JP3176916B2 - 同一のｎ末端を有する塩基性繊維芽細胞増殖因子の高レベル発現 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 技術分野 本発明は、増殖因子の組み換え生産の分野に関する。
特に、本発明は、同一のＮ末端を有するヒト塩基性繊維
芽細胞増殖因子の生産に関する。本発明は、同一のＮ末
端を有するヒト塩基性繊維芽細胞増殖因子の高レベルな
発現および回収の手段および方法を提供する。

発明の背景 塩基性繊維芽細胞増殖因子（bFGF）は、毛細管内皮細
胞を含む広範囲な細胞型において強力なマイトジェン活
性を発現するタンパク質である。ウシの下垂体由来のbF
GFの完全なアミノ酸配列が決定されている（Esch,F.
ら、Proc Natl Acad Sci（USA）（1985）82:6507）。ヒ
トbFGFをコードするクローニングされたDNA配列は単離
され、そのアミノ酸配列のヒトタンパク質を131−、146
−および154−アミノ酸形態は決定されている（1987年
３月26日にWO 87/01728として公開されているPCT出願US
86/01879、Abraham,J.ら、Science（1986）233:545、Ab
raham,J.ら、The EMBO Journal（1986）５:2523）。ク
ローニングされたDNA配列を分析すると、可能な開始メ
チオニンコドンが、bFGFの154−アミノ酸形態のコーデ
ィング配列のすぐ上流側に存在することが示され、この
ことは、（ｉ）この遺伝子からの一次翻訳産物の長さが
155個の残基で、（ii）154−アミノ酸形態が、開始メチ
オニンの翻訳後除去によって得られることを示してい
る。次いて、Florkiewicz、R.およびSommer,A.（Proc N
atl Acad Sci（USA）（1989）86:3978−3981）およびPr
ats,H.ら、（Proc Natl Acad Sci（USA）（1989）86:18
36−1840）は、155−残基一次翻訳産物のメチオニン開
始コドンの上流側に存在するロイシンコドンにおける、
代替翻訳開始の結果として生産され得る、より長い形態
のbFGFの存在を報告した。

部分的には、毛細管内皮細胞における強力なマイトジ
ェン活性のために、bFGFは、血管形成、すなわち新しい
毛細血管を形成する工程を促進する。従って、bFGFは、
創傷が適切に治癒する場合の、新しい毛細血管床の形成
が必要であるときに、創傷治癒剤として非常に有用であ
る。

ヒトbFGFをコードする、単離されクローニングされた
DNA配列を入手することにっよって、組み換えDNA技術を
用いて、これらの配列を含む発現ベクターで形質転換さ
れた宿主細胞においてタンパク質を発現し、そのタンパ
ク質を臨床的使用のために回収することが可能になっ
た。Ｎ末端メチオニンをプロセシングし得る原核および
真核宿主において、ヒトbFGFおよびウシの等価物の155
−残基一次翻訳産物を発現させることにより、微小不均
一性のＮ末端を有するタンパク質が生産されることが観
察されている（例えば、Barr、Philip J.ら、J Biol Ch
em（1988）263（31）:16471の参照のこと）。E.coliに
おいてヒトbFGFの155−残基一次翻訳産物を発現させる
と、約70/30の比で、混合Ｎ末端配列Ala−Ala−Gly−Se
r−Ile−/Ala−Gly−Ser−Ile−を有するタンパク質が
回収されることを一貫して観察してきた。この微小不均
一性は、分子の生物活性に影響を与えないようである
が、一般に、臨床用には、同一の物性、すなわち、分子
真で実質的に同一のＮ末端配列を有するタンパク質を得
ることが望まれると考えられる。

発明の要旨 本発明は、実質的に同一のＮ末端を有するヒトbFGFの
高レベルな発現の方法および手段を提供する。「実質的
に同一」とは、Edman分解法による配列分析によって、b
FGFが、95％、好ましくは98％より多くの、同一Ｎ末端
を有する物質を含むことが示されることを意味する。本
発明は、ヒトbFGFの155−アミノ酸一次翻訳産物のＮ末
端メチオニン残基の直後にある２つのアラニン残基の一
つをコードするコドンが欠失すると、Ｎ末端が同一のヒ
トbFGFタンパク質が発現および回収されるという発見に
基づいている。特に、Ｎ末端メチオニンの翻訳後プロセ
シングに次いで、同一なＮ末端配列Ala−Gly−Ser−を
有する長さが153個のアミノ酸のヒトbFGFが生産され
る。さらに、以下の実施例３および５におけるE.coli発
現ベクターを用いて、Alaが欠失した配列が発現する
と、その発現レベルは、Alaを決失していない対応のタ
ンパク質配列の発現レベルよりもおよび50％から100％
高くなることが発見されている。

従って、本発明により同一のＮ末端を有するヒトbFGF
を生産する方法が提供され、該方法は、Ｎ末端メチオニ
ンを翻訳後除去し得る宿主細胞において、Ｎ末端メチオ
ニンの直後に存在する２つのアラニン残基のうちの１つ
の残基のコドンが欠失している、ヒトbFGFの155−アミ
ノ酸形態のアミノ酸配列がコードするDNA配列を発現す
る工程と、そのタンパク質を回収する工程と、を包含す
る。また、同一のＮ末端を有するヒト塩基性FGFの高レ
ベルな発現および回収のためのベクターが提供される。
このベクターは、ヒトbFGFの155−アミノ酸形態をコー
ドするDNA配列を含み、このDNA配列からは、Ｎ末端メチ
オニンの直後にある２つのアラニンのうちの１つのアラ
ニンのコドンが欠失しており、該DNA配列は、宿主細胞
においてその発現を方向づけ得る制御配列に、作動可能
なように連結される。さらに、Ｎ末端配列Ala−Gly−Se
r−を有するヒトbFGF配列の153個のアミノ酸を有する同
一のタンパク質を含むヒトbFGF組成物が提供される。

図面の簡単な説明 図1Aは、ヒトbFGFコードする単離された天然のcDNA配
列、ならびに155−残基一次翻訳産物の推定アミノ酸配
列を示す（配列番号１および配列番号２）。図1Bは、ウ
シbFGFコードする単離された天然のcDNA配列、ならびに
155−残基一次翻訳産物の推定アミノ酸配列を示す（配
列番号３および配列番号４）。

図２は、bFGFをコードするDNA配列を示す（配列番号
５および配列番号６）。このDNA配列は、図1Bのウシ配
列の５′末端の部分（図示されているHha I部位から上
流）を、天然のウシ配列と比較してＧ＋Ｃの含有量が少
ない合成DNA配列と置き換え、Ｎ末端メチオニンの直後
にある２つのアラニン残基のうち１つの残基のコドンを
欠失させ、図1Bのコドン121および137を、それぞれACC
およびTCCに変換させ、cDNA配列が（ｉ）Ｎ末端アラニ
ンの１つを欠失しているヒトbFGFをコードし、（ii）そ
の５′および３′末端を、それぞれNde I部位およびHin
III部位ではさまれるように、翻訳終止コドンの３′側
にHind III制御エンドヌクレアーゼ部位を形成すること
によって、生産された。

図３は、本発明のDNA配列の制御発現に使用されるtrp
プロモーター／オペレーター配列（Ｂ）（配列番号９お
よび配列番号10）を結合することにより形成した、一連
の合成オリゴデオキシヌクレオチド（Ａ）（配列番号７
および配列番号８）を示す。

図４は、ヒトbFGFをコードするDNA配列が挿入されてp
TsF11を形成する、pTrp−233の構築を示す。

図５は、ヒトbFGFの発現ベクターである、pTsF−９Δ
βgalの調製を模式的に示す。

図６は、bFGF（MAGS）コーディング配列の挿入に適し
た発現ベクターである、pTsF−９Δβgal−GM−２の調
製を模式的に示す。

図７は、クーマシーブルーで染色したSDS−PAGEゲル
の写真である。このゲル上では、ヒトbFGFをコードする
DNA配列で形質転換されたE.coliの発現産物が、ヒトbFG
Fのアラニン欠失形態をコードする本発明のDNA配列で形
質転換されたE.coliの発現産物に沿って電気泳動され
た。

図8A、8B、8Cおよび8Dは、図７のSDS−PAGEゲルのレ
ーン２から５におけるそれぞれのタンパク質の一連の走
査デンシトメトリーによるプロットである。

発明の詳細な説明 本発明は、ヒトbFGFの155−アミン酸前駆体をコード
し、Ｎ末端メチオニンのすぐ後ろの２つのアラニン残基
のうち１つのアラニン残基のコドンを欠失しているDNA
配列を使用する。以下では、ヒトbFGFをコードし改変さ
れた形を、一次翻訳産物がＮ末端配列Met−Ala−Gly−S
er−有することを示すために「bFGF（MAGS）」と表す。
このヒトbFGFおよびウシbFGFの155−残基形態のアミン
酸配列を、図1Aおよび図1Bにそれぞれ示す。図1Aおよび
図1Bに示されるDNA配列は、ここに参考として援用され
ているPCT公報第WO 87/01728号に記載のように決定され
た、天然のコーディング配列である。これらの配列のい
ずれかが、部位特異的変異誘発（Zoller,M.J.,およびSm
ith,M.,Nucleic Acids Res（1982）10:6487およびAdelm
a,J.P.ら.,DNA（1983）２:183）によって改変され得、
Ｎ末端メチオニンのすぐ後のアラニン残基の１つを欠い
たヒトbFGFの類似体をコードするDNAを生産する。周知
のDNAコードの変性により、他のDNA配列がＮ末端アラニ
ン残基の１つを欠く所望のヒトbFGF配列をコードする場
合は、そのDNA配列が使用し得ることが理解される。好
適な実施態様においては、アラニン残基を有しないヒト
bFGFをコードするDNA配列が提供される。このような実
施態様では、アラニン残基を欠くヒトbFGFをコードして
いるDNA配列が提供され、そこでは分子のＮ末端末端部
をコードするDNAの実質的な部分が、天然のDNA配列と比
較するとＧ＋Ｃが有量が減少しているように改変され
る。

所望するならば、bFGF（MAGS）をコードするDNA配列
全体は、重複する合成オリゴヌクレオチドを連結するこ
とによって合成的に生産され、このように連結されて所
望のDNA配列全体を形成する。個々のオリゴヌクレオチ
ドは、Edge,ら,Nature（1981）292:756およびDuckwort
h,ら,Nucleic Acids Res（1981）９:1691に記載のホス
ホトリエステル法またはBeaucage,S.L.およびCaruther
s,M.H.,Tet Letts（1981）22:1859およびMatteucci,M.
D.およびCaruthers,M.H.,J Am Chem Soc（1981）103:31
85に記載のホスホルアミダイト法によって調製し得、市
販で入手可能な自動オリゴヌクレオチド合成機によって
も調製し得る。このアプローチはかなりの長さの遺伝子
全体を合成するために効果的に用いられている。

好ましくは、bFGF（MAGS）をコードするDNA配列は、
ヒトbFGFの155−アミノ酸前駆体全長をコードするDNA配
列のＮ末端アラニンコドンの１つを取り除くための、部
位特異的変異誘発によって生産される。部位特異的変異
誘発は、上記Zoller,M.J.およびSmith,M.および上記Ade
lman,J.P.に開示されている工程を用いて行ない得る。
変異誘発は、ヒトbFGFの155−アミノ酸配列をコードす
る一本鎖DNA（バクテリオファージM13の誘導体に含まれ
る）上で、限定された誤対合を除き所望する変異（即
ち、ATG出発（メチオニン）コドンのすぐ後ろのアラニ
ンコドンの１つを欠失）を示す一本鎖DNAに相補的な合
成オリゴヌクレオチドプライマーを使用して行なわれ
る。

オリゴヌクレオチドプライマーの大きさは、変異が誘
発される遺伝子領域へプライマーが安定してハイブリダ
イズする必要性および現在使用可能なオリゴヌクレオチ
ド合成法の限界により決定される。オリゴヌクレオチド
特異性の変異において用いられるオリゴヌクレオチドを
デザインする際に考慮されるべき事柄（例えば、変異部
位をはさむ部分の長さ、全体の長さ）は、Smith,Mおよ
びGillam,S.によるGenetic Engineering:Principles an
d Methods,Plenum Press（1981）3:1−32に記載されて
いる。一般的に、オリゴヌクレオチドの全体の長さは、
変異部位からの５′および３′伸長部がDNAポリメタラ
ーゼのエキソヌレアーゼ活性による変異の修正を回避す
るのに充分な長さであり、変異部位において、安定かつ
固有のハイブリダイゼーションを最適に行えるものであ
る。本発明にしたがって変異誘発に用いられるオリゴヌ
クレオチドは、通常、約18から約45の塩基を有し、好ま
しくは約23から約27の塩基を有する。それらは変化した
または欠失したコドンの３′側に少なくとも約９個の塩
基を有する。

アラニン残基の１つのコドンを欠く合成ヌクレオチド
プライマーは、155−アミノ酸pFGFをコードするDNA配列
の鎖がクローニングされたM13,fd、またはφX174のよう
な一本鎖ファージにハイブリダイズされる。ファージが
遺伝子のセンス鎖またはアンチセンス鎖のいずれかを有
し得ることが好ましい。ファージがアンチセンス鎖を有
する場合は、プライマーは、欠失するアラニンを指定す
るコドンの欠失を除いて、変異する領域のコーディング
配列と同一である。ファージがセンス鎖を有する場合
は、プライマーは、欠失するアラニン残基をコードする
ものと相補的であるトリプレットの欠失を除いて、変異
する領域のコーディング配列と相補的である。

ハイブリダイゼーションにおいて使用し得る条件は、
上記Smith,MおよびGillam,S.によって記載されている。
一般に、温度は、約０℃から70℃の間の範囲であり、さ
らに一般的には約10℃から50℃である。ハイブリダイゼ
ーションの後、プライマーは、DNAポリメラーゼＩ（Kle
nowフラグメント）、T₄DNAポリメラーゼ、または他の適
切なDNAポリメラーゼとの反応により、ファージDNA上で
伸長される。得られたdsDNAは、T₄リガーゼのようなDNA
リガーゼで閉環dsDNAに変換される。一本鎖領域を有す
るDNA分子は、S1エンドヌクレアーゼ処理により破壊し
得る。あるいは、部分的二本鎖の調製物は、リガーゼま
たはS1の処理を施さずに直接的に使用し得る。

得られた全部または一部が二本鎖になったDNAは、フ
ァージを保持する宿主バクテリア中に形質転換される。
形質転換されたバクテリアの培養物は寒天表面にプレー
トされ、ファージを有する個々の細胞からのプラーク形
成を可能にする。

理論的には、新しいプラークの50％は、一本鎖に変異
形を有するファージであり;50％はオリジナルの配列を
有している。得られたプラークは、レプリカとしてニト
ロセルロースフィルターまたは他の支持膜の上へ載せら
れた後、洗浄され、変性され、その後キナーゼ処理した
合成プライマーとハイブリタイズされる。洗浄は、正確
なマッチの結合は起こるが、オリジナル鎖とのミスマッ
チが起きるのは防がれるのに充分な温度で実施される。
その後、プローブとハイブリダイズするプラークは取り
出され、培養され、そしてDNAが回収される。

さらに、本発明の範囲内には、アミノ酸配列における
さらなる変化がＮ末端Met−Ala−Gly−Ser−の下流で起
こるアラニンを欠失したヒトbFGFの155−アミノ酸配列
形態の生産が含まれる。ここに参考として援用されてい
るPCT公報第WO89/00198号は、bFGFの多くの類似体を開
示しており、これらの類似体は天然のbFGF配列のアミノ
酸残基が分子特性において効果的な変化を起こすために
他のアミノ酸で置換されている。特に、このPCT公報で
は、ヘパリン結合領域におけるアミノ酸残基が、155残
基一次翻訳産物の128から138までの位置で、中性または
陰性に荷電したアミノ酸残基によって置換されている類
似対を開示している。さらに、１つ以上の天然のシステ
イン残基、好ましくは、155−残基一次翻訳産物の78か
ら96位が、中性アミノ酸残基で置換されている類似体も
開示されている。これらのアミノ酸置換物はいずれも、
本発明のアラニン欠失物と共同させ得る。本発明の範囲
から特別に除外されるのは、PCT WO 89/00198に開示さ
れているbFGFのＮ末端が短くなったものである。Ｎ末端
がMet−Ala−Gly−Ser−であるその下流のアミノ酸配列
の改変は、PCT WO 89/0198に開示されているDNAの部位
特異的変異により行なわれ得、この変異は、アラニンコ
ドンを欠失する変異の前まは後のいずれかで行なわれ得
る。

ヒトbFGF（MAGS）に対応するヒト以外の哺乳類のbFGF
もまた、本発明によって提供し得る。例えば、ウシbFGF
の155−残基前駆体のアミノ酸配列は、ヒト前駆体タン
パク質とアミノ酸残基が２つ異なる。即ち、ウシタンパ
ク質は、121位にThrではなくSerを有しており、137位に
SerではなくProを有している（155−アミノ酸配列に基
づくナンバーリングシステムによる）。このように、ヒ
トbFGF（MAGS）に対応するウシタンパク質をコードする
DNA配列は、図２のDNA配列の変異によって調製し得、12
0番および136番のアミノ酸残基に対応するコドンを変え
る。これは、各コドンにおいて１個のヌクレオチドの変
異により達成される。

bFGF（MAGS）をコードするDNA配列を、適切な発現ベ
クターに挿入し、宿主細胞内のコーディング配列の発現
を指示できる制御配列に作動可能なように結合する。
「制御配列」とは、コーディング配列に適切に結合され
た場合に、その配列をそれが適合する宿主内において発
現される能力を有するDNA配列を示す。そのような制御
配列は、少なくとも原核細胞および真核細胞の両方の宿
主内のプロモーターを含み、そして任意にオペレーター
配列、エンハンサーおよび転写終止シグナルを含む。特
定の宿主において発現を行なう際に必要または有用なさ
らなる因子が使用し得る。「作動可能なように結合し
た」とは、成分が通常の機能を果たすように配置された
並列形態を示す。このように、コーディング配列に作動
可能なように結合した制御配列は、コーディング配列の
発現を行なうことができる。当業者に周知のように、発
現ベクターもまた、使用される宿主細胞内で機能する複
製起点を有し得る。好ましくはベクターは、ベクターを
有する宿主細胞の同定および選択を可能にする抗生物質
耐性の遺伝子のような表現型マーカーも含有する。

発現ベクターは、適切な宿主細胞を形質転換するため
に使用される。原核および真核の両方の宿主が使用し得
る。原核細胞としては非常に頻繁に、E.coliの種々の株
により代表される。しかし、他の微生物株も使用し得
る。E.coliは、ヒトbFGFの155−残基前駆体形態のＮ末
端メチオニン残基を翻訳後プロセシングする能力す有す
る。E.coliの有用な株としては、例えば、MC1061、DH
1、RR1、C600hfl、K803、HB101、JA221、JM101、JM10
3、およびＢを含み、E.coli Ｂが好ましい宿主であ
る。プラスミドベクターとしては、複製領域、選択可能
なマーカーおよび宿主に適合する種由来の制御配列を含
むものが使用される；例えばE.coliは、典型的には２つ
のSalmonella種、およびBolivarら,Gene（1977）２:95
による１つのE.coli株から得られたプラスミド部分を組
み合わせて得られたラスミドである、pBR322由来のベク
ターを用いて形質変換される。pBR322は、アンピシリン
とテトラサイクリン耐性の遺伝子を有し、所望されるベ
クターを構築する際に維持または破壊し得る、複数の選
択可能なマーカーを提供する。本明細書で定義される、
リボソーム結合部位配列と共に、任意にオペレーターを
有し、転写を開始するためのプロモーターを含む一般的
に用いられる原核細胞の制御配列には、β−ラクタマー
ゼ（ペニシリナーゼ）およびラクトース（lac）プロモ
ーターシステム（Changら,Nature（1977）198:1056）、
トリプトファン（trp）プロモーターシステム（Goeddel
ら,Nucleic Acids Res（1980）８:4057）、Ｎ遺伝子リ
ボソーム結合部位を有するラムダ由来のP_Lプロモーター
（Shimatakeら,Nature（1981）292:128）、およびtrp−
lac（trc）プロモーターシステム（Amann,E.およびBros
ius,J.,Gene（1985）40:183）のような一般的に使用さ
れるプロモーターを含む。

細菌に加えて、酵母またはチャイニーズハムスター卵
巣（CHO）細胞のような真核細胞もまた、宿主として使
用し得る。当業者にとっては、種々の真核宿主との組み
合わせに有用な制御配列、複数起点、マーカーなどは周
知である。

bFGF（MAGS）のコーディング配列を含む発現ベクター
を、宿主細胞を形質転換するために使用する。使用する
宿主細胞に依存して、その細胞に適切な標準的技術を用
いて形質転換を行なう。Cohen,S.N.,Proc Natl Acad Sc
i（USA）（1972）69:2110に記載の塩化カルシウムを使
用したカルシウム処理またはManiatisら、Molecular Cl
oning:A Laboratory Manual（1982）Cold Spring harbo
r Press,254ページおよびHanahan,D.,J Mol Biol（198
3）166:557−580に記載のRbCl₂法が、原核細胞または実
質的に細胞壁バリアを有する他の細胞に使用し得る。そ
のような細胞壁を持たない哺乳類の細胞には、Grahamお
よびvan der Eb,Virology（1978）52:546のリン酸カル
シウム沈澱法が使用し得、任意にWigler,M.ら、Cell（1
979）16:777−785によって改変された方法が使用し得
る。酵母への形質転換は、Beggs,J.D.,Nature（1978）2
75:104−109またはHinnen,A.,ら,Proc Natl Acad Sci
（USA）（1978）75:1929の方法により実施し得る。

bFGF（MAGS）発現ベクターを有する形質転換体は、ベ
クター構築の際組み込まれる特定の表現型マーカーに依
存して、周知の技術によって同定し得る。即ち、アンピ
シリンのような抗生物質の存在下での成長によって同定
する。制限酵素分析またはジデオキシ法による配列決定
のような種々の周知技術は、正しいベクター構築を確認
するために使用し得る。

bFGF（MAGS）の発現は、特定のベクター構築と使用す
る宿主細胞に大きく依存し、当業者には容易に理解され
る条件下で行ない得る。ベクターが、trpプロモーター
のような誘導プロモーターの制御下にbFGF（MAGS）のDN
A配列を有する場合には、形質転換された宿主細胞を適
切な成長媒体に植菌し、至適密度まで増殖するように使
用し得；制御プロモーターからのbFGF（MAGS）の発現
は、その後、適切なインデューサー（例えばtrpプロモ
ーターの場合は、３−β−インドールアクリル酸）の付
加によって誘導し得る。発現したbFGF（MAGS）は、天然
源からのbFGFの精製技術で使用される周知の技術により
回収し得る。好適な精製工程においては、発現したタン
パク質を含む形質転換体を、機械的または化学的に溶解
し、タンパク質を放出させる。DNaseおよびRNaseで処理
した後に、反応物を遠心し、上清を市販で入手可能なヘ
パリン−セファロースカラム（Pharmacia,Inc.）上に負
荷する。カラムを塩濃度が約1.0Mまたはそれ以下のNaCl
緩衝液で洗浄した後、このbFGF（MAGS）は2.0M NaClカ
ラムから溶出し得る。所望されれば、ヘパリン−セファ
ロースクロマトグラフィー段階は、繰り返し得、あるい
はS/P SephadexまたはMono S樹脂上でのイオン交換クロ
マトグラフィーのような他の周知のタンパク質精製段階
と組み合わし得る。工業規模の生産においては、最終の
形態中にわずかな量のヘパリンも含むことは好ましくな
いため、ヘパリン−セファロースクロマトグラフィーよ
りも銅キレートアフィニティクロマトグラフィーが好ま
しい。

極めて驚くべきことに、bFGF（MAGS）がE.coli Bで発
現するとき、その発現レベルは、同一の宿主ベクターシ
ステムおよび同一の発現条件を用いた対応する野生型
（突然変異していない）ヒトbFGFの発現よりも、50％か
ら100％大きいオーダーであることが見い出された。特
に、本発明の方法は、bFGF（MAGS）を、宿主細胞により
発現させたタンパク質全体の少なくとも10％のレベルで
発現させる。さらにＮ末端アミノ酸分析によると、E.co
li BでのbFGF（MAGS）発現により、実質的に同一のＮ末
端を有する最終タンパク質産物が得られることが示さ
れ、即ち、このタンパク質をEdman分解法でＮ末端分析
すると、bFGFの95％以上、好ましくは98％以上が同一Ｎ
末端を有することが示される。E.coliのような原核細胞
宿主は、bFGFのATG出発コドンによりコードされたＮ末
端メチオニン残基を除去できることが分かっている。従
って、本発明の方法によって、Ｎ末端配列がAla−Gly−
Ser−の153アミノ酸残基を有するbFGFが回収される。

本発明により得られるbFGF（MAGS）は、Ｎ末端配列が
Ala−Ala−Gly−Ser−であるか、または混合Ｎ末端を有
し、対応するbFGFと同一の有用性を有している。このbF
GF（MAGS）は、創傷の治癒を促進するために有用であ
る。精製bFGF（MAGS）は、一般に、外傷を負った組織に
血管新生および治癒を促すために、局所的に適用され
る。適切な基質としては、火傷、皮膚潰瘍、形成手術の
ような外科的剥離、または治療を要するその他の創傷部
位がある。bFGF（MAGS）の適用は治療を促すので、感染
の危険性も減少させる。

bFGF（MAGS）が新規の血管新生を促進する有用性があ
る適応症は、骨折、靱帯および腱の修復、腱炎、および
滑液包炎などの筋骨格系の症状；火傷、切傷、裂傷、床
ずれなどの皮膚症状、および糖尿病のような治癒の遅い
潰瘍；および虚血および心筋梗塞下にある組織修復が含
まれる。

組み換え的に生産されたbFGF（MAGS）の、入手可能な
賦形剤およびキャリヤを用いた調合剤は、当業者に周知
の標準的方法により調製される。このタンパク質は、外
用水薬、ゲル、制御放出システムの一部、または所望さ
れれば抗生物質のようなさらなる活性成分を含めた軟膏
として調合し得る。

表面的な部位に最適である局所用投与では、標準的な
局所用調合剤は、例えば、患部表面1cm²あたりに0.1−1
00μｇのbFGF（MAGS）が使用される。そのような溶液
は、患部へイ度のみかあるいは、２から４週間（または
不十分な治療条件ではこれよりも長い期間）の間に１日
２回まで投与する。調合剤中のbFGF（MAGS）および他の
成分の濃度は、もちろん、創傷の種類と重篤度および患
者の体質に依存する。投与量は、傷跡が残らないように
するために経時的に少なくし得る。例えば、３度の火傷
のような最もひどい傷は、bFGF（MAGS）を100μg/cm²の
投与量で治療し得るが、治療開始後、投与量は傷が治る
に従い次第に約0.1μg/cm²またはそれ以下にまで下げ得
る。キャリアとしてBSAを使用するFGFの局所用調合剤
は、Franklin,J.D.ら,Plastic and Reconstruc Surg（1
979）64:766−770に開示されている。

骨および深部軟組織（表面ではない）の修復には、投
与は局所的であるが、注射または直接インプラントした
患部の周辺にゆっくりとした放出形態で投与することが
好ましい。骨の損傷のような症状では手術が必要になり
得、従ってインプランテーションが直接的に適用とな
る。ゆっくりとした放出形態は、Hydron（Langer,R.,
ら.,Nature（1976）263:797−799）またはElvax 40P（D
opont）（Murray,J.B.,ら,In Vitro（1983）19:743−74
7）のようにポリマー中に調合し得る。他の徐放システ
ムは、Hsieh,D.S.T.,ら,J Pharm Sci（1983）72:17−2
2）によって提案され、および特に表皮増殖因子のため
の調合剤は、本発明では好ましくないが、Buckley,A.,
ら,Proc Natl Acad Sci（USA）（1985）82:7340−7344
によって提案されている。

徐放送達の局所的投与では、調合剤中のbFGF（MAGS）
の濃度は、症状の性質や重篤度およびポリマーからのbF
GF（MAGS）の放出速度を含めた多くの要素に依存する。
一般に調合は、Buckleyら（上記Proc Natl Acad Sci（U
SA））に記載のように、組織濃度の約10倍の一定な局所
的濃度を有するように組み立てられる。組織でのbFGF濃
度５−50ng/g湿重量に基づき（60ng/g湿重量であるEGF
と比較し得る）、１時間当り50−5000ngのFGF放出が受
容可能である。もちろん、初期濃度は傷の重篤度に依存
する。

bFGF（MAGS）は、表皮増殖因子（EGF）、トランスフ
ォーミング増殖因子（TGF−αまたはTGF−β）、インシ
ュリン様増殖因子（IGF−１およびIGF−２）、イアミン
（Gly−His−Lysトリペプチド）および／または血小板
由来の増殖因子（PDGF）などの他の増殖因子と共同し
て、および相乗的に、作用し得ることが予測される。さ
らに、特に骨の修復には、上皮小体のホルモンが骨の再
吸収を速めるので、上皮小体ホルモンの拮抗薬と共同し
て作用し得る。そのため、本発明のbFGF（MAGS）が、上
記の１つ以上の因子と組み合わせた同一の組成物によ
り、または同一のプロトコールで投与される実施例は、
本発明の組成物および投与のプロトコールの範囲に含ま
れ、こうして所望される組織修復はさらに効果的に達成
される。

bFGF（MAGS）は、神経突起生長、神経再生、および神
経生存を促進するのに効果的であるため、アルツハイマ
ー病およびパーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、およ
び一般的な神経システムの老化、および脊髄および末梢
神経の損傷のようなある種の神経学的疾患の治療に有用
であり得る。

これらの適応のための薬剤投与は、好ましくは上記創
治療に関連して述べたものと同じ形態でインプラントに
より行われる。この薬剤は、移植療法のような細胞培養
物のインプラントによって、即ち、移植する前に培養物
を本発明のbFGF（MAGS）調製物で処理するか、または組
み換えDNA技術によって細胞をbFGF（MAGS）産生変する
ことにより、送達し得る。さらに、bFGF（MAGS）は、脊
髄液に直接注射し得、または全身的に適用し得る。全身
用調合剤は、一般に従来技術で知られており、緩衝液ま
たは生理食塩水またはその他の適切な賦形剤中の形態を
含む。全身用調合剤の投与レベルは、上記の局所用調合
剤に使用した濃度と同じ局所的濃度で作用組織へ送達し
得る。組織培養または外植片維持には、0.1−10ng/mlの
血清または培養培地が使用し得る。

bFGF（MAGS）は、手術中に受けた傷組織の再形成およ
び修復を助けるために特に有用である。この使用のため
に、bFGF（MAGS）は、外科用留め金として使用されるポ
リマー中に含ませることが有用であり得る。こうしてこ
のタンパク質は、この留め金を用いて行われる機械的縫
合を生物学的に補い、組織の修復において「自然な」治
癒工程を促進し助けることができる。

さらに、ここで議論されているbFGF（MAGS）により与
えられるもののような脈管形成刺激（angiogenic stimu
li）は組織プラスミノーゲン活性因子（tPA）の放出、
およびインビトロでの内皮細胞からのコラゲナーゼ放出
（Gross,J.L.ら,Proc Natl Acad Sci（USA）（1983）8
0:2623）を生じさせる。そのため、本発明のbFGF（MAG
S）もまた、これらの酵素に反応する症状の治療に有用
である。急性の症状（心筋梗塞や心臓発作を伴う血塊の
存在など）においては、血塊を溶かすためにtPAを多量
に直接投与することが必要であり得るが、塞栓を形成す
る慢性的傾向の治療においては、血中に適切なレベルの
tPAを保つためのbFGF（MAGS）投与が所望され得る。そ
のため、この適用には、筋肉内または皮下注射のような
従来の方法を用いる薬剤の全身的投与が好ましい。

以下の実施例は、本発明の実施をさらに示すことを意
図するものであって、本発明の範囲をどのような点にお
いても制限することを意図するものではない。出発物質
として使用するウシbFGFをコードするcDNAは、初めにウ
シゲノムライブラリーをスクリーニングし、重要なプロ
ーブを得ることによって得られ、その後PCT公報WO 87/0
1728に詳述されている別のDNAを回収する。しかし、こ
の重要なプローブの配列、およびウシおよびヒトbFGFの
コーディング領域の配列は周知であり、インビトロで化
学的に構築し得るので、この工程を繰り返す必要はな
い。さらに、ヒトおよびウシbFGFの配列を有するバクテ
リオファージは、American Type Culture Collectionに
寄託されている。従って、下記の実施例において出発物
質として使用されるbFGFのDNA配列は、種々の起源のも
のから入手可能である。

実施例１ pTrp−233細菌発現プラスミドの構築 A.合成トリプトファンオペロンプロモーターおよびオペ
レーター調節配列の構築 図3Aに示す10図のオリゴデオキシヌクレオチドを、ホ
スホトリエステル性によって合成した、精製した。１お
よび10以外のオリゴデオキシヌクレオチド各々500ピコ
モルを、37℃で30分間、60mM Tris−HC1、pH8、15mM DT
T、10mM MgCl₂、［γ−32p］−ATP 20μCiおよびポリヌ
クレオチドキナーゼ（P/L Biochemicals）20ユニットを
含有する溶液20μｌ中で別々にリン酸化した。続いて、
60mM Tris−HCl、pH8、15mM DTT、10mM MgCl₂、15mM AT
Pおよび別のポリヌクレオチドキナーゼ20ユニットを含
有する溶液20μｌを添加し、その後、37℃で30分間、イ
ンキュベートした。インキュベートした後、試料を100
℃で５分間、インキュベートした。オリゴデオキシヌク
レオチド１および10の500ピコモルを、上記緩衝液からA
TPを除いた溶液30μｌ中で希釈した。

二本鎖対を構築するオリゴデオキシヌクレオチド（例
えば、オリゴデオキシヌクレオチド１および２、３およ
び４等、図3A）各々16.7ピコモルを混合し、90℃で２分
間、インキュベートし、その後、ゆっくりと室温まで冷
却した。その後、構築に、各々の対を他の二本鎖対と結
合させ、フェノール／クロロホルムで抽出し、その後、
エタノールで沈澱させた。得られたオリゴデオキシヌク
レオチド対を、5mM Tris−HCl、pH8、10mM MgCl₂、20mM
DTTを含有する溶液30μｌ中で再構築し、50℃で10分間
熱した後、室温まで冷却し、その後、ATPを添加するこ
とにより、最終濃度0.5mMを得た。T4 DNAリガーゼ800ユ
ニットを添加し、得られた混合物を12.5℃で12−16時間
インキュベートした。

連結反応混合物をフェノール／クロロホルムを用いて
抽出し、そのDNAをエタノールで沈澱させた。乾燥したD
NAを、溶液30μｌ中で再構築し、EcoR IおよびPst Iを
用いて37℃で１時間消化した。得られた混合物をフェノ
ール／クロロホルムを用いて抽出し、エタノールで沈澱
させた。その後、Laemmli,Nature（1970）227:680の方
法に従って、８％ポリアクリルアミドゲル上の電気泳動
により、様々な二本鎖DNAセグメントを分離した。加湿
ゲルオートラジオグラフィーによってDNA断片を視覚化
し、長さで約100bpに相当するバンドを切出して、一晩
溶出した。切出した合成DNA断片を、同様にEcoR Iおよ
びPst Iによって消化したプラスミドM13mp8またはM13mp
9（Messing,J.およびVieira,J.,Gene（1982）19:269）
に連結し、得られた物質をジデオキシヌクレオチド配列
分析（Sanger,F.ら、Proc Natl Acad Sci（USA）（197
7）74:5463）することにより、図3Aに示す設計配列を確
認した。正しい配列を含有するM13誘導体をM13−trpと
名付けた。M13−trp中の設計配列は、trpオペロンリー
ダーペプチドのリボソーム結合領域に加えて、プロモー
ター（−35および−10領域）およびトリプトファン（tr
p）オペロンのオペレーター領域を含有する（図3B）。
図3Bに示す配列に類似の配列が、E.coli中における異種
タンパク質の発現に有用であることが証明されている
（Hallewell,R.A.、およびEmtage,S.,Gene（1980）９:2
7,Ikehara,M.ら、Proc Natl Acad Sci（USA）（1984）8
1:5956）。

B.合成trpプロモーター／オペレーター含有プラスミ
ド、pTrp−233の構築 プラスミドpKK233−２（図4A;Amann,E.およびBrosiu
s,J.,前出）を、Nde Iを用いて完全に消化し、その後、
Maniatisら、Molecular Cloning,Cold Spring Harbor L
aboratories（1982）,p.394の方法により、E.coli DNA
ポリマラーゼＩ、クレノウ断片（Boehringer−Mannhei
m,Inc.）５ユニットを用いて、末端を満たし、50μＭに
dATP,dCTP,dGTPおよびTTPを添加した。得られた物質の2
5℃で20分間インキュベートした。フェノール／クロロ
ホルム抽出およびエタノール沈澱に続いて、Nde Iで消
化したDNAを再連結させてE.coliに形質転換した（Nakam
ura,K.ら、J Mol Appl Genet（1982）１:289）。得られ
た、Nde I部位を欠いたプラスミドをpKK233−２−Nde
（図4B）と命名した。

プラスミドpKK233−２−Nde 20ナノグラムをEcoR Iお
よびPst Iを用いて完全に消化し、その後、Maniatis
ら、前出、pp.133−134に従って、仔ウシの腸ホスファ
ターゼ処理（Boehringer−Mannheim）を実施した。EcoR
IおよびPst Iを用いて、このファージの複製型（二本
鎖DNA型）を消化することにより、M13−trpから合成trp
プロモーター／オペレーター配列50ナノグラムを得、Ec
oR I−Pst Iを用いて消化したPKK233−２−Nde 10ナノ
グラムと混合した。上記のようにT4 DNAリガーゼと連結
した後、得られた混合物をE.coli JA221 lpp^-/I′lac I
に形質転換した。形質転換体をスクリーニングすること
により、100bp EcoR I−Pst I合成trpプロモーター／オ
ペレーターを含有するプラスミドDNAの存在をスクリー
ニングした。その後、適切なプラスミドを単離してpTrp
−233と命名した。図4Cに、4.4−kbプラスミドpTrp−23
3のプラスミドマップを示す。

実施例２ プラスミドpTsF11の構築 A.ヒト塩基性繊維芽細胞増殖因子をコードするcDNA配列
の構築 参考のため援用されるPCT公報WO 87/01728;Abraham,
J.A.ら,Science（1986），前出；およびAbraham,J.A.
ら、The EMBO Journal（1986），前出に記載されている
ように、ハイブリダイゼーションプローブをつくるため
に、クローンλBB2中に含有されたウシ塩基性FGF cDNA
を用いることにより、塩基性FGFクローンを、ヒトcDNA
およびゲノムライブラリーから単離した。

ウシ塩基性FGFとヒト塩基性FGFとの間には、155残基
前駆体型に２つの、アミノ酸の違いがある:121位におい
て、ウシのタンパク質はSerを有し、ヒトのタンパク質
はThrを有すること；および137位において、ウシのタン
パク質はProを有し、ヒトのタンパク質はSerを有するこ
とである。これらの違いは各々の場合において、その部
位におけるアミノ酸用のコドンにおける、ひとつのヌク
レオチドの違いに相当する。されゆえ、以下に述べるよ
うに、ヒトのタンパク質をコードするために、部位特異
性変異誘発によって、ウシのcDNAを便宜的に修正し得
る。実際、部位特異性変異誘発技術の標準的なものを用
いることにより、これらのコドンを変更した。EcoR Iを
用いてλBB2クローン（ATCC NO.40196）を消化し、bFGF
タンパク質をコードする配列にわたる1.4kbの領域を、M
13mp8のEcoR I部位に連結した。そして、正しい方向に
挿入物を有するファージを回収させた。３個のオリゴヌ
クレオチド：「万能」プライマーである17−mer;コドン
121においてコーディング配列を変更する変異誘発性の1
6−mer 5′−GAAATACACCAGTTGG−３′（配列番号11）；
コドン137において配列を変更する変異誘発性の17−mer
5′−ACTTGGATCCAAAACAG−３′（配列番号12）の存在
下で１回目のインビトロ変異誘発を実行した。その後、
得られた、変異誘発されたファージを、プライマーで方
向づけられた、２回目のインビトロ変異誘発にかけるこ
とにより、変異誘発性25−mer,5′−TTTTACATGAAGCTTTA
TATTTCAG−３′（配列番号13）を用いて翻訳終止コドン
から下流にHind III部位34bpを作成した。

得られた、変異したDNAをジデオキシヌクレオチド配
列分析（Sangerら、前出）によって配列分析することに
より、所望の変異が起こったことを確認した。変異した
M13ファージDNAの複製型からのHind IIIを用いて、FGF
コーディング領域にわたる約640bpの断片を切出し、Hin
d IIIで消化したpUC13（Messing,J.,Methods Enzymol
（1983）101:20）に連結することにより、中間プラスミ
ドpJJ15−１を得た。

B.N末端のための合成コーディング領域を有するヒトbFG
F cDNAの構築 pJJ15−１中に含有されるコーディング領域の５′端
末（最初の125bp）のＧ＋Ｃ含有量を低下させるため
に、連続する配列の上にリストアップされている合成オ
リゴヌクレオチドを用いて、下に示されている配列を有
する合成DNA断片を構築した。オリゴヌクレオチドを対
にアニーリングし、その対を順に連結し、Hind IIIで切
断されたM13mp9に連結した。M13mp9にクローニングした
合成135bp挿入物の配列を、ジデオキシ配列分析により
確認した。合成断片を有するM13mp9ファージの複製型
を、Hind IIIを用いて消化し、135bp断片を単離した。
この断片を、Hind IIIで切断されたpUC9に連結した。そ
の後、得られたプラスミドをNde IおよびHha Iを用いて
消化し、合成挿入物の126bpサブ断片を単離した。この1
26bpのNde IからHha Iのサブ断片を、JJ15−１からの37
7bpのHha IからHind IIIのDNA断片に結合した。上記377
bpのHha IからHind IIIのDNA断片は塩基性FGFコーディ
ング配列のほぼ４分の３にわたり、この部分は、カルボ
キシ末端である。その後、得られた物質を、発現ベクタ
ーpTrp−233のNde IおよびHind III部位に連結すること
により、プラスミドpTsF11（図5A,5B）を得た。

実施例３ bFGFのためのpTsF−９Δβgal発現ベクターの生成 trpプロモーター／オペレーターの制御下でbFGFを発
現させるためのコピー数の多い発現ベクターを、以下の
方法で調製した。この方法を図５に示す。E.coli中で機
能する複製起点（ori）、アンピシリン耐性遺伝子、lac
プロモーター／オペレーター、およびポリリンカー領域
を含有するプラスミドpUC9（図5D;Vieira,J.およびMess
ing,J.,Gene（1982）19:259）を、Pvu I（New England
Biolabs）およびEcoR I（New England Biolabs）を用い
て、製造会社の指示に従って、3.25時間消化した。

同時に、上記のようにPvu IおよびEcoR Iを用いて、p
TsF11 DNA（図5B）をインキュベートした。２つの制限
酵素を用いた消化によって生成したpUC9およびpTsF11断
片を、T4 DNAリガーゼの存在下で連結した。連結反応
を、E.coliに形質転換した。形質転換のアンピシリン耐
性コロニーからのプラスミドDNAを、プラスミドサイズ
および制限分析によって分析することにより、プラスミ
ドを単離した。このプラスミドにおいて、pTsF11の適当
な断片（trpプロモーター／オペレーター領域、bFGFコ
ーディング領域、転写終止配列、およびAmp遺伝子の
５′末端半分を含有する約1.5kbのPvu I−EcoR I断片）
を、図5Eに示す方向で、pUC9の約1.7kbのPvu I−EcoR I
断片（複製起点およびAmp遺伝子の３′末端半分を含有
する）に連結した。このプラスミドをpTsF−９と命名し
た。

製造会社の指示に従って、Pvu IIおよびEcoR Iを用い
てpTsF−9 DNAをインキュベートした。デオキシヌクレ
オシドトリホスフェートおよびDNAポリメラーゼＩのク
レノウ断片とともにDNAをインキュベートすることによ
り、EcoR Iの開裂部位における突出部を満たした。T4 D
NAリガーゼの存在下の平滑末端の連結により、DNAを再
び円形にした。E.coli Bをアンピシリン耐性に形質転換
するために、連結反応を用いた。単一のコロニー形質転
換体からのプラスミドDNAを、プラスミドサイズおよび
制限分析によって分析することにより、図5FにおいてpT
sF−９Δβgalと示されているプラスミドを単離した。
満たしたEcoR I部位およびPvu II部位の平滑末端連結の
結果、pTsF−９Δβgal中のEcoR I部位を回復させた。
プラスミドpTsF−９Δβgalは、trpプロモーター／オペ
レーターの制御下のbFGFコーディング配列、アンピシリ
ン耐性遺伝子およびE.coli中で機能する複製起点を含有
する。

実施例４ bFGF（MAGS）をコードするDNA配列の生成 pTsF11（trpプロモーター／オペレーター領域および
ヒトのbFGFの155残基前駆体型をコードするDNAを含有す
る）の約590bpのEcoR I−Hind III DNA断片を、M13mp9
のEcoR I−Hind III部位に連結することにより、プラス
ミドFGFt7910を構築した。FGFt7910の一本鎖DNAが単離
されると、ZollerおよびSmith,前出に記載されているよ
うに、インビトロ変異誘発を実行した。上記インビトロ
変異誘発は、ATG開始コドンによってコードされるメチ
オニンの直後の２つのアラニンのうちの１つのためのコ
ドンを欠いた、bFGFのＮ末端の一部位をコーディングす
る合成オリゴヌクレオチドを用いて行った。この変異誘
発の結果、以下に示すアラニン用のコドンのうちの１つ
が除去された。

一本鎖DNA1μｇを、リン酸化した変異誘発性のオリゴ
ヌクレオチド５′−pGTATCACATATGGCTGGTTCTATC−３′
（配列番号26）５ナノグラムおよびM13万能配列プライ
マー（P.L.Biochemicalsから購入した17mer）１ナノグ
ラムと、55℃で５から15分間、10mM Tris−HCl pH7.5お
よび10mM MgCl₂を含有する溶液0.01ml中でハイブリダイ
ズした。反応液を室温まで冷却し、その後、デオキシヌ
クレオシドトリホスフェートdATP、dGTP、dCTPおよびTT
P各々0.12mM、DNAポリメラーゼＩ（Boehringer Mannhei
m）のクレノウ断片５ユニット、およびT4 DNAリガーゼ
（New England Biolabs）20ユニットを含有する溶液0.0
1mlを添加し、15℃で４−６時間インキュベートした。
その後、反応液の一部（0.002ml）を、競合するE.coli
JM101細菌に添加し、37℃でＬ寒天皿上で一晩培養し
た。得られたM13プラークのDNAを、２つのニトロセルロ
ースフィルターの各々に移し、80℃で減圧下で２時間焼
成し、その後、42℃で２時間、プレハイブリダイゼーシ
ョン溶液中でインキュベートした。プレハイブリダイゼ
ーション溶液は、6xSSC（1xSSCは150mM NaCl,15mMクエ
ン酸ナトリウム,pH7.0である）,0.1％ドデシル硫酸ナト
リウム（SDS）、2xデンハルツ（Denhardt's）（0.04％
フィコール、0.04％ポリビニルピロリドン、0.04％ウシ
血清アルブミン）、および変性サケ精子のDNA0.4mg/ml
を含有する。その後、［γ−³²P］−ATPおよびT4ポリヌ
クレオチドキナーゼで標識された５′末端であった変異
誘発性オリゴヌクレオチドを含有する新に調製したプレ
ハイブリダイゼーション溶液を用いて、42℃で３時間、
フィルターをインキュベートした。その後、フィルター
を、4xSSCを用いて室温で15分間洗浄し、65℃で15分間
一回洗浄し、室温でTMACl溶液（3Mテトラメチルアンモ
ニウムクロライド、50mM Tris−HlC、pH8.0、2mM EDT
A、0.1％SDS）中で一回洗浄し、65℃でTMACl溶液中で一
回洗浄し、その後、得られたフィルターを、Ｘ線フィル
ムを室温で一晩露光するために用いた。その後、Ｘ線フ
ィルム上の暗い複写が陽性であるクローンを元の皿から
取り出した。DNAを単離して、その後、ジデオキシ配列
分析法によって、変異した配列を検出するために分析し
た。変異したM13クローンの複製型DNAを調製し、EcoR I
およびHind IIIを用いて消化し、変異した塩基性FGFを
コードするDNA断片を、アガローゼゲル電気泳動によっ
て単離した。この断片中の、bFGFコーディング領域の配
列を図２に示す。

実施例５ bFGF（MAGS）のための発現ベクターの構築 図６に示す方法に従って、bFGF（MAGS）をコードする
DNA断片の挿入に適した発現ベクターを調製した。上記
のプラスミドpTrp−233（図5A、図6A）を製造会社の指
示に従ってEcoR IおよびPvu Iを用いて消化し、trpプロ
モーター／オペレーターを含有する断片を単離した。同
時に、EcoR IおよびPvu Iを用いて、pUC9を消化し、複
製起点を有する断片を単離した。単離した断片をT4 DNA
の存在下で連結することにより、trpプロモーター／オ
ペレーターおよびpTrp−233と複製起点とからのポリリ
ンカー領域、lacプロモーター／オペレーターおよびpUC
9からのポリリンカーを含有するプラスミドであるpTrp
−９を生成した（図6C）。EcoR IおよびPvu IIを用いて
pTrp−９を消化し、上記のように、DNAポリメラーゼ
Ｉ、クレノウ断片およびデオキシヌクレオシドトリホス
フェートを用いてEcoR I末端を満たした。T4 DNAリガー
ゼの存在下で平滑末端を連結することにより、DNAを再
び円形にした。E.coli Bをアンピシリン耐性に形質転換
するために、連結反応を用いた。単一コロニー形質転換
体からのプラスミドDNAを、プラスミドサイズおよび制
限分析によって分析することにより、pTsF−９Δβgal
−GM−２（図6D）と示されたプラスミドを単離した。

プラスミドpTsF−９Δβgal−GM−２を、製造会社の
指示に従ってEcoR IおよびHind IIIを用いてインキュベ
ートし、アンピシリン耐性遺伝子および複製起点を含有
する大きな断片をアガローゼゲル上で単離した。その
後、bFGF（MAGS）コーディング配列およびtrpプロモー
ター／オペレーターを含有するEcoR I−Hind III断片
（実施例４）をT4 DNAリガーゼの存在下で、pTsF−９Δ
βgal−GM−２の、単離した断片に連結した。競合する
E.coli W3110細胞を形質転換するために連結を用い、そ
の後、E.coli W3110細胞を、アンピシリン100μg/mlを
添加したＬ寒天皿上で一晩増殖させた。コロニー９を選
択して、アンピシリン100μg/mlを添加したＬ肉汁中で
増殖させ、その後、プラスミドDNAを細菌から単離して
制限消化によって分析することにより、所望の構築を確
認した。得られたプラスミドはpTsF−９Δβgal（MAG
S）と命名されているが、これは、bFGFコーディング配
列に代えてbFGF（MAGS）コーディング配列を含有する以
外は、pTsF−９Δβgalと同一である。

実施例６ bFGFおよびbFGF（MAGS）の発現 pTsF−９ΔΗgalおよびpTsF−９Δβgal（MAGS）のプ
ラスミドを別々にE.coliのＢ細胞に形質転換した。単コ
ロニーを用いて培養物をＬ＋amp培地に植え付けた後、3
0℃で５時間増殖させた。次にこれらの培養物を用いて
発現培養物（0.5％のカサミノ酸（casamino acid）、0.
4％のグルコース、２μg/mlのチアミン、0.1mMのCaC
l₂、0.8mMのMgSO₄、および50μg/mlのアンピシリンを含
有するM9塩に１から100倍に希釈したもの）を接種し
た。50μg/mlの３−β−インドールアクリル酸を添加し
て、trpプロモーターを誘導して、培養物を一夜30℃で
増殖した。14から18時間後に、A₅₅₀を測定して、１単位
吸光度の細胞ペレットを100μｌのSDS含有ポリアクリル
アミドゲル負荷用緩衝液に再懸濁して、煮沸した。得た
10μｌの上清を15％のアルクリアミド−SDSゲルに負荷
して、電気泳動にかけた。ゲルをクーマシーブルーで染
色した。図７は、レーン１に分子量マーカーを伴った染
色したゲルの写真である。レーン２および３に、pTsF−
９Δβgal形質転換細胞の２つの培養物から抽出したタ
ンパク質を負荷した。レーン４および５に、pTsF−９Δ
βgal（MAGS）形質転換細胞の２つの培養物から抽出し
たタンパク質を負荷した。レーン６は、bFGF標準を含有
する。レーン４および５のbFGF（MAGS）に対応するバン
ドは、レーン２および３のbFGFに対応するバンドより視
覚的に暗い。

レーン２から５の、様々な種類のタンパク質の相対濃
度をスキャニング濃度計により測定した。図8Aから8Dは
レーン２から５のそれぞれの濃度をプロットしたもので
ある。bFGFまたはbFGF（MAGS）のピークは矢印で示され
ている。全細胞タンパク質に比例して発現するbFGFまた
はbFGF（MAGS）の量は、濃度計によるプロットのカーブ
の下の面積に基づて各培養物について計算される。pTsF
−９Δβgalで形質転換された２つの培養物（図8A−8
B）の平均発現レベルは、全細胞タンパク質の6.7％であ
り、一方、pTsF−９Δβgal（MAGS）で形質転換された
２つの培養物（図8C−8D）の平均発現レベルは、全細胞
タンパク質の10.8％であった。

実施例７ bFGF（MAGS）のＮ末端配列の決定 実施例６と同様の手順により、pTsF−９Δβgal（MAG
S）で形質転換されたE.coli B細胞をカサミノ酸および5
0μg/mlのアンピシリンを含有するM9培地２リットル増
殖した。培養物を光学濃度が0.58（550nmで測定）にな
るまで増殖し、50μg/mlの３−β−インドールアクリル
酸で誘導し、その後振盪させながら一夜30℃でインキュ
ベートした。培養物を遠心分離機にかけ、細胞ペレット
を、20mMのTris−HCl、pH7.5、5mMのEDTA、1mMのフェニ
ルメチルスルフォニルフルオライド、および0,5mg/mlの
リゾチーム含有溶液30mlに再懸濁した。氷の上に30分置
いた後、上清に超音波をあてて細胞を破砕した。RNアー
ゼおよびDNアーゼを各100μｇ添加した。氷の上に30分
置いた後、混合物を遠心分離機にかけ、上清を精製のた
め取り除いた。

上清を、20mMのリン酸ナトリウムpH7、5mMのEDTAで平
衡化したSP−セファデックスのカラム（2.5cm×2cm）に
供した。カラムを、280nmでの吸光度が基準レベルに戻
るまで同じ緩衝液で洗浄した。タンパク質を20mMのリン
酸ナトリウムpH7、5mMのEDTA、500mMのNaClでカラムか
ら溶離させた。

SP−セファデックスカラムから500mMのNaClをぬい
て、20mMのTris−HCL、pH7.5、5mMのEDTA、600mMのNaCl
で平衡化したヘパリン−セファロースのカラム（2.5cm
×2cm）に負荷した。カラムを、280nmでの吸光度が基準
レベルに戻るまで同じ緩衝液で緩衝した。タンパク質を
20mMのTris−HCl、pH7.5、5mMのEDTA、2MのNaClで溶離
させた。

このようにして得られたbFGF（MAGS）を自動ガス相シ
ークエネーターを用いてエドマン分解法によりＮ末端ア
ミノ酸配列を分析した。多量のタンパク質をシークエネ
ーターに負荷すると、極少量の、すなわち１〜２％の、
Ｎ末端配列Gly−Ser−を有するタンパク質が検出され、
残りは、Ｎ末端配列Ala−Gly−Serを有するタンパク質
であった。bFGFをpTsF−９Δβgalで形質転換されたE.c
oli B細胞を用いて、本質的に同様の方法で生産して精
製すると、得られたタンパク質は約70％のAla−Ala−Gl
y−Ser−および30％のAla−Gly−Ser−を含有する混合
Ｎ末端配列を示した。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (56)参考文献 特表 昭63−500843（ＪＰ，Ａ) 特表 平４−507099（ＪＰ，Ａ) 国際公開90／2800（ＷＯ，Ａ１) (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C12P 21/02 C12N 1/21 C12N 15/19 C07K 14/50 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＣＡ（ＳＴＮ) ＭＥＤＬＩＮＥ（ＳＴＮ) ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (13)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】同一のＮ末端を有する塩基性繊維芽細胞増
   殖因子を生成するための方法であって、該方法は、以下
   の工程： 哺乳類の塩基性繊維芽細胞増殖因子の155アミノ酸から
   なる前駆体形態において、Ｎ末端メチオニンの直後にあ
   る２つのアラニン残基のうちの１つが欠失している形態
   をコードするDNA配列を、Ｎ末端メチオニン残基が翻訳
   後に欠失される宿主細胞中で発現する、工程；および 該Ｎ末端メチオニン残基を含まない発現されたタンパク
   質を回収する、工程、を包含する、方法。
2. 【請求項２】前記発現されるDNAコーディング配列が、
   ヒト塩基性繊維芽細胞増殖因子の155アミノ酸からなる
   前駆体形態において、Ｎ末端メチオニン残基の直後にあ
   る２つのアラニン残基のうちの１つが欠失している形態
   をコードする配列を含有する、請求項１に記載の方法。
3. 【請求項３】前記発現されるDNAコーディング配列が、
   塩基７から９のアラニン（GCC）コドンを除いた配列番
   号１のコーディング配列を含有する、請求項２に記載の
   方法。
4. 【請求項４】前記発現されるDNAコーディング配列が、
   配列番号５のコーディング配列である、請求項２に記載
   の方法。
5. 【請求項５】前記塩基性繊維芽細胞増殖因子が、前記宿
   主細胞によって発現された全タンパク質の少なくとも10
   ％のレベルで発現される、請求項１に記載の方法。
6. 【請求項６】同一のＮ末端を有する塩基性繊維芽細胞増
   殖因子を発現するためのベクターであって、該ベクター
   は、哺乳類の塩基性繊維芽細胞増殖因子の155アミノ酸
   からなる前駆体形態において、Ｎ末端メチオニン残基の
   直後にある２つのアラニン残基のうちの１つを欠失して
   いる形態をコードするDNA配列を含有し、該DNA配列が、
   宿主細胞内でその発現を導き得る調節配列に作動可能に
   連結されている、ベクター。
7. 【請求項７】前記塩基性繊維芽細胞増殖因子をコードす
   るDNA配列が、ヒト塩基性繊維芽細胞増殖因子の155アミ
   ノ酸からなる前駆体形態において、Ｎ末端メチオニン残
   基の直後にある２つのアラニン残基のうちの１つが欠失
   している形態をコードする配列を含有する、請求項６に
   記載のベクター。
8. 【請求項８】前記増殖因子のアミノ酸配列をコードする
   DNA配列が、塩基７から９のアラニン（GCC）コドンを除
   いた配列番号１のコーディング配列を含有する、請求項
   ７に記載のベクター。
9. 【請求項９】前記増殖因子のアミノ酸配列をコードする
   DNA配列が、配列番号５のコーディング配列を含有す
   る、請求項７に記載のベクター。
10. 【請求項１０】前記調節配列が、trpプロモーター−オ
    ペレーター配列を含有する、請求項７に記載のベクタ
    ー。
11. 【請求項１１】請求項７に記載のベクターで形質転換さ
    れた、宿主細胞。
12. 【請求項１２】前記細胞がE.coli細胞である、請求項11
    に記載の宿主細胞。
13. 【請求項１３】前記宿主細胞がE.coli B細胞である、請
    求項12に記載の宿主細胞。