＨＰＶ ４４ ＤＮＡまたはその断
片、または本質的に純粋なＨＰＶ Ｃ５７ ＤＮＡまた
はその断片；および本質的に純粋なＨＰＶ ３５ＲＮＡ
またはその断片、本質的に純粋なＨＰＶ ４３ ＲＮＡ
またはその断片、本質的に純粋なＨＰＶ ４４ ＲＮＡ
またはその断片、または本質的に純粋なＨＰＶ Ｃ５７
ＲＮＡまたはその断片によって満足された。
【００２５】なお他の実施態様において、本発明の前述
の目的は、工程： （１）ストリンジェントでない条件下に、 （a）（i）マーカーで標識されたＨＰＶ ３５ ＤＮＡ
またはその断片、マーカーで標識されたＨＰＶ ４３
ＤＮＡまたはその断片、マーカーで標識されたＨＰＶ
４４ ＤＮＡまたはその断片、あるいはマーカーで標識
されたＨＰＶＣ５７ ＤＮＡまたはその断片、および
（ii）マーカーで標識されたＨＰＶ ３５ ＲＮＡまた
はその断片、マーカーで標識されたＨＰＶ ４３ ＲＮ
Ａまたはその断片、マーカーで標識されたＨＰＶ ４４
ＲＮＡまたはその断片、あるいはマーカーで標識され
たＨＰＶ Ｃ５７ ＲＮＡまたはその断片、から成る群
より選択される構成員、および （b）ＤＮＡまたはＲＮＡの未知の試料、 を使用し
てハイブリダイゼーションを実施し、そして （２）交差ハイブリダイゼーションの存在についてアッ
セイして、前記試料中のＨＶＰのＤＮＡまたはＲＮＡを
検出する、を含んでなることを特徴とするＨＶＰのＤＮ
ＡまたはＲＮＡを検出する方法によって満足された。
【００２６】ほかの実施態様において、本発明の前述の
目的は、工程： （１）ストリンジェントな条件下に、 （a）（i）それぞれ、マーカーで標識されたＨＰＶ ３
５ ＤＮＡまたはその断片、マーカーで標識されたＨＰ
Ｖ ４３ ＤＮＡまたはその断片、マーカーで標識され
たＨＰＶ ４４ ＤＮＡまたはその断片、あるいはマー
カーで標識されたＨＰＶ Ｃ５７ ＤＮＡまたはその断
片、および（ii）それぞれ、マーカーで標識されたＨＰ
Ｖ ３５ ＲＮＡまたはその断片、マーカーで標識され
たＨＰＶ ４３ ＲＮＡまたはその断片、マーカーで標
識されたＨＰＶ ４４ ＲＮＡまたはその断片、あるい
はマーカーで標識されたＨＰＶ Ｃ５７ ＲＮＡまたは
その断片、から成る群より選択される構成員、および （b）ＤＮＡまたはＲＮＡの未知の試料、を使用してハ
イブリダイゼーションを実施し、そして （２）交差ハイブリダイゼーションの存在についてアッ
セイして、前記試料中の、それぞれ、ＨＰＶ ３５ Ｄ
ＮＡまたはＲＮＡ、ＨＰＶ ４３ ＤＮＡまたはＲＮ
Ａ、ＨＰＶ ４４ ＤＮＡまたはＲＮＡ、あるいはＨＰ
Ｖ Ｃ５７ ＤＮＡまたはＲＮＡを検出する、を含んで
なることを特徴とするＨＰＶ ３５ ＤＮＡまたはＲＮ
Ａ、ＨＰＶ ４３ ＤＮＡまたはＲＮＡ、ＨＰＶ ４４
ＤＮＡまたはＲＮＡ、あるいはＨＰＶＣ５７ ＤＮＡ
またはＲＮＡを検出する方法によって満足された。
【００２７】なおほかの実施態様において、本発明の前
述の目的は、工程： （１）ストリンジェントな条件下に、 （a）性器の病変のサンプリングの各性器の病変から誘
導されたＤＮＡまたはＲＮＡの第１分画、前記サンプリ
ングは頚の癌への疫学的進行を示す、および （b）（i）、それぞれ、マーカーで標識されたＨＰＶ
３５ ＤＮＡまたはその断片、マーカーで標識されたＨ
ＰＶ ４３ ＤＮＡまたはその断片、マーカーで標識さ
れたＨＰＶ ４４ ＤＮＡまたはその断片、あるいはマ
ーカーで標識されたＨＰＶ Ｃ５７ ＤＮＡまたはその
断片、および（ii）それぞれ、マーカーで標識されたＨ
ＰＶ ３５ ＲＮＡまたはその断片、マーカーで標識さ
れたＨＰＶ ４３ ＲＮＡまたはその断片、マーカーで
標識されたＨＰＶ ４４ ＲＮＡまたはその断片、ある
いはマーカーで標識されたＨＰＶ Ｃ５７ ＲＮＡまた
はその断片、から成る群より選択される構成員、を使用
してハイブリダイゼーションを実施し、そして （２）ストリンジェントな条件下に、 （a）性器の病変の前記サンプリングの各性器の病変か
ら誘導されたＤＮＡまたはＲＮＡの第２分画、および （b）マーカーで標識された性器の病変から誘導された
ＤＮＡまたはＲＮＡの未知の試料、を使用して、ハイブ
リダイゼーションを実施し、 （３）工程（１）におい
て得られた交差ハイブリダイゼーションの疫学的分布を
工程（２）において得られたそれおよび前記疫学的分布
を構成する各病変からのＤＮＡの交差ハイブリダイゼー
ションと比較して、前記試料中の、それぞれ、ＨＰＶ
３５ ＤＮＡまたはＲＮＡ、ＨＰＶ ４３ ＤＮＡまた
はＲＮＡ、ＨＰＶ ４４ ＤＮＡまたはＲＮＡ、あるい
はＨＰＶ Ｃ５７ ＤＮＡまたはＲＮＡを検出する、を
含んでなることを特徴とするＨＰＶ ３５ ＤＮＡまた
はＲＮＡ、ＨＰＶ ４３ ＤＮＡまたはＲＮＡ、ＨＰＶ
４４ ＤＮＡまたはＲＮＡ、あるいはＨＰＶＣ５７
ＤＮＡまたはＲＮＡを検出する方法によって満足され
た。
【００２８】従来未知のＨＰＶのタイプが本発明におい
て発見され、そしてそれらをＨＰＶ３５、ＨＰＶ ４
３、ＨＰＶ ４４およびＨＰＶ Ｃ５７と表示する。Ｈ
ＰＶ３５、ＨＰＶ ４３、ＨＰＶ ４４およびＨＰＶ
Ｃ５７は、本発明において最初にクローニングされ、こ
うして、一般にＤＮＡまたはＲＮＡの未知の試料、とく
に一般にＨＰＶ ＤＮＡまたはＲＮＡおよびとくに性器
の病変から誘導されたＤＮＡまたはＲＮＡの未知の試料
において、一般にＨＰＶ ＤＮＡまたはＲＮＡ、とく
に、それぞれ、ＨＰＶ ３５ ＤＮＡまたはＲＮＡ、Ｈ
ＰＶ ４３ ＤＮＡまたはＲＮＡ、ＨＰＶ ４４ ＤＮ
ＡまたはＲＮＡ、またはＨＰＶ Ｃ５７ＤＮＡまたはＲ
ＮＡの検出のためのハイブリダイゼーションプローブの
調製が可能となった。
【００２９】ＨＰＶ ３５は、ワシントン、Ｄ．Ｃ．に
おいて得られた腺癌の生検から単離およびクローニング
された。
【００３０】ＨＰＶ ４３は、組織病理学的検査で角質
増殖のみを示す、ミシガン州から得られた陰門組織の生
検から単離およびクローニングされた。
【００３１】ＨＰＶ ４４は、ミシガン州から得られた
陰門のコンジロームの生検から単離およびクローニング
された。
【００３２】ＨＰＶ Ｃ５７は、ワシントン、Ｄ．Ｃ．
から得られた陰門のコンジロームの生検から単離および
クローニングされた。
【００３３】最初にＨＰＶ ３５、ＨＰＶ ４３、ＨＰ
Ｖ ４４およびＨＰＶ Ｃ５７をクローニングしてＨＰ
Ｖ ３５のクローン１Ａおよび１Ｂ、ＨＰＶ ４３のク
ローン１Ａおよび１Ｂ、ＨＰＶ ４４のクローン１およ
びＨＰＶ Ｃ５７のクローン１Ａおよび１Ｂを調製する
ために、ここに提供した実施例において使用した特定の
クローニングベクターはλ Ｌ４７であった。
【００３４】ＨＰＶ ３５のクローン１Ａおよび１Ｂか
らのＨＰＶ ３５ ＤＮＡは、pＢＲ３２２（ＡＴＣＣ
Ｎo．３７０１７）中においてサブクローニングしてＨ
ＰＶ ３５のクローン２Ａおよび２Ｂを調製した。ＨＰ
Ｖ ３５のクローン２Ａおよび２Ｂは、アメリカン・タ
イプ・カルチャー・コレクション（Ａmerican Ｔype
Ｃulture Ｃollection）において、それぞれ、ＡＴＣ
Ｃ Ｎo．４０３３０および４０３３１で受託された。
【００３５】ＨＰＶ ４３のクローン１Ａおよび１Ｂか
らのＨＰＶ ４３ ＤＮＡは、pＴ７１３［ＧＩＢＣＯ
／ＢＲＬ、ガイサースバーグ(Ｇaithersburg）、マリイ
ランド州］中においてサブクローニングしてＨＰＶ ４
３のクローン２Ａおよび２Ｂを調製した。ＨＰＶ ４３
のクローン２Ａおよび２Ｂは、アメリカン・タイプ・カ
ルチャー・コレクション（Ａmerican Ｔype Ｃulture
Ｃollection）において、それぞれ、ＡＴＣＣ Ｎo．
４０３３８および４０３３９で受託された。
【００３６】ＨＰＶ ４４のクローン１からのＨＰＶ
４４ ＤＮＡは、pＴ７１３［ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ、ガ
イサースバーグ（Ｇaithersburg）、マリイランド州］
中においてサブクローニングしてＨＰＶ ４４のクロー
ン２を調製した。ＨＰＶ ４４のクローン２は、アメリ
カン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ａmerican
Ｔype Ｃulture Ｃollection）において、ＡＴＣＣ
Ｎo．４０３５３で受託された。
【００３７】ＨＰＶ Ｃ５７のクローン１Ａおよび１Ｂ
からのＨＰＶ Ｃ５７ ＤＮＡは、pＴ７１３［ＧＩＢ
ＣＯ／ＢＲＬ、ガイサースバーグ（Ｇaithersburg）、
マリイランド州］中においてサブクローニングしてＨＰ
Ｖ Ｃ５７のクローン２Ａおよび２Ｂを調製した。ＨＰ
Ｖ Ｃ５７のクローン２Ａおよび２Ｂは、アメリカン・
タイプ・カルチャー・コレクション（Ａmerican Ｔype
Ｃulture Ｃollection）において、それぞれ、ＡＴ
ＣＣ Ｎo．４０３４１および４０３７９で受託され
た。
【００３８】ＨＰＶ ３５ ＤＮＡは、その全体におい
て、ＨＰＶ ３５のクローン２Ａおよび２Ｂから、Ｂam
ＨＩ制限エンドヌクレアーゼを使用して切除し、そして
任意のよく知られた原核および真核クローニングベクタ
ー中でサブクローニングすることができた。
【００３９】ＨＰＶ ４３ ＤＮＡは、その全体におい
て、ＨＰＶ ４３のクローン２ＡからＨindＩＩＩ制限
エンドヌクレアーゼを使用してそしてクローン２Ｂから
ＢamＨＩ制限エンドヌクレアーゼを使用して切除し、そ
して任意のよく知られた原核および真核クローニングベ
クター中でサブクローニングすることができた。
【００４０】ＨＰＶ ４４ ＤＮＡは、その全体におい
て、ＨＰＶ ４４のクローン２から、ＢamＨＩ制限エン
ドヌクレアーゼを使用して切除し、そして任意のよく知
られた原核および真核クローニングベクター中でサブク
ローニングすることができた。
【００４１】ＨＰＶ Ｃ５７ ＤＮＡは、その全体にお
いて、ＨＰＶ Ｃ５７のクローン２ＡからＥcoＲＩ制限
エンドヌクレアーゼを使用してそしてクローン２Ｂから
ＢamＨＩ制限エンドヌクレアーゼを使用して切除し、そ
して任意のよく知られた原核および真核クローニングベ
クター中でサブクローニングすることができた。
【００４２】ＨＰＶ ３５、ＨＰＶ ４３、ＨＰＶ ４
４またはＨＰＶ Ｃ５７をサブクローニングするための
使用する特定のクローニングベクターは、臨界的でな
く、そして任意の既知の原核クローニングベクター、例
えば、pＵＣ１１、λ誘導ベクター、例えば、λ シャ
ロンまたはＭ１３誘導バクテリオファージ［参照、マニ
アチス（Ｍaniatis）、Ｔ．ら、モレキュラー・クロー
ニング（Ｍolecular Ｃloning）：実験室のマニュアル
（a laboratory manual）、コールド・スプリング・
ハーバー・ラボラトリー（Ｃold Ｓpring Ｈarbor
Ｌaboratories）、ニューヨーク州、コールド・スプリ
ング・ハーバー（１９８２）およびレネン（Ｌoene
n）、Ｗ．Ａ．Ｍ．ら、遺伝子（Ｇene）、２０：２４９
（１９８０）］または任意の既知の真核クローニングベ
クター、例えば、pＺＩＰ−Ｎeo ＳＶ［Ｘ１］またはp
ＢＫＴＫ−１［参照、ポウエールス（Ｐoueels）、Ｐ．
Ｈ．ら、クローニングベクターズ（Ｃlonig Ｖector
s）：実験室のマニュアル（Ａ Ｌaboratory Ｍanua
l）、エルセイヴェール（Ｅlseiver）、アムステルダム
（１９８５）］であることができる。
【００４３】ＨＰＶ ３５ ＤＮＡ、ＨＰＶ ４３ Ｄ
ＮＡ、ＨＰＶ ４４ ＤＮＡまたはＨＰＶ Ｃ５７ Ｄ
ＮＡの断片は、同様に、それぞれ、ＨＰＶ ３５のクロ
ーン２Ａおよび２Ｂ、ＨＰＶ ４３のクローン２Ａおよ
び２Ｂ、ＨＰＶ ４４のクローン２、またはＨＰＶ Ｃ
５７のクローン２Ａおよび２Ｂから他のよく知られた制
限エンドヌクレアーゼを使用して切除し、そして前述の
クローニングベクター中でクローニングすることができ
る。同様に、ＨＰＶ ３５のクローン２Ａおよび２Ｂ中
のＨＰＶ ３５ ＤＮＡ、ＨＰＶ ４３のクローン２Ａ
および２Ｂ中のＨＰＶ ４３ ＤＮＡ、ＨＰＶ ４４の
クローン２中のＨＰＶ ４４ ＤＮＡ、またはＨＰＶ
Ｃ５７のクローン２Ａおよび２Ｂ中のＨＰＶ Ｃ５７
ＤＮＡは、それらから切除し、一緒に結合し、そして前
述のクローニングベクター中でクローニングして、それ
ぞれ、ＨＰＶ ３５のゲノム、ＨＰＶ ４３のゲノム、
ＨＰＶ ４４のゲノムおよびＨＰＶ Ｃ５７のゲノムの
実質的にすべてを含有するベクターを得ることができ
る。
【００４４】ＨＰＶ ３５ ＤＮＡまたはその断片、Ｈ
ＰＶ ４３ ＤＮＡまたはその断片、ＨＰＶ ４４ Ｄ
ＮＡまたはその断片、またはＨＰＶ Ｃ５７ ＤＮＡま
たはその断片のクローニングは、一般にＨＰＶ ＤＮＡ
またはＲＮＡ、とくに、それぞれ、ＨＰＶ ３５ ＤＮ
ＡまたはＲＮＡ、ＨＰＶ ４３ ＤＮＡまたはＲＮＡ、
ＨＰＶ ４４ ＤＮＡまたはＲＮＡ、またはＨＰＶ Ｃ
５７ ＤＮＡまたはＲＮＡのための核酸のハイブリダイ
ゼーションプローブを調製するために、それぞれ、大量
のＨＰＶ ３５ ＤＮＡまたはその断片、ＨＰＶ ４３
ＤＮＡまたはその断片、ＨＰＶ ４４ ＤＮＡまたは
その断片、またはＨＰＶ Ｃ５７ ＤＮＡまたはその断
片を比較的簡単に生産することを可能とする。
【００４５】さらに、ＨＰＶ ３５ ＤＮＡまたはその
断片、ＨＰＶ ４３ ＤＮＡまたはその断片、ＨＰＶ
４４ ＤＮＡまたはその断片、またはＨＰＶ Ｃ５７
ＤＮＡまたはその断片を、他のよく知られたクローニン
グベクター中で、サブクローニングして特定のクローニ
ングベクターの特別の性質を得るという利点を使用るこ
とができ、これらの性質は、クローニングベクター中に
挿入されたＨＰＶ ３５ ＤＮＡ、ＨＰＶ ４３ ＤＮ
Ａ、ＨＰＶ ４４ ＤＮＡ、またはＨＰＶ Ｃ５７ Ｄ
ＮＡに対して相同性のＲＮＡの生体外の合成を促進する
［参照、マニアチス（Ｍaniatis）、Ｔ．ら、モレキュ
ラー・クローニング（Ｍolecular Ｃloning）：実験室
のマニュアル（a laboratory manual）、コールド・
スプリング・ハーバー・ラボラトリー（Ｃold Ｓpring
Ｈarbor Ｌaboratories）、ニューヨーク州、コール
ド・スプリング・ハーバー（１９８２）］。これらのク
ローニングベクターの例は、pＴ７１２およびpＴ７１３
を包含し、それらの各々はＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ、ガイサ
ースバーグ（Ｇaithersburg）、マリイランド州、から
商業的に入手可能である。ＨＰＶ ３５ ＤＮＡまたは
その断片、ＨＰＶ ４３ ＤＮＡまたはその断片、ＨＰ
Ｖ ４４ ＤＮＡまたはその断片、またはＨＰＶ Ｃ５
７ ＤＮＡまたはその断片は、これらのクローニングベ
クター中にサブクローニングすることができるので、そ
れぞれ、ＨＰＶ ３５ ＤＮＡまたはその断片、ＨＰＶ
４３ ＤＮＡまたはその断片、ＨＰＶ ４４ ＤＮＡ
またはその断片、またはＨＰＶ Ｃ５７ ＤＮＡまたは
その断片は、ファージエンコーデッド（encoded）ＲＮ
Ａポリメラーゼ、例えば、Ｔ７、Ｔ３またはＳＰ６のた
めの効率よい鋳型としてはたらくことができる。このよ
うなクローニングベクターおよびこのようなＲＮＡポリ
メラーゼを使用すると、それぞれ、ＨＰＶ ３５ＤＮＡ
またはその断片、ＨＰＶ ４３ ＤＮＡまたはその断
片、ＨＰＶ ４４ＤＮＡまたはその断片、またはＨＰＶ
Ｃ５７ ＤＮＡまたはその断片の鎖のいずれかに対し
て相補的なＨＰＶ ３５ ＲＮＡ、ＨＰＶ ４３ ＲＮ
Ａ、ＨＰＶ４４ ＲＮＡ、またはＨＰＶ Ｃ５７ ＲＮ
Ａを、この分野においてよく知られた方法を使用する生
体外転写によって合成することができる。
【００４６】ＨＰＶ ３５ ＤＮＡまたはその断片、Ｈ
ＰＶ ４３ ＤＮＡまたはその断片、ＨＰＶ ４４ Ｄ
ＮＡまたはその断片、またはＨＰＶ Ｃ５７ ＤＮＡま
たはその断片を含有するクローニングベクターを増殖す
るための特定のバクテリアまたは真核宿主は、使用する
クローニングベクターに依存するであろう。例えば、λ
Ｌ４７中でクローニングしたＨＰＶ ３５ ＤＮＡ、
ＨＰＶ ４３ ＤＮＡ、ＨＰＶ ４４ ＤＮＡまたはＨ
ＰＶ Ｃ５７ ＤＮＡを増殖するための典型的な宿主
は、Ｅ． coli ＮＭ５３８［フリンシャンフ（Ｆrins
chanf）、Ａ．Ｍ．ら、ジャーナル・オブ・モレキュラ
ー・バイオロジー（Ｊ．Ｍol．Ｂiol.)、１７０：８２
７（１９８３）］を包含する。他の宿主、例えば、Ｅ．
coli ＨＢ１０１［ボイアー（Ｂoyer）、Ｈ．Ｗ．
ら、ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー
(Ｊ.Ｍol．Ｂiol.）、４１：４５９（１９６９）］は、
クローニングベクターとしてpＢＲ３２２またはpＵＣ１
１を使用するとき、用いることができる。pＺＩＰ−Ｎe
o ＳＶ［Ｘ１］中でクローニングしたＨＰＶ ３５
ＤＮＡ、ＨＰＶ ４３ ＤＮＡ、ＨＰＶ ４４ ＤＮＡ
またはＨＰＶ Ｃ５７ ＤＮＡを増殖するための典型的
な宿主はサルのＣos 細胞であり、これに対してpＢＫ
ＴＫ−１中でクローニングしたＨＰＶ ＤＮＡを増殖す
るための典型的な宿主はある数のよく知られた哺乳動物
の細胞系のいずれかでらろう［例えば、ポウエールス
（Ｐoueels）、Ｐ．Ｈ．ら、クローニングベクターズ
（Ｃlonig Ｖectors）：実験室のマニュアル（Ａ Ｌa
boratory Ｍanual）、エルセイヴェール（Ｅlseive
r）、アムステルダム（１９８５）］。
【００４７】一般にＨＰＶ ＤＮＡまたはＲＮＡあるい
はとくにＨＰＶ ３５ ＤＮＡまたはＲＮＡ、ＨＰＶ
４３ ＤＮＡまたはＲＮＡ、ＨＰＶ ４４ ＤＮＡまた
はＲＮＡ、またはＨＰＶ Ｃ５７ ＤＮＡまたはＲＮＡ
への本発明のプローブのハイブリダイゼーションは、使
用するハイブリダイゼーション条件に依存するであろ
う。すなわち、ストリンジェントでないハイブリダイゼ
ーション条件下で、ＨＰＶ ３５ ＤＮＡまたはＲＮＡ
またはその断片、ＨＰＶ ４３ ＤＮＡまたはＲＮＡま
たはその断片、ＨＰＶ ４４ ＤＮＡまたはＲＮＡまた
はその断片、またはＨＰＶ Ｃ５７ ＤＮＡまたはＲＮ
Ａまたはその断片は、一般にＨＰＶ ＤＮＡまたはＲＮ
Ａのためのハイブリダイゼーションプローブとして使用
できる。他方において、ストリンジェントなハイブリダ
イゼーション条件下で、ＨＰＶ ３５ ＤＮＡまたはＲ
ＮＡまたはその断片、ＨＰＶ ４３ ＤＮＡまたはＲＮ
Ａまたはその断片、ＨＰＶ ４４ ＤＮＡまたはＲＮＡ
またはその断片、またはＨＰＶ Ｃ５７ ＤＮＡまたは
ＲＮＡまたはその断片は、とくに、それぞれ、ＨＰＶ３
５ ＤＮＡまたはＲＮＡ、ＨＰＶ ４３ ＤＮＡまたは
ＲＮＡ、ＨＰＶ ４４ ＤＮＡまたはＲＮＡ、またはＨ
ＰＶ Ｃ５７ ＤＮＡまたはＲＮＡのためのハイブリダ
イゼーションプローブとして使用できる。
【００４８】前述のように、ＨＰＶの異なるタイプのＤ
ＮＡおよびＲＮＡは、ストリンジェントでないハイブリ
ダイゼーション条件下に、すなわち、一般のグループと
してＨＰＶ ＤＮＡまたはＲＮＡのそれに等しい塩基組
成を有する、完全に塩基対の二本鎖のＤＮＡの融点より
ほぼ３５℃以上低い温度において、交差ハイブリダイゼ
ーションすることができる。
【００４９】さらに、ＤＮＡまたはＲＮＡの未知の試料
は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件
下、すなわち、一般のグループとしてＨＰＶ ＤＮＡま
たはＲＮＡのそれに等しい塩基組成を有する、完全に塩
基対の二本鎖のＤＮＡの融点よりほぼ１０℃低い温度に
おいて、交差ハイブリダイゼーションを実施することに
よって、特定のＨＰＶのタイプの存在について試験し、
そしてそのタイプを同定することが可能である。
【００５０】本発明の方法において、ストリンジェント
でないハイブリダイゼーション条件下のハイブリダイゼ
ーションは、まず、ストリンジェントでないハイブリダ
イゼーション条件下でハイブリダイゼーションし、次い
でストリンジェントでないハイブリダイゼーション条件
下で洗浄することによって実施する。
【００５１】さらに、本発明の方法において、ストリン
ジェントなハイブリダイゼーション条件下のハイブリダ
イゼーションは、まず、ストリンジェントでないハイブ
リダイゼーション条件下でハイブリダイゼーションし、
次いでストリンジェントなハイブリダイゼーション条件
下で洗浄するか、あるいはストリンジェントなハイブリ
ダイゼーション条件下でハイブリダイゼーションし、次
いでストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下
で洗浄することによって実施する。最初の方法、すなわ
ち、ストリンジェントでないハイブリダイゼーション条
件下でハイブリダイゼーションし、次いでストリンジェ
ントなハイブリダイゼーション条件下で洗浄する方法に
おいて、異なるタイプのＤＮＡまたはＲＮＡの間で形成
する雑種は不安定であるが、同一タイプのＤＮＡまたは
ＲＮＡの間で形成する雑種は安定である。
【００５２】ＤＮＡまたはＲＮＡの未知の試料が使用す
るハイブリダイゼーションプローブと同一もしくは異な
るＨＰＶのタイプをもつかどうかを決定するために、ハ
イブリダイゼーションは、好ましくは、ストリンジェン
トでないハイブリダイゼーション条件下に実施し、次い
でストリンジェントでないハイブリダイゼーション条件
下で洗浄する。雑種の存在をアッセイした後、検出され
た雑種をストリンジェントなハイブリダイゼーション条
件下に洗浄する。この方法において、ストリンジェント
でないハイブリダイゼーション条件下のハイブリダイゼ
ーション後に残留する雑種の量を決定し、そしてストリ
ンジェントなハイブリダイゼーション条件下の洗浄後に
存在する雑種の量と比較する。ストリンジェントなハイ
ブリダイゼーション条件下の洗浄が形成する雑種の量を
ほとんど減少しないか、あるいは最少に減少する場合、
これは本来形成した雑種、すなわち、ストリンジェント
でないハイブリダイゼーション条件下に形成した雑種
が、同一タイプのＤＮＡまたはＲＮＡであったことを示
す。逆に、ストリンジェントなハイブリダイゼーション
条件下の洗浄後に残留する雑種が壊滅しているか、ある
いは雑種の量が非常に減少している場合、本来形成した
雑種、すなわち、ストリンジェントでないハイブリダイ
ゼーション条件下に形成した雑種は異なるタイプのＤＮ
ＡまたはＲＮＡの間のものであったことが示される。
【００５３】ＨＰＶ ＤＮＡまたはＲＮＡがＤＮＡまた
はＲＮＡの未知の試料にストリンジェントなハイブリダ
イゼーション条件下に結合する能力は、高度のヌクレオ
チド配列の相同性を指示する。他方において、ＨＰＶ
ＤＮＡまたはＲＮＡがＤＮＡまたはＲＮＡの未知の試料
にストリンジェントでないハイブリダイゼーション条件
下においてのみ結合する能力は、低いか、あるいは中間
の程度のヌクレオチド配列の相同性を指示する。ヌクレ
オチド配列の相同性の精確な程度は、未知のＤＮＡを直
接に配列決定し、そしてそＲをＨＰＶ ＤＮＡの未知の
配列と比較することによってのみ決定することができ
る。
【００５４】一般にＤＮＡまたはＲＮＡの未知の試料、
とくに性器の病変から誘導したＤＮＡまたはＲＮＡの未
知の試料中のＨＰＶ ＤＮＡまたはＲＮＡの検出を実施
する場合において、実際的事柄として、ハイブリダイゼ
ーションプローブの混合物からなるハイブリダイゼーシ
ョンプローブ組成物を利用することは有利である。これ
らのハイブリダイゼーションプローブは、ＤＮＡまたは
ＲＮＡの未知の試料中に存在することが疑われるタイプ
のすべてまたはほとんどを代表する配列をもつプローブ
からなる。ＨＰＶのタイプ６、１１、１６、１８、３
１、３３、３５、４３、４４およびＣ５７を代表するＤ
ＮＡまたはＲＮＡの配列のハイブリダイゼーションプロ
ーブ混合物は、これらのＨＰＶのタイプが性器の病変に
おいてもっとも発見されやすいと思われるので、ＤＮＡ
またはＲＮＡの未知の試料を性器の病変から誘導すると
き、とくに有利である。他の既知のＨＰＶのタイプは、
性器の病変においてめったにあるいはけっして見出され
ない。例えば、ＨＰＶのタイプ１、２および４は、一般
に、他のタイプの病変、すなわち、皮膚のいぼ［ヘイル
マン（Ｈeilman）、Ｃ．Ａ．ら、ウイルス学誌（Ｊ．Ｖ
irol．）、３６０：３９５（１９８０）］において見出
され、こうしてＨＰＶのタイプ１、２および４を含有す
るＤＮＡまたはＲＮＡ配列のハイブリダイゼーションプ
ローブ混合物は、ＤＮＡまたはＲＮＡの未知の試料が皮
膚のいぼから誘導されるとき有用でありうるが、ＤＮＡ
またはＲＮＡの未知の試料が性器の病変から誘導される
とき、有用ではない。
【００５５】ハイブリダイゼーションプローブの混合物
中に使用できるＨＰＶのタイプ６、１１、１６、１８、
３１および３３の配列の例は、ギッスマン（Ｇissma
n)、Ｌ.、キャンサー・サーベイズ（Ｃancer Ｓur
v．）、３：１６１（１９８４）、プフィスター（Ｐfis
ter）、Ｈ．バイオケルミカル・ファーマコロジー（Ｂi
ochem． Ｐharmacol．）、９９：１１１（１９８
３）、ダースト（Ｄurst）、Ｍ．ら、プロシーディング
ス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシ
ズ(Ｐroc. Ｎatl． Ａcad． Ｓci．）ＵＳＡ、８
０：３８１２（１９８３）、ボシャート（Ｂoshart）、
Ｍ．ら、ＥＭＢＯ Ｊ．、３：１１５１（１９８４）、
ロリンクズ（Ｌorincz）、Ａ．Ｔ．ら、ウイルス学誌
（Ｊ． Ｖirol．）、５８：２２５（１９８６）および
ベウデノン（Ｂeaudenon）、Ｓ．、ネイチャー（Ｎatur
e）、３２１、２４６（１９８６）中に記載されてい
る。さらに、ハイブリダイゼーションプローブ混合物中
に使用できるＨＰＶのタイプ１、２および４の配列の例
は、この分野においてよく知られている[参照、ヘイルマ
ン(Ｈeilman）、Ｃ．Ａ．ら、ウイルス学誌（Ｊ． Ｖi
rol．）、３６０：３９５（１９８０）］。こうして、
ＨＰＶ ３５、ＨＰＶ ４３、ＨＰＶ ４４およびＨＰ
Ｖ Ｃ５７に関する本明細書における開示および、ＨＰ
Ｖのタイプ６、１１、１６、１８、３１および３３関し
かつ他のＨＰＶのタイプ、例えば、ＨＰＶのタイプ、２
および４に関する当業者の知識を用いると、ハイブリダ
イゼーションプローブの混合物は容易に調製することが
できる。
【００５６】ハイブリダイゼーションプローブの混合物
において、各ＨＰＶのタイプのＤＮＡまたはＲＮＡの特
定の百分率は本発明において臨界的ではない。一般に、
各ＨＰＶのタイプのほぼ等モル量のＤＮＡまたはＲＮＡ
を混合物中に使用する。
【００５７】ＨＰＶの検出しかつタイプを決定する手段
として核酸のハイブリダイゼーションは、前述のように
溶液中で［参照、ロギンス（Ｌoggins）、Ｊ．Ｒ．ら、
癌の研究（Ｃancer Ｒesearch)、３９：５４５（１９７
９）］あるいは固体の支持体上で［参照、マニアチス
（Ｍaniatis）、Ｔ．ら、モレキュラー・クローニング
（Ｍolecular Ｃloning）：実験室のマニュアル（a l
aboratory manual）、コールド・スプリング・ハーバ
ー・ラボラトリー（Ｃold Ｓpring ＨarborＬaborato
ries）、ニューヨーク州、コールド・スプリング・ハー
バー（１９８２）］あるいはその場で［参照、ブリガチ
（Ｂrigati）、Ｄ．Ｊ．ら、ウイルス学（Ｖirol．）、
１２６：３２（１９８３）およびベックマン（Ｂeckma
n）、Ａ．Ｍ．ら、ジャーナル・オブ・メディカル・バ
イロロジー（Ｊ． Ｍed． Ｖirol．）、１６：２６５
（１９８５）］実施できる。
【００５８】固体の支持体上のハイブリダイゼーション
は、ある数の異なる手順を使用して実施できる。１つの
このような手順は、未知のＤＮＡまたはＲＮＡのすべて
を精製し、それらを固体の支持体に一本鎖の形態で固定
化し、次いでＨＰＶ ３５ＤＮＡまたはＲＮＡまたはそ
の断片、ＨＰＶ ４３ ＤＮＡまたはＲＮＡまたはその
断片、ＨＰＶ ４４ ＤＮＡまたはＲＮＡまたはその断
片、またはＨＰＶＣ５７ ＤＮＡまたはＲＮＡまたはそ
の断片とハイブリダイゼーションすることを包含する。
【００５９】あるいは、精製した未知のＤＮＡを１また
は２以上の制限エンドヌクレアーゼで消化し、そして試
料中の生ずるＤＮＡ断片を電気泳動的に分離することが
できる。次いで、ＤＮＡ断片を固体の支持体に移し、そ
して標識したＨＰＶ ３５ＤＮＡまたはＲＮＡまたはそ
の断片、て標識したＨＰＶ ４３ ＤＮＡまたはＲＮＡ
またはその断片、て標識したＨＰＶ ４４ ＤＮＡまた
はＲＮＡまたはその断片、またはて標識したＨＰＶ Ｃ
５７ ＤＮＡまたはＲＮＡまたはその断片とハイブリダ
イゼーションすることとができる。
【００６０】その場のハイブリダイゼーションはガラス
のスライド上で実施し、そしてこの手順の最終の結果は
顕微鏡で見る。この手順において、ＤＮＡまたはＲＮＡ
は細胞から精製せず、他の細胞成分のすべてと一緒に放
置する。
【００６１】ＨＰＶ ３５ ＲＮＡまたはその断片、Ｈ
ＰＶ ４３ ＲＮＡまたはその断片、ＨＰＶ ４４ Ｒ
ＮＡまたはその断片、またはＨＰＶ Ｃ５７ ＲＮＡま
たはその断片は、とくに、精製したＤＮＡ、とくにな性
器の病変から精製したＤＮＡよりはむしろ、粗製の抽出
物、とくに粗製の性器の病変の抽出物を使用するとき、
それぞれ、ＨＰＶ ３５ ＤＮＡ、ＨＰＶ ４３ ＤＮ
Ａ、ＨＰＶ ４４ ＨＰＶ Ｃ５７ ＤＮＡのための核
酸のハイブリダイゼーションプローブとして使用するこ
とが好ましい。
【００６２】それぞれ、ＨＰＶ ３５ ＲＮＡ、ＨＰＶ
４３ ＲＮＡ、ＨＰＶ ４４ ＲＮＡまたはＨＰＶ
Ｃ５７ ＲＮＡを、ＤＮＡの未知の試料中のＨＰＶ ３
５ＤＮＡ、ＨＰＶ ４３ ＤＮＡ、ＨＰＶ ４４ ＤＮ
ＡまたはＨＰＶ Ｃ５７ＤＮＡを検出するためのハイブ
リダイゼーションプローブとして使用するとき、ストリ
ンジェントなハイブリダイゼーション条件下の最初のハ
イブリダイゼーション後に形成したＤＮＡ−ＲＮＡ雑種
は、室温において膵臓ＲＮアーゼ［５０ミリモルのＮa
Ｃｌ中の約２０mg／mｌ（pＨ７．０）］で処理し、次い
でストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で
洗浄することが好ましい。
【００６３】ＨＰＶ ３５ ＤＮＡまたはその断片、Ｈ
ＰＶ ４３ ＤＮＡまたはその断片、ＨＰＶ ４４ Ｄ
ＮＡまたはその断片またはＨＰＶ Ｃ５７ ＤＮＡまた
はその断片、あるいはＨＰＶ ３５ ＲＮＡまたはその
断片、ＨＰＶ ４３ ＲＮＡまたはその断片、ＨＰＶ
４４ ＲＮＡまたはその断片またはＨＰＶ Ｃ５７ＲＮ
Ａまたはその断片は、とくに放射性マーカー、例えば、
32Ｐ、14Ｃ、3Ｈ、125Ｉまたは35Ｓで標識するとき、そ
れぞれ、ＨＰＶ ３５ ＤＮＡまたはＲＮＡ、ＨＰＶ
４３ ＤＮＡまたはＲＮＡ、ＨＰＶ ４４ ＤＮＡまた
はＲＮＡ、またはＨＰＶ Ｃ５７ ＤＮＡまたはＲＮＡ
のための核酸のハイブリダイゼーションプローブとして
有用である。
【００６４】ＨＰＶ ３５ ＤＮＡまたはその断片、Ｈ
ＰＶ ４３ ＤＮＡまたはその断片、ＨＰＶ ４４ Ｄ
ＮＡまたはその断片またはＨＰＶ Ｃ５７ ＤＮＡまた
はその断片は、例えば、リグビイ（Ｒigby）、Ｐ．Ｊ．
Ｗ．ら、ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジ
ー(Ｊ．Ｍol．Ｂiol．）、１１３：２３７（１９７７）
に記載されてるように、よく知られた方法による「ニッ
ク翻訳（nick-translation）」によって、あるいは、例
えば、ディーン（Ｄeen）、Ｋ．Ｃ．ら、アナリティカ
ル・バイオケミストリー（Ａnal． Ｂiochem．）、１
３５：４５６（１９８３）に記載されているように、Ｔ
４ ＤＮＡポリメラーゼ置換合成によって、放射性標識
することができる。
【００６５】ＨＰＶ ３５ ＲＮＡまたはその断片、Ｈ
ＰＶ ４３ ＲＮＡまたはその断片、ＨＰＶ ４４ Ｒ
ＮＡまたはその断片またはＨＰＶ Ｃ５７ ＲＮＡまた
はその断片は、例えば、ダバンルー（Ｄavanloo）、
Ｐ．ら、プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカ
デミー・オブ・サイエンシズ（Ｐroc． Ｎatl． Ａca
d． Ｓci．）ＵＳＡ、８１：２０３５（１９８４）に
記載されているように、生体外の転写によって放射性マ
ーカーで標識することができる。ＲＮＡポリメラーゼは
標識された前駆体を利用できるので、標識されたＲＮＡ
をこの方法によって合成して、一般にＨＰＶ ＤＮＡま
たはＲＮＡ、あるいはとくにＨＰＶ ３５ＤＮＡまたは
ＲＮＡ、ＨＰＶ ４３ ＤＮＡまたはＲＮＡ、ＨＰＶ
４４ ＤＮＡまたはＲＮＡ、またはＨＰＶ Ｃ５７ Ｄ
ＮＡまたはＲＮＡの検出のために、それぞれ、ＨＰＶ
３５ ＲＮＡ プローブ、ＨＰＶ ４３ ＲＮＡ プロ
ーブ、ＨＰＶ ４４ ＲＮＡ プローブまたはＨＰＶ
Ｃ５７ ＲＮＡ プローブを調製することが可能であ
る。標識ＲＮＡを合成するために使用できる標識前駆体
は、放射性マーカー、例えば、32Ｐ、14Ｃ、125Ｉまた
は35Ｓを含有する前駆体を包含する。
【００６６】ＨＰＶ ３５ ＤＮＡまたはその断片、Ｈ
ＰＶ ４３ ＤＮＡまたはその断片、ＨＰＶ ４４ Ｄ
ＮＡまたはその断片またはＨＰＶ Ｃ５７ ＤＮＡまた
はその断片、あるいはＨＰＶ ３５ ＲＮＡまたはその
断片、ＨＰＶ ４３ ＲＮＡまたはその断片、ＨＰＶ
４４ ＲＮＡまたはその断片またはＨＰＶ Ｃ５７ＲＮ
Ａまたはその断片は、また、とくに非放射性マーカー、
例えば、ビオチン、酵素または蛍光性基を使用して標識
するとき、それぞれ、ＨＰＶ ３５ ＤＮＡまたはＲＮ
Ａ、ＨＰＶ ４３ ＤＮＡまたはＲＮＡ、ＨＰＶ ４４
ＤＮＡまたはＲＮＡ、またはＨＰＶ Ｃ５７ ＤＮＡ
またはＲＮＡのための核酸ハイブリダイゼーションプロ
ーブとして有用である。ビオチンは、ハプテン様基とし
て作用し、そしてＤＮＡまたはＲＮＡに結合することが
でき、そしてアビジン接合酵素またはストレプトアビジ
ン接合酵素をビオチンに結合し、次いで洗浄して非特異
的に結合した酵素を除去することによって検出すること
ができる。酵素のための適当な基質を添加すると、基質
の着色した生成物への転化を検出することができる［参
照、レアリー（Ｌeary）、Ｊ．Ｊ．ら、プロシーディン
グス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエン
シズ（Ｐroc．Ｎatl． Ａcad． Ｓci．）ＵＳＡ、８
０：４０４５（１９８３）］。このような酵素の例は、
アルカリ性ホスファターゼおよびセイヨウワサビペルオ
キシダーゼを包含する。さらに、蛍光性分子、例えば、
フルオレセインおよびローダミンをアビジンまたはスト
レプトアビジンに化学的に接合して、そして非放射性マ
ーカーとして使用できる。
【００６７】あるいは、前述の酵素または蛍光性分子
は、例えば、レンズ（Ｒenz）、Ｍ．ら、ＥＭＢＯ
Ｊ.、６：８１７（１９８３）に記載されているよう
に、ＨＰＶ３５ ＤＮＡまたはその断片、ＨＰＶ ４３
ＤＮＡまたはその断片、ＨＰＶ４４ ＤＮＡまたはそ
の断片またはＨＰＶ Ｃ５７ ＤＮＡまたはその断片、
あるいはＨＰＶ ３５ ＲＮＡまたはその断片、ＨＰＶ
４３ ＲＮＡまたはその断片、ＨＰＶ ４４ ＲＮＡ
またはその断片またはＨＰＶ Ｃ５７ ＲＮＡまたはそ
の断片に直接化学的に接合し、そしてこの方法でハイブ
リダイゼーションプローブとして使用できる。
【００６８】このように標識したＨＰＶ ３５ ＤＮＡ
またはその断片、ＨＰＶ ４３ ＤＮＡまたはその断
片、ＨＰＶ ４４ ＤＮＡまたはその断片またはＨＰＶ
Ｃ５７ ＤＮＡまたはその断片、あるいはＨＰＶ ３
５ ＲＮＡまたはその断片、ＨＰＶ ４３ ＲＮＡまた
はその断片、ＨＰＶ ４４ ＲＮＡまたはその断片また
はＨＰＶ Ｃ５７ ＲＮＡまたはその断片は、前述のよ
うに、ＤＮＡまたはＲＮＡの未知の試料、とくに性器の
病変から誘導したＤＮＡまたはＲＮＡの未知の試料を使
用するハイブリダイゼーションの研究において使用し
て、試料が、一般にＨＰＶ ＤＮＡまたはＲＮＡ、とく
に、それぞれ、ＨＰＶ ３５ ＤＮＡ、ＨＰＶ ４３
ＤＮＡ、ＨＰＶ ４４ ＤＮＡまたはＨＰＶ Ｃ５７
ＤＮＡを含有するかどうかを決定することができる。
【００６９】ＤＮＡの未知の試料は、性器の病変から誘
導されることに加えて、他の病変、例えば、のど、口ま
たは皮膚の病変から誘導することができる。
【００７０】ＤＮＡまたはＲＮＡの未知の試料は、例え
ば、上皮の病変を生検すること、頚をこすること、ある
いは頚をスワッビング（swabbing）して剥脱した細胞を
得ることによって得ることができる。さらに、ＤＮＡま
たはＲＮＡの未知の試料は、マニアチス（Ｍaniati
s）、Ｔ．ら、モレキュラー・クローニング（Ｍolecula
rＣloning）：実験室のマニュアル（a laboratory ma
nual）、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリ
ー（Ｃold Ｓpring Ｈarbor Ｌaboratories）、ニュ
ーヨーク州、コールド・スプリング・ハーバー（１９８
２）およびギッスマン（Ｇissman）、Ｌ.、キャンサー
・サーベイズ(Ｃancer Ｓurv.)、３：１６１−１８１
（１９８４）に記載されているような、よく知られた手
段によって、その中で病変からのＤＮＡをクローニング
した細胞からＤＮＡまたはＲＮＡの未知の試料を得るこ
とができる。
【００７１】本発明の方法において、交差ハイブリダイ
ゼーションのためのアッセイは、前記核酸雑種と関連し
た放射性または非放射性マーカーの存在についてアッセ
イすることによって実施できる。特定のマーカーが存在
するかどうかを決定するための方法は、使用するマーカ
ーに依存し、そしてこの分野においてよく知られてい
る。
【００７２】ＨＰＶ ３５ ＤＮＡまたはＲＮＡ、ＨＰ
Ｖ ４３ ＤＮＡまたはＲＮＡ、ＨＰＶ ４４ ＤＮＡ
またはＲＮＡ、またはＨＰＶ Ｃ５７ ＤＮＡまたはＲ
ＮＡの検出が、性器の病変から誘導したＤＮＡまたはＲ
ＮＡの未知の試料の交差ハイブリダイゼーションの疫学
的分布と、それぞれ、ＨＰＶ ３５ ＤＮＡ、ＨＰＶ４
３ ＤＮＡ、ＨＰＶ ４４ ＤＮＡまたはＨＰＶ Ｃ５
７ ＤＮＡのそれとの比較に基づく、本発明の実施態様
において、ＤＮＡまたはＲＮＡの未知の試料は、適度に
ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下に、
すなわち、２つのＨＰＶが共通のタイプの異なる分離物
を表わすかどうか、あるいは異なるタイプの分離物を表
わすかどうかを決定するためにヒドロキシアパタイトの
クロマトグラフィーを使用して、それぞれ、ＨＰＶ ３
５ ＤＮＡ、ＨＰＶ ４３ ＤＮＡ、ＨＰＶ ４４ Ｄ
ＮＡまたはＨＰＶ Ｃ５７ ＤＮＡとの５０％より少な
い交差ハイブリダイゼーションを示すことがあり、しか
も、ここにおける定義によって、それぞれ、なおＨＰＶ
３５ ＤＮＡまたはＲＮＡ、ＨＰＶ ４３ ＤＮＡま
たはＲＮＡ、ＨＰＶ ４４ ＤＮＡまたはＲＮＡ、また
はＨＰＶ Ｃ５７ＤＮＡまたはＲＮＡと考えることがで
きる。結局、また、試料中において、それぞれ、ＨＰＶ
３５ ＤＮＡまたはＲＮＡ、ＨＰＶ ４３ ＤＮＡま
たはＲＮＡ、ＨＰＶ ４４ ＤＮＡまたはＲＮＡ、また
はＨＰＶ Ｃ５７ ＤＮＡまたはＲＮＡを検出するため
に、疫学的分布を構成する各病変の交差ハイブリダイゼ
ーションを比較することが必要である。これは、異なる
ＨＰＶのタイプが同一のあるいは同様な疫学的分布を示
すことがあるからである。しかしながら、疫学的分布を
構成うる同一の病変が、それぞれ、ＨＰＶ ３５ ＤＮ
Ａ、ＨＰＶ ４３ＤＮＡ、ＨＰＶ ４４ ＤＮＡまたは
ＨＰＶ Ｃ５７ ＤＮＡ、および性器の病変から誘導し
たＤＮＡまたはＲＮＡの未知の試料の両者と交差ハイブ
リダイゼーションすることを立証することによって、性
器の病変から誘導した未知のＤＮＡまたはＲＮＡの試料
が、それぞれ、ＨＰＶ ３５ ＤＮＡまたはＲＮＡ、Ｈ
ＰＶ４３ ＤＮＡまたはＲＮＡ、ＨＰＶ ４４ ＤＮＡ
またはＲＮＡ、またはＨＰＶ Ｃ５７ ＤＮＡまたはＲ
ＮＡであると明確に結論することが可能である。
【００７３】下にいっそう詳しく説明するように、ＨＰ
Ｖ ３５ ＤＮＡまたはＲＮＡは、穏和な異形成から侵
入性の癌までの頚の病変のほぼ１％〜４％で存在するこ
とが発見された。こうして、ＨＰＶ ３５ ＤＮＡまた
はＲＮＡは種々の等級の頚の病変中にむしろ均一に分布
している。
【００７４】ＨＰＶ ４３ ＤＮＡまたはＲＮＡは、両
性の頚の病変（例えば、穏和な異形成）のほぼ１％〜４
％で存在することが発見されたが、侵入性の癌において
見出されなかった。こうして、ＨＰＶ ４３ ＤＮＡま
たはＲＮＡは低い等級の頚の病変中にのみ存在するよう
に思われる。
【００７５】ＨＰＶ ４４ ＤＮＡまたはＲＮＡは、両
性の頚の病変のほぼ１％〜４％で存在することが発見さ
れたが、侵入性の癌において見出されなかった。こうし
て、ＨＰＶ ４４ ＤＮＡまたはＲＮＡは低い等級の頚
の病変中にのみ存在するように思われる。
【００７６】ＨＰＶ Ｃ５７ ＤＮＡまたはＲＮＡは、
両性の頚の病変のほぼ１％〜４％で存在することが発見
され、そして侵入性の癌の４％で見出された。こうし
て、ＨＰＶ Ｃ５７ ＤＮＡまたはＲＮＡは低い等級の
頚の病変および癌中に存在するように思われる。他方に
おいて、他のＨＰＶのタイプ、例えば、ＨＰＶのタイプ
６、１１、１６、１８および３１は、種々の等級の頚の
病変において異なる分布を示す。
【００７７】こうして、ＨＰＶ ３５ ＤＮＡまたはＲ
ＮＡ、ＨＰＶ ４３ ＤＮＡまたはＲＮＡ、ＨＰＶ ４
４ ＤＮＡまたはＲＮＡ、またはＨＰＶ Ｃ５７ ＤＮ
ＡまたはＲＮＡの検出が、性器の病変から誘導したＤＮ
ＡまたはＲＮＡの未知の試料の交差ハイブリダイゼーシ
ョンの疫学的分布と、それぞれ、ＨＰＶ ３５ ＤＮ
Ａ、ＨＰＶ ４３ ＤＮＡ、ＨＰＶ ４４ ＤＮＡまた
はＨＰＶ Ｃ５７ ＤＮＡのそれとの比較に基づく、本
発明の実施態様において、性器の病変から誘導したＤＮ
ＡまたはＲＮＡの未知の試料は頚の病変と交差ハイブリ
ダイゼーションするであろう。交差ハイブリダイゼーシ
ョンのこのような疫学的分布が、性器の病変から誘導し
たＤＮＡまたはＲＮＡの未知の試料で発見された場合、
このＤＮＡまたはＲＮＡの未知の試料は、それぞれ、Ｈ
ＰＶ ３５ ＤＮＡまたはＲＮＡ、ＨＰＶ ４３ ＤＮ
ＡまたはＲＮＡ、ＨＰＶ ４４ ＤＮＡまたはＲＮＡ、
またはＨＰＶ Ｃ５７ ＤＮＡまたはＲＮＡであること
がある。疫学的分布を構成する同一の病変が、また、性
器の病変から誘導したＤＮＡまたはＲＮＡの未知の試料
と交差ハイブリダイゼーションすることを立証すること
によって、性器の病変から誘導したＤＮＡまたはＲＮＡ
の未知の試料は、それぞれ、ＨＰＶ ３５ ＤＮＡまた
はＲＮＡ、ＨＰＶ ４３ ＤＮＡまたはＲＮＡ、ＨＰＶ
４４ ＤＮＡまたはＲＮＡ、またはＨＰＶ Ｃ５７
ＤＮＡまたはＲＮＡであると結論することができる。
【００７８】本発明においてハイブリダイゼーションプ
ローブとして使用できるＨＰＶ ３５ ＤＮＡまたはＨ
ＰＶ ３５ ＲＮＡの断片、ＨＰＶ ４３ ＤＮＡまた
はＨＰＶ ４３ ＲＮＡの断片、ＨＰＶ ４４ ＤＮＡ
またはＨＰＶ ４４ ＲＮＡの断片、またはＨＰＶ Ｃ
５７ ＤＮＡまたはＨＰＶ Ｃ５７ ＲＮＡの断片の特
定の大きさは、臨界的ではない。ＨＰＶ ３５ ＤＮＡ
またはＨＰＶ ３５ＲＮＡの断片、ＨＰＶ ４３ ＤＮ
ＡまたはＨＰＶ ４３ ＲＮＡの断片、ＨＰＶ ４４
ＤＮＡまたはＨＰＶ ４４ ＲＮＡの断片、またはＨＰ
Ｖ Ｃ５７ＤＮＡまたはＨＰＶ Ｃ５７ ＲＮＡの断片
の大きさは、一本鎖または二本鎖のプローブを使用する
かどうかに依存して、約１５〜約８０００塩基または塩
基対、好ましくは約３００〜約８００塩基または塩基対
であることができる。ハイブリダイゼーションをその場
で実施するとき、ＨＰＶ ３５ ＤＮＡまたはＨＰＶ３
５ ＲＮＡの断片、ＨＰＶ ４３ ＤＮＡまたはＨＰＶ
４３ ＲＮＡの断片、ＨＰＶ ４４ ＤＮＡまたはＨ
ＰＶ ４４ ＲＮＡの断片、またはＨＰＶＣ５７ ＤＮ
ＡまたはＨＰＶ Ｃ５７ ＲＮＡの断片の大きさは、約
５００塩基または塩基対より小さいことが好ましい。な
ぜなら、この大きさの断片は、約１０００塩基または塩
基対より大きいＨＰＶ ＤＮＡまたはＨＰＶ ＲＮＡよ
り効率的にその場でハイブリダイゼーションするからで
ある。二本鎖のＤＮＡまたはＲＮＡを使用するとき、Ｄ
ＮＡまたはＲＮＡはハイブリダイゼーションの実施前に
変性しなくてはならない。
【００７９】ＨＰＶ ３５ ＤＮＡの断片、ＨＰＶ ４
３ ＤＮＡの断片、ＨＰＶ ４４ＤＮＡの断片またはＨ
ＰＶ Ｃ５７ ＤＮＡの断片は、それぞれ、ＨＰＶ ３
５のクローン２Ａおよび２Ｂ、ＨＰＶ ４３のクローン
２Ａおよび２Ｂ、ＨＰＶ４４のクローン２、またはＨＰ
Ｖ Ｃ５７のクローン２Ａまたは２Ｂの制限エンドヌク
レアーゼの消化によって、あるいは商業的に入手可能な
合成装置を使用してこのようなんものを合成的につくこ
とによって、あるいはよく知られた手段［サンガー（Ｓ
anger）、Ｓ．ら、プロシーディングス・オブ・ナショ
ナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ（Ｐroc． Ｎa
tl． Ａcad． Ｓci．）ＵＳＡ、７４：５３６３（１
９７７）］によって決定できるＨＰＶ ３５ ＤＮＡの
配列、ＨＰＶ ４３ ＤＮＡの配列、ＨＰＶ ４４ Ｄ
ＮＡの配列またはＨＰＶ Ｃ５７ ＤＮＡの配列を使用
して、よく知られた化学的方法によって、得ることがで
きる。
【００８０】ＨＰＶ ３５ ＤＮＡまたはＲＮＡ、ＨＰ
Ｖ ４３ ＤＮＡまたはＲＮＡ、ＨＰＶ ４４ ＤＮＡ
またはＲＮＡ、またはＨＰＶ Ｃ５７ ＤＮＡまたはＲ
ＮＡを検出するとき、それぞれ、ＨＰＶ ３５ ゲノ
ム、ＨＰＶ ４３ ゲノム、ＨＰＶ ４４ ゲノムまた
はＨＰＶ Ｃ５７ ゲノムの実質的にすてをハイブリダ
イゼーションプローブとして使用することが好ましい。
【００８１】次の実施例により本発明をさらに説明す
る。これらの実施例は本発明の範囲を限定することを意
図しない。特記しないかぎり、すべての部、百分率、比
などは重量による。
【００８２】
【実施例】
実施例１ （Ａ）ＨＰＶ ３５ ＤＮＡのクローニング 使用した出発物質は、数ミリグラムの組織から成る、ワ
シントン、Ｄ．Ｃ．から得た頚の腺癌の生検物であっ
た。合計のＤＮＡは、マニアチス（Ｍaniatis）、Ｔ．
ら、モレキュラー・クローニング（Ｍolecular Ｃloni
ng）：実験室のマニュアル（a laboratory manua
l）、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー
（Ｃold Ｓpring Ｈarbor Ｌaboratories）、ニュー
ヨーク州、コールド・スプリング・ハーバー（１９８
２）に記載されているようにして精製した。より詳しく
は、組織を細かく分割し、次いで１．０mlの５０ミリモ
ルのトリス−ＨＣl、pＨ８．０［０．６％（w／v）のド
デシル硫酸ナトリウムおよび５０μg／mlのプロイテナ
ーゼＫを含有する］中で３７℃において１夜消化した。
生ずる消化物を１．０mlのフェノール：クロロホルム
（１：１（v／v））で２回抽出した。次いで、２容量の
９０％（v／v）のエタノールの添加によって、ＤＮＡを
水性相から沈殿させた。沈殿したＤＮＡを１０ミリモル
のトリス、１．０ミリモルのＥＤＴＡ緩衝液、pＨ８．
０（以後「ＴＥ 緩衝液」）中に約１．０mg／mlの濃度
で再溶解した。
【００８３】ＤＮＡをＰstＩで完全に消化し、１％（v
／v）のアガロースゲル中で電気泳動させ、そしてＤＮ
Ａを、サザーン（Ｓouthern）、Ｅ．Ｍ．、ジャーナル
・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Ｊ． Ｍol．
Ｂiol．）、９８：５０３（１９７５）に記載されてい
るように、ニトロセルロースフィルターに移した。次い
で、フィルターをストリンジェントでないハイブリダイ
ゼーション条件（Ｔm−３５℃）およびストリンジェン
トなハイブリダイゼーション条件（Ｔm−１０℃）にお
いてＨＰＶタイプ６、１１、１６、１８および３１から
のＤＮＡでプロービングした。ハイブリダイゼーション
は、４３℃において、１．０モルのＮaＣl、５０ミリモ
ルのリン酸ナトリウム緩衝液（pＨ７．４）、１．０ミ
リモルのＥＤＴＡ、２％（w／v）のドデシル硫酸ナトリ
ウム、０．１％（w／v）のゼラチン、５０μg／mlのtＲ
ＮＡおよび３０％（w／v）のホルムアミド中で１夜実施
した。３０分の洗浄を５５℃において１．２×ＳＳＣ
（１×ＳＳＣは０．１５モルのＮaＣl＋０．０１５モル
のクエン酸ナトリウムである）、１０ミリモルのリン酸
ナトリウム（pＨ７．４）、１．０ミリモルのＥＤＴＡ
および０．５％（w／v）のドデシル硫酸ナトリウム中で
実施した。ハイブリダイゼーションは、ＨＰＶタイプ
６、１１、１６、１８および３１でストリンジェントで
ない条件下に達成されたが、ストリンジェントなハイブ
リダイゼーション条件下に達成されなかった。
【００８４】得られた精製したＤＮＡおよびλ Ｌ４７
をＢamＨＩ制限エンドヌクレアーゼで消化した。これは
３．７５kbおよび４．１kbの断片を生成し、その合計、
すなわち、７．８５kbは乳頭腫ウイルスのゲノムについ
て典型的な大きさであった。これらの断片の各々をλ
Ｌ４７の単一のＢamＨＩ部位中にクローニングした。よ
り詳しくは、２．０μgの得られた精製したＤＮＡおよ
び２．０μgのλ Ｌ４７ ＤＮＡを１０単位のＢamＨ
Ｉで、合計容量５０μlのＴＥ 緩衝液中で３７℃で１
時間切断した。次いで、生ずる反応混合物を４００μl
のＴＥ 緩衝液で希釈し、そして前述のように等体積の
フェノール：クロロホルムでフェノール抽出した。次い
で、水性相をクロロホルム：イソアミルアルコール（２
４：１（v／v））で抽出し、そして水性相からのＤＮＡ
を８０％（v／v）のエタノールで沈殿させ、そして乾燥
した。次いで、乾燥したＤＮＡを１０μlの６６ミリモ
ルのトリス−ＨＣl、６．６ミリモルのＭgＣl2、１０ミ
リモルのＤＴＴおよび１．０ミリモルのＡＴＰからなる
１×リガーゼ緩衝液中に懸濁させ、そして４２℃で２時
間インキュベーションしてλアームをアニールした。次
に、０．５μlのＴ４ ＤＮＡリガーゼ、すなわち、約
１単位、および０．５μlの１０ミリモルのＡＴＰ、pＨ
７．０、を反応溶液に添加し、そして結合を１２℃で１
夜進行させた。
【００８５】次に、結合生成物をパッケージングして感
染性ファージを形成し、そしてＥ．coli ＮＭ５３８を
感染させるために使用した。より詳しくは、１０g／lの
トリプトンおよび５．０g／lのＮaＣlからなるアガロー
ス平板（以後、「ＴＮ 培地」）上で増殖するＥ． co
li ＮＭ５３８の単一のコロニーを選択し、そして振盪
プラットホーム（２５０rpm）上の２０mlのＴＮ 培地
中で３７℃において１夜、早期の定常期に増殖させた。
次いで、細胞培養物をＴＮ 培地で４倍に希釈し、そし
て３時間増殖させた。次に、ソーバル（Ｓorvall）ＨＢ
−４ローター中で５分間５，０００rpmにおいて遠心す
ることによって、細胞を収穫し、そして得られる細胞沈
殿物を１０ミリモルのＭgＳＯ4中のもとの容量の０．２
５中に再懸濁し、そして４℃で貯蔵した。
【００８６】パッケージングした感染性ファージを、商
業的に入手可能なＢＲＬラムダ（Ｌambda）生体外パッ
ケージングシステムで調製した［参照、マニアチス（Ｍ
aniatis）、Ｔ．ら、モレキュラー・クローニング（Ｍo
lecular Ｃloning）：実験室のマニュアル（a labora
tory manual）、コールド・スプリング・ハーバー・ラ
ボラトリー（Ｃold Ｓpring Ｈarbor Ｌaboratorie
s）、ニューヨーク州、コールド・スプリング・ハーバ
ー（１９８２）］。
【００８７】０．５モルのトリス−ＨＣl（pＨ８．
０）、０．１モルのＮaＣl、０．０１モルのＭgＳＯ4お
よび０．０１％（w／v）のゼラチンからなるファージ貯
蔵緩衝液（Ｄifco）中で１．５×１０4のプラーク／９c
m直径平板に適当に希釈した、パッケージングしたファ
ージの適当な希釈物の１００μlを、１０−１５mlの試
験管中で、前述のように調製したＥ． coli ＮＭ５３
８の１００μlに添加し、おだやかに混合しそして室温
において１５分間インキュベーションした。次いで、細
胞−ファージ溶液を、１リットルにつき１０gのトリプ
チカーゼ大豆ブロス、５．０gのＮaＣlおよび１５gの寒
天を含むトリプチカーゼ大豆ブロス寒天平板（これは少
なくとも１日前に調製されかつ３７℃に前もって加温さ
れている）上にプレイティングした。その後、１０ミリ
モルのＭgＳＯ4中に溶解した０．５％のアガロース（超
純粋、電気泳動等級）からなるアガロースのオーバーレ
イ（overlay）（溶液が沸騰するまでマイクロ波の炉内
で加熱し、次いで使用前４５℃に冷却してある）の３〜
５mlを、プレイティングした細胞−ファージの上に配置
した。アガロースが固化した後、平板を循環が良好な３
７℃の通風インキュベーターに移し、ここで平板の蓋に
割れ目を３０分間形成し、そして蓋を閉じ、そして平板
を倒立させた。８〜１２時間後、プラークが現われるよ
うになった。
【００８８】感染は平板上でバクテリアの全面溶菌を生
じた。ＨＰＶ ＤＮＡを有する組換えファージは、ベン
トン（Ｂenton）、Ｗ．Ｄ．ら、サイエンス（Ｓcienc
e）、１９６：１８０（１９７７）に記載されるよう
に、「プラークリフト（plaque lifts）」を実施するこ
とによって局在化した。さらに詳しくは、全面溶菌の平
板を４℃に１時間配置してアガロースを固化させた。次
いで、ニトロセルロースフィルターの適当な大きさの片
を、その中央においてたわませることによって、平板の
中央に接触させ、そして中央の点をへりに向けて動かせ
ることによって配置した。次いで、４つの非対称の孔を
ニトロセルロースフィルターおよび寒天を通して小さい
ゲージの針で開け、そして孔の位置を永久的マーカーで
平板の底にしるしをした。これにより、陽性のシグナル
を含有するニトロセルロースフィルターおよび他の領域
を、平板上の対応する位置に関係づけることができた。
１０分後、ニトロセルロースフィルターを除去し、そし
てプラークが上方を向くようにして、ニトロセルロース
フィルターを、２００mlの０．５モルのＮaＯＨ、２．
０モルのＮaＣlを含有する皿中に１分間配置することに
よって、ＤＮＡを変性した。次いで、ニトロセルロース
フィルターを５００mlの０．５モルのトリス−ＨＣl、
２．０モルのＮaＣl、pＨ７．５、中に５分間浸漬する
ことによって中和した。次に、フィルターを０．９モル
のＮaＣl、０．０９モルのクエン酸ナトリウムからなる
６×ＳＳＣ中で１分間すすぎ、ワットマン３ＭＭ紙で乾
燥し、次いで８０℃において真空下に３０分間ベーキン
グした。
【００８９】その後、プローブとして「ニック翻訳」に
より32Ｐで標識したＨＰＶ １６ＤＮＡを使用するスト
リンジェントでないハイブリダイゼーションを、リフト
したプラークから分離したＤＮＡについて実施し［参
照、リグビイ（Ｒigby）、Ｐ．Ｊ．Ｗ．ら、ジャーナル
・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Ｊ． Ｍol．Ｂ
iol．）、１１３：２３７（１９７７）およびマニアチ
ス（Ｍaniatis）、Ｔ．ら、モレキュラー・クローニン
グ（Ｍolecular Ｃloning）：実験室のマニュアル（a
laboratory manual）、コールド・スプリング・ハー
バー・ラボラトリー（Ｃold Ｓpring Ｈarbor Ｌabo
ratories）、ニューヨーク州、コールド・スプリング・
ハーバー（１９８２）］、次いで洗浄およびオートラジ
オグラフィーを実施した。さらに詳しくは、ハイブリダ
イゼーションは、１．０モルのＮaＣl、２８％（v／v）
のホルムアミド、５０ミリモルのＮ−トリス（ヒドロキ
シメチル）−メチル−２−アミノエタンスルホン酸(以
後「ＴＥＳ」)、１０×デンハルト溶液、０．１ミリモル
のＥＤＴＡおよび１０ミリモルのリン酸ナトリウム（p
Ｈ７．４）からなる溶液中で４１℃において実施した。
次いで、ストリンジェントでないハイブリダイゼーショ
ンは、１０ミリモルのリン酸ナトリウム（pＨ７．
４）、０．１ミリモルのＥＤＴＡ中の１．１×ＳＳＣ
（０．１６５モルのＮaＣlおよび０．０１６５モルのク
エン酸ナトリウムからなる）を使用して５２℃において
実施した。
【００９０】放射性露出の部位と対応づけることによっ
て、ＨＰＶ １６ ＤＮＡにハイブリダイゼーションし
たＤＮＡを含有する、ファージを含有する平板の領域を
切除し、そして前述のようにＥ． coli ＮＭ５３８を
再感染させるために使用した。ＨＰＶ ＤＮＡを含有す
るファージのプラークの局在化は、上の手順を反復する
ことによって達成した。スクリーニングした２×１０5
のプラークのうちから７つのプラークが同定され、そし
て３つのタイプのクローンが見出された。２つのクロー
ンは３．７５kbのインサートを示し、２つのクローンは
４．１kbのインサートを示し、そして２つのクローンは
４．３kbのインサートを示した。すべての同様な大きさ
のクローンは同一の制限地図を有した。３．７５kbおよ
び４．１kbのクローンは交差ハイブリダイゼーションし
なかった。しかしながら、４．３kbのクローンは３．７
５kbのクローンと相同性であり、そしてまたヒトゲノム
のＤＮＡと相同性であることがわかった。これから示唆
されるように、これらのクローンはヒトＤＮＡおよびＨ
ＰＶ ３５ ＤＮＡの組込まれたコピーの間の接合断片
を含有し、こうしてそれ以上分析しなかった。３．７５
kbの断片を含有するクローンはＨＰＶ ３５ クローン
１Ａと表示し、そして４．１kbの断片を含有するクロー
ンはＨＰＶ ３５ クローン１Ｂと表示した。
【００９１】次いで、ＨＰＶ ３５ クローン１Ａおよ
び１ＢのＨＰＶ ＤＮＡをＢamＨＩで消化し、そしてp
ＢＲ３２２の単一のＢamＨＩ部位中でサブクローニング
した。得られる組換えＤＮＡをＨＰＶ ３５ クローン
２Ａおよび２Ｂと表示した。ＨＰＶ ３５ クローン２
Ａおよび２Ｂは、アメリカン・タイプ・カルチャー・コ
レクション（Ａmerican Ｔype Ｃulture Ｃollectio
n）に、それぞれ、ＡＴＣＣ Ｎo．４０３３０およびＡ
ＴＣＣ Ｎo．４０３３１で受託された。
【００９２】（Ｂ）ＨＰＶ ３５ ＤＮＡの特性づけ １、ハイブリダイゼーションの研究 ハイブリダイゼーションの研究を、ＨＰＶ ３５ クロ
ーン２Ａおよび２ＢＤＮＡついて実施して、ＨＰＶ ３
５ クローン２Ａおよび２Ｂが新しいＨＰＶのタイプで
あることを立証した。
【００９３】より詳しくは、ＨＰＶ ３５ クローン２
Ａおよび２Ｂから調製した32Ｐ「ニック翻訳した」ＤＮ
Ａを、ストリンジェントな条件下にサザンブロッティン
グによって、ＨＰＶのタイプ１〜３４からのＤＮＡの
５．０ngに対してハイブリダイゼーションした。ＨＰＶ
のタイプ１〜３４からのＤＮＡは、インスティチュート
・パスツール（Ｉnstitut Ｐasteur）（フランス国パ
リ）のゲラルド・オース（Ｇerard Ｏrth）博士、ＨＰ
Ｖのタイプの表示の譲渡人、およびパピロマ・レファラ
ンス・センター（Ｐappilloma Ｒeference Ｃenter）
（西ドイツ国ヘイデルベルグ）のエセル−ミシェレ・デ
・ビリアース（Ｅthel−Ｍichelle deＶilliers）博士
から、ニトロセルロースフィルター上に予備固定化され
た形態で入手した。より詳しくは、ハイブリダイゼーシ
ョンは、４１℃において、１．０モルのＮaＣl、２８％
（v／v）のホルムアミド、５０ミリモルのＮ−トリスＴ
ＥＳ、１０×デンハルト溶液、０．５ミリモルのＥＤＴ
Ａおよび２０ミリモルのリン酸ナトリウム（pＨ７．
４）からなる溶液中で実施した。次いで、ストリンジェ
ントな洗浄を、６５℃において、１０ミリモルのリン酸
ナトリウム（pＨ７．４）、０．１ミリモルのＥＤＴＡ
中の０．０３×ＳＳＣ（０．００４５モルのＮaＣlおよ
び０．０００４５モルのクエン酸ナトリウムからなる）
を使用して実施した。
【００９４】有意の相同性はＨＰＶ ３５ クローン２
Ａおよび２Ｂの組換えＤＮＡとＨＰＶタイプ６、１１、
１６、１８および３１との間でストリンジェントでない
ハイブリダイゼーション条件下に検出されたが、ストリ
ンジェントなハイブリダイゼーション条件下でＨＰＶの
タイプ１〜３４のいずれを使用しても相同性は観測され
ず、こうしてＨＰＶ ３５ クローン２Ａおよび２Ｂは
新しいＨＰＶのタイプを表わすことが立証された。
【００９５】２、制限エンドヌクレアーゼ地図 ＨＰＶ ３５についての制限エンドヌクレアーゼ地図を
第１図に示す。次の制限エンドヌクレアーゼはＨＰＶ
３５ ＤＮＡを切断しなかった：ＳphＩ、ＸabＩ、Ｎco
ＩおよびＨpaＩ。
【００９６】３、ゲノムの構成 ＨＰＶ ３５のゲノムがＨＰＶ ６への同一または同様
なオープンリーディングフレームを有することを立証す
るために、次のハイブリダイゼーションの研究を実施し
た。ＨＰＶ ３５ クローン２Ａおよび２Ｂから精製し
たＤＮＡを、前述のように、ストリンジェントでない条
件下およびストリンジェントな条件下にプローブとして
ＨＰＶ ６ ＤＮＡの32Ｐ「ニック翻訳した」断片を使
用してサザンブロッティングにかけた。より詳しくは、
ＢamＨＩ直線化ＨＰＶ ６bクローンの断片を、ＥcoＲ
ＩおよびＰstＩで発生させ、次いでゲル精製し、32Ｐで
ニック翻訳し、そして次のものを含有するサザンブロッ
トをプロービングするために使用した：（a）ＨＰＶ
３５ クローン２Ａ ＤＮＡの精製したＢamＨＩ断片の
ＰstＩ制限消化物または（b）ＨＰＶ ３５ クローン
２Ｂ ＤＮＡの精製したＢamＨＩ断片のＰvuＩＩ−Ｐst
Ｉ制限消化物。第２図に示す結果が立証するように、Ｈ
ＰＶ ３５ クローン２Ａおよび２ＢのＤＮＡはＨＰＶ
６と同一のゲノムの構成を有する。
【００９７】４、疫学的分布 ＨＰＶ ３５ クローン２Ａおよび２Ｂから調製したハ
イブリダイゼーションプローブはストリンジェントな条
件下にＨＰＶ ３５ ＤＮＡのみに対して効率よくハイ
ブリダイゼーションすること、およびこれらのハイブリ
ダイゼーションプローブはＨＰＶ ３５を含有する性器
の病変を検出するためにかつ他のＨＰＶのタイプ、例え
ば、６、１１、１６、１８、３１または３３のＤＮＡを
含有する性器の病変とこのような性器の病変を区別する
ために使用できることを立証するために、ワシントン、
Ｄ．Ｃ．の首都圏（マリイランド州およびバージニア州
を含む）およびミシガン州および周辺の州からの、剥脱
した細胞を含有する頚の生検物および頚のスワブの収集
物のＤＮＡを、ストリンジェントな条件下およびストリ
ンジェントでない条件下の核酸のハイブリダイゼーショ
ンによって、ＨＰＶ３５に対して特異的なプローブを包
含する、種々のＨＰＶのタイプに対して特異的なプロー
ブを使用して、特定のＨＰＶ ＤＮＡの存在について分
析した。生検物を二分し、この試料の半分は普通の光学
顕微鏡のための処理し、そして他方の半分は凍結し、そ
して分子の分析のために−２０℃で貯蔵した。サザンブ
ロットのハイブリダイゼーションを実施する組織は、低
温保持装置上で区画して、ＤＮＡの抽出のための材料を
得た。ほぼすべての１／１８の区画をヘマトキシリンお
よびエオシン着色で着色し、そして顕微鏡的に検査し
て、この組織の試料が光学顕微鏡によって分析される試
料の一部に匹敵することを確証した。剥脱した頚の細胞
は、標準の細胞学的方法、例えば、乳頭の塗布（pap s
mear）によって、対をなす試料について分析し、それら
の他方をＤＮＡの分析のために使用した。
【００９８】高分子量のＤＮＡを、前述のように試料か
ら調製した。精製した細胞のＤＮＡの１〜１０μgをＰs
tＩまたはＢamＨＩで消化し、そして消化した試料を
１．０％（w／v）のアガロースゲル中で電気泳動させ、
そしてニトロセルロースフィルターに移した。その後、
ハイブリダイゼーションを、前述のようにストリンジェ
ントな条件下に、前述のタイプからのニック翻訳した32
Ｐ標識ＨＰＶ ＤＮＡを使用して実施した。（ＨＰＶ
３５ ＤＮＡについて、ＨＰＶ ３５ クローン２Ａお
よび２ＢからのＨＰＶ ＤＮＡの混合物を使用した。）
註：ＨＰＶ ＤＮＡはpＢＲ３２２または関連するベク
ター中で増殖するので、組織試料中のpＢＲ３２２およ
び関係するベクター様配列との反応の可能性を最小とす
るために、すべてのプローブは電気泳動的に精製して、
関係するベクター配列のほとんどを除去した。追加のハ
イブリダイゼーションを、また、標識したpＢＲ３２２
および関係するベクターの存在下に実施して、組織試料
中のプラスミド様配列による、潜在的な誤った陽性の物
質を明らかにした。結果を下表１に示す。表１における
結果は第３図にグラフで示されている。
【００９９】
【表１】
【０１００】表１および第３図が立証するように、ＨＰ
Ｖ ３５を含有する頚の生検物は、溶液中の交差ハイブ
リダイゼーションの程度に基準および引続くヒドロキシ
アパタイトのクロマトグラフィーによってばかりでな
く、かつまた、性器の病変の明確な集団、すなわち、他
のＨＰＶのタイプを含有するものに比較して、ＨＰＶ３
５ ＤＮＡを含有するもの、を特異的に検出しかつ同定
するＨＰＶ ３５ ＤＮＡ プローブの能力によって、
他のＨＰＶのタイプ、例えば、６、１１、１６、１８、
３１および３３、を含有する生検物と区別することがで
きる。さらに、表１および第３図中の結果が示すよう
に、頚に生検物の間のＨＰＶ ３５ ＤＮＡの疫学的分
布はいくつかの他のＨＰＶのタイプについて見出される
ものと区別される。
【０１０１】実施例２ （Ａ）ＨＰＶ ４３ ＤＮＡのクローニング 使用した出発物質は、数ミリグラムの組織から成る、ミ
シガン州から得た陰門角質増殖症の生検物であった。合
計のＤＮＡは、マニアチス（Ｍaniatis）、Ｔ．ら、モ
レキュラー・クローニング（Ｍolecular Ｃloning）：
実験室のマニュアル（a laboratory manual）、コー
ルド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー（Ｃold
Ｓpring Ｈarbor Ｌaboratories）、ニューヨーク
州、コールド・スプリング・ハーバー（１９８２）に記
載されているようにして精製した。より詳しくは、組織
を細かく分割し、次いで１．０mlの５０ミリモルのトリ
ス−ＨＣl、pＨ８．０［０．６％（w／v）のドデシル硫
酸ナトリウムおよび５０μg／mlのプロイテナーゼＫを
含有する］中で３７℃において１夜消化した。生ずる消
化物を１．０mlのフェノール：クロロホルム（１：１
（v／v））で２回抽出した。次いで、２容量の９０％
（v／v）のエタノールの添加によって、ＤＮＡを水性相
から沈殿させた。沈殿したＤＮＡを１０ミリモルのトリ
ス、１．０ミリモルのＥＤＴＡ緩衝液、pＨ８．０（以
後「ＴＥ 緩衝液」）中に約１．０mg／mlの濃度で再溶
解した。
【０１０２】ＤＮＡをＰstＩで完全に消化し、１％（v
／v）のアガロースゲル中で電気泳動させ、そしてＤＮ
Ａを、サザーン（Ｓouthern）、Ｅ．Ｍ．、ジャーナル
・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Ｊ． Ｍol．
Ｂiol．）、９８：５０３（１９７５）に記載されてい
るように、ニトロセルロースフィルターに移した。次い
で、フィルターをストリンジェントでないハイブリダイ
ゼーション条件（Ｔm−３５℃）およびストリンジェン
トなハイブリダイゼーション条件（Ｔm−１０℃）にお
いてＨＰＶタイプ６、１１、１６、１８および３１から
のＤＮＡでプロービングした。ハイブリダイゼーション
は、４３℃において、１．０モルのＮaＣl、５０ミリモ
ルのリン酸ナトリウム緩衝液（pＨ７．４）、１．０ミ
リモルのＥＤＴＡ、２％（w／v）のドデシル硫酸ナトリ
ウム、０．１％（w／v）のゼラチン、５０μg／mlのtＲ
ＮＡおよび３０％（w／v）のホルムアミド中で１夜実施
した。３０分の洗浄を５５℃において１．２×ＳＳＣ
（１×ＳＳＣは０．１５モルのＮaＣl＋０．０１５モル
のクエン酸ナトリウムである）、１０ミリモルのリン酸
ナトリウム（pＨ７．４）、１．０ミリモルのＥＤＴＡ
および０．５％（w／v）のドデシル硫酸ナトリウム中で
実施した。ハイブリダイゼーションは、ＨＰＶタイプ
６、１１、１６、１８および３１でストリンジェントで
ない条件下に達成されたが、ストリンジェントなハイブ
リダイゼーション条件下に達成されなかった。
【０１０３】得られた精製したＤＮＡおよびλ Ｌ４７
をＢamＨＩ制限エンドヌクレアーゼ（これは６．３kbの
断片を生成した）またはＨindＩＩＩ（これは２．８５k
bの断片を生成した）で消化した。その合計、すなわ
ち、９．１５kbは乳頭腫ウイルスのゲノムより大きい。
マッピングにより、６．３kbおよび２．８５kbの断片は
それらの長さの１．５５kbについて重複することを示し
た。６．３kbおよび２．８５kbの断片によって表わされ
る重複しないＨＰＶ配列の量は、７．６kbすなわちＨＰ
Ｖ ゲノムの典型的な大きさのほぼ９６％である。より
詳しくは、２．０μgの得られた精製したＤＮＡおよび
２．０μgのλ Ｌ４７ ＤＮＡを１０単位のＢamＨＩ
で、合計容量５０μlのＴＥ 緩衝液中で３７℃で１時
間切断した。次いで、生ずる反応混合物を４００μlの
ＴＥ 緩衝液で希釈し、そして前述のように等体積のフ
ェノール：クロロホルムでフェノール抽出した。次い
で、水性相をクロロホルム：イソアミルアルコール（２
４：１（v／v））で抽出し、そして水性相からのＤＮＡ
を８０％（v／v）のエタノールで沈殿させ、そして乾燥
した。次いで、乾燥したＤＮＡを１０μlの６６ミリモ
ルのトリス−ＨＣl、６．６ミリモルのＭgＣl2、１０ミ
リモルのＤＴＴおよび１．０ミリモルのＡＴＰからなる
１×リガーゼ緩衝液中に懸濁させ、そして４２℃で２時
間インキュベーションしてλアームをアニールした。次
に、０．５μlのＴ４ ＤＮＡリガーゼ、すなわち、約
１単位、および０．５μlの１０ミリモルのＡＴＰ、pＨ
７．０、を各反応溶液に添加し、そして結合を１２℃で
１夜進行させた。
【０１０４】次に、結合生成物をパッケージングして感
染性ファージを形成し、そしてＥ．coli ＮＭ５３８を
感染させるために使用した。より詳しくは、１０g／lの
トリプトンおよび５．０g／lのＮaＣlからなるアガロー
ス平板（以後、「ＴＮ 培地」）上で増殖するＥ． co
li ＮＭ５３８の単一のコロニーを選択し、そして振盪
プラットホーム（２５０rpm）上の２０mlのＴＮ 培地
中で３７℃において１夜、早期の定常期に増殖させた。
次いで、細胞培養物をＴＮ 培地で４倍に希釈し、そし
て３時間増殖させた。次に、ソーバル（Ｓorvall）ＨＢ
−４ローター中で５分間５，０００rpmにおいて遠心す
ることによって、細胞を収穫し、そして得られる細胞沈
殿物を１０ミリモルのＭgＳＯ4中のもとの容量の０．２
５中に再懸濁し、そして４℃で貯蔵した。
【０１０５】パッケージングした感染性ファージを、商
業的に入手可能なＢＲＬラムダ（Ｌambda）生体外パッ
ケージングシステムで調製した［参照、マニアチス（Ｍ
aniatis）、Ｔ．ら、モレキュラー・クローニング（Ｍo
lecular Ｃloning）：実験室のマニュアル（a labora
tory manual）、コールド・スプリング・ハーバー・ラ
ボラトリー（Ｃold Ｓpring Ｈarbor Ｌaboratorie
s）、ニューヨーク州、コールド・スプリング・ハーバ
ー（１９８２）］。
【０１０６】０．５モルのトリス−ＨＣl（pＨ８．
０）、０．１モルのＮaＣl、０．０１モルのＭgＳＯ4お
よび０．０１％（w／v）のゼラチンからなるファージ貯
蔵緩衝液（Ｄifco）中で１．５×１０4のプラーク／９c
m直径平板に適当に希釈した、パッケージングしたファ
ージの適当な希釈物の１００μlを、１０−１５mlの試
験管中で、前述のように調製したＥ． coli ＮＭ５３
８の１００μlに添加し、おだやかに混合しそして室温
において１５分間インキュベーションした。次いで、細
胞−ファージ溶液を、１リットルにつき１０gのトリプ
チカーゼ大豆ブロス、５．０gのＮaＣlおよび１５gの寒
天を含むトリプチカーゼ大豆ブロス寒天平板（これは少
なくとも１日前に調製されかつ３７℃に前もって加温さ
れている）上にプレイティングした。その後、１０ミリ
モルのＭgＳＯ4中に溶解した０．５％のアガロース（超
純粋、電気泳動等級）からなるアガロースのオーバーレ
イ（overlay）（溶液が沸騰するまでマイクロ波の炉内
で加熱し、次いで使用前４５℃に冷却してある）の３〜
５mlを、プレイティングした細胞−ファージの上に配置
した。アガロースが固化した後、平板を循環が良好な３
７℃の通風インキュベーターに移し、ここで平板の蓋に
割れ目を３０分間形成し、そして蓋を閉じ、そして平板
を倒立させた。８〜１２時間後、プラークが現われるよ
うになった。
【０１０７】感染は平板上でバクテリアの全面溶菌を生
じた。ＨＰＶ ＤＮＡを有する組換えファージは、ベン
トン（Ｂenton）、Ｗ．Ｄ．ら、サイエンス（Ｓcienc
e）、１９６：１８０（１９７７）に記載されるよう
に、「プラークリフト（plaquelifts）」を実施するこ
とによって局在化した。さらに詳しくは、全面溶菌の平
板を４℃に１時間配置してアガロースを固化させた。次
いで、ニトロセルロースフィルターの適当な大きさの片
を、その中央においてたわませることによって、平板の
中央に接触させ、そして中央の点をへりに向けて動かせ
ることによって配置した。次いで、４つの非対称の孔を
ニトロセルロースフィルターおよび寒天を通して小さい
ゲージの針で開け、そして孔の位置を永久的マーカーで
平板の底にしるしをした。これにより、陽性のシグナル
を含有するニトロセルロースフィルターおよび他の領域
を、平板上の対応する位置に関係づけることができた。
１０分後、ニトロセルロースフィルターを除去し、そし
てプラークが上方を向くようにして、ニトロセルロース
フィルターを、２００mlの０．５モルのＮaＯＨ、２．
０モルのＮaＣlを含有する皿中に１分間配置することに
よって、ＤＮＡを変性した。次いで、ニトロセルロース
フィルターを５００mlの０．５モルのトリス−ＨＣl、
２．０モルのＮaＣl、pＨ７．５、中に５分間浸漬する
ことによって中和した。次に、フィルターを０．９モル
のＮaＣl、０．０９モルのクエン酸ナトリウムからなる
６×ＳＳＣ中で１分間すすぎ、ワットマン３ＭＭ紙で乾
燥し、次いで８０℃において真空下に３０分間ベーキン
グした。
【０１０８】その後、プローブとして「ニック翻訳」に
より32Ｐで標識したＨＰＶ １６ＤＮＡを使用するスト
リンジェントでないハイブリダイゼーションを、リフト
したプラークから分離したＤＮＡについて実施し［参
照、リグビイ（Ｒigby）、Ｐ．Ｊ．Ｗ．ら、ジャーナル
・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Ｊ． Ｍol．Ｂ
iol．）、１１３：２３７（１９７７）およびマニアチ
ス（Ｍaniatis）、Ｔ．ら、モレキュラー・クローニン
グ（Ｍolecular Ｃloning）：実験室のマニュアル（a
laboratory manual）、コールド・スプリング・ハー
バー・ラボラトリー（Ｃold Ｓpring Ｈarbor Ｌabo
ratories）、ニューヨーク州、コールド・スプリング・
ハーバー（１９８２）］、次いで洗浄およびオートラジ
オグラフィーを実施した。さらに詳しくは、ハイブリダ
イゼーションは、１．０モルのＮaＣl、２８％（v／v）
のホルムアミド、５０ミリモルのＮ−トリス（ヒドロキ
シメチル）−メチル−２−アミノエタンスルホン酸(以
後「ＴＥＳ」)、１０×デンハルト溶液、０．１ミリモル
のＥＤＴＡおよび１０ミリモルのリン酸ナトリウム（p
Ｈ７．４）からなる溶液中で４１℃において実施した。
次いで、ストリンジェントでないハイブリダイゼーショ
ンは、１０ミリモルのリン酸ナトリウム（pＨ７．
４）、０．１ミリモルのＥＤＴＡ中の１．１×ＳＳＣ
（０．１６５モルのＮaＣlおよび０．０１６５モルのク
エン酸ナトリウムからなる）を使用して５２℃において
実施した。
【０１０９】放射性露出の部位と対応づけることによっ
て、ＨＰＶ １６ ＤＮＡにハイブリダイゼーションし
たＤＮＡを含有する、ファージを含有する平板の領域を
切除し、そして前述のようにＥ． coli ＮＭ５３８を
再感染させるために使用した。ＨＰＶ ＤＮＡを含有す
るファージのプラークの局在化は、上の手順を反復する
ことによって達成した。ＢamＨＩ消化ＤＮＡを使用する
クローニングからスクリーニングした１．６５×１０5
のプラークのうちから１つのプラークが同定された。ク
ローニングした断片は６．３kbの大きさを示し、そして
ＨＰＶ ４３クローン１Ａと表示した。ＨindＩＩＩ消
化ＤＮＡを使用するクローニングからスクリーニングし
た９×１０4のプラークのうちから１つのプラークが同
定された。クローニングした断片は２．８５kbの大きさ
を示し、そしてＨＰＶ ４３クローン１Ｂと表示した。
【０１１０】次いで、ＨＰＶ ４３ クローン１Ａおよ
び１ＢのＨＰＶ ＤＮＡを、それぞれ、ＢamＨＩまたは
ＨindＩＩＩで消化し、そしてpＢＲ３２２の単一のＢam
ＨＩまたはＨindＩＩＩ部位中でサブクローニングし
た。得られる組換えＤＮＡをＨＰＶ ４３ クローン２
Ａおよび２Ｂと表示した。ＨＰＶ ４３ クローン２Ａ
および２Ｂは、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレ
クション（ＡmericanＴype Ｃulture Ｃollection）
に、それぞれ、ＡＴＣＣ Ｎo．４０３３８およびＡＴ
ＣＣ Ｎo．４０３３９で受託された。
【０１１１】（Ｂ）ＨＰＶ ４３ ＤＮＡの特性づけ １、ハイブリダイゼーションの研究 ハイブリダイゼーションの研究を、ＨＰＶ ４３ クロ
ーン２Ａおよび２ＢＤＮＡついて実施して、ＨＰＶ ４
３ クローン２Ａおよび２Ｂが新しいＨＰＶのタイプで
あることを立証した。
【０１１２】より詳しくは、ＨＰＶ ４３ クローン２
Ａおよび２Ｂから調製した32Ｐ「ニック翻訳した」ＤＮ
Ａを、ストリンジェントな条件下にサザンブロッティン
グによって、ＨＰＶのタイプ１〜４２からのＤＮＡの
５．０ngに対してハイブリダイゼーションした。ＨＰＶ
のタイプ１〜４２からのＤＮＡは、インスティチュート
・パスツール（Ｉnstitut Ｐasteur）（フランス国パ
リ）のゲラルド・オース（Ｇerard Ｏrth）博士、ＨＰ
Ｖのタイプの表示の譲渡人、パピロマ・レファランス・
センター（Ｐappilloma Ｒeference Ｃenter）（西ド
イツ国ヘイデルベルグ）のエセル−ミシェレ・デ・ビリ
アース（Ｅthel−Ｍichelle de Ｖilliers）博士か
ら、およびライフ・テクノロジーズ・インコーポレーテ
ッド（ＬifeＴechnologies，Ｉnc．）から、ニトロセル
ロースフィルター上に予備固定化された形態で入手し
た。より詳しくは、ハイブリダイゼーションは、４１℃
において、１．０モルのＮaＣl、２８％（v／v）のホル
ムアミド、５０ミリモルのＮ−トリス ＴＥＳ、１０×
デンハルト溶液、０．５ミリモルのＥＤＴＡおよび２０
ミリモルのリン酸ナトリウム（pＨ７．４）からなる溶
液中で実施した。次いで、ストリンジェントな洗浄を、
６５℃において、１０ミリモルのリン酸ナトリウム（p
Ｈ７．４）、０．１ミリモルのＥＤＴＡ中の０．０３×
ＳＳＣ（０．００４５モルのＮaＣlおよび０．０００４
５モルのクエン酸ナトリウムからなる）を使用して実施
した。
【０１１３】有意の相同性はＨＰＶ ４３ クローン２
Ａおよび２Ｂの組換えＤＮＡと他のＨＰＶのタイプとの
間でストリンジェントでないハイブリダイゼーション条
件下に検出されたが、ストリンジェントなハイブリダイ
ゼーション条件下でＨＰＶのタイプ１〜４２のいずれを
使用しても相同性は観測されず、こうしてＨＰＶ ４３
クローン２Ａおよび２Ｂは新しいＨＰＶのタイプを表
わすことが立証された。
【０１１４】２、制限エンドヌクレアーゼ地図 ＨＰＶ ４３ クローン２Ａおよび２Ｂについての制限
エンドヌクレアーゼ地図を第４図に示す。次の制限エン
ドヌクレアーゼはＨＰＶ ４３ ＤＮＡを切断しなかっ
た：ＥcoＲＩおよびＳphＩ。
【０１１５】３、ゲノムの構成 ＨＰＶ ４３のゲノムがＨＰＶ ６への同一または同様
なオープンリーディングフレームを有することを立証す
るために、次のハイブリダイゼーションの研究を実施し
た。ＨＰＶ ４３ クローン２Ａおよび２Ｂから精製し
たＤＮＡを、前述のように、ストリンジェントでない条
件下およびストリンジェントな条件下にプローブとして
ＨＰＶ ６ ＤＮＡの32Ｐ「ニック翻訳した」断片を使
用してサザンブロッティングにかけた。より詳しくは、
ＢamＨＩ直線化ＨＰＶ ６bクローンの断片を、ＥcoＲ
ＩおよびＰstＩで発生させ、次いでゲル精製し、32Ｐで
ニック翻訳し、そして次のものを含有するサザンブロッ
トをプロービングするために使用した：（a）ＨＰＶ
４３ クローン２Ａ ＤＮＡの精製したＢamＨＩ断片の
ＰstＩ制限消化物またはＨＰＶ ４３ クローン２Ｂ
ＤＮＡの精製したＨindＩＩＩ断片のＰstＩ制限消化
物。第５図に示す結果が立証するように、ＨＰＶ ４３
クローン２Ａおよび２ＢのＤＮＡはＨＰＶ ６と同一
のゲノムの構成を有する。
【０１１６】４、疫学的分布 ＨＰＶ ４３ クローン２Ａおよび２Ｂから調製したハ
イブリダイゼーションプローブはストリンジェントな条
件下にＨＰＶ ４３ ＤＮＡのみに対して効率よくハイ
ブリダイゼーションすること、およびこれらのハイブリ
ダイゼーションプローブはＨＰＶ ４３を含有する性器
の病変を検出するためにかつ他のＨＰＶのタイプ、例え
ば、６、１１、１６、１８、３１または３３のＤＮＡを
含有する性器の病変とこのような性器の病変を区別する
ために使用できることを立証するために、ワシントン、
Ｄ．Ｃ．の首都圏（マリイランド州およびバージニア州
を含む）およびミシガン州および周辺の州からの、剥脱
した細胞を含有する頚の生検物および頚のスワブの収集
物のＤＮＡを、ストリンジェントな条件下およびストリ
ンジェントでない条件下の核酸のハイブリダイゼーショ
ンによって、ＨＰＶ４３に対して特異的なプローブを包
含する、種々のＨＰＶのタイプに対して特異的なプロー
ブを使用して、特定のＨＰＶ ＤＮＡの存在について分
析した。生検物を二分し、この試料の半分は普通の光学
顕微鏡のための処理し、そして他方の半分は凍結し、そ
して分子の分析のために−２０℃で貯蔵した。サザンブ
ロットのハイブリダイゼーションを実施する組織は、低
温保持装置上で区画して、ＤＮＡの抽出のための材料を
得た。ほぼすべての１／１８の区画をヘマトキシリンお
よびエオシン着色で着色し、そして顕微鏡的に検査し
て、この組織の試料が光学顕微鏡によって分析される試
料の一部に匹敵することを確証した。剥脱した頚の細胞
は、標準の細胞学的方法、例えば、乳頭の塗布（pap s
mear）によって、対をなす試料について分析し、それら
の他方をＤＮＡの分析のために使用した。
【０１１７】高分子量のＤＮＡを、前述のように試料か
ら調製した。精製した細胞のＤＮＡの１〜１０μgをＰs
tＩまたはＢamＨＩで消化し、そして消化した試料を
１．０％（w／v）のアガロースゲル中で電気泳動させ、
そしてニトロセルロースフィルターに移した。その後、
ハイブリダイゼーションを、前述のようにストリンジェ
ントな条件下に、前述のタイプからのニック翻訳した32
Ｐ標識ＨＰＶ ＤＮＡを使用して実施した。（ＨＰＶ
４３ ＤＮＡについて、ＨＰＶ ４３ クローン２Ａお
よび２ＢからのＨＰＶ ＤＮＡの混合物を使用した。）
註：ＨＰＶ ＤＮＡは、pＴ７１３、pＢＲ３２２または
関連するベクター中で増殖するので、組織試料中のpＴ
７１３、pＢＲ３２２および関係するベクター様配列と
の反応の可能性を最小とするために、すべてのプローブ
は電気泳動的に精製して、関係するベクター配列のほと
んどを除去した。追加のハイブリダイゼーションを、ま
た、標識したpＢＲ３２２および関係するベクターの存
在下に実施して、組織試料中のプラスミド様配列によ
る、潜在的な誤った陽性の物質を明らかにした。結果を
下表２に示す。表２における結果は第６図にグラフで示
されている。
【０１１８】
【表２】
【０１１９】表２および第６図が立証するように、ＨＰ
Ｖ ４３を含有する頚の生検物は、溶液中の交差ハイブ
リダイゼーションの程度に基準および引続くヒドロキシ
アパタイトのクロマトグラフィーによってばかりでな
く、かつまた、性器の病変の明確な集団、すなわち、他
のＨＰＶのタイプを含有するものに比較して、ＨＰＶ４
３ ＤＮＡを含有するもの、を特異的に検出しかつ同定
するＨＰＶ ４３ ＤＮＡ プローブの能力によって、
他のＨＰＶのタイプ、例えば、６、１１、１６、１８、
３１および３３、を含有する生検物と区別することがで
きる。さらに、表２および第６図中の結果が示すよう
に、頚に生検物の間のＨＰＶ ４３ ＤＮＡの疫学的分
布はいくつかの他のＨＰＶのタイプについて見出される
ものと区別される。
【０１２０】実施例３ （Ａ）ＨＰＶ ４４ ＤＮＡのクローニング 使用した出発物質は、数ミリグラムの組織から成る、ミ
シガン州から得た陰門コンジロームの生検物であった。
合計のＤＮＡは、マニアチス（Ｍaniatis）、Ｔ．ら、
モレキュラー・クローニング（Ｍolecular Ｃlonin
g）：実験室のマニュアル（a laboratory manual）、
コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー（Ｃol
d Ｓpring Ｈarbor Ｌaboratories）、ニューヨーク
州、コールド・スプリング・ハーバー（１９８２）に記
載されているようにして精製した。より詳しくは、組織
を細かく分割し、次いで１．０mlの５０ミリモルのトリ
ス−ＨＣl、pＨ８．０［０．６％（w／v）のドデシル硫
酸ナトリウムおよび５０μg／mlのプロイテナーゼＫを
含有する］中で３７℃において１夜消化した。生ずる消
化物を１．０mlのフェノール：クロロホルム（１：１
（v／v））で２回抽出した。次いで、２容量の９０％
（v／v）のエタノールの添加によって、ＤＮＡを水性相
から沈殿させた。沈殿したＤＮＡを１０ミリモルのトリ
ス、１．０ミリモルのＥＤＴＡ緩衝液、pＨ８．０（以
後「ＴＥ 緩衝液」）中に約１．０mg／mlの濃度で再溶
解した。
【０１２１】ＤＮＡをＰstＩで完全に消化し、１％（v
／v）のアガロースゲル中で電気泳動させ、そしてＤＮ
Ａを、サザーン（Ｓouthern）、Ｅ．Ｍ．、ジャーナル
・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Ｊ． Ｍol．
Ｂiol．）、９８：５０３（１９７５）に記載されてい
るように、ニトロセルロースフィルターに移した。次い
で、フィルターをストリンジェントでないハイブリダイ
ゼーション条件（Ｔm−３５℃）およびストリンジェン
トなハイブリダイゼーション条件（Ｔm−１０℃）にお
いてＨＰＶタイプ６、１１、１６、１８および３１から
のＤＮＡでプロービングした。ハイブリダイゼーション
は、４３℃において、１．０モルのＮaＣl、５０ミリモ
ルのリン酸ナトリウム緩衝液（pＨ７．４）、１．０ミ
リモルのＥＤＴＡ、２％（w／v）のドデシル硫酸ナトリ
ウム、０．１％（w／v）のゼラチン、５０μg／mlのtＲ
ＮＡおよび３０％（w／v）のホルムアミド中で１夜実施
した。３０分の洗浄を５５℃において１．２×ＳＳＣ
（１×ＳＳＣは０．１５モルのＮaＣl＋０．０１５モル
のクエン酸ナトリウムである）、１０ミリモルのリン酸
ナトリウム（pＨ７．４）、１．０ミリモルのＥＤＴＡ
および０．５％（w／v）のドデシル硫酸ナトリウム中で
実施した。ハイブリダイゼーションは、ＨＰＶタイプ
６、１１、１６、１８および３１でストリンジェントで
ない条件下に達成されたが、ストリンジェントなハイブ
リダイゼーション条件下に達成されなかった。
【０１２２】得られた精製したＤＮＡおよびλ Ｌ４７
をＢamＨＩ制限エンドヌクレアーゼ（これは７．８kbの
断片を生成した）で消化した。これは乳頭腫ウイルスの
ゲノムについて典型的である。この断片をλ Ｌ４７の
単一のＢamＨＩ中にクローニングした。より詳しくは、
２．０μgの得られた精製したＤＮＡおよび２．０μgの
λ Ｌ４７ ＤＮＡを１０単位のＢamＨＩで、合計容量
５０μlのＴＥ 緩衝液中で３７℃で１時間切断した。
次いで、生ずる反応混合物を４００μlのＴＥ 緩衝液
で希釈し、そして前述のように等体積のフェノール：ク
ロロホルムでフェノール抽出した。次いで、水性相をク
ロロホルム：イソアミルアルコール（２４：１（v／
v））で抽出し、そして水性相からのＤＮＡを８０％（v
／v）のエタノールで沈殿させ、そして乾燥した。次い
で、乾燥したＤＮＡを１０μlの６６ミリモルのトリス
−ＨＣl、６．６ミリモルのＭgＣl2、１０ミリモルのＤ
ＴＴおよび１．０ミリモルのＡＴＰからなる１×リガー
ゼ緩衝液中に懸濁させ、そして４２℃で２時間インキュ
ベーションしてλアームをアニールした。次に、０．５
μlのＴ４ ＤＮＡリガーゼ、すなわち、約１単位、お
よび０．５μlの１０ミリモルのＡＴＰ、pＨ７．０、を
各反応溶液に添加し、そして結合を１２℃で１夜進行さ
せた。
【０１２３】次に、結合生成物をパッケージングして感
染性ファージを形成し、そしてＥ．coli ＮＭ５３８を
感染させるために使用した。より詳しくは、１０g／lの
トリプトンおよび５．０g／lのＮaＣlからなるアガロー
ス平板（以後、「ＴＮ 培地」）上で増殖するＥ． co
li ＮＭ５３８の単一のコロニーを選択し、そして振盪
プラットホーム（２５０rpm）上の２０mlのＴＮ 培地
中で３７℃において１夜、早期の定常期に増殖させた。
次いで、細胞培養物をＴＮ 培地で４倍に希釈し、そし
て３時間増殖させた。次に、ソーバル（Ｓorvall）ＨＢ
−４ローター中で５分間５，０００rpmにおいて遠心す
ることによって、細胞を収穫し、そして得られる細胞沈
殿物を１０ミリモルのＭgＳＯ4中のもとの容量の０．２
５中に再懸濁し、そして４℃で貯蔵した。
【０１２４】パッケージングした感染性ファージを、商
業的に入手可能なＢＲＬラムダ（Ｌambda）生体外パッ
ケージングシステムで調製した［参照、マニアチス（Ｍ
aniatis）、Ｔ．ら、モレキュラー・クローニング（Ｍo
lecular Ｃloning）：実験室のマニュアル（a labora
tory manual）、コールド・スプリング・ハーバー・ラ
ボラトリー（Ｃold Ｓpring Ｈarbor Ｌaboratorie
s）、ニューヨーク州、コールド・スプリング・ハーバ
ー（１９８２）］。
【０１２５】０．５モルのトリス−ＨＣl（pＨ８．
０）、０．１モルのＮaＣl、０．０１モルのＭgＳＯ4お
よび０．０１％（w／v）のゼラチンからなるファージ貯
蔵緩衝液（Ｄifco）中で１．５×１０4のプラーク／９c
m直径平板に適当に希釈した、パッケージングしたファ
ージの適当な希釈物の１００μlを、１０−１５mlの試
験管中で、前述のように調製したＥ． coli ＮＭ５３
８の１００μlに添加し、おだやかに混合しそして室温
において１５分間インキュベーションした。次いで、細
胞−ファージ溶液を、１リットルにつき１０gのトリプ
チカーゼ大豆ブロス、５．０gのＮaＣlおよび１５gの寒
天を含むトリプチカーゼ大豆ブロス寒天平板（これは少
なくとも１日前に調製されかつ３７℃に前もって加温さ
れている）上にプレイティングした。その後、１０ミリ
モルのＭgＳＯ4中に溶解した０．５％のアガロース（超
純粋、電気泳動等級）からなるアガロースのオーバーレ
イ（overlay）（溶液が沸騰するまでマイクロ波の炉内
で加熱し、次いで使用前４５℃に冷却してある）の３〜
５mlを、プレイティングした細胞−ファージの上に配置
した。アガロースが固化した後、平板を循環が良好な３
７℃の通風インキュベーターに移し、ここで平板の蓋に
割れ目を３０分間形成し、そして蓋を閉じ、そして平板
を倒立させた。８〜１２時間後、プラークが現われるよ
うになった。
【０１２６】感染は平板上でバクテリアの全面溶菌を生
じた。ＨＰＶ ＤＮＡを有する組換えファージは、ベン
トン（Ｂenton）、Ｗ．Ｄ．ら、サイエンス（Ｓcienc
e）、１９６：１８０（１９７７）に記載されるよう
に、「プラークリフト（plaque lifts)」を実施すること
によって局在化した。さらに詳しくは、全面溶菌の平板
を４℃に１時間配置してアガロースを固化させた。次い
で、ニトロセルロースフィルターの適当な大きさの片
を、その中央においてたわませることによって、平板の
中央に接触させ、そして中央の点をへりに向けて動かせ
ることによって配置した。次いで、４つの非対称の孔を
ニトロセルロースフィルターおよび寒天を通して小さい
ゲージの針で開け、そして孔の位置を永久的マーカーで
平板の底にしるしをした。これにより、陽性のシグナル
を含有するニトロセルロースフィルターおよび他の領域
を、平板上の対応する位置に関係づけることができた。
１０分後、ニトロセルロースフィルターを除去し、そし
てプラークが上方を向くようにして、ニトロセルロース
フィルターを、２００mlの０．５モルのＮaＯＨ、２．
０モルのＮaＣlを含有する皿中に１分間配置することに
よって、ＤＮＡを変性した。次いで、ニトロセルロース
フィルターを５００mlの０．５モルのトリス−ＨＣl、
２．０モルのＮaＣl、pＨ７．５、中に５分間浸漬する
ことによって中和した。次に、フィルターを０．９モル
のＮaＣl、０．０９モルのクエン酸ナトリウムからなる
６×ＳＳＣ中で１分間すすぎ、ワットマン３ＭＭ紙で乾
燥し、次いで８０℃において真空下に３０分間ベーキン
グした。
【０１２７】その後、プローブとして「ニック翻訳」に
より32Ｐで標識したＨＰＶ １６ＤＮＡを使用するスト
リンジェントでないハイブリダイゼーションを、リフト
したプラークから分離したＤＮＡについて実施し［参
照、リグビイ（Ｒigby）、Ｐ．Ｊ．Ｗ．ら、ジャーナル
・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Ｊ． Ｍol．Ｂ
iol．）、１１３：２３７（１９７７）およびマニアチ
ス（Ｍaniatis）、Ｔ．ら、モレキュラー・クローニン
グ（Ｍolecular Ｃloning）：実験室のマニュアル（a
laboratory manual）、コールド・スプリング・ハー
バー・ラボラトリー（Ｃold Ｓpring Ｈarbor Ｌabo
ratories）、ニューヨーク州、コールド・スプリング・
ハーバー（１９８２）］、次いで洗浄およびオートラジ
オグラフィーを実施した。さらに詳しくは、ハイブリダ
イゼーションは、１．０モルのＮaＣl、２８％（v／v）
のホルムアミド、５０ミリモルのＮ−トリス（ヒドロキ
シメチル）−メチル−２−アミノエタンスルホン酸(以
後「ＴＥＳ」)、１０×デンハルト溶液、０．１ミリモル
のＥＤＴＡおよび１０ミリモルのリン酸ナトリウム（p
Ｈ７．４）からなる溶液中で４１℃において実施した。
次いで、ストリンジェントでないハイブリダイゼーショ
ンは、１０ミリモルのリン酸ナトリウム（pＨ７．
４）、０．１ミリモルのＥＤＴＡ中の１．１×ＳＳＣ
（０．１６５モルのＮaＣlおよび０．０１６５モルのク
エン酸ナトリウムからなる）を使用して５２℃において
実施した。
【０１２８】放射性露出の部位と対応づけることによっ
て、ＨＰＶ １６ ＤＮＡにハイブリダイゼーションし
たＤＮＡを含有する、ファージを含有する平板の領域を
切除し、そして前述のようにＥ． coli ＮＭ５３８を
再感染させるために使用した。ＨＰＶ ＤＮＡを含有す
るファージのプラークの局在化は、上の手順を反復する
ことによって達成した。スクリーニングした２×１０5
のプラークのうちから６つのプラークが同定された。す
べてのクローンは同一の制限地図を有した。クローンの
１つをそれ以上の研究のために選択し、そしてＨＰＶ
４４ クローン１と表示した。
【０１２９】次いで、ＨＰＶ ４４ クローン１のＨＰ
Ｖ ＤＮＡをＢamＨＩで消化し、そしてpＴ７１３の単
一のＢamＨＩ部位中でサブクローニングした。得られる
組換えＤＮＡをＨＰＶ ４４ クローン２と表示した。
ＨＰＶ ４４ クローン２は、アメリカン・タイプ・カ
ルチャー・コレクション（Ａmerican Ｔype Ｃulture
Ｃollection）にＡＴＣＣ Ｎo．４０３５３で受託さ
れた。
【０１３０】（Ｂ）ＨＰＶ ４４ ＤＮＡの特性づけ １、ハイブリダイゼーションの研究 ハイブリダイゼーションの研究を、ＨＰＶ ４４ クロ
ーン２ ＤＮＡついて実施して、ＨＰＶ ４４ クロー
ン２が新しいＨＰＶのタイプであることを立証した。
【０１３１】より詳しくは、ＨＰＶ ４４ クローン２
から調製した32Ｐ「ニック翻訳した」ＤＮＡを、ストリ
ンジェントな条件下にサザンブロッティングによって、
ＨＰＶのタイプ１〜４３からのＤＮＡの５．０ngに対し
てハイブリダイゼーションした。ＨＰＶのタイプ１〜４
３からのＤＮＡは、インスティチュート・パスツール
（Ｉnstitut Ｐasteur）（フランス国パリ）のゲラル
ド・オース（Ｇerard Ｏrth）博士、ＨＰＶのタイプの
表示の譲渡人、およびパピロマ・レファランス・センタ
ー（Ｐappilloma Ｒeference Ｃenter）（西ドイツ国
ヘイデルベルグ）のエセル−ミシェレ・デ・ビリアース
（Ｅthel−Ｍichelle de Ｖilliers）博士から、およ
びライフ・テクノロジーズ・インコーポレーテッド（Ｌ
ife Ｔechnologies，Ｉnc．）から、ニトロセルロース
フィルター上に予備固定化された形態で入手した。より
詳しくは、ハイブリダイゼーションは、４１℃におい
て、１．０モルのＮaＣl、２８％（v／v）のホルムアミ
ド、５０ミリモルのＮ−トリスＴＥＳ、１０×デンハル
ト溶液、０．５ミリモルのＥＤＴＡおよび２０ミリモル
のリン酸ナトリウム（pＨ７．４）からなる溶液中で実
施した。次いで、ストリンジェントな洗浄を、６５℃に
おいて、１０ミリモルのリン酸ナトリウム（pＨ７．
４）、０．１ミリモルのＥＤＴＡ中の０．０３×ＳＳＣ
（０．００４５モルのＮaＣlおよび０．０００４５モル
のクエン酸ナトリウムからなる）を使用して実施した。
【０１３２】有意の相同性はＨＰＶ ４４ クローン２
の組換えＤＮＡと他のＨＰＶのタイプとの間でストリン
ジェントでないハイブリダイゼーション条件下に検出さ
れたが、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条
件下でＨＰＶのタイプ１〜４３のいずれを使用しても相
同性は観測されず、こうしてＨＰＶ ４４ クローン２
は新しいＨＰＶのタイプを表わすことが立証された。
【０１３３】２、制限エンドヌクレアーゼ地図 ＨＰＶ ４４ クローン２についての制限エンドヌクレ
アーゼ地図を第７図に示す。次の制限エンドヌクレアー
ゼはＨＰＶ ４４ ＤＮＡを切断しなかった：ＢglＩ、
ＢglＩＩ、ＣlaＩ、ＥcoＲＶ、ＨindＩＩＩ、ＮruＩ、
ＳalＩ、ＳphＩ、ＳstＩおよびＸhoＩ。
【０１３４】３、ゲノムの構成 ＨＰＶ ４４のゲノムがＨＰＶ ６への同一または同様
なオープンリーディングフレームを有することを立証す
るために、次のハイブリダイゼーションの研究を実施し
た。ＨＰＶ ４４ クローン２から精製したＤＮＡを、
前述のように、ストリンジェントでない条件下およびス
トリンジェントな条件下にプローブとしてＨＰＶ ６
ＤＮＡの32Ｐ「ニック翻訳した」断片を使用してサザン
ブロッティングにかけた。より詳しくは、ＢamＨＩ直線
化ＨＰＶ ６bクローンの断片を、ＥcoＲＩおよびＰst
Ｉで発生させ、次いでゲル精製し、32Ｐでニック翻訳
し、そしてＨＰＶ ４４ クローン２ ＤＮＡの精製し
たＨpaＩ断片のＮcoＩ制限消化物を含有するサザンブロ
ットをプロービングするために使用した。第８図に示す
結果が立証するように、ＨＰＶ ４４ クローン２のＤ
ＮＡはＨＰＶ ６と同一のゲノムの構成を有する。
【０１３５】４、疫学的分布 ＨＰＶ ４４ クローン２から調製したハイブリダイゼ
ーションプローブはストリンジェントな条件下にＨＰＶ
４４ ＤＮＡのみに対して効率よくハイブリダイゼー
ションすること、およびこれらのハイブリダイゼーショ
ンプローブはＨＰＶ ４４を含有する性器の病変を検出
するためにかつ他のＨＰＶのタイプ、例えば、６、１
１、１６、１８、３１または３３のＤＮＡを含有する性
器の病変とこのような性器の病変を区別するために使用
できることを立証するために、ワシントン、Ｄ．Ｃ．の
首都圏（マリイランド州およびバージニア州を含む）お
よびミシガン州および周辺の州からの、剥脱した細胞を
含有する頚の生検物および頚のスワブの収集物のＤＮＡ
を、ストリンジェントな条件下およびストリンジェント
でない条件下の核酸のハイブリダイゼーションによっ
て、ＨＰＶ ４４に対して特異的なプローブを包含す
る、種々のＨＰＶのタイプに対して特異的なプローブを
使用して、特定のＨＰＶ ＤＮＡの存在について分析し
た。生検物を二分し、この試料の半分は普通の光学顕微
鏡のための処理し、そして他方の半分は凍結し、そして
分子の分析のために−２０℃で貯蔵した。サザンブロッ
トのハイブリダイゼーションを実施する組織は、低温保
持装置上で区画して、ＤＮＡの抽出のための材料を得
た。ほぼすべての１／１８の区画をヘマトキシリンおよ
びエオシン着色で着色し、そして顕微鏡的に検査して、
この組織の試料が光学顕微鏡によって分析される試料の
一部に匹敵することを確証した。剥脱した頚の細胞は、
標準の細胞学的方法、例えば、乳頭の塗布（pap smea
r）によって、対をなす試料について分析し、それらの
他方をＤＮＡの分析のために使用した。
【０１３６】高分子量のＤＮＡを、前述のように試料か
ら調製した。精製した細胞のＤＮＡの１〜１０μgをＰs
tＩまたはＢamＨＩで消化し、そして消化した試料を
１．０％（w／v）のアガロースゲル中で電気泳動させ、
そしてニトロセルロースフィルターに移した。その後、
ハイブリダイゼーションを、前述のようにストリンジェ
ントな条件下に、前述のタイプからのニック翻訳した32
Ｐ標識ＨＰＶ ＤＮＡを使用して実施した。註：ＨＰＶ
ＤＮＡは、pＴ７１３または関連するベクター中で増
殖するので、組織試料中のpＴ７１３および関係するベ
クター様配列との反応の可能性を最小とするために、す
べてのプローブは電気泳動的に精製して、関係するベク
ター配列のほとんどを除去した。追加のハイブリダイゼ
ーションを、また、標識したpＴ７１３またはpＢＲ３２
２および関係するベクターの存在下に実施して、組織試
料中のプラスミド様配列による、潜在的な誤った陽性の
物質を明らかにした。結果を下表３に示す。表３におけ
る結果は第９図にグラフで示されている。
【０１３７】
【表３】
【０１３８】表３および第９図が立証するように、ＨＰ
Ｖ ４４を含有する頚の生検物は、溶液中の交差ハイブ
リダイゼーションの程度に基準および引続くヒドロキシ
アパタイトのクロマトグラフィーによってばかりでな
く、かつまた、性器の病変の明確な集団、すなわち、他
のＨＰＶのタイプを含有するものに比較して、ＨＰＶ４
４ ＤＮＡを含有するもの、を特異的に検出しかつ同定
するＨＰＶ ４４ ＤＮＡ プローブの能力によって、
他のＨＰＶのタイプ、例えば、６、１１、１６、１８、
３１および３３、を含有する生検物と区別することがで
きる。さらに、表３および第９図中の結果が示すよう
に、頚に生検物の間のＨＰＶ ４４ ＤＮＡの疫学的分
布はいくつかの他のＨＰＶのタイプについて見出される
ものと区別される。
【０１３９】実施例４ （Ａ）ＨＰＶ Ｃ５７ ＤＮＡのクローニング 使用した出発物質は、数ミリグラムの組織から成る、ミ
シガン州から得た陰門コンジロームの生検物であった。
合計のＤＮＡは、マニアチス（Ｍaniatis）、Ｔ．ら、
モレキュラー・クローニング（Ｍolecular Ｃlonin
g）：実験室のマニュアル（a laboratory manual）、
コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー（Ｃol
d Ｓpring Ｈarbor Ｌaboratories）、ニューヨーク
州、コールド・スプリング・ハーバー（１９８２）に記
載されているようにして精製した。より詳しくは、組織
を細かく分割し、次いで１．０mlの５０ミリモルのトリ
ス−ＨＣl、pＨ８．０［０．６％（w／v）のドデシル硫
酸ナトリウムおよび５０μg／mlのプロイテナーゼＫを
含有する］中で３７℃において１夜消化した。生ずる消
化物を１．０mlのフェノール：クロロホルム（１：１
（v／v））で２回抽出した。次いで、２容量の９０％
（v／v）のエタノールの添加によって、ＤＮＡを水性相
から沈殿させた。沈殿したＤＮＡを１０ミリモルのトリ
ス、１．０ミリモルのＥＤＴＡ緩衝液、pＨ８．０（以
後「ＴＥ 緩衝液」）中に約１．０mg／mlの濃度で再溶
解した。
【０１４０】ＤＮＡをＰstＩで完全に消化し、１％（v
／v）のアガロースゲル中で電気泳動させ、そしてＤＮ
Ａを、サザーン（Ｓouthern）、Ｅ．Ｍ．、ジャーナル
・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Ｊ． Ｍol．
Ｂiol．）、９８：５０３（１９７５）に記載されてい
るように、ニトロセルロースフィルターに移した。次い
で、フィルターをストリンジェントでないハイブリダイ
ゼーション条件（Ｔm−３５℃）およびストリンジェン
トなハイブリダイゼーション条件（Ｔm−１０℃）にお
いてＨＰＶタイプ６、１１、１６、１８および３１から
のＤＮＡでプロービングした。ハイブリダイゼーション
は、４３℃において、１．０モルのＮaＣl、５０ミリモ
ルのリン酸ナトリウム緩衝液（pＨ７．４）、１．０ミ
リモルのＥＤＴＡ、２％（w／v）のドデシル硫酸ナトリ
ウム、０．１％（w／v）のゼラチン、５０μg／mlのtＲ
ＮＡおよび３０％（w／v）のホルムアミド中で１夜実施
した。３０分の洗浄を５５℃において１．２×ＳＳＣ
（１×ＳＳＣは０．１５モルのＮaＣl＋０．０１５モル
のクエン酸ナトリウムである）、１０ミリモルのリン酸
ナトリウム（pＨ７．４）、１．０ミリモルのＥＤＴＡ
および０．５％（w／v）のドデシル硫酸ナトリウム中で
実施した。ハイブリダイゼーションは、ＨＰＶタイプ
６、１１、１６、１８および３１でストリンジェントで
ない条件下に達成されたが、ストリンジェントなハイブ
リダイゼーション条件下に達成されなかった。
【０１４１】得られた精製したＤＮＡおよびλ Ｌ４７
をＥcoＲＩ制限エンドヌクレアーゼで消化した。これは
５．１kbの断片を生成した。これは典型的乳頭腫ウイル
スのゲノムの大きさのほぼ６５％を表わす。この断片を
λ Ｌ４７の単一のＥcoＲＩ部位中にクローニングし
た。他の得られた精製したＤＮＡの他の部分をＢamＨＩ
制限エンドヌクレアーゼで消化した。これは５．９kbの
断片を生成した。これは典型的乳頭腫ウイルスのゲノム
の大きさのほぼ７５％を表わす。この断片をλＬ４７の
単一のＥcoＲＩ部位中にクローニングした。より詳しく
は、２．０μgの得られた精製したＤＮＡおよび２．０
μgのλ Ｌ４７ ＤＮＡを１０単位のＢamＨＩで、合
計容量５０μlのＴＥ 緩衝液中で３７℃で１時間切断
した。次いで、生ずる反応混合物を４００μlのＴＥ
緩衝液で希釈し、そして前述のように等体積のフェノー
ル：クロロホルムでフェノール抽出した。次いで、水性
相をクロロホルム：イソアミルアルコール（２４：１
（v／v））で抽出し、そして水性相からのＤＮＡを８０
％（v／v）のエタノールで沈殿させ、そして乾燥した。
次いで、乾燥したＤＮＡを１０μlの６６ミリモルのト
リス−ＨＣl、６．６ミリモルのＭgＣl2、１０ミリモル
のＤＴＴおよび１．０ミリモルのＡＴＰからなる１×リ
ガーゼ緩衝液中に懸濁させ、そして４２℃で２時間イン
キュベーションしてλアームをアニールした。次に、
０．５μlのＴ４ ＤＮＡリガーゼ、すなわち、約１単
位、および０．５μlの１０ミリモルのＡＴＰ、pＨ７．
０、を各反応溶液に添加し、そして結合を１２℃で１夜
進行させた。
【０１４２】次に、結合生成物をパッケージングして感
染性ファージを形成し、そしてＥ．coli ＮＭ５３８を
感染させるために使用した。より詳しくは、１０g／lの
トリプトンおよび５．０g／lのＮaＣlからなるアガロー
ス平板（以後、「ＴＮ 培地」）上で増殖するＥ． co
li ＮＭ５３８の単一のコロニーを選択し、そして振盪
プラットホーム（２５０rpm）上の２０mlのＴＮ 培地
中で３７℃において１夜、早期の定常期に増殖させた。
次いで、細胞培養物をＴＮ 培地で４倍に希釈し、そし
て３時間増殖させた。次に、ソーバル（Ｓorvall）ＨＢ
−４ローター中で５分間５，０００rpmにおいて遠心す
ることによって、細胞を収穫し、そして得られる細胞沈
殿物を１０ミリモルのＭgＳＯ4中のもとの容量の０．２
５中に再懸濁し、そして４℃で貯蔵した。
【０１４３】パッケージングした感染性ファージを、商
業的に入手可能なＢＲＬラムダ（Ｌambda）生体外パッ
ケージングシステムで調製した［参照、マニアチス（Ｍ
aniatis）、Ｔ．ら、モレキュラー・クローニング（Ｍo
lecular Ｃloning）：実験室のマニュアル（a labora
tory manual）、コールド・スプリング・ハーバー・ラ
ボラトリー（Ｃold Ｓpring Ｈarbor Ｌaboratorie
s）、ニューヨーク州、コールド・スプリング・ハーバ
ー（１９８２）］。
【０１４４】０．５モルのトリス−ＨＣl（pＨ８．
０）、０．１モルのＮaＣl、０．０１モルのＭgＳＯ4お
よび０．０１％（w／v）のゼラチンからなるファージ貯
蔵緩衝液（Ｄifco）中で１．５×１０4のプラーク／９c
m直径平板に適当に希釈した、パッケージングしたファ
ージの適当な希釈物の１００μlを、１０−１５mlの試
験管中で、前述のように調製したＥ． coli ＮＭ５３
８の１００μlに添加し、おだやかに混合しそして室温
において１５分間インキュベーションした。次いで、細
胞−ファージ溶液を、１リットルにつき１０gのトリプ
チカーゼ大豆ブロス、５．０gのＮaＣlおよび１５gの寒
天を含むトリプチカーゼ大豆ブロス寒天平板（これは少
なくとも１日前に調製されかつ３７℃に前もって加温さ
れている）上にプレイティングした。その後、１０ミリ
モルのＭgＳＯ4中に溶解した０．５％のアガロース（超
純粋、電気泳動等級）からなるアガロースのオーバーレ
イ（overlay）（溶液が沸騰するまでマイクロ波の炉内
で加熱し、次いで使用前４５℃に冷却してある）の３〜
５mlを、プレイティングした細胞−ファージの上に配置
した。アガロースが固化した後、平板を循環が良好な３
７℃の通風インキュベーターに移し、ここで平板の蓋に
割れ目を３０分間形成し、そして蓋を閉じ、そして平板
を倒立させた。８〜１２時間後、プラークが現われるよ
うになった。
【０１４５】感染は平板上でバクテリアの全面溶菌を生
じた。ＨＰＶ ＤＮＡを有する組換えファージは、ベン
トン（Ｂenton）、Ｗ．Ｄ．ら、サイエンス（Ｓcienc
e）、１９６：１８０（１９７７）に記載されるよう
に、「プラークリフト（plaquelifts）」を実施するこ
とによって局在化した。さらに詳しくは、全面溶菌の平
板を４℃に１時間配置してアガロースを固化させた。次
いで、ニトロセルロースフィルターの適当な大きさの片
を、その中央においてたわませることによって、平板の
中央に接触させ、そして中央の点をへりに向けて動かせ
ることによって配置した。次いで、４つの非対称の孔を
ニトロセルロースフィルターおよび寒天を通して小さい
ゲージの針で開け、そして孔の位置を永久的マーカーで
平板の底にしるしをした。これにより、陽性のシグナル
を含有するニトロセルロースフィルターおよび他の領域
を、平板上の対応する位置に関係づけることができた。
１０分後、ニトロセルロースフィルターを除去し、そし
てプラークが上方を向くようにして、ニトロセルロース
フィルターを、２００mlの０．５モルのＮaＯＨ、２．
０モルのＮaＣlを含有する皿中に１分間配置することに
よって、ＤＮＡを変性した。次いで、ニトロセルロース
フィルターを５００mlの０．５モルのトリス−ＨＣl、
２．０モルのＮaＣl、pＨ７．５、中に５分間浸漬する
ことによって中和した。次に、フィルターを０．９モル
のＮaＣl、０．０９モルのクエン酸ナトリウムからなる
６×ＳＳＣ中で１分間すすぎ、ワットマン３ＭＭ紙で乾
燥し、次いで８０℃において真空下に３０分間ベーキン
グした。
【０１４６】その後、プローブとして「ニック翻訳」に
より32Ｐで標識したＨＰＶ １６ＤＮＡを使用するスト
リンジェントでないハイブリダイゼーションを、リフト
したプラークから分離したＤＮＡについて実施し［参
照、リグビイ（Ｒigby）、Ｐ．Ｊ．Ｗ．ら、ジャーナル
・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Ｊ． Ｍol．Ｂ
iol．）、１１３：２３７（１９７７）およびマニアチ
ス（Ｍaniatis）、Ｔ．ら、モレキュラー・クローニン
グ（Ｍolecular Ｃloning）：実験室のマニュアル（a
laboratory manual）、コールド・スプリング・ハー
バー・ラボラトリー（Ｃold Ｓpring Ｈarbor Ｌabo
ratories）、ニューヨーク州、コールド・スプリング・
ハーバー（１９８２）］、次いで洗浄およびオートラジ
オグラフィーを実施した。さらに詳しくは、ハイブリダ
イゼーションは、１．０モルのＮaＣl、２８％（v／v）
のホルムアミド、５０ミリモルのＮ−トリス（ヒドロキ
シメチル）−メチル−２−アミノエタンスルホン酸(以
後「ＴＥＳ」)、１０×デンハルト溶液、０．１ミリモル
のＥＤＴＡおよび１０ミリモルのリン酸ナトリウム（p
Ｈ７．４）からなる溶液中で４１℃において実施した。
次いで、ストリンジェントでないハイブリダイゼーショ
ンは、１０ミリモルのリン酸ナトリウム（pＨ７．
４）、０．１ミリモルのＥＤＴＡ中の１．１×ＳＳＣ
（０．１６５モルのＮaＣlおよび０．０１６５モルのク
エン酸ナトリウムからなる）を使用して５２℃において
実施した。
【０１４７】放射性露出の部位と対応づけることによっ
て、ＨＰＶ １６ ＤＮＡにハイブリダイゼーションし
たＤＮＡを含有する、ファージを含有する平板の領域を
切除し、そして前述のようにＥ． coli ＮＭ５３８を
再感染させるために使用した。ＨＰＶ ＤＮＡを含有す
るファージのプラークの局在化は、上の手順を反復する
ことによって達成した。ＥcoＲＩ消化ＤＮＡを使用する
クローニングからスクリーニングした１．５×１０5の
プラークのうちから２つのプラークが同定された。両者
のクローンは同一の制限地図を有した。クローンの一方
をさらに研究するために選択し、そしてそしてＨＰＶ
Ｃ５７ クローン１Ａと表示した。１つのクローンはＢ
amＨＩ消化ＤＮＡを使用するクローニングからスクリー
ニングした５×１０4のプラークのうちから同定され、
そしてＨＰＶ Ｃ５７ クローン１Ｂと表示した。同定
された。クローニングした断片は２．８５kbの大きさを
示し、そしてＨＰＶ Ｃ５７ クローン１Ｂと表示し
た。
【０１４８】次いで、ＨＰＶ Ｃ５７ クローン１Ａお
よび１ＢのＨＰＶ ＤＮＡを、それぞれ、ＥcoＲＩまた
はＢamＨＩで消化し、そしてpＴ７１３の単一のＥcoＲ
ＩまたはＢamＨＩ部位中でサブクローニングした。得ら
れる組換えＤＮＡをＨＰＶＣ５７ クローン２Ａおよび
２Ｂと表示した。ＨＰＶ Ｃ５７ クローン２Ａおよび
２Ｂは、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクショ
ン（Ａmerican Ｔype Ｃulture Ｃollection）に、
それぞれ、ＡＴＣＣ Ｎo．４０３４１およびＡＴＣＣ
Ｎo．４０３７９で受託された。
【０１４９】（Ｂ）ＨＰＶ Ｃ５７ ＤＮＡの特性づけ １、ハイブリダイゼーションの研究 ハイブリダイゼーションの研究を、ＨＰＶ Ｃ５７ ク
ローン２Ａおよび２ＢＤＮＡついて実施して、ＨＰＶ
Ｃ５７ クローン２Ａおよび２Ｂが新しいＨＰＶのタイ
プであることを立証した。
【０１５０】より詳しくは、ＨＰＶ Ｃ５７ クローン
２Ａおよび２Ｂから調製した32Ｐ「ニック翻訳した」Ｄ
ＮＡを、ストリンジェントな条件下にサザンブロッティ
ングによって、ＨＰＶのタイプ１〜４５からのＤＮＡの
５．０ngに対してハイブリダイゼーションした。ＨＰＶ
のタイプ１〜４５からのＤＮＡは、インスティチュート
・パスツール（Ｉnstitut Ｐasteur）（フランス国パ
リ）のゲラルド・オース（Ｇerard Ｏrth）博士、ＨＰ
Ｖのタイプの表示の譲渡人、パピロマ・レファランス・
センター（Ｐappilloma Ｒeference Ｃenter）（西ド
イツ国ヘイデルベルグ）のエセル−ミシェレ・デ・ビリ
アース（Ｅthel−Ｍichelle de Ｖilliers）博士か
ら、およびライフ・テクノロジーズ・インコーポレーテ
ッド（Ｌife Ｔechnologies，Ｉnc．）から、ニトロセ
ルロースフィルター上に予備固定化された形態で入手し
た。より詳しくは、ハイブリダイゼーションは、４１℃
において、１．０モルのＮaＣl、２８％（v／v）のホル
ムアミド、５０ミリモルのＮ−トリス ＴＥＳ、１０×
デンハルト溶液、０．５ミリモルのＥＤＴＡおよび２０
ミリモルのリン酸ナトリウム（pＨ７．４）からなる溶
液中で実施した。次いで、ストリンジェントな洗浄を、
６５℃において、１０ミリモルのリン酸ナトリウム（p
Ｈ７．４）、０．１ミリモルのＥＤＴＡ中の０．０３×
ＳＳＣ（０．００４５モルのＮaＣlおよび０．０００４
５モルのクエン酸ナトリウムからなる）を使用して実施
した。
【０１５１】有意の相同性はＨＰＶ Ｃ５７ クローン
２Ａおよび２Ｂの組換えＤＮＡと他のＨＰＶのタイプと
の間でストリンジェントでないハイブリダイゼーション
条件下に検出されたが、ストリンジェントなハイブリダ
イゼーション条件下でＨＰＶのタイプ１〜４５のいずれ
を使用しても相同性は観測されず、こうしてＨＰＶＣ５
７ クローン２Ａおよび２Ｂは新しいＨＰＶのタイプを
表わすことが立証された。
【０１５２】２、制限エンドヌクレアーゼ地図 ＨＰＶ Ｃ５７ クローン２Ａおよび２Ｂについての制
限エンドヌクレアーゼ地図を第１０図に示す。次の制限
エンドヌクレアーゼはＨＰＶ Ｃ５７ ＤＮＡを切断し
なかった：ＢglＩＩ、ＮcoＩ、ＨindＩＩＩ、ＳalＩ、
ＳstＩおよびＸbaＩ。
【０１５３】３、ゲノムの構成 ＨＰＶ Ｃ５７のゲノムがＨＰＶ ６への同一または同
様なオープンリーディングフレームを有することを立証
するために、次のハイブリダイゼーションの研究を実施
した。ＨＰＶ Ｃ５７ クローン２Ａおよび２Ｂから精
製したＤＮＡを、前述のように、ストリンジェントでな
い条件下およびストリンジェントな条件下にプローブと
してＨＰＶ ６ ＤＮＡの32Ｐ「ニック翻訳した」断片
を使用してサザンブロッティングにかけた。より詳しく
は、ＢamＨＩ直線化ＨＰＶ ６bクローンの断片を、Ｅc
oＲＩおよびＰstＩで発生させ、次いでゲル精製し、32
Ｐでニック翻訳し、そしてＨＰＶ Ｃ５７ クローン２
Ａ ＤＮＡの精製したＥcoＲＩ断片＋ＥcoＲＶ制限消化
物およびＨＰＶ Ｃ５７ クローン２Ａ ＤＮＡの精製
したＢamＨＩ断片のＥcoＲＩ＋ＥcoＲＶ消化物を含有す
るサザンブロットをプロービングするために使用した。
第１１図に示す結果が立証するように、ＨＰＶ Ｃ５７
クローン２Ａおよび２ＢのＤＮＡはＨＰＶ ６と同一
のゲノムの構成を有する。
【０１５４】４、疫学的分布 ＨＰＶ Ｃ５７ クローン２Ａおよび２Ｂから調製した
ハイブリダイゼーションプローブはストリンジェントな
条件下にＨＰＶ Ｃ５７ ＤＮＡのみに対して効率よく
ハイブリダイゼーションすること、およびこれらのハイ
ブリダイゼーションプローブはＨＰＶ Ｃ５７を含有す
る性器の病変を検出するためにかつ他のＨＰＶのタイ
プ、例えば、６、１１、１６、１８、３１または３３の
ＤＮＡを含有する性器の病変とこのような性器の病変を
区別するために使用できることを立証するために、ワシ
ントン、Ｄ．Ｃ．の首都圏（マリイランド州およびバー
ジニア州を含む）およびミシガン州および周辺の州から
の、剥脱した細胞を含有する頚の生検物および頚のスワ
ブの収集物のＤＮＡを、ストリンジェントな条件下およ
びストリンジェントでない条件下の核酸のハイブリダイ
ゼーションによって、ＨＰＶ Ｃ５７に対して特異的な
プローブを包含する、種々のＨＰＶのタイプに対して特
異的なプローブを使用して、特定のＨＰＶ ＤＮＡの存
在について分析した。生検物を二分し、この試料の半分
は普通の光学顕微鏡のための処理し、そして他方の半分
は凍結し、そして分子の分析のために−２０℃で貯蔵し
た。サザンブロットのハイブリダイゼーションを実施す
る組織は、低温保持装置上で区画して、ＤＮＡの抽出の
ための材料を得た。ほぼすべての１／１８の区画をヘマ
トキシリンおよびエオシン着色で着色し、そして顕微鏡
的に検査して、この組織の試料が光学顕微鏡によって分
析される試料の一部に匹敵することを確証した。剥脱し
た頚の細胞は、標準の細胞学的方法、例えば、乳頭の塗
布（pap smear）によって、対をなす試料について分析
し、それらの他方をＤＮＡの分析のために使用した。
【０１５５】高分子量のＤＮＡを、前述のように試料か
ら調製した。精製した細胞のＤＮＡの１〜１０μgをＰs
tＩまたはＢamＨＩで消化し、そして消化した試料を
１．０％（w／v）のアガロースゲル中で電気泳動させ、
そしてニトロセルロースフィルターに移した。その後、
ハイブリダイゼーションを、前述のようにストリンジェ
ントな条件下に、前述のタイプからのニック翻訳した32
Ｐ標識ＨＰＶ ＤＮＡを使用して実施した。（ＨＰＶ
Ｃ５７ ＤＮＡについて、ＨＰＶ Ｃ５７ クローン２
Ａおよび２ＢからのＨＰＶ ＤＮＡの混合物を使用し
た。）註：ＨＰＶＤＮＡは、pＴ７１３または関連する
ベクター中で増殖するので、組織試料中のpＴ７１３お
よび関係するベクター様配列との反応の可能性を最小と
するために、すべてのプローブは電気泳動的に精製し
て、関係するベクター配列のほとんどを除去した。追加
のハイブリダイゼーションを、また、標識したpＴ７１
３またはpＢＲ３２２および関係するベクターの存在下
に実施して、組織試料中のプラスミド様配列による、潜
在的な誤った陽性の物質を明らかにした。結果を下表４
に示す。表４における結果は第１２図にグラフで示され
ている。
【０１５６】
【表４】
【０１５７】表４および第１２図が立証するように、Ｈ
ＰＶ Ｃ５７を含有する頚の生検物は、溶液中の交差ハ
イブリダイゼーションの程度に基準および引続くヒドロ
キシアパタイトのクロマトグラフィーによってばかりで
なく、かつまた、性器の病変の明確な集団、すなわち、
他のＨＰＶのタイプを含有するものに比較して、ＨＰＶ
Ｃ５７ ＤＮＡを含有するもの、を特異的に検出しか
つ同定するＨＰＶ Ｃ５７ ＤＮＡ プローブの能力に
よって、他のＨＰＶのタイプ、例えば、６、１１、１
６、１８、３１および３３、を含有する生検物と区別す
ることができる。さらに、表４および第１２図中の結果
が示すように、頚に生検物の間のＨＰＶＣ５７ ＤＮＡ
の疫学的分布はいくつかの他のＨＰＶのタイプについて
見出されるものと区別される。
【０１５８】本発明を詳細にかつ特定の実施態様に関し
て説明したが、種々の変更および修正は本発明の精神お
よび範囲を逸脱しないで可能でることが明らかである。
【０１５９】本発明の主な特徴および態様は以下の通り
である。
【０１６０】１．クローニングベクターおよび、それぞ
れ、ＨＰＶ ３５ ＤＮＡまたはその断片の実質的にす
べて、ＨＰＶ ４３ ＤＮＡまたはその断片の実質的に
すべて、ＨＰＶ ４４ ＤＮＡまたはその断片の実質的
にすべて、またはＨＰＶ Ｃ５７ ＤＮＡまたはその断
片の実質的にすべてを含んでなることを特徴とするＨＰ
Ｖ ３５、ＨＰＶ ４３、ＨＰＶ ４４またはＨＰＶ
Ｃ５７の組換えＤＮＡ。
【０１６１】２．前記クローニングベクターは、pＢＲ
３２２、pＵＣ１１、λシャロン、λＬ４７、Ｍ１３誘
導バクテリオファージ、pＺＩＰ−Ｎeo ＳＶ［Ｘ
１］、pＢＫＴＫ−１、pＴ７１２およびpＴ７１３から
成る群より選択される上記第１項記載の組換えＤＮＡ。
【０１６２】３．前記断片は約１５〜約８０００塩基対
の大きさである上記第１項記載の組換えＤＮＡ。
【０１６３】４．前記断片は約３００〜約８００塩基対
の大きさである上記第３項記載の組換えＤＮＡ。
【０１６４】５．前記組換えＤＮＡはＨＰＶ ３５ ク
ローン２Ａおよび２Ｂ（それぞれ、ＡＴＣＣ Ｎo．４
０３３０およびＡＴＣＣ Ｎo．４０３３１）、ＨＰＶ
４３クローン２Ａおよび２Ｂ（それぞれ、ＡＴＣＣ
Ｎo．４０３３８およびＡＴＣＣ Ｎo．４０３３９）、
ＨＰＶ ４４ クローン（ＡＴＣＣ Ｎo．４０３５
３）またはＨＰＶ Ｃ５７ クローン２Ａおよび２Ｂ
（それぞれ、ＡＴＣＣ Ｎo．４０３４１およびＡＴＣ
Ｃ Ｎo．４０３７９）の同定特性を有する上記第１項
記載の組換えＤＮＡ。
【０１６５】６．前記組換えＤＮＡのＨＰＶ ＤＮＡは
マーカーで標識されている上記第１項記載の組換えＤＮ
Ａ。
【０１６６】７．前記マーカーは放射性マーカーである
上記第６項記載の組換えＤＮＡ。
【０１６７】８．前記マーカーは32Ｐ、14Ｃ、3Ｈ、125
Ｉおよび35Ｓから選択される放射性マーカーである上記
第７項記載の組換えＤＮＡ。
【０１６８】９．前記マーカーはビオチン、酵素および
蛍光性分子から成る群より選択される非放射性マーカー
である上記第６項記載の組換えＤＮＡ。
【０１６９】１０．前記酵素はアルカリ性ホスファター
ゼおよびセイヨウワサビペルオキシダーゼから成る群よ
り選択される上記第９項記載の組換えＤＮＡ。 １１．
前記蛍光性分子はフルオレセインまたはローダミンから
成る群より選択される上記第９項記載の組換えＤＮＡ。
【０１７０】１２．本質的に純粋なＨＰＶ ３５ ＤＮ
Ａまたはその断片、本質的に純粋なＨＰＶ ４３ ＤＮ
Ａまたはその断片、本質的に純粋なＨＰＶ ４４ ＤＮ
Ａまたはその断片、または本質的に純粋なＨＰＶ Ｃ５
７ ＤＮＡまたはその断片。
【０１７１】１３．前記ＨＰＶ ＤＮＡまたはその断片
は生物学的に産生される上記第１２項記載の本質的に純
粋なＨＰＶ ＤＮＡ。
【０１７２】１４．前記ＨＰＶ ＤＮＡまたはその断片
は化学的に産生される上記第１２項記載の本質的に純粋
なＨＰＶ ＤＮＡ。
【０１７３】１５．前記断片は約１５〜約８０００塩基
または塩基対の大きさである上記第１２項記載の本質的
に純粋なＨＰＶ ＤＮＡ。
【０１７４】１６．前記断片は約３００〜約８００塩基
または塩基対の大きさである上記第１５項記載の本質的
に純粋なＨＰＶ ＤＮＡ。
【０１７５】１７．前記ＨＰＶ ＤＮＡまたはその断片
はマーカーで標識されている上記第１２項記載の本質的
に純粋なＨＰＶ ＤＮＡ。
【０１７６】１８．前記マーカーは放射性マーカーであ
る上記第１７項記載の本質的に純粋なＨＰＶ ＤＮＡ。
【０１７７】１９．前記マーカーは32Ｐ、14Ｃ、3Ｈ、
125Ｉおよび35Ｓから選択される放射性マーカーである
上記第１８項記載の本質的に純粋なＨＰＶ ＤＮＡ。
【０１７８】２０．前記マーカーはビオチン、酵素およ
び蛍光性分子から成る群より選択される非放射性マーカ
ーである上記第１７項記載の本質的に純粋なＨＰＶ Ｄ
ＮＡ。
【０１７９】２１．前記酵素はアルカリ性ホスファター
ゼおよびセイヨウワサビペルオキシダーゼから成る群よ
り選択される上記第２０項記載の本質的に純粋なＨＰＶ
ＤＮＡ。
【０１８０】２２．前記蛍光性分子はフルオレセインま
たはローダミンから成る群より選択される上記第２０項
記載の本質的に純粋なＨＰＶ ＤＮＡ。
【０１８１】２３．本質的に純粋なＨＰＶ ３５ ＲＮ
Ａまたはその断片、本質的に純粋なＨＰＶ ４３ ＲＮ
Ａまたはその断片、本質的に純粋なＨＰＶ ４４ ＲＮ
Ａまたはその断片、または本質的に純粋なＨＰＶ Ｃ５
７ ＲＮＡまたはその断片。
【０１８２】２４．前記ＨＰＶ ＲＮＡまたはその断片
は生物学的に産生される上記第２３項記載の本質的に純
粋なＨＰＶ ＲＮＡ。
【０１８３】２５．前記ＨＰＶ ＲＮＡまたはその断片
は化学的に産生される上記第２３項記載の本質的に純粋
なＨＰＶ ＲＮＡ。
【０１８４】２６．前記断片は約１５〜約８０００塩基
または塩基対の大きさである上記第２３項記載の本質的
に純粋なＨＰＶ ＲＮＡ。
【０１８５】２７．前記断片は約３００〜約８００塩基
または塩基対の大きさである上記第２６項記載の本質的
に純粋なＨＰＶ ＲＮＡ。
【０１８６】２８．前記ＨＰＶ ＲＮＡまたはその断片
はマーカーで標識されている上記第２３項記載の本質的
に純粋なＨＰＶ ＲＮＡ。
【０１８７】２９．前記マーカーは放射性マーカーであ
る上記第２８項記載の本質的に純粋なＨＰＶ ＲＮＡ。
【０１８８】３０．前記マーカーは32Ｐ、14Ｃ、3Ｈ、
125Ｉおよび35Ｓから選択される放射性マーカーである
上記第２９項記載の本質的に純粋なＨＰＶ ＲＮＡ。
【０１８９】３１．前記マーカーはビオチン、酵素およ
び蛍光性分子から成る群より選択される非放射性マーカ
ーである上記第２８項記載の本質的に純粋なＨＰＶ Ｒ
ＮＡ。
【０１９０】３２．前記酵素はアルカリ性ホスファター
ゼおよびセイヨウワサビペルオキシダーゼから成る群よ
り選択される上記第３１項記載の本質的に純粋なＨＰＶ
ＲＮＡ。
【０１９１】３３．前記蛍光性分子はフルオレセインま
たはローダミンから成る群より選択される上記第３１項
記載の本質的に純粋なＨＰＶ ＲＮＡ。
【０１９２】３４．（i）マーカーで標識されたＨＰＶ
３５ ＤＮＡまたはその断片、（ii）マーカーで標識
されたＨＰＶ ３５ ＲＮＡまたはその断片、（iii）
マーカーで標識されたＨＰＶ ４３ ＤＮＡまたはその
断片、（iv）マーカーで標識されたＨＰＶ ４３ ＲＮ
Ａまたはその断片、（v）マーカーで標識されたＨＰＶ
４４ ＤＮＡまたはその断片、（vi）マーカーで標識さ
れたＨＰＶ ４４ ＲＮＡまたはその断片、（vii）マ
ーカーで標識されたＨＰＶ Ｃ５７ ＤＮＡまたはその
断片および（viii）マーカーで標識されたＨＰＶ Ｃ５
７ ＲＮＡまたはその断片から成る群より選択されるＨ
ＰＶハイブリダイゼーションプローブ。
【０１９３】３５．前記断片は約１５〜約８０００塩基
または塩基対の大きさである上記第３４項記載のＨＰＶ
ハイブリダイゼーションプローブ。
【０１９４】３６．前記断片は約３００〜約８００塩基
または塩基対の大きさである上記第３５項記載のＨＰＶ
ハイブリダイゼーションプローブ。
【０１９５】３７．前記マーカーは放射性マーカーであ
る上記第３４項記載のＨＰＶハイブリダイゼーションプ
ローブ。
【０１９６】３８．前記マーカーは32Ｐ、14Ｃ、3Ｈ、
125Ｉおよび35Ｓから選択される放射性マーカーである
上記第３７項記載のＨＰＶハイブリダイゼーションプロ
ーブ。
【０１９７】３９．前記マーカーはビオチン、酵素およ
び蛍光性分子から成る群より選択される非放射性マーカ
ーである上記第３４項記載のＨＰＶハイブリダイゼーシ
ョンプローブ。
【０１９８】４０．前記酵素はアルカリ性ホスファター
ゼおよびセイヨウワサビペルオキシダーゼから成る群よ
り選択される上記第３９項記載のＨＰＶハイブリダイゼ
ーションプローブ。
【０１９９】４１．前記蛍光性分子はフルオレセインま
たはローダミンから成る群より選択される上記第３９項
記載のＨＰＶハイブリダイゼーションプローブ。
【０２００】４２．（a）（i）マーカーで標識されたＨ
ＰＶ ３５ ＤＮＡまたはその断片および（ii）マーカ
ーで標識されたＨＰＶ ３５ ＲＮＡまたはその断片か
ら成る群より選択される構成員、および（b）マーカー
で標識された少なくとも１つの他のＨＰＶタイプのＤＮ
ＡまたはＲＮＡまたはその断片、あるいは（a’）（i）
マーカーで標識されたＨＰＶ ４３ ＤＮＡまたはその
断片および（ii）マーカーで標識されたＨＰＶ ４３
ＲＮＡまたはその断片から成る群より選択される構成
員、および（b’）マーカーで標識された少なくとも１
つの他のＨＰＶタイプのＤＮＡまたはＲＮＡまたはその
断片、あるいは（a”）（i）マーカーで標識されたＨＰ
Ｖ ４４ ＤＮＡまたはその断片および（ii）マーカー
で標識されたＨＰＶ ４４ ＲＮＡまたはその断片から
成る群より選択される構成員、および（b”）マーカー
で標識された少なくとも１つの他のＨＰＶタイプのＤＮ
ＡまたはＲＮＡまたはその断片、あるいは（a"'）（i）
マーカーで標識されたＨＰＶ Ｃ５７ ＤＮＡまたはそ
の断片および（ii）マーカーで標識されたＨＰＶ Ｃ５
７ ＲＮＡまたはその断片から成る群より選択される構
成員、および（b"'）マーカーで標識された少なくとも
１つの他のＨＰＶタイプのＤＮＡまたはＲＮＡまたはそ
の断片から成る群より選択されるＨＰＶハイブリダイゼ
ーションプローブ組成物。
【０２０１】４３．前記断片は約１５〜約８０００塩基
または塩基対の大きさである上記第４２項記載のＨＰＶ
ハイブリダイゼーションプローブ組成物。
【０２０２】４４．前記断片は約３００〜約８００塩基
または塩基対の大きさである上記第４３項記載のＨＰＶ
ハイブリダイゼーションプローブ組成物。
【０２０３】４５．前記マーカーは放射性マーカーであ
る上記第４２項記載のＨＰＶハイブリダイゼーションプ
ローブ組成物。
【０２０４】４６．前記マーカーは32Ｐ、14Ｃ、3Ｈ、
125Ｉおよび35Ｓから選択される放射性マーカーである
上記第４５項記載のＨＰＶハイブリダイゼーションプロ
ーブ組成物。
【０２０５】４７．前記マーカーはビオチン、酵素およ
び蛍光性分子から成る群より選択される非放射性マーカ
ーである上記第４２項記載のＨＰＶハイブリダイゼーシ
ョンプローブ組成物。
【０２０６】４８．前記酵素はアルカリ性ホスファター
ゼおよびセイヨウワサビペルオキシダーゼから成る群よ
り選択される上記第４７項記載のＨＰＶハイブリダイゼ
ーションプローブ組成物。
【０２０７】４９．前記蛍光性分子はフルオレセインま
たはローダミンから成る群より選択される上記第４７項
記載のＨＰＶハイブリダイゼーションプローブ組成物。
【０２０８】５０．前記他のＨＶＰタイプはＨＶＰ
６、ＨＶＰ １１、ＨＶＰ １６、ＨＶＰ １８および
ＨＶＰ ３１から成る群より選択される少なくとも１種
の構成員である上記第４２項記載のハイブリダイゼーシ
ョンプローブ組成物。
【０２０９】５１．前記他のＨＶＰタイプはＨＶＰ １
６、ＨＶＰ １８およびＨＶＰ ３１から成る群より選
択される少なくとも１種の構成員である上記第５０項記
載のハイブリダイゼーションプローブ組成物。
【０２１０】５２．前記他のＨＶＰタイプはＨＶＰ １
６、ＨＶＰ １８およびＨＶＰ ３１である上記第５１
項記載のハイブリダイゼーションプローブ組成物。
【０２１１】５３．工程： （１）ストリンジェントでない条件下に、 （a）（i）マーカーで標識されたＨＰＶ ３５ ＤＮＡ
またはその断片、マーカーで標識されたＨＰＶ ４３
ＤＮＡまたはその断片、マーカーで標識されたＨＰＶ
４４ ＤＮＡまたはその断片、あるいはマーカーで標識
されたＨＰＶＣ５７ ＤＮＡまたはその断片、および
（ii）マーカーで標識されたＨＰＶ ３５ ＲＮＡまた
はその断片、マーカーで標識されたＨＰＶ ４３ ＲＮ
Ａまたはその断片、マーカーで標識されたＨＰＶ ４４
ＲＮＡまたはその断片、あるいはマーカーで標識され
たＨＰＶ Ｃ５７ ＲＮＡまたはその断片、から成る群
より選択される構成員、および （b）ＤＮＡまたはＲＮＡの未知の試料、 を使用し
てハイブリダイゼーションを実施し、そして （２）交差ハイブリダイゼーションの存在についてアッ
セイして、前記試料中のＨＶＰのＤＮＡまたはＲＮＡを
検出する、を含んでなることを特徴とするＨＶＰのＤＮ
ＡまたはＲＮＡを検出する方法。
【０２１２】５４．ＤＮＡまたはＲＮＡの前記未知の試
料は性器、のど、口または皮膚の病変から誘導される上
記第５３項記載の方法。
【０２１３】５５．ＤＮＡまたはＲＮＡの前記未知の試
料は性器の病変から誘導される上記第５４項記載の方
法。
【０２１４】５６．性器の病変からのＤＮＡまたはＲＮ
Ａの前記未知の試料を、上皮の病変の生検、頚のこす
り、または頚のスワッビングによって剥脱された細胞を
得ることによって得るか、あるいはクローニングベクタ
ー中でクローニングされた性器の病変から誘導されたＤ
ＮＡである上記第５５項記載の方法。
【０２１５】５７．前記断片は約１５〜約８０００塩基
または塩基対の大きさである上記第５３項記載の方法。
【０２１６】５８．前記断片は約３００〜約８００塩基
または塩基対の大きさである上記第５７項記載の方法。
【０２１７】５９．ハイブリダイゼーションを、また、 （c）（i）マーカーで標識されたＨＰＶ ６ ＤＮＡま
たはその断片および（ii）マーカーで標識されたＨＰＶ
６ ＲＮＡまたはその断片から成る群より選択される
構成員、（i）マーカーで標識されたＨＰＶ １１ Ｄ
ＮＡまたはその断片および（ii）マーカーで標識された
ＨＰＶ １１ ＲＮＡまたはその断片から成る群より選
択される構成員、（i）マーカーで標識されたＨＰＶ
１６ ＤＮＡまたはその断片および（ii）マーカーで標
識されたＨＰＶ １６ ＲＮＡまたはその断片から成る
群より選択される構成員、および（i）マーカーで標識
されたＨＰＶ １８ ＤＮＡまたはその断片および（i
i）マーカーで標識されたＨＰＶ １８ ＲＮＡまたは
その断片から成る群より選択される構成員、の少なくと
も１種を使用して実施する上記第５３項記載の方法。
【０２１８】６０．前記他のタイプはＨＶＰ １６およ
びＨＶＰ １８から成る群より選択される少なくとも１
種の構成員である上記第５９項記載の方法。
【０２１９】６１．前記他のＨＶＰタイプはＨＶＰ １
６およびＨＶＰ １８である上記第６０項記載の方法。
【０２２０】６２．前記マーカーは放射性マーカーであ
る上記第５３項記載の方法。
【０２２１】６３．前記マーカーは32Ｐ、14Ｃ、3Ｈ、
125Ｉおよび35Ｓから選択される放射性マーカーである
上記第６２項記載の方法。
【０２２２】６４．前記マーカーはビオチン、酵素およ
び蛍光性分子から成る群より選択される非放射性マーカ
ーである上記第５３項記載の方法。
【０２２３】６５．前記酵素はアルカリ性ホスファター
ゼおよびセイヨウワサビペルオキシダーゼから成る群よ
り選択される上記第６４項記載の方法。
【０２２４】６６．前記蛍光性分子はフルオレセインま
たはローダミンから成る群より選択される上記第６４項
記載の方法。
【０２２５】６７．前記交差ハイブリダイゼーションは
ＤＮＡ−ＤＮＡ雑種を産生する上記第５３項記載の方
法。
【０２２６】６８．前記交差ハイブリダイゼーションは
ＤＮＡ−ＲＮＡ雑種を産生する上記第５３項記載の方
法。
【０２２７】６９．工程： （１）ストリンジェントな条件下に、 （a）（i）それぞれ、マーカーで標識されたＨＰＶ ３
５ ＤＮＡまたはその断片、マーカーで標識されたＨＰ
Ｖ ４３ ＤＮＡまたはその断片、マーカーで標識され
たＨＰＶ ４４ ＤＮＡまたはその断片、あるいはマー
カーで標識されたＨＰＶ Ｃ５７ ＤＮＡまたはその断
片、および（ii）それぞれ、マーカーで標識されたＨＰ
Ｖ ３５ ＲＮＡまたはその断片、マーカーで標識され
たＨＰＶ ４３ ＲＮＡまたはその断片、マーカーで標
識されたＨＰＶ ４４ ＲＮＡまたはその断片、あるい
はマーカーで標識されたＨＰＶ Ｃ５７ ＲＮＡまたは
その断片、から成る群より選択される構成員、および （b）ＤＮＡまたはＲＮＡの未知の試料、 を使用し
てハイブリダイゼーションを実施し、そして （２）交差ハイブリダイゼーションの存在についてアッ
セイして、前記試料中の、それぞれ、ＨＰＶ ３５ Ｄ
ＮＡまたはＲＮＡ、ＨＰＶ ４３ ＤＮＡまたはＲＮ
Ａ、ＨＰＶ ４４ ＤＮＡまたはＲＮＡ、あるいはＨＰ
Ｖ Ｃ５７ ＤＮＡまたはＲＮＡを検出する、を含んで
なることを特徴とするＨＰＶ ３５ ＤＮＡまたはＲＮ
Ａ、ＨＰＶ ４３ ＤＮＡまたはＲＮＡ、ＨＰＶ ４４
ＤＮＡまたはＲＮＡ、あるいはＨＰＶＣ５７ ＤＮＡ
またはＲＮＡを検出する方法。
【０２２８】７０．ＤＮＡまたはＲＮＡの前記未知の試
料は性器、のど、口または皮膚の病変から誘導される上
記第６９項記載の方法。
【０２２９】７１．ＤＮＡまたはＲＮＡの前記未知の試
料は性器の病変から誘導される上記第７０項記載の方
法。
【０２３０】７２．性器の病変からのＤＮＡまたはＲＮ
Ａの前記未知の試料を、上皮の病変の生検、頚のこす
り、または頚のスワッビングによって剥脱された細胞を
得ることによって得るか、あるいはクローニングベクタ
ー中でクローニングされた性器の病変から誘導されたＤ
ＮＡである上記第７１項記載の方法。
【０２３１】７３．前記断片は約１５〜約８０００塩基
または塩基対の大きさである上記第６９項記載の方法。
【０２３２】７４．前記断片は約３００〜約８００塩基
または塩基対の大きさである上記第７３項記載の方法。
【０２３３】７５．ＨＰＶ ３５ ＤＮＡ、ＨＰＶ ４
３ ＤＮＡ、ＨＰＶ ４４ ＤＮＡまたはＨＰＶ Ｃ５
７ ＤＮＡは、それぞれ、ＨＰＶ ３５のゲノムの実質
的にすべて、ＨＰＶ ４３のゲノムの実質的にすべて、
ＨＰＶ ４４のゲノムの実質的にすべて、またはＨＰＶ
Ｃ５７のゲノムの実質的にすべてからなる上記第６９
項記載の方法。
【０２３４】７６．前記マーカーは放射性マーカーであ
る上記第６９項記載の方法。
【０２３５】７７．前記マーカーは32Ｐ、14Ｃ、3Ｈ、
125Ｉおよび35Ｓから選択される放射性マーカーである
上記第７６項記載の方法。
【０２３６】７８．前記マーカーはビオチン、酵素およ
び蛍光性分子から成る群より選択される非放射性マーカ
ーである上記第６９項記載の方法。
【０２３７】７９．前記酵素はアルカリ性ホスファター
ゼおよびセイヨウワサビペルオキシダーゼから成る群よ
り選択される上記第７８項記載の方法。
【０２３８】８０．前記蛍光性分子はフルオレセインま
たはローダミンから成る群より選択される上記第７８項
記載の方法。
【０２３９】８１．前記交差ハイブリダイゼーションは
ＤＮＡ−ＤＮＡ雑種を産生する上記第６９項記載の方
法。
【０２４０】８２．前記交差ハイブリダイゼーションは
ＤＮＡ−ＲＮＡ雑種を産生する上記第６９項記載の方
法。
【０２４１】８３．工程： （１）ストリンジェントな条件下に、 （a）性器の病変のサンプリングの各性器の病変から誘
導されたＤＮＡまたはＲＮＡの第１分画、前記サンプリ
ングは頚の癌への疫学的進行を示す、および （b）（i）、それぞれ、マーカーで標識されたＨＰＶ
３５ ＤＮＡまたはその断片、マーカーで標識されたＨ
ＰＶ ４３ ＤＮＡまたはその断片、マーカーで標識さ
れたＨＰＶ ４４ ＤＮＡまたはその断片、あるいはマ
ーカーで標識されたＨＰＶ Ｃ５７ ＤＮＡまたはその
断片、および（ii）それぞれ、マーカーで標識されたＨ
ＰＶ ３５ ＲＮＡまたはその断片、マーカーで標識さ
れたＨＰＶ ４３ ＲＮＡまたはその断片、マーカーで
標識されたＨＰＶ ４４ ＲＮＡまたはその断片、ある
いはマーカーで標識されたＨＰＶ Ｃ５７ ＲＮＡまた
はその断片、から成る群より選択される構成員、を使用
してハイブリダイゼーションを実施し、そして （２）ストリンジェントな条件下に、 （a）性器の病変の前記サンプリングの各性器の病変か
ら誘導されたＤＮＡまたはＲＮＡの第２分画、および （b）マーカーで標識された性器の病変から誘導された
ＤＮＡまたはＲＮＡの未知の試料、を使用して、ハイブ
リダイゼーションを実施し、 （３）工程（１）におい
て得られた交差ハイブリダイゼーションの疫学的分布を
工程（２）において得られたそれおよび前記疫学的分布
を構成する各病変からのＤＮＡの交差ハイブリダイゼー
ションと比較して、前記試料中の、それぞれ、ＨＰＶ
３５ ＤＮＡまたはＲＮＡ、ＨＰＶ ４３ ＤＮＡまた
はＲＮＡ、ＨＰＶ ４４ ＤＮＡまたはＲＮＡ、あるい
はＨＰＶ Ｃ５７ ＤＮＡまたはＲＮＡを検出する、を
含んでなることを特徴とするＨＰＶ ３５ ＤＮＡまた
はＲＮＡ、ＨＰＶ ４３ ＤＮＡまたはＲＮＡ、ＨＰＶ
４４ ＤＮＡまたはＲＮＡ、あるいはＨＰＶＣ５７
ＤＮＡまたはＲＮＡを検出する方法。
【０２４２】８４．前記断片は約１５〜約８０００塩基
または塩基対の大きさである上記第８３項記載の方法。
【０２４３】８５．前記断片は約３００〜約８００塩基
または塩基対の大きさである上記第８４項記載の方法。
【０２４４】８６．ＨＰＶ ３５ ＤＮＡ、ＨＰＶ ４
３ ＤＮＡ、ＨＰＶ ４４ ＤＮＡまたはＨＰＶ Ｃ５
７ ＤＮＡは、それぞれ、ＨＰＶ ３５のゲノムの実質
的にすべて、ＨＰＶ ４３のゲノムの実質的にすべて、
ＨＰＶ ４４のゲノムの実質的にすべて、またはＨＰＶ
Ｃ５７のゲノムの実質的にすべてからなる上記第８３
項記載の方法。
【０２４５】８７．前記マーカーは放射性マーカーであ
る上記第８３項記載の方法。
【０２４６】８８．前記マーカーは32Ｐ、14Ｃ、3Ｈ、
125Ｉおよび35Ｓから選択される放射性マーカーである
上記第８７項記載の方法。
【０２４７】８９．前記マーカーはビオチン、酵素およ
び蛍光性分子から成る群より選択される非放射性マーカ
ーである上記第８３項記載の方法。
【０２４８】９０．前記酵素はアルカリ性ホスファター
ゼおよびセイヨウワサビペルオキシダーゼから成る群よ
り選択される上記第８９項記載の方法。
【０２４９】９１．前記蛍光性分子はフルオレセインま
たはローダミンから成る群より選択される上記第８９項
記載の方法。
【０２５０】９２．性器の病変からのＤＮＡまたはＲＮ
Ａの前記未知の試料を、上皮の病変の生検、頚のこす
り、または頚のスワッビングによって剥脱された細胞を
得ることによって得るか、あるいはクローニングベクタ
ー中でクローニングされた性器の病変から誘導されたＤ
ＮＡである上記第８３項記載の方法。
【０２５１】９３．前記交差ハイブリダイゼーションは
ＤＮＡ−ＤＮＡ雑種を産生する上記第８３項記載の方
法。
【０２５２】９４．前記交差ハイブリダイゼーションは
ＤＮＡ−ＲＮＡ雑種を産生する上記第８３項記載の方
法。
【図面の簡単な説明】
【図１】ＨＰＶ ３５ ＤＮＡの制限ヌクレアーゼ地図
を示す。次のコードを使用して制限酵素部位を表わす：
Ｂ１、ＢamＨＩ；Ｅ５、ＥcoＲＶ；Ｈ３、ＨindＩＩ
Ｉ；Ｐ１、ＰstＩ；Ｐ２、ＰstＩＩ；およびＳ１、Ｓph
Ｉ。
【図２】ストリンジェントでないハイブリダイゼーショ
ン条件下の核酸のハイブリダイゼーションによって決定
した、ＨＶＰ ６とＨＰＶ ３５ ＤＮＡとの間の部分
的相同性の領域を示す。矢印は相同性を示す領域を接続
する。破線の矢印は、弱い相同性のみを有する領域を示
す。ＨＶＰ ６の最小のＢamＨＩ−ＰstＩの断片は、Ｈ
ＰＶ ３５に対してハイブリダイゼーションしなかっ
た。図１における地図の各々は、直線の地図の端がＨＶ
Ｐ ６のＨpaＩ部位の相対的位置に相当するように配置
されている。ＨＶＰ ６について推定したオープンフレ
ームの位置は相同性の地図より上に示されている。
【図３】表１に基づく種々の病変におけるＨＰＶのタイ
プの分布をグラフで示す。
【図４】ＨＰＶ ４３ ＤＮＡの制限ヌクレアーゼ地図
を示す。
【図５】ストリンジェントでないハイブリダイゼーショ
ン条件下の核酸のハイブリダイゼーションによって決定
した、ＨＶＰ ６とＨＰＶ ４３ ＤＮＡとの間の部分
的相同性の領域を示す。矢印は相同性を示す領域を接続
する。図５中の地図の各々は、直線の地図の端がＨＶＰ
６のＨpaＩ部位の相対的位置に相当するように配置さ
れている。ＨＶＰ ６について推定したオープンフレー
ムの位置は相同性の地図より上に示されている。
【図６】表２に基づく種々の病変におけるＨＰＶのタイ
プの分布をグラフで示す。
【図７】ＨＰＶ ４４ ＤＮＡの制限ヌクレアーゼ地図
を示す。
【図８】ストリンジェントでないハイブリダイゼーショ
ン条件下の核酸のハイブリダイゼーションによって決定
した、ＨＶＰ ６とＨＰＶ ４４ ＤＮＡとの間の部分
的相同性の領域を示す。矢印は相同性を示す領域を接続
する。破線の矢印は、弱い相同性のみを有する領域を示
す。図８中の地図の各々は、直線の地図の端がＨＶＰ
６のＨpaＩ部位の相対的位置に相当するように配置され
ている。ＨＶＰ６について推定したオープンフレームの
位置は相同性の地図より上に示されている。
【図９】表３に基づく種々の病変におけるＨＰＶのタイ
プの分布をグラフで示す。
【図１０】ＨＰＶ Ｃ５７ ＤＮＡの制限ヌクレアーゼ
地図を示す。
【図１１】ストリンジェントでないハイブリダイゼーシ
ョン条件下の核酸のハイブリダイゼーションによって決
定した、ＨＶＰ ６とＨＰＶ Ｃ５７ ＤＮＡとの間の
部分的相同性の領域を示す。矢印は相同性を示す領域を
接続する。図１１中の地図の各々は、直線の地図の端が
ＨＶＰ ６のＨpaＩ部位の相対的位置に相当するように
配置されている。ＨＶＰ ６について推定したオープン
フレームの位置は相同性の地図より上に示されている。
【図１２】表４に基づく種々の病変におけるＨＰＶのタ
イプの分布をグラフで示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (31)優先権主張番号 ０６０８８３ (32)優先日 昭和62年６月12日(1987．6．12) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号 １１４９８５ (32)優先日 昭和62年10月30日(1987．10．30) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） 微生物の受託番号 ＡＴＣＣ ４０３３８ 微生物の受託番号 ＡＴＣＣ ４０３３９ (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12N 15/00 - 15/90 C12Q 1/68 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (9)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 クローニングベクターおよびＨＰＶ ４
    ３ ＤＮＡまたはその断片を含んでなり、該ＨＰＶ ４３
    ＤＮＡはＨＰＶ ４３ クローン２Ａおよび２Ｂ（それ
    ぞれＡＴＣＣ Ｎｏ.４０３３８およびＡＴＣＣ Ｎｏ.４
    ０３３９）のＨＰＶ ＤＮＡ（ここで、ＨＰＶ ４３
    クローン２Ａおよび２Ｂ中のＨＰＶ ＤＮＡは、それぞ
    れ、プラスミドｐＴ７１３の単一のＢａｍＨＩまたはＨ
    ｉｎｄＩＩＩ部位に挿入されたＢａｍＨＩまたはＨｉｎ
    ｄＩＩＩ断片である）と同一の塩基配列を有するもので
    あり、そして該断片は少なくとも１５塩基対の大きさを
    有し且つストリンジエントな条件下にＨＰＶ ４３ Ｄ
    ＮＡのみにハイブリダイゼーシヨンするものであること
    を特徴とするＨＰＶ ４３の組換えＤＮＡ。
  2. 【請求項２】 ＨＰＶ ４３ クローン２Ａおよび２Ｂ
    （それぞれＡＴＣＣＮｏ.４０３３８およびＡＴＣＣ Ｎ
    ｏ.４０３３９）のＨＰＶ ＤＮＡ（ここで、ＨＰＶ
    ４３ クローン２Ａおよび２Ｂ中のＨＰＶ ＤＮＡは、
    それぞれ、プラスミドｐＴ７１３の単一のＢａｍＨＩま
    たはＨｉｎｄＩＩＩ部位に挿入されたＢａｍＨＩまたは
    ＨｉｎｄＩＩＩ断片である）と同一の塩基配列を有する
    実質的に純粋なＨＰＶ ４３ ＤＮＡまたは少なくとも１
    ５塩基対の大きさを有し且つストリンジエントな条件下
    にＨＰＶ ４３ ＤＮＡのみにハイブリダイゼーシヨン
    するその断片。
  3. 【請求項３】 請求項２に記載のＨＰＶ ４３ ＤＮＡま
    たはその断片に相補的で実質的に純粋なＨＰＶ ４３ Ｒ
    ＮＡまたはその断片。
  4. 【請求項４】 （ｉ）マーカーで標識された、ＨＰＶ
    ４３ クローン２Ａおよび２Ｂ（それぞれＡＴＣＣ Ｎ
    ｏ.４０３３８およびＡＴＣＣ Ｎｏ.４０３３９）のＨ
    ＰＶ ＤＮＡ（ここで、ＨＰＶ ４３ クローン２Ａお
    よび２Ｂ中のＨＰＶ ＤＮＡは、それぞれ、プラスミド
    ｐＴ７１３の単一のＢａｍＨＩまたはＨｉｎｄＩＩＩ部
    位に挿入されたＢａｍＨＩまたはＨｉｎｄＩＩＩ断片で
    ある）と同一の塩基配列を有するＨＰＶ ４３ ＤＮＡま
    たは少なくとも１５塩基対の大きさを有し且つストリン
    ジエントな条件下にＨＰＶ ４３ ＤＮＡのみにハイブ
    リダイゼーシヨンするその断片および（ｉｉ）マーカー
    で標識された、上記ＨＰＶ４３ ＤＮＡまたはその断片
    と相補的なＨＰＶ ４３ ＲＮＡまたはその断片よりなる
    群から選ばれる一員からなるＨＰＶハイブリダイゼーシ
    ヨンプローブ。
  5. 【請求項５】 （ａ） （ｉ）マーカーで標識された、
    ＨＰＶ ４３ クローン２Ａおよび２Ｂ（それぞれＡＴＣ
    Ｃ Ｎｏ.４０３３８およびＡＴＣＣ Ｎｏ.４０３３９）
    のＨＰＶ ＤＮＡ（ここで、ＨＰＶ ４３ クローン２
    Ａおよび２Ｂ中のＨＰＶ ＤＮＡは、それぞれ、プラス
    ミドｐＴ７１３の単一のＢａｍＨＩまたはＨｉｎｄＩＩ
    Ｉ部位に挿入されたＢａｍＨＩまたはＨｉｎｄＩＩＩ断
    片である）と同一の塩基配列を有するＨＰＶ ４３ ＤＮ
    Ａまたは少なくとも１５塩基対の大きさを有し且つスト
    リンジエントな条件下にＨＰＶ ４３ ＤＮＡのみにハ
    イブリダイゼーシヨンするその断片および（ｉｉ）マー
    カーで標識された、上記ＨＰＶ ４３ ＤＮＡまたはその
    断片と相補的なＨＰＶ ４３ ＲＮＡまたはその断片よ
    りなる群から選ばれる一員、並びに （ｂ） マーカーで標識された少なくとも１つの他のＨ
    ＰＶタイプのＤＮＡもしくはＲＮＡまたはその断片から
    なるＨＰＶハイブリダイゼーシヨンプローブ組成物。
  6. 【請求項６】 （１） ストリンジエントでない条件下
    に、 （ａ）（ｉ） マーカーで標識された、ＨＰＶ ４３ ク
    ローン２Ａおよび２Ｂ（それぞれＡＴＣＣ Ｎｏ.４０３
    ３８およびＡＴＣＣ Ｎｏ.４０３３９）のＨＰＶ ＤＮ
    Ａ（ここで、ＨＰＶ ４３ クローン２Ａおよび２Ｂ中
    のＨＰＶＤＮＡは、それぞれ、プラスミドｐＴ７１３の
    単一のＢａｍＨＩまたはＨｉｎｄＩＩＩ部位に挿入され
    たＢａｍＨＩまたはＨｉｎｄＩＩＩ断片である）と同一
    の塩基配列を有するＨＰＶ ４３ ＤＮＡまたは少なくと
    も１５塩基対の大きさを有し且つストリンジエントな条
    件下にＨＰＶ ４３ ＤＮＡのみにハイブリダイゼーシ
    ヨンするその断片、および （ii） マーカーで標識された、上記ＨＰＶ ４３ ＤＮ
    Ａまたはその断片と相補的なＨＰＶ ４３ ＲＮＡまたは
    その断片よりなる群から選ばれる一員と （ｂ） 未知のＤＮＡまたはＲＮＡ試料を用いてハイブ
    リダイゼーシヨンを行ない、 （２） 交差ハイブリダイゼーシヨンの存在についてア
    ツセイして、該試料中のＨＰＶ ＤＮＡまたはＲＮＡを
    検出することを特徴とするＨＰＶ ＤＮＡまたはＲＮＡ
    の検出方法。
  7. 【請求項７】 （１） ストリンジエントでない条件下
    に、 （ａ）（ｉ） マーカーで標識された、ＨＰＶ ４３ ク
    ローン２Ａおよび２Ｂ（それぞれＡＴＣＣ Ｎｏ.４０３
    ３８およびＡＴＣＣ Ｎｏ.４０３３９）のＨＰＶ ＤＮ
    Ａ（ここで、ＨＰＶ ４３ クローン２Ａおよび２Ｂ中
    のＨＰＶＤＮＡは、それぞれ、プラスミドｐＴ７１３の
    単一のＢａｍＨＩまたはＨｉｎｄＩＩＩ部位に挿入され
    たＢａｍＨＩまたはＨｉｎｄＩＩＩ断片である）と同一
    の塩基配列を有するＨＰＶ ４３ ＤＮＡまたは少なくと
    も１５塩基対の大きさを有し且つストリンジエントな条
    件下にＨＰＶ ４３ ＤＮＡのみにハイブリダイゼーシ
    ヨンするその断片、および （ii） マーカーで標識された、上記ＨＰＶ ４３ ＤＮ
    Ａまたはその断片と相補的なＨＰＶ ４３ ＲＮＡまたは
    その断片よりなる群から選ばれる一員と （ｂ） 未知のＤＮＡまたはＲＮＡ試料と （ｃ） （ｉ）マーカーで標識されたＨＰＶ ６ ＤＮＡ
    またはその断片および（ii）マーカーで標識されたＨＰ
    Ｖ ６ ＲＮＡまたはその断片よりなる群から選ばれる一
    員；（ｉ）マーカーで標識されたＨＰＶ １１ ＤＮＡま
    たはその断片および（ii）マーカーで標識されたＨＰＶ
    １１ ＲＮＡまたはその断片よりなる群から選ばれる一
    員；（ｉ）マーカーで標識されたＨＰＶ １６ ＤＮＡま
    たはその断片および（ii）マーカーで標識されたＨＰＶ
    １６ ＲＮＡまたはその断片よりなる群から選ばれる一
    員；および（ｉ）マーカーで標識されたＨＰＶ １８Ｄ
    ＮＡまたはその断片および（ii）マーカーで標識された
    ＨＰＶ １８ ＲＮＡまたはその断片よりなる群から選ば
    れる一員、 の少なくとも１種を用いてハイブリダイゼーシヨンを行
    ない、 （２） 交差ハイブリダイゼーシヨンの存在についてア
    ツセイして、該試料中のＨＰＶ ＤＮＡまたはＲＮＡを
    検出することを特徴とするＨＰＶ ＤＮＡまたはＲＮＡ
    の検出方法。
  8. 【請求項８】 （１） ストリンジエントな条件下に、 （ａ）（ｉ） マーカーで標識された、ＨＰＶ ４３ ク
    ローン２Ａおよび２Ｂ（それぞれＡＴＣＣ Ｎｏ.４０３
    ３８およびＡＴＣＣ Ｎｏ.４０３３９）のＨＰＶ ＤＮ
    Ａ（ここで、ＨＰＶ ４３ クローン２Ａおよび２Ｂ中
    のＨＰＶＤＮＡは、それぞれ、プラスミドｐＴ７１３の
    単一のＢａｍＨＩまたはＨｉｎｄＩＩＩ部位に挿入され
    たＢａｍＨＩまたはＨｉｎｄＩＩＩ断片である）と同一
    の塩基配列を有するＨＰＶ ４３ ＤＮＡまたは少なくと
    も１５塩基対の大きさを有し且つストリンジエントな条
    件下にＨＰＶ ４３ ＤＮＡのみにハイブリダイゼーシ
    ヨンするその断片、および （ii） マーカーで標識された、上記ＨＰＶ ４３ ＤＮ
    Ａまたはその断片と相補的なＨＰＶ ４３ ＲＮＡまたは
    その断片よりなる群から選ばれる一員と （ｂ） 未知のＤＮＡまたはＲＮＡ試料を用いてハイブ
    リダイゼーシヨンを行ない、 （２） 交差ハイブリダイゼーシヨンの存在についてア
    ツセイして、該試料中のＨＰＶ ４３ ＤＮＡまたはＲ
    ＮＡを検出することを特徴とするＨＰＶ ４３ ＤＮＡま
    たはＲＮＡの検出方法。
  9. 【請求項９】 （１） ストリンジエントな条件下に、 （ａ） 頸部癌への疫学的進行を示す性器病変のサンプ
    リングの各個々の性器病変から誘導されたＤＮＡまたは
    ＲＮＡの第１の分画、並びに （ｂ）（ｉ） マーカーで標識された、ＨＰＶ ４３ ク
    ローン２Ａおよび２Ｂ（それぞれＡＴＣＣ Ｎｏ.４０３
    ３８およびＡＴＣＣ Ｎｏ.４０３３９）のＨＰＶ ＤＮ
    Ａ（ここで、ＨＰＶ ４３ クローン２Ａおよび２Ｂ中
    のＨＰＶＤＮＡは、それぞれ、プラスミドｐＴ７１３の
    単一のＢａｍＨＩまたはＨｉｎｄＩＩＩ部位に挿入され
    たＢａｍＨＩまたはＨｉｎｄＩＩＩ断片である）と同一
    の塩基配列を有するＨＰＶ ４３ ＤＮＡまたは少なくと
    も１５塩基対の大きさを有し且つストリンジエントな条
    件下にＨＰＶ ４３ ＤＮＡのみにハイブリダイゼーシ
    ヨンするその断片、および （ii） マーカーで標識された、上記ＨＰＶ ４３ ＤＮ
    Ａまたはその断片と相補的なＨＰＶ ４３ ＲＮＡまたは
    その断片よりなる群から選ばれる一員を用いてハイブリ
    ダイゼーシヨンを行ない、 そして性器病変の該サンプリングの各個々の性器病変か
    ら誘導されたＤＮＡまたはＲＮＡとの交差ハイブリダイ
    ゼーシヨンについてアツセイし、 （２） ストリンジエントな条件下に、 （ａ） 性器病変の該サンプリングの各個々の性器病変
    から誘導されたＤＮＡまたはＲＮＡの第２の分画、およ
    び （ｂ） マーカーで標識された性器病変から誘導された
    未知のＤＮＡまたはＲＮＡの試料を用いてハイブリダイ
    ゼーシヨンを行ない、 そして性器病変の該サンプリングの各個々の性器病変か
    ら誘導されたＤＮＡまたはＲＮＡとの交差ハイブリダイ
    ゼーシヨンの存在についてアツセイし、 （３） 段階（１）で得られる性器病変の該サンプリン
    グの交差ハイブリダイゼーシヨンの全パターンを段階
    （２）で得られるものと比較し、 （４） 段階（１）で得られる性器病変の該サンプリン
    グの各個々の性器病変の交差ハイブリダイゼーシヨンを
    段階（２）で得られるものと比較し、 ここで、（ｉ）性器病変の該サンプリングの交差ハイブ
    リダイゼーシヨンの全パターンが本質的に同じであり、
    且つ（ii）性器病変の該サンプリングの各個々の性器病
    変の交差ハイブリダイゼーシヨンが本質的に同じである
    場合に、未知試料中のＨＰＶ ４３ ＤＮＡまたはＲＮＡ
    の存在が検出されることを特徴とするＨＰＶ ４３ ＤＮ
    ＡまたはＲＮＡの検出方法。
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