JP2003033194A - 同一のｎ末端を有する塩基性繊維芽細胞増殖因子の高レベル発現 - Google Patents

同一のｎ末端を有する塩基性繊維芽細胞増殖因子の高レベル発現

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Abstract

(57)【要約】 【課題】 異なるＮ末端アミノ酸配列を有するヒト塩基
性繊維芽細胞増殖因子のどの種も実質的に含んでいな
い、Ｎ末端にアミノ酸配列Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−を
有するヒト塩基性繊維芽細胞増殖因子を提供すること。 【解決手段】 上記課題は、異なるＮ末端アミノ酸配列
を有するヒト塩基性繊維芽細胞増殖因子のどの種も実質
的に含んでいない、Ｎ末端にアミノ酸配列Ａｌａ−Ｇｌ
ｙ−Ｓｅｒ−を有するヒト塩基性繊維芽細胞増殖因子お
よびその組成物を提供することにより達成された。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】（技術分野）本発明は、増殖
因子の組み換え生産の分野に関する。特に、本発明は、
同一のＮ末端を有するヒト塩基性繊維芽細胞増殖因子の
生産に関する。本発明は、同一のＮ末端を有するヒト塩
基性繊維芽細胞増殖因子の高レベルな発現および回収の
手段および方法を提供する。
【０００２】
【従来の技術】（発明の背景）塩基性繊維芽細胞増殖因
子（ｂＦＧＦ）は、毛細管内皮細胞を含む広範囲な細胞
型において強力なマイトジェン活性を発現するタンパク
質である。ウシの下垂体由来のｂＦＧＦの完全なアミノ
酸配列が決定されている（Ｅｓｃｈ，Ｆ．ら、Ｐｒｏｃ
Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ（ＵＳＡ）（１９８５）
８２：６５０７）。ヒトｂＦＧＦをコードするクローニ
ングされたＤＮＡ配列は単離され、そのアミノ酸配列の
ヒトタンパク質の１３１−、１４６−および１５４−ア
ミノ酸形態は決定されている（１９８７年３月２６日に
ＷＯ ８７／０１７２８として公開されているＰＣＴ出
願 ＵＳ８６／０１８７９、Ａｂｒａｈａｍ，Ｊ．ら、
Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８６）２３３：５４５、Ａｂｒａ
ｈａｍ，Ｊ．ら、ＴｈｅＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ（１
９８６）５：２５２３）。クローニングされたＤＮＡ配
列を分析すると、可能な開始メチオニンコドンが、ｂＦ
ＧＦの１５４−アミノ酸形態のコーディング配列のすぐ
上流側に存在することが示され、このことは、（ｉ）こ
の遺伝子からの一次翻訳産物の長さが１５５個の残基
で、（ｉｉ）１５４−アミノ酸形態が、開始メチオニン
の翻訳後除去によって得られることを示している。次い
で、Ｆｌｏｒｋｉｅｗｉｃｚ、Ｒ．およびＳｏｍｍｅ
ｒ，Ａ．（Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ（Ｕ
ＳＡ）（１９８９）８６：３９７８−３９８１）および
Ｐｒａｔｓ，Ｈ．ら、（Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ
Ｓｃｉ（ＵＳＡ）（１９８９）８６：１８３６−１８
４０）は、１５５−残基一次翻訳産物のメチオニン開始
コドンの上流側に存在するロイシンコドンにおける、代
替翻訳開始の結果として生産され得る、より長い形態の
ｂＦＧＦの存在を報告した。
【０００３】部分的には、毛細管内皮細胞における強力
なマイトジェン活性のために、ｂＦＧＦは、血管形成、
すなわち新しい毛細血管を形成する工程を促進する。従
って、ｂＦＧＦは、創傷が適切に治癒する場合の、新し
い毛細血管床の形成が必要であるときに、創傷治癒剤と
して非常に有用である。
【０００４】ヒトｂＦＧＦをコードする、単離されクロ
ーニングされたＤＮＡ配列を入手することによって、組
み換えＤＮＡ技術を用いて、これらの配列を含む発現ベ
クターで形質転換された宿主細胞においてタンパク質を
発現し、そのタンパク質を臨床的使用のために回収する
ことが可能になった。Ｎ末端メチオニンをプロセシング
し得る原核および真核宿主において、ヒトｂＦＧＦおよ
びウシの等価物の１５５−残基一次翻訳産物を発現させ
ることにより、微小不均一性のＮ末端を有するタンパク
質が生産されることが観察されている（例えば、Ｂａｒ
ｒ、Ｐｈｉｌｉｐ Ｊ．ら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ
（１９８８）２６３（３１）：１６４７１を参照のこ
と）。Ｅ．ｃｏｌｉにおいてヒトｂＦＧＦの１５５−残
基一次翻訳産物を発現させると、約７０／３０の比で、
混合Ｎ末端配列Ａｌａ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｉｌ
ｅ−／Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−を有するタン
パク質が回収されることを一貫して観察してきた。この
微小不均一性は、分子の生物活性に影響を与えないよう
であるが、一般に、臨床用には、同一の物質、すなわ
ち、分子間で実質的に同一のＮ末端配列を有するタンパ
ク質を得ることが望まれると考えられる。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、異な
るＮ末端アミノ酸配列を有するヒト塩基性繊維芽細胞増
殖因子のどの種も実質的に含んでいない、Ｎ末端にアミ
ノ酸配列Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−を有するヒト塩基性
繊維芽細胞増殖因子を提供することである。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明によれば、Ｎ末端
メチオニン残基が翻訳後欠失される宿主細胞内で、該Ｎ
末端メチオニンの直後の２個のアラニン残基のうち少な
くとも１個がない、哺乳類の塩基性繊維芽増殖因子の前
駆体型の１５５アミノ酸をコードするＤＮＡ配列を発現
する、工程；および該Ｎ末端メチオニン残基のない発現
されたタンパク質を回収する、工程；を包含する、同一
のＮ末端を有する塩基性繊維芽増殖因子を生産する方法
が提供される。
【０００７】１つの実施態様では、上記発現されるＤＮ
Ａコーディング配列は、Ｎ末端メチオニン残基の直後に
ある２個のアラニン残基の１個が欠失されたヒト塩基性
繊維芽細胞増殖因子の前駆体型の１５５アミノ酸をコー
ドする配列を含有する。
【０００８】好ましい実施態様では、上記発現されるＤ
ＮＡコーディング配列は、塩基７から９のアラニン（Ｇ
ＣＣ）コドンを除いた図１のコーディング配列を含有す
る。
【０００９】別の好ましい実施態様では、上記発現され
るＤＮＡコーディング配列は、図２のコーディング配列
である。
【００１０】別の実施態様では、上記塩基性繊維芽細胞
増殖因子は、宿主細胞によって発現された全タンパク質
の少なくとも１０％のレベルで発現される。
【００１１】本発明によれば、同一Ｎ末端を有する塩基
性繊維芽細胞増殖因子を発現するためのベクターであっ
て、該Ｎ末端メチオニン残基の直後にある２個のアラニ
ン残基の１個がない、哺乳類の塩基性繊維芽細胞増殖因
子の前駆体型の１５５アミノ酸をコードするＤＮＡ配列
を含有し、該ＤＮＡ配列が、宿主細胞内でその発現を導
き得る調節配列に作動可能に連結されている、ベクター
が提供される。
【００１２】１つの実施態様では、上記塩基性繊維芽細
胞増殖因子をコードするＤＮＡ配列は、Ｎ末端メチオニ
ン残基の直後にある２個のアラニン残基の１個が欠失さ
れた、ヒト塩基性繊維芽細胞増殖因子の前駆体型の１５
５アミノ酸をコードする配列を含有する。
【００１３】好ましい実施態様では、上記増殖因子のア
ミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列は、塩基７から９の
アラニン（ＧＣＣ）コドンを除いた図１のコーディング
配列を含有する。
【００１４】別の好ましい実施態様では、上記増殖因子
のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列は、図２のコー
ディング配列を含有する。
【００１５】なお別の好ましい実施態様では、上記調節
配列は、ｔｒｐプロモーター−オペレーター配列を含有
する。
【００１６】本発明によれば、上記のベクターで形質転
換された、宿主細胞が提供される。
【００１７】１つの実施態様では、上記細胞はＥ．ｃｏ
ｌｉ細胞である。
【００１８】好ましい実施態様では、上記宿主細胞は
Ｅ．ｃｏｌｉＢ細胞である。
【００１９】本発明によれば、Ｎ末端にアミノ酸配列Ａ
ｌａ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−を有するヒト塩基性繊維芽細胞
増殖因子であって、異なるＮ末端アミノ酸配列を有する
ヒト塩基性繊維芽細胞増殖因子のどの種も実質的に含ん
でいない、ヒト塩基性繊維芽細胞増殖因子が提供され
る。
【００２０】１つの実施態様では、上記のヒト塩基性繊
維芽細胞増殖因子は、図１のアミノ酸位３のＡｌａで始
まる１５３アミノ酸配列を有する。
【００２１】
【発明の実施の形態】（発明の要旨）本発明は、実質的
に同一のＮ末端を有するヒトｂＦＧＦの高レベルな発現
の方法および手段を提供する。「実質的に同一」とは、
Ｅｄｍａｎ分解法による配列分析によって、ｂＦＧＦ
が、９５％、好ましくは９８％より多くの、同一Ｎ末端
を有する物質を含むことが示されることを意味する。本
発明は、ヒトｂＦＧＦの１５５−アミノ酸一次翻訳産物
のＮ末端メチオニン残基の直後にある２つのアラニン残
基の１つをコードするコドンが欠失すると、Ｎ末端が同
一のヒトｂＦＧＦタンパク質が発現および回収されると
いう発見に基づいている。特にＮ末端メチオニンの翻訳
後プロセシングに次いで、同一なＮ末端配列Ａｌａ−Ｇ
ｌｙ−Ｓｅｒ−を有する長さが１５３個のアミノ酸のヒ
トｂＦＧＦが生産される。さらに、以下の実施例３およ
び５におけるＥ．ｃｏｌｉ発現ベクターを用いて、Ａｌ
ａが欠失した配列が発現すると、その発現レベルは、Ａ
ｌａを欠失していない対応のタンパク質配列の発現レベ
ルよりもおよそ５０％から１００％高くなることが発見
されている。
【００２２】従って、本発明により同一のＮ末端を有す
るヒトｂＦＧＦを生産する方法が提供され、該方法は、
Ｎ末端メチオニンを翻訳後除去し得る宿主細胞におい
て、Ｎ末端メチオニンの直後に存在する２つのアラニン
残基のうちの１つの残基のコドンが欠失している、ヒト
ｂＦＧＦの１５５−アミノ酸形態のアミノ酸配列をコー
ドするＤＮＡ配列を発現する工程と、そのタンパク質を
回収する工程と、を包含する。また、同一のＮ末端を有
するヒト塩基性ＦＧＦの高レベルな発現および回収のた
めのベクターが提供される。このベクターは、ヒトｂＦ
ＧＦの１５５−アミノ酸形態をコードするＤＮＡ配列を
含み、このＤＮＡ配列からは、Ｎ末端メチオニンの直後
にある２つのアラニンのうちの１つのアラニンのコドン
が欠失しており、該ＤＮＡ配列は、宿主細胞においてそ
の発現を方向づけ得る制御配列に、作動可能なように連
結される。さらに、Ｎ末端配列Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ
−を有するヒトｂＦＧＦ配列の１５３個のアミノ酸を有
する同一のタンパク質を含むヒトｂＦＧＦ組成物が提供
される。
【００２３】（発明の詳細な説明）本発明は、ヒトｂＦ
ＧＦの１５５−アミノ酸前駆体をコードし、Ｎ末端メチ
オニンのすぐ後ろの２つのアラニン残基のうち１つのア
ラニン残基のコドンを欠失しているＤＮＡ配列を使用す
る。以下では、ヒトｂＦＧＦをコードし改変された形
を、一次翻訳産物がＮ末端配列Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ｇｌｙ
−Ｓｅｒ−を有することを示すために「ｂＦＧＦ（ＭＡ
ＧＳ）」と表す。このヒトｂＦＧＦおよびウシｂＦＧＦ
の１５５−残基形態のアミノ酸配列を、図１Ａおよび図
１Ｂにそれぞれ示す。図１Ａおよび図１Ｂに示されるＤ
ＮＡ配列は、ここに参考として援用されているＰＣＴ公
報第ＷＯ ８７／０１７２８号に記載のように決定され
た、天然のコーディング配列である。これらの配列のい
ずれかが、部位特異的変異誘発（Ｚｏｌｌｅｒ，Ｍ．
Ｊ．，およびＳｍｉｔｈ，Ｍ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ
ｉｄｓ Ｒｅｓ（１９８２）１０：６４８７およびＡｄ
ｅｌｍａｎ，Ｊ．Ｐ．ら．，ＤＮＡ（１９８３）２：１
８３）によって改変され得、Ｎ末端メチオニンのすぐ後
のアラニン残基の１つを欠いたヒトｂＦＧＦの類似体を
コードするＤＮＡを生産する。周知のＤＮＡコードの変
性により、他のＤＮＡ配列がＮ末端アラニン残基の１つ
を欠く所望のヒトｂＦＧＦ配列をコードする場合は、そ
のＤＮＡ配列が使用し得ることが理解される。好適な実
施態様においては、アラニン残基を有しないヒトｂＦＧ
ＦをコードするＤＮＡ配列が提供される。このような実
施態様では、アラニン残基を欠くヒトｂＦＧＦをコード
しているＤＮＡ配列が提供され、そこでは分子のＮ末端
部をコードするＤＮＡの実質的な部分が、天然のＤＮＡ
配列と比較するとＧ＋Ｃ含有量が減少しているように改
変される。
【００２４】所望するならば、ｂＦＧＦ（ＭＡＧＳ）を
コードするＤＮＡ配列全体は、重複する合成オリゴヌク
レオチドを連結することによって合成的に生産され、こ
のように連結されて所望のＤＮＡ配列全体を形成する。
個々のオリゴヌクレオチドは、Ｅｄｇｅ，ら，Ｎａｔｕ
ｒｅ（１９８１）２９２：７５６およびＤｕｃｋｗｏｒ
ｔｈ，ら，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ（１９
８１）９：１６９１に記載のホスホトリエステル法また
はＢｅａｕｃａｇｅ，Ｓ．Ｌ．およびＣａｒｕｔｈｅｒ
ｓ，Ｍ．Ｈ．，Ｔｅｔ Ｌｅｔｔｓ（１９８１）２２：
１８５９およびＭａｔｔｅｕｃｃｉ，Ｍ．Ｄ．およびＣ
ａｒｕｔｈｅｒｓ，Ｍ．Ｈ．，Ｊ ＡｍＣｈｅｍ Ｓｏ
ｃ（１９８１）１０３：３１８５に記載のホスホルアミ
ダイト法によって調製し得、市販で入手可能な自動オリ
ゴヌクレオチド合成機によっても調製し得る。このアプ
ローチはかなりの長さの遺伝子全体を合成するために効
果的に用いられている。
【００２５】好ましくは、ｂＦＧＦ（ＭＡＧＳ）をコー
ドするＤＮＡ配列は、ヒトｂＦＧＦの１５５−アミノ酸
前駆体全長をコードするＤＮＡ配列のＮ末端アラニンコ
ドンの１つを取り除くための、部位特異的変異誘発によ
って生産される。部位特異的変異誘発は、上記Ｚｏｌｌ
ｅｒ，Ｍ．Ｊ．およびＳｍｉｔｈ，Ｍ．および上記Ａｄ
ｅｌｍａｎ，Ｊ．Ｐ．に開示されている工程を用いて行
ない得る。変異誘発は、ヒトｂＦＧＦの１５５−アミノ
酸形態をコードする一本鎖ＤＮＡ（バクテリオファージ
Ｍ１３の誘導体に含まれる）上で、限定された誤対合を
除き所望する変異（即ち、ＡＴＧ出発（メチオニン）コ
ドンのすぐ後ろのアラニンコドンの１つを欠失）を示す
一本鎖ＤＮＡに相補的な合成オリゴヌクレオチドプライ
マーを使用して行なわれる。
【００２６】オリゴヌクレオチドプライマーの大きさ
は、変異が誘発される遺伝子領域ヘプライマーが安定し
てハイブリダイズする必要性および現在使用可能なオリ
ゴヌクレオチド合成法の限界により決定される。オリゴ
ヌクレオチド特異性の変異において用いられるオリゴヌ
クレオチドをデザインする際に考慮されるべき事柄（例
えば、変異部位をはさむ部分の長さ、全体の長さ）は、
Ｓｍｉｔｈ，ＭおよびＧｉｌｌａｍ，Ｓ．によるＧｅｎ
ｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌ
ｅｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ，Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅ
ｓｓ（１９８１）３：１−３２に記載されている。一般
的に、オリゴヌクレオチドの全体の長さは、変異部位か
らの５’および３’伸長部がＤＮＡポリメラーゼのエキ
ソヌレアーゼ活性による変異の修正を回避するのに充分
な長さであり、変異部位において、安定かつ固有のハイ
ブリダイゼーションを最適に行えるものである。本発明
にしたがって変異誘発に用いられるオリゴヌクレオチド
は、通常、約１８から約４５の塩基を有し、好ましくは
約２３から約２７の塩基を有する。それらは変化したま
たは欠失したコドンの３’側に少なくとも約９個の塩基
を有する。
【００２７】アラニン残基の１つのコドンを欠く合成ヌ
クレオチドプライマーは、１５５−アミノ酸ｂＦＧＦを
コードするＤＮＡ配列の鎖がクローニングされたＭ１
３、ｆｄ、またはφＸ１７４のような一本鎖ファージに
ハイブリダイズされる。ファージが遺伝子のセンス鎖ま
たはアンチセンス鎖のいずれかを有し得ることが好まし
い。ファージがアンチセンス鎖を有する場合は、プライ
マーは、欠失するアラニンを指定するコドンの欠失を除
いて、変異する領域のコーディング配列と同一である。
ファージがセンス鎖を有する場合は、プライマーは、欠
失するアラニン残基をコードするものと相補的であるト
リプレットの欠失を除いて、変異する領域のコーディン
グ配列と相補的である。
【００２８】ハイブリダイゼーションにおいて使用し得
る条件は、上記Ｓｍｉｔｈ，ＭおよびＧｉｌｌａｍ，
Ｓ．によって記載されている。一般に、温度は、約０℃
から７０℃の間の範囲であり、さらに一般的には約１０
℃から５０℃である。ハイブリダイゼーションの後、プ
ライマーは、ＤＮＡポリメラーゼＩ（Ｋｌｅｎｏｗフラ
グメント）、Ｔ4 ＤＮＡポリメラーゼ、または他の適
切なＤＮＡポリメラーゼとの反応により、ファージＤＮ
Ａ上で伸長される。得られたｄｓＤＮＡは、Ｔ4リガー
ゼのようなＤＮＡリガーゼで閉環ｄｓＤＮＡに変換され
る。一本鎖領域を有するＤＮＡ分子は、Ｓ１エンドヌク
レアーゼ処理により破壊し得る。あるいは、部分的二本
鎖の調製物は、リガーゼまたはＳ１の処理を施さずに直
接的に使用し得る。
【００２９】得られた全部または一部が二本鎖になった
ＤＮＡは、ファージを保持する宿主バクテリア中に形質
転換される。形質転換されたバクテリアの培養物は寒天
表面にプレートされ、ファージを有する個々の細胞から
のプラーク形成を可能にする。
【００３０】理論的には、新しいプラークの５０％は、
一本鎖に変異形を有するファージであり；５０％はオリ
ジナルの配列を有している。得られたプラークは、レプ
リカとしてニトロセルロースフィルターまたは他の支持
膜の上へ載せられた後、洗浄され、変性され、その後キ
ナーゼ処理した合成プライマーとハイブリダイズされ
る。洗浄は、正確なマッチの結合は起こるが、オリジナ
ル鎖とのミスマッチが起きるのは防がれるのに充分な温
度で実施される。その後、プローブとハイブリダイズす
るプラークは取り出され、培養され、そしてＤＮＡが回
収される。
【００３１】さらに、本発明の範囲内には、アミノ酸配
列におけるさらなる変化がＮ末端Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ｇｌ
ｙ−Ｓｅｒ−の下流で起こるアラニンを欠失したヒトｂ
ＦＧＦの１５５−アミノ酸配列形態の生産が含まれる。
ここに参考として援用されているＰＣＴ公報第ＷＯ８９
／００１９８号は、ｂＦＧＦの多くの類似体を開示して
おり、これらの類似体は天然のｂＦＧＦ配列のアミノ酸
残基が分子特性において効果的な変化を起こすために他
のアミノ酸で置換されている。特に、このＰＣＴ公報で
は、へパリン結合領域におけるアミノ酸残基が、１５５
残基一次翻訳産物の１２８から１３８までの位置で、中
性または陰性に荷電したアミノ酸残基によって置換され
ている類似対を開示している。さらに、１つ以上の天然
のシステイン残基、好ましくは、１５５−残基一次翻訳
産物の７８から９６位が、中性アミノ酸残基で置換され
ている類似体も開示されている。これらのアミノ酸置換
物はいずれも、本発明のアラニン欠失物と共同させ得
る。本発明の範囲から特別に除外されるのは、ＰＣＴ
ＷＯ８９／００１９８に開示されているｂＦＧＦのＮ末
端が短くなったものである。Ｎ末端がＭｅｔ−Ａｌａ−
Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−であるその下流のアミノ酸配列の改変
は、ＰＣＴ ＷＯ ８９／０１９８に開示されているＤＮ
Ａの部位特異的変異により行なわれ得、この変異は、ア
ラニンコドンを欠失する変異の前または後のいずれかで
行なわれ得る。
【００３２】ヒトｂＦＧＦ（ＭＡＧＳ）に対応するヒト
以外の哺乳類のｂＦＧＦもまた、本発明によって提供し
得る。例えば、ウシｂＦＧＦの１５５−残基前駆体のア
ミノ酸配列は、ヒト前駆体タンパク質とアミノ酸が２つ
異なる。即ち、ウシタンパク質は、１２１位にＴｈｒで
はなくＳｅｒを有しており、１３７位にＳｅｒではなく
Ｐｒｏを有している（１５５−アミノ酸配列に基づくナ
ンバーリングシステムによる）。このように、ヒトｂＦ
ＧＦ（ＭＡＧＳ）に対応するウシタンパク質をコードす
るＤＮＡ配列は、図２のＤＮＡ配列の変異によって調製
し得、１２０番および１３６番のアミノ酸残基に対応す
るコドンを変える。これは、各コドンにおいて１個のヌ
クレオチドの変異により達成される。
【００３３】ｂＦＧＦ（ＭＡＧＳ）をコードするＤＮＡ
配列を、適切な発現ベクターに挿入し、宿主細胞内のコ
ーディング配列の発現を指示できる制御配列に作動可能
なように結合する。「制御配列」とは、コーディング配
列に適切に結合された場合に、その配列をそれが適合す
る宿主内において発現させる能力を有するＤＮＡ配列を
示す。そのような制御配列は、少なくとも原核細胞およ
び真核細胞の両方の宿主内のプロモーターを含み、そし
て任意にオペレーター配列、エンハンサーおよび転写終
止シグナルを含む。特定の宿主において発現を行なう際
に必要または有用なさらなる因子が使用し得る。「作動
可能なように結合した」とは、成分が通常の機能を果た
すように配置された並列形態を示す。このように、コー
ディング配列に作動可能なように結合した制御配列は、
コーディング配列の発現を行なうことができる。当業者
に周知のように、発現ベクターもまた、使用される宿主
細胞内で機能する複製起点を有し得る。好ましくはベク
ターは、ベクターを有する宿主細胞の同定および選択を
可能にする抗生物質耐性の遺伝子のような表現型マーカ
ーも含有する。
【００３４】発現ベクターは、適切な宿主細胞を形質転
換するために使用される。原核および真核の両方の宿主
が使用し得る。原核細胞としては非常に頻繁に、Ｅ．ｃ
ｏｌｉの種々の株により代表される。しかし、他の微生
物株も使用し得る。Ｅ．ｃｏｌｉは、ヒトｂＦＧＦの１
５５−残基前駆体形態のＮ末端メチオニン残基を翻訳後
プロセシングする能力を有する。Ｅ．ｃｏｌｉの有用な
株としては、例えば、ＭＣ１０６１、ＤＨ１、ＲＲ１、
Ｃ６００ｈｆｌ、Ｋ８０３、ＨＢ１０１、ＪＡ２２１、
ＪＭ１０１、ＪＭ１０３、およびＢを含み、Ｅ．ｃｏｌ
ｉ Ｂが好ましい宿主である。プラスミドベクターとし
ては、複製領域、選択可能なマーカーおよび宿主に適合
する種由来の制御配列を含むものが使用される；例えば
Ｅ．ｃｏｌｉは、典型的には２つのＳａｌｍｏｎｅｌｌ
ａ種、およびＢｏｌｉｖａｒら，Ｇｅｎｅ（１９７７）
２：９５による１つのＥ．ｃｏｌｉ株から得られたプラ
スミド部分を組み合わせて得られたプラスミドである、
ｐＢＲ３２２由来のベクターを用いて形質変換される。
ｐＢＲ３２２は、アンピシリンとテトラサイクリン耐性
の遺伝子を有し、所望されるベクターを構築する際に維
持または破壊し得る、複数の選択可能なマーカーを提供
する。本明細書で定義される、リボソーム結合部位配列
と共に、任意にオペレーターを有し、転写を開始するた
めのプロモーターを含む一般的に用いられる原核細胞の
制御配列には、β−ラクタマーゼ（ペニシリナーゼ）お
よびラクトース（ｌａｃ）プロモーターシステム（Ｃｈ
ａｎｇら，Ｎａｔｕｒｅ（１９７７）１９８：１０５
６）、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーターシステム
（Ｇｏｅｄｄｅｌら，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒ
ｅｓ（１９８０）８：４０５７）、Ｎ遺伝子リボソーム
結合部位を有するラムダ由来のＰLプロモーター（Ｓｈ
ｉｍａｔａｋｅら，Ｎａｔｕｒｅ（１９８１）２９２：
１２８）、およびｔｒｐ−ｌａｃ（ｔｒｃ）プロモータ
ーシステム（Ａｍａｎｎ，Ｅ．およびＢｒｏｓｉｕｓ，
Ｊ．，Ｇｅｎｅ（１９８５）４０：１８３）のような一
般的に使用されるプロモーターを含む。
【００３５】細菌に加えて、酵母またはチャイニーズハ
ムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞のような真核細胞もまた、
宿主として使用し得る。当業者にとっては、種々の真核
宿主との組み合わせに有用な制御配列、複製起点、マー
カーなどは周知である。
【００３６】ｂＦＧＦ（ＭＡＧＳ）のコーディング配列
を含む発現ベクターを、宿主細胞を形質転換するために
使用する。使用する宿主細胞に依存して、その細胞に適
切な標準的技術を用いて形質転換を行なう。Ｃｏｈｅ
ｎ，Ｓ．Ｎ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ
（ＵＳＡ）（１９７２）６９：２１１０に記載の塩化カ
ルシウムを使用したカルシウム処理またはＭａｎｉａｔ
ｉｓら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（１９８２）Ｃｏｌ
ｄ Ｓｐｒｉｎｇ ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，２５４
ページおよびＨａｎａｈａｎ，Ｄ．，Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉ
ｏｌ（１９８３）１６６：５５７−５８０に記載のＲｂ
Ｃｌ2法が、原核細胞または実質的に細胞壁バリアを有
する他の細胞に使用し得る。そのような細胞壁を持たな
い哺乳類の細胞には、Ｇｒａｈａｍおよびｖａｎ ｄｅ
ｒ Ｅｂ，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（１９７８）５２：５４６
のリン酸カルシウム沈澱法が使用し得、任意にＷｉｇｌ
ｅｒ，Ｍ．ら、Ｃｅｌｌ（１９７９）１６：７７７−７
８５によって改変された方法が使用し得る。酵母への形
質転換は、Ｂｅｇｇｓ，Ｊ．Ｄ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９
７８）２７５：１０４−１０９またはＨｉｎｎｅｎ，
Ａ．，ら，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ（Ｕ
ＳＡ）（１９７８）７５：１９２９の方法により実施し
得る。
【００３７】ｂＦＧＦ（ＭＡＧＳ）発現ベクターを有す
る形質転換体は、ベクター構築の際組み込まれる特定の
表現型マーカーに依存して、周知の技術によって同定し
得る。即ち、アンピシリンのような抗生物質の存在下で
の成長によって同定する。制限酵素分析またはジデオキ
シ法による配列決定のような種々の周知技術は、正しい
ベクター構築を確認するために使用し得る。
【００３８】ｂＦＧＦ（ＭＡＧＳ）の発現は、特定のベ
クター構築と使用する宿主細胞に大きく依存し、当業者
には容易に理解される条件下で行ない得る。ベクター
が、ｔｒｐプロモーターのような誘導プロモーターの制
御下にｂＦＧＦ（ＭＡＧＳ）のＤＮＡ配列を有する場合
には、形質転換された宿主細胞を適切な成長媒体に植菌
し、至適密度まで増殖するように使用し得；制御プロモ
ーターからのｂＦＧＦ（ＭＡＧＳ）の発現は、その後、
適切なインデューサー（例えばｔｒｐプロモーターの場
合は、３−β−インドールアクリル酸）の付加によって
誘導し得る。発現したｂＦＧＦ（ＭＡＧＳ）は、天然源
からのｂＦＧＦの精製技術で使用される周知の技術によ
り回収し得る。好適な精製工程においては、発現したタ
ンパク質を含む形質転換体を、機械的または化学的に溶
解し、タンパク質を放出させる。ＤＮａｓｅおよびＲＮ
ａｓｅで処理した後に、反応物を遠心し、上清を市販で
入手可能なヘパリン−セファロースカラム（Ｐｈａｒｍ
ａｃｉａ，Ｉｎｃ．）上に負荷する。カラムを塩濃度が
約１．０Ｍまたはそれ以下のＮａＣｌ緩衝液で洗浄した
後、このｂＦＧＦ（ＭＡＧＳ）は２．０Ｍ ＮａＣｌカ
ラムから溶出し得る。所望されれば、ヘパリン−セファ
ロースクロマトグラフィー段階は、繰り返し得、あるい
はＳ／Ｐ ＳｅｐｈａｄｅｘまたはＭｏｎｏ Ｓ樹脂上
でのイオン交換クロマトグラフィーのような他の周知の
タンパク質精製段階と組み合わし得る。工業規模の生産
においては、最終の形態中にわずかな量のヘパリンも含
むことは好ましくないため、ヘパリン−セファロースク
ロマトグラフィーよりも銅キレートアフィニティクロマ
トグラフィーが好ましい。
【００３９】極めて驚くべきことに、ｂＦＧＦ（ＭＡＧ
Ｓ）がＥ．ｃｏｌｉ Ｂで発現するとき、その発現レベ
ルは、同一の宿主ベクターシステムおよび同一の発現条
件を用いた対応する野生型（突然変異していない）ヒト
ｂＦＧＦの発現よりも、５０％から１００％大きいオー
ダーであることが見い出された。特に、本発明の方法
は、ｂＦＧＦ（ＭＡＧＳ）を、宿主細胞により発現させ
たタンパク質全体の少なくとも１０％のレベルで発現さ
せる。さらにＮ末端アミノ酸分析によると、Ｅ．ｃｏｌ
ｉ ＢでのｂＦＧＦ（ＭＡＧＳ）発現により、実質的に
同一のＮ末端を有する最終タンパク質産物が得られるこ
とが示され、即ち、このタンパク質をＥｄｍａｎ分解法
でＮ末端分析すると、ｂＦＧＦの９５％以上、好ましく
は９８％以上が同一Ｎ末端を有することが示される。
Ｅ．ｃｏｌｉのような原核細胞宿主は、ｂＦＧＦのＡＴ
Ｇ出発コドンによりコードされたＮ末端メチオニン残基
を除去できることが分かっている。従って、本発明の方
法によって、Ｎ末端配列がＡｌａ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−の
１５３アミノ酸残基を有するｂＦＧＦが回収される。
【００４０】本発明により得られるｂＦＧＦ（ＭＡＧ
Ｓ）は、Ｎ末端配列がＡｌａ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ
−であるか、または混合Ｎ末端を有し、対応するｂＦＧ
Ｆと同一の有用性を有している。このｂＦＧＦ（ＭＡＧ
Ｓ）は、創傷の治癒を促進するために有用である。精製
ｂＦＧＦ（ＭＡＧＳ）は一般に、外傷を負った組織に血
管新生および治癒を促すために、局所的に適用される。
適切な基質としては、火傷、皮膚潰瘍、形成手術のよう
な外科的剥離、または治療を要するその他の創傷部位が
ある。ｂＦＧＦ（ＭＡＧＳ）の適用は治癒を促すので、
感染の危険性も減少させる。
【００４１】ｂＦＧＦ（ＭＡＧＳ）が新規の血管新生を
促進する有用性がある適応症は、骨折、靱帯および腱の
修復、腱炎、および滑液包炎などの筋骨格系の症状；火
傷、切傷、裂傷、床ずれなどの皮膚症状、および糖尿病
のような治癒の遅い潰瘍；および虚血および心筋梗塞下
にある組織修復が含まれる。
【００４２】組み換え的に生産されたｂＦＧＦ（ＭＡＧ
Ｓ）の、入手可能な賦形剤およびキャリアを用いた調合
剤は、当業者に周知の標準的方法により調製される。こ
のタンパク質は、外用水薬、ゲル、制御放出システムの
一部、または所望されれば抗生物質のようなさらなる活
性成分を含めた軟膏として調合し得る。
【００４３】表面的な部位に最適である局所用投与で
は、標準的な局所用調合剤は、例えば、患部表面１ｃｍ
2あたりに０．１−１００μｇのｂＦＧＦ（ＭＡＧＳ）
が使用される。そのような溶液は、患部へ１度のみかあ
るいは、２から４週間（または不十分な治療条件ではこ
れよりも長い期間）の間に１日２回まで投与する。調合
剤中のｂＦＧＦ（ＭＡＧＳ）および他の成分の濃度は、
もちろん、創傷の種類と重篤度および患者の体質に依存
する。投与量は、傷跡が残らないようにするために経時
的に少なくし得る。例えば、３度の火傷のような最もひ
どい傷は、ｂＦＧＦ（ＭＡＧＳ）を１００μｇ／ｃｍ2
の投与量で治療し得るが、治療開始後、投与量は傷が治
るに従い次第に約０．１μｇ／ｃｍ2またはそれ以下に
まで下げ得る。キャリアとしてＢＳＡを使用するＦＧＦ
の局所用調合剤は、Ｆｒａｎｋｌｉｎ，Ｊ．Ｄ．ら，Ｐ
ｌａｓｔｉｃ ａｎｄ Ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃ Ｓｕｒｇ
（１９７９）６４：７６６−７７０に開示されている。
【００４４】骨および深部軟組織（表面ではない）の修
復には、投与は局所的であるが、注射または直接インプ
ラントした患部の周辺にゆっくりとした放出形態で投与
することが好ましい。骨の損傷のような症状では手術が
必要になり得、従ってインプランテーションが直接的に
適用となる。ゆっくりとした放出形態は、Ｈｙｄｒｏｎ
（Ｌａｎｇｅｒ，Ｒ．，ら．，Ｎａｔｕｒｅ（１９７
６）２６３：７９７−７９９）またはＥｌｖａｘ ４０
Ｐ（Ｄｏｐｏｎｔ）（Ｍｕｒｒａｙ，Ｊ．Ｂ．，ら，Ｉ
ｎ Ｖｉｔｒｏ（１９８３）１９：７４３−７４７）の
ようにポリマー中に調合し得る。他の徐放システムは、
Ｈｓｉｅｈ，Ｄ．Ｓ．Ｔ．，ら，Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｓｃ
ｉ（１９８３）７２：１７−２２）によって提案され、
および特に表皮増殖因子のための調合剤は、本発明では
好ましくないが、Ｂｕｃｋｌｅｙ，Ａ．，ら，Ｐｒｏｃ
Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ（ＵＳＡ）（１９８５）
８２：７３４０−７３４４によって提案されている。
【００４５】徐放送達の局所的投与では、調合剤中のｂ
ＦＧＦ（ＭＡＧＳ）の濃度は、症状の性質や重篤度およ
びポリマーからのｂＦＧＦ（ＭＡＧＳ）の放出速度を含
めた多くの要素に依存する。一般に調合は、Ｂｕｃｋｌ
ｅｙら（上記Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ
（ＵＳＡ））に記載のように、組織濃度の約１０倍の一
定な局所的濃度を有するように組み立てられる。組織で
のｂＦＧＦ濃度５−５０ｎｇ／ｇ湿重量に基づき（６０
ｎｇ／ｇ湿重量であるＥＧＦと比較し得る）、１時間当
り５０−５０００ｎｇのＦＧＦ放出が受容可能である。
もちろん、初期濃度は傷の重篤度に依存する。
【００４６】ｂＦＧＦ（ＭＡＧＳ）は、表皮増殖因子
（ＥＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ−
αまたはＴＧＦ−β）、インシュリン様増殖因子（ＩＧ
Ｆ−１およびＩＧＦ−２）、イアミン（Ｇｌｙ−Ｈｉｓ
−Ｌｙｓ トリペプチド）および／または血小板由来の
増殖因子（ＰＤＧＦ）などの他の増殖因子と共同して、
および相乗的に、作用し得ることが予測される。さら
に、特に骨の修復には、上皮小体のホルモンが骨の再吸
収を速めるので、上皮小体ホルモンの拮抗薬と共同して
作用し得る。そのため、本発明のｂＦＧＦ（ＭＡＧＳ）
が、上記の１つ以上の因子と組み合わせた同一の組成物
により、または同一のプロトコールで投与される実施例
は、本発明の組成物および投与のプロトコールの範囲に
含まれ、こうして所望される組織修復はさらに効果的に
達成される。
【００４７】ｂＦＧＦ（ＭＡＧＳ）は、神経突起生長、
神経再生、および神経生存を促進するのに効果的である
ため、アルツハイマー病およびパーキンソン病、筋萎縮
性側索硬化症、および一般的な神経システムの老化、お
よび脊髄および末梢神経の損傷のようなある種の神経学
的疾患の治療に有用であり得る。
【００４８】これらの適応のための薬剤投与は、好まし
くは上記創傷治療に関連して述べたものと同じ形態でイ
ンプラントにより行われる。この薬剤は、移植療法のよ
うな細胞培養物のインプラントによって、即ち、移植す
る前に培養物を本発明のｂＦＧＦ（ＭＡＧＳ）調製物で
処理するか、または組み換えＤＮＡ技術によって細胞を
ｂＦＧＦ（ＭＡＧＳ）産生化することにより、送達し得
る。さらに、ｂＦＧＦ（ＭＡＧＳ）は、脊髄液に直接注
射し得、または全身的に適用し得る。全身用調合剤は、
一般に従来技術で知られており、緩衝液または生理食塩
水またはその他の適切な賦形剤中の形態を含む。全身用
調合剤の投与レベルは、上記の局所用調合剤に使用した
濃度と同じ局所的濃度で作用組織へ送達し得る。組織培
養または外植片維持には、０．１−１０ｎｇ／ｍｌの血
清または培養培地が使用し得る。
【００４９】ｂＦＧＦ（ＭＡＧＳ）は、手術中に受けた
傷組織の再形成および修復を助けるために特に有用であ
る。この使用のために、ｂＦＧＦ（ＭＡＧＳ）は、外科
用留め金として使用されるポリマー中に含ませることが
有用であり得る。こうしてこのタンパク質は、この留め
金を用いて行われる機械的縫合を生物学的に補い、組織
の修復において「自然な」治癒工程を促進し助けること
ができる。
【００５０】さらに、ここで議論されているｂＦＧＦ
（ＭＡＧＳ）により与えられるもののような脈管形成刺
激（ａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ ｓｔｉｍｕｌｉ）は組織プ
ラスミノーゲン活性因子（ｔＰＡ）の放出、およびイン
ビトロでの内皮細胞からのコラゲナーゼ放出（Ｇｒｏｓ
ｓ，Ｊ．Ｌ．ら，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃ
ｉ（ＵＳＡ）（１９８３）８０：２６２３）を生じさせ
る。そのため、本発明のｂＦＧＦ（ＭＡＧＳ）もまた、
これらの酵素に反応する症状の治療に有用である。急性
の症状（心筋梗塞や心臓発作を伴う血塊の存在など）に
おいては、血塊を溶かすためにｔＰＡを多量に直接投与
することが必要であり得るが、塞栓を形成する慢性的傾
向の治療においては、血中に適切なレベルのｔＰＡを保
つためのｂＦＧＦ（ＭＡＧＳ）投与が所望され得る。そ
のため、この適応には、筋肉内または皮下注射のような
従来の方法を用いる薬剤の全身的投与が好ましい。
【００５１】以下の実施例は、本発明の実施をさらに示
すことを意図するものであって、本発明の範囲をどのよ
うな点においても制限することを意図するものではな
い。出発物質として使用するウシｂＦＧＦをコードする
ｃＤＮＡは、初めにウシゲノムライブラリーをスクリー
ニングし、重要なプローブを得ることによって得られ、
その後ＰＣＴ公報 ＷＯ ８７／０１７２８に詳述され
ている別のＤＮＡを回収する。しかし、この重要なプロ
ーブの配列、およびウシおよびヒトｂＦＧＦのコーディ
ング領域の配列は周知であり、インビトロで化学的に構
築し得るので、この工程を繰り返す必要はない。さら
に、ヒトおよびウシｂＦＧＦの配列を有するバクテリオ
ファージは、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕ
ｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎに寄託されている。従っ
て、下記の実施例において出発物質として使用されるｂ
ＦＧＦのＤＮＡ配列は、種々の起源のものから入手可能
である。
【００５２】
【実施例】（実施例１） （ｐＴｒｐ−２３３細菌発現プラスミドの構築） Ａ．合成トリプトファンオペロンプロモーターおよびオ
ペレーター調節配列の構築 図３Ａに示す１０個のオリゴデオキシヌクレオチドを、
ホスホトリエステル法によって合成し、精製した。１お
よび１０以外のオリゴデオキシヌクレオチド各々５００
ピコモルを、３７℃で３０分間、６０ ｍＭ Ｔｒｉｓ
−ＨＣｌ、ｐＨ８、１５ｍＭ ＤＴＴ、１０ｍＭ Ｍｇ
Ｃｌ2、［γ−３２ｐ］−ＡＴＰ２０μＣｉおよびポリ
ヌクレオチドキナーゼ（Ｐ／Ｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ
ｌｓ）２０ユニットを含有する溶液２０μｌ中で別々に
リン酸化した。続いて、６０ ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣ
ｌ、ｐＨ８、１５ ｍＭ ＤＴＴ、１０ ｍＭ ＭｇＣ
ｌ2、１．５ｍＭ ＡＴＰおよび別のポリヌクレオチド
キナーゼ２０ユニットを含有する溶液１０μｌを添加
し、その後、３７℃で３０分間、インキュベートした。
インキュベートした後、試料を１００℃で５分間、イン
キュベートした。オリゴデオキシヌクレオチド１および
１０の５００ピコモルを、上記緩衝液からＡＴＰを除い
た溶液３０μｌ中で希釈した。
【００５３】二本鎖対を構築するオリゴデオキシヌクレ
オチド（例えば、オリゴデオキシヌクレオチド１および
２、３および４等、図３Ａ）各々１６．７ピコモルを混
合し、９０℃で２分間、インキュベートし、その後、ゆ
っくりと室温まで冷却した。その後、構築に、各々の対
を他の二本鎖対と結合させ、フェノール／クロロホルム
で抽出し、その後、エタノールで沈澱させた。得られた
オリゴデオキシヌクレオチド対を、５ ｍＭ Ｔｒｉｓ
−ＨＣｌ、ｐＨ８、１０ ｍＭ ＭｇＣｌ2、２０ ｍ
Ｍ ＤＴＴを含有する溶液３０ μｌ中で再構築し、５
０℃で１０分間熱した後、室温まで冷却し、その後、Ａ
ＴＰを添加することにより、最終濃度０．５ ｍＭを得
た。Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ８００ユニットを添加し、得
られた混合物を１２．５℃で１２−１６時間インキュベ
ートした。
【００５４】連結反応混合物をフェノール／クロロホル
ムを用いて抽出し、そのＤＮＡをエタノールで沈澱させ
た。乾燥したＤＮＡを、溶液３０ μｌ中で再構築し、
ＥｃｏＲＩおよびＰｓｔＩを用いて３７℃で１時間消化
した。得られた混合物をフェノール／クロロホルムを用
いて抽出し、エタノールで沈澱させた。その後、Ｌａｅ
ｍｍｌｉ，Ｎａｔｕｒｅ（１９７０）２２７：６８０の
方法に従って、８％ポリアクリルアミドゲル上の電気泳
動により、様々な二本鎖ＤＮＡセグメントを分離した。
加湿ゲルオートラジオグラフィーによってＤＮＡ断片を
視覚化し、長さで約１００ｂｐに相当するバンドを切出
して、一晩溶出した。切出した合成ＤＮＡ断片を、同様
にＥｃｏＲＩおよびＰｓｔＩによって消化したプラスミ
ドＭ１３ｍｐ８またはＭ１３ｍｐ９（Ｍｅｓｓｉｎｇ，
Ｊ．およびＶｉｅｉｒａ，Ｊ．，Ｇｅｎｅ（１９８２）
１９：２６９）に連結し、得られた物質をジデオキシヌ
クレオチド配列分析（Ｓａｎｇｅｒ，Ｆ．ら、Ｐｒｏｃ
Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ（ＵＳＡ）（１９７７）
７４：５４６３）することにより、図３Ａに示す設計配
列を確認した。正しい配列を含有するＭ１３誘導体をＭ
１３−ｔｒｐと名付けた。Ｍ１３−ｔｒｐ中の設計配列
は、ｔｒｐオペロンリーダーペプチドのリボソーム結合
領域に加えて、プロモーター（−３５および−１０領
域）およびトリプトファン（ｔｒｐ）オペロンのオペレ
ーター領域を含有する（図３Ｂ）。図３Ｂに示す配列に
類似の配列が、Ｅ．ｃｏｌｉ中における異種タンパク質
の発現に有用であることが証明されている（Ｈａｌｌｅ
ｗｅｌｌ，Ｒ．Ａ．、およびＥｍｔａｇｅ，Ｓ．，Ｇｅ
ｎｅ（１９８０）９：２７，Ｉｋｅｈａｒａ，Ｍ．ら、
Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ（ＵＳＡ）（１
９８４）８１：５９５６）。
【００５５】Ｂ．合成ｔｒｐプロモーター／オペレータ
ー含有プラスミド、ｐＴｒｐ−２３３の構築 プラスミドｐＫＫ２３３−２（図４Ａ；Ａｍａｎｎ，
Ｅ．およびＢｒｏｓｉｕｓ，Ｊ．，前出）を、ＮｄｅＩ
を用いて完全に消化し、その後、Ｍａｎｉａｔｉｓら、
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｃｏｌｄ Ｓｐ
ｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ
（１９８２），ｐ．３９４の方法により、Ｅ．ｃｏｌｉ
ＤＮＡポリマラーゼＩ、クレノウ断片（Ｂｏｅｈｒｉ
ｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｉｎｃ．）５ユニットを
用いて、末端を満たし、５０ μＭにｄＡＴＰ，ｄＣＴ
Ｐ，ｄＧＴＰおよびＴＴＰを添加した。得られた物質を
２５℃で２０分間インキュベートした。フェノール／ク
ロロホルム抽出およびエタノール沈澱に続いて、Ｎｄｅ
Ｉで消化したＤＮＡを再連結させてＥ．ｃｏｌｉに形質
転換した（Ｎａｋａｍｕｒａ，Ｋ．ら、Ｊ Ｍｏｌ Ａ
ｐｐｌ Ｇｅｎｅｔ（１９８２）１：２８９）。得られ
た、ＮｄｅＩ部位を欠いたプラスミドをｐＫＫ２３３−
２−Ｎｄｅ（図４Ｂ）と命名した。
【００５６】プラスミドｐＫＫ２３３−２−Ｎｄｅ ２
０ナノグラムをＥｃｏＲＩおよびＰｓｔＩを用いて完全
に消化し、その後、Ｍａｎｉａｔｉｓら、前出、ｐｐ．
１３３−１３４に従って、仔ウシの腸ホスファターゼ処
理（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を実施
した。ＥｃｏＲＩおよびＰｓｔＩを用いて、このファー
ジの複製型（二本鎖ＤＮＡ型）を消化することにより、
Ｍ１３−ｔｒｐから合成ｔｒｐプロモーター／オペレー
ター配列５０ナノグラムを得、ＥｃｏＲＩ−ＰｓｔＩを
用いて消化したｐＫＫ２３３−２−Ｎｄｅ１０ナノグラ
ムと混合した。上記のようにＴ４ ＤＮＡリガーゼと連
結した後、得られた混合物をＥ．ｃｏｌｉ ＪＡ２２１
１ｐｐ-／Ｉ’ｌａｃＩに形質転換した。形質転換体
をスクリーニングすることにより、１００ ｂｐ Ｅｃ
ｏＲＩ−ＰｓｔＩ合成ｔｒｐプロモーター／オペレータ
ーを含有するプラスミドＤＮＡの存在をスクリーニング
した。その後、適切なプラスミドを単離してｐＴｒｐ−
２３３と命名した。図４Ｃに、４．４−ｋｂプラスミド
ｐＴｒｐ−２３３のプラスミドマップを示す。
【００５７】（実施例２） （プラスミドｐＴｓＦ１１の構築） Ａ．ヒト塩基性繊維芽細胞増殖因子をコードするｃＤＮ
Ａ配列の構築 参考のため援用されるＰＣＴ公報ＷＯ ８７／０１７２
８；Ａｂｒａｈａｍ，Ｊ．Ａ．ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１
９８６），前出；およびＡｂｒａｈａｍ，Ｊ．Ａ．ら、
Ｔｈｅ ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ（１９８６），前出
に記載されているように、ハイブリダイゼーションプロ
ーブをつくるために、クローンλＢＢ２中に含有された
ウシ塩基性ＦＧＦ ｃＤＮＡを用いることにより、塩基
性ＦＧＦクローンを、ヒトｃＤＮＡおよびゲノムライブ
ラリーから単離した。
【００５８】ウシ塩基性ＦＧＦとヒト塩基性ＦＧＦとの
間には、１５５残基前駆体型に２つの、アミノ酸の違い
がある：１２１位において、ウシのタンパク質はＳｅｒ
を有し、ヒトのタンパク質はＴｈｒを有すること；およ
び１３７位において、ウシのタンパク質はＰｒｏを有
し、ヒトのタンパク質はＳｅｒを有することである。こ
れらの違いは各々の場合において、その部位におけるア
ミノ酸用のコドンにおける、ひとつのヌクレオチドの違
いに相当する。それゆえ、以下に述べるように、ヒトの
タンパク質をコードするために、部位特異性変異誘発に
よって、ウシのｃＤＮＡを便宜的に修正し得る。実際、
部位特異性変異誘発技術の標準的なものを用いることに
より、これらのコドンを変更した。ＥｃｏＲＩを用いて
λ ＢＢ２クローン（ＡＴＣＣ ＮＯ．４０１９６）を
消化し、ｂＦＧＦタンパク質をコードする配列にわたる
１．４ｋｂの領域を、Ｍ１３ｍｐ８のＥｃｏＲＩ部位に
連結した。そして、正しい方向に挿入物を有するファー
ジを回収した。３個のオリゴヌクレオチド：「万能」プ
ライマーである１７−ｍｅｒ；コドン１２１においてコ
ーディング配列を変更する変異誘発性の１６−ｍｅｒ
５’−ＧＡＡＡＴＡＣＡＣＣＡＧＴＴＧＧ−３’（配列
番号１１）；コドン１３７において配列を変更する変異
誘発性の１７−ｍｅｒ ５’−ＡＣＴＴＧＧＡＴＣＣＡ
ＡＡＡＣＡＧ−３’（配列番号１２）の存在下で１回目
のインビトロ変異誘発を実行した。その後、得られた、
変異誘発されたファージを、プライマーで方向づけられ
た、２回目のインビトロ変異誘発にかけることにより、
変異誘発性２５−ｍｅｒ，５’ＴＴＴＴＡＣＡＴＧＡＡ
ＧＣＴＴＴＡＴＡＴＴＴＣＡＧ−３’（配列番号１３）
を用いて翻訳終止コドンから下流にＨｉｎｄＩＩＩ部位
３４ ｂｐを作成した。
【００５９】得られた、変異したＤＮＡをジデオキシヌ
クレオチド配列分析（Ｓａｎｇｅｒら、前出）によって
配列分析することにより、所望の変異が起こったことを
確認した。変異したＭ１３ファージＤＮＡの複製型から
のＨｉｎｄＩＩＩを用いて、ＦＧＦコーディング領域に
わたる約６４０ ｂｐの断片を切出し、ＨｉｎｄＩＩＩ
で消化したｐＵＣ１３（Ｍｅｓｓｉｎｇ，Ｊ．，Ｍｅｔ
ｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ（１９８３）１０１：２０）
に連結することにより、中間プラスミドｐＪＪ１５−１
を得た。
【００６０】Ｂ． Ｎ末端のための合成コーディング領
域を有するヒトｂＦＧＦ ｃＤＮＡの構築 ｐＪＪ１５−１中に含有されるコーディング領域の５’
末端（最初の１２５ｂｐ）のＧ＋Ｃ含有量を低下させる
ために、連続する配列の上にリストアップされている合
成オリゴヌクレオチドを用いて、下に示されている配列
を有する合成ＤＮＡ断片を構築した。オリゴヌクレオチ
ドを対にアニーリングし、その対を順に連結し、Ｈｉｎ
ｄＩＩＩで切断されたＭ１３ｍｐ９に連結した。Ｍ１３
ｍｐ９にクローニングした合成１３５ｂｐ挿入物の配列
を、ジデオキシ配列分析により確認した。合成断片を有
するＭ１３ｍｐ９ファージの複製型を、ＨｉｎｄＩＩＩ
を用いて消化し、１３５ｂｐ断片を単離した。この断片
を、ＨｉｎｄＩＩＩで切断されたｐＵＣ９に連結した。
その後、得られたプラスミドをＮｄｅＩおよびＨｈａＩ
を用いて消化し、合成挿入物の１２６ｂｐサブ断片を単
離した。この１２６ｂｐのＮｄｅＩからＨｈａＩのサブ
断片を、ＪＪ１５−１からの３７７ｂｐのＨｈａＩから
ＨｉｎｄＩＩＩのＤＮＡ断片に結合した。上記３７７ｂ
ｐのＨｈａＩからＨｉｎｄＩＩＩのＤＮＡ断片は塩基性
ＦＧＦコーディング配列のほぼ４分の３にわたり、この
部分は、カルボキシ末端である。その後、得られた物質
を、発現ベクターｐＴｒｐ−２３３のＮｄｅＩおよびＨ
ｉｎｄＩＩＩ部位に連結することにより、プラスミドｐ
ＴｓＦ１１（図５Ａ，５Ｂ）を得た。
【００６１】
【化１】 （実施例３） （ｂＦＧＦのためのｐＴｓＦ−９Δβｇａｌ発現ベクタ
ーの生成）ｔｒｐプロモーター／オペレーターの制御下
でｂＦＧＦを発現させるためのコピー数の多い発現ベク
ターを、以下の方法で調製した。この方法を図５に示
す。Ｅ．ｃｏｌｉ中で機能する複製起点（ｏｒｉ）、ア
ンピシリン耐性遺伝子、ｌａｃプロモーター／オペレー
ター、およびポリリンカー領域を含有するプラスミドｐ
ＵＣ９（図５Ｄ；Ｖｉｅｉｒａ，Ｊ．およびＭｅｓｓｉ
ｎｇ，Ｊ．，Ｇｅｎｅ（１９８２）１９：２５９）を、
ＰｖｕＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）
およびＥｃｏＲＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌ
ａｂｓ）を用いて、製造会社の指示に従って、３．２５
時間消化した。
【００６２】同時に、上記のようにＰｖｕＩおよびＥｃ
ｏＲＩを用いて、ｐＴｓＦ１１ＤＮＡ（図５Ｂ）をイン
キュベートした。２つの制限酵素を用いた消化によって
生成したｐＵＣ９およびｐＴｓＦ１１断片を、Ｔ４ Ｄ
ＮＡリガーゼの存在下で連結した。連結反応を、Ｅ．ｃ
ｏｌｉ Ｂに形質転換した。形質転換体のアンピシリン
耐性コロニーからのプラスミドＤＮＡを、プラスミドサ
イズおよび制限分析によって分析することにより、プラ
スミドを単離した。このプラスミドにおいて、ｐＴｓＦ
１１の適当な断片（ｔｒｐプロモーター／オペレーター
領域、ｂＦＧＦコーディング領域、転写終止配列、およ
びＡｍｐ遺伝子の５’末端半分を含有する約１．５ｋｂ
のＰｖｕＩ−ＥｃｏＲＩ断片）を、図５Ｅに示す方向
で、ｐＵＣ９の約１．７ｋｂのＰｖｕＩ−ＥｃｏＲＩ断
片（複製起点およびＡｍｐ遺伝子の３’末端半分を含有
する）に連結した。このプラスミドをｐＴｓＦ−９と命
名した。
【００６３】製造会社の指示に従って、ＰｖｕＩＩおよ
びＥｃｏＲＩを用いてｐＴｓＦ−９ＤＮＡをインキュベ
ートした。デオキシヌクレオシドトリホスフェートおよ
びＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ断片とともにＤＮＡ
をインキュベートすることにより、ＥｃｏＲＩの開裂部
位における突出部を満たした。Ｔ４ ＤＮＡリガーゼの
存在下での平滑末端の連結により、ＤＮＡを再び円形に
した。Ｅ．ｃｏｌｉＢをアンピシリン耐性に形質転換す
るために、連結反応を用いた。単一のコロニー形質転換
体からのプラスミドＤＮＡを、プラスミドサイズおよび
制限分析によって分析することにより、図５Ｆにおいて
ｐＴｓＦ−９Δβｇａｌと示されているプラスミドを単
離した。満たしたＥｃｏＲＩ部位およびＰｖｕＩＩ部位
の平滑末端連結の結果、ｐＴｓＦ−９Δβｇａｌ中のＥ
ｃｏＲＩ部位を回復させた。プラスミドｐＴｓＦ−９Δ
βｇａｌは、ｔｒｐプロモーター／オペレーターの制御
下のｂＦＧＦコーディング配列、アンピシリン耐性遺伝
子およびＥ．ｃｏｌｉ中で機能する複製起点を含有す
る。
【００６４】（実施例４） （ｂＦＧＦ（ＭＡＧＳ）をコードするＤＮＡ配列の生
成）ｐＴｓＦ１１（ｔｒｐプロモーター／オペレーター
領域およびヒトのｂＦＧＦの１５５残基前駆体型をコー
ドするＤＮＡを含有する）の約５９０ ｂｐのＥｃｏＲ
Ｉ−ＨｉｎｄＩＩＩＤＮＡ断片を、Ｍ１３ｍｐ９のＥｃ
ｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ部位に連結することにより、プ
ラスミドＦＧＦｔ７９１０を構築した。ＦＧＦｔ７９１
０の一本鎖ＤＮＡが単離されると、Ｚｏｌｌｅｒおよび
Ｓｍｉｔｈ，前出に記載されているように、インビトロ
変異誘発を実行した。上記インビトロ変異誘発は、ＡＴ
Ｇ開始コドンによってコードされるメチオニンの直後の
２つのアラニンのうちの１つのためのコドンを欠いた、
ｂＦＧＦのＮ末端の一部位をコーディングする合成オリ
ゴヌクレオチドを用いて行った。この変異誘発の結果、
以下に示すアラニン用のコドンのうちの１つが除去され
た。
【００６５】
【化２】 一本鎖ＤＮＡ１μｇを、リン酸化した変異誘発性のオリ
ゴヌクレオチド５’−ｐＧＴＡＴＣＡＣＡＴＡＴＧＧＣ
ＴＧＧＴＴＣＴＡＴＣ−３’（配列番号２６）５ナノグ
ラムおよびＭ１３万能配列プライマー（Ｐ．Ｌ．Ｂｉｏ
ｃｈｅｍｉｃａｌｓから購入した１７ ｍｅｒ）１ナノ
グラムと、５５℃で５から１５分間、１０ ｍＭ Ｔｒ
ｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．５および１０ ｍＭ ＭｇＣｌ
2を含有する溶液０．０１ｍｌ中でハイブリダイズし
た。反応液を室温まで冷却し、その後、デオキシヌクレ
オシドトリホスフェートｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ
およびＴＴＰ各々０．１２ ｍＭ、ＤＮＡポリメラーゼ
Ｉ（ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍ）のクレノ
ウ断片５ユニット、およびＴ４ ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅ
ｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）２０ユニットを
含有する溶液０．０１ ｍｌを添加し、１５℃で４−６
時間インキュベートした。その後、反応液の一部（０．
００２ ｍｌ）を、競合するＥ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０１
細菌に添加し、３７℃でＬ寒天皿上で一晩培養した。得
られたＭ１３プラークのＤＮＡを、２つのニトロセルロ
ースフィルターの各々に移し、８０℃で減圧下で２時間
焼成し、その後、４２℃で２時間、プレハイブリダイゼ
ーション溶液中でインキュベートした。プレハイブリダ
イゼーション溶液は、６×ＳＳＣ（１×ＳＳＣは１５０
ｍＭ ＮａＣｌ，１５ ｍＭクエン酸ナトリウム，ｐＨ
７．０である），０．１％ドデシル硫酸ナトリウム（Ｓ
ＤＳ）、２×デンハルツ（Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ）
（０．０４％フィコール、０．０４％ポリビニルピロリ
ドン、０．０４％ウシ血清アルブミン）、および変性サ
ケ精子のＤＮＡ０．４ｍｇ／ｍｌを含有する。その後、
［γ−32Ｐ］−ＡＴＰおよびＴ４ポリヌクレオチドキナ
ーゼで標識された５’末端であった変異誘発性オリゴヌ
クレオチドを含有する新に調製したプレハイブリダイゼ
ーション溶液を用いて、４２℃で３時間、フィルターを
インキュベートした。その後、フィルターを、４×ＳＳ
Ｃを用いて室温で１５分間洗浄し、６５℃で１５分間一
回洗浄し、室温でＴＭＡＣｌ溶液（３Ｍテトラメチルア
ンモニウムクロライド、５０ ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣ
ｌ、ｐＨ８．０、２ ｍＭＥＤＴＡ、０．１％ＳＤＳ）
中で一回洗浄し、６５℃でＴＭＡＣｌ溶液中で一回洗浄
し、その後、得られたフィルターを、Ｘ線フィルムを室
温で一晩露光するために用いた。その後、Ｘ線フィルム
上の暗い複写が陽性であるクローンを元の皿から取り出
した。ＤＮＡを単離して、その後、ジデオキシ配列分析
法によって、変異した配列を検出するために分析した。
変異したＭ１３クローンの複製型ＤＮＡを調製し、Ｅｃ
ｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩを用いて消化し、変異した
塩基性ＦＧＦをコードするＤＮＡ断片を、アガローゼゲ
ル電気泳動によって単離した。この断片中の、ｂＦＧＦ
コーディング領域の配列を図２に示す。
【００６６】（実施例５） （ｂＦＧＦ（ＭＡＧＳ）のための発現ベクターの構築）
図６に示す方法に従って、ｂＦＧＦ（ＭＡＧＳ）をコー
ドするＤＮＡ断片の挿入に適した発現ベクターを調製し
た。上記のプラスミドｐＴｒｐ−２３３（図５Ａ、図６
Ａ）を製造会社の指示に従ってＥｃｏＲＩおよびＰｖｕ
Ｉを用いて消化し、ｔｒｐプロモーター／オペレーター
を含有する断片を単離した。同時に、ＥｃｏＲＩおよび
ＰｖｕＩを用いて、ｐＵＣ９を消化し、複製起点を有す
る断片を単離した。単離した断片をＴ４ ＤＮＡの存在
下で連結することにより、ｔｒｐプロモーター／オペレ
ーターおよびｐＴｒｐ−２３３と複製起点とからのポリ
リンカー領域、ｌａｃプロモーター／オペレーターおよ
びｐＵＣ９からのポリリンカーを含有するプラスミドで
あるｐＴｒｐ−９を生成した（図６Ｃ）。ＥｃｏＲＩお
よびＰｖｕＩＩを用いてｐＴｒｐ−９を消化し、上記の
ように、ＤＮＡポリメラーゼＩ、クレノウ断片およびデ
オキシヌクレオシドトリホスフフェートを用いてＥｃｏ
ＲＩ末端を満たした。Ｔ４ ＤＮＡリガーゼの存在下で
平滑末端を連結することにより、ＤＮＡを再び円形にし
た。Ｅ．ｃｏｌｉ Ｂをアンピシリン耐性に形質転換す
るために、連結反応を用いた。単一コロニー形質転換体
からのプラスミドＤＮＡを、プラスミドサイズおよび制
限分析によって分析することにより、ｐＴｓＦ−９Δβ
ｇａｌ−ＧＭ−２（図６Ｄ）と示されたプラスミドを単
離した。
【００６７】プラスミドｐＴｓＦ−９Δβｇａｌ−ＧＭ
−２を、製造会社の指示に従ってＥｃｏＲＩおよびＨｉ
ｎｄＩＩＩを用いてインキュベートし、アンピシリン耐
性遺伝子および複製起点を含有する大きな断片をアガロ
ーゼゲル上で単離した。その後、ｂＦＧＦ（ＭＡＧＳ）
コーディング配列およびｔｒｐプロモーター／オペレー
ターを含有するＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片（実施
例４）をＴ４ ＤＮＡリガーゼの存在下で、ｐＴｓＦ−
９Δβｇａｌ−ＧＭ−２の、単離した断片に連結した。
競合するＥ．ｃｏｌｉ Ｗ３１１０細胞を形質転換する
ために連結を用い、その後、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｗ３１１０
細胞を、アンピシリン１００ μｇ／ｍｌを添加したＬ
寒天皿上で一晩増殖させた。コロニーを選択して、アン
ピシリン１００ μｇ／ｍｌを添加したＬ肉汁中で増殖
させ、その後、プラスミドＤＮＡを細菌から単離して制
限消化によって分析することにより、所望の構築を確認
した。得られたプラスミドはｐＴｓＦ−９Δβｇａｌ
（ＭＡＧＳ）と命名されているが、これは、ｂＦＧＦコ
ーディング配列に代えてｂＦＧＦ（ＭＡＧＳ）コーディ
ング配列を含有する以外は、ｐＴｓＦ−９Δβｇａｌと
同一である。
【００６８】（実施例６） （ｂＦＧＦおよびｂＦＧＦ（ＭＡＧＳ)の発現）ｐＴｓ
Ｆ−９ΔβｇａｌおよびｐＴｓＦ−９Δβｇａｌ（ＭＡ
ＧＳ）のプラスミドを別々にＥ．ｃｏｌｉのＢ細胞に形
質転換した。単コロニーを用いて培養物をＬ＋ａｍｐ培
地に植え付けた後、３０℃で５時間増殖させた。次にこ
れらの培養物を用いて発現培養物（０．５％のカサミノ
酸（ｃａｓａｍｉｎｏ ａｃｉｄ）、０．４％のグルコ
ース、２μｇ／ｍｌのチアミン、０．１ｍＭのＣａＣｌ
2、０．８ｍＭのＭｇＳＯ4、および５０μｇ／ｍｌのア
ンピシリンを含有するＭ９塩に１から１００倍に希釈し
たもの）を接種した。５０μｇ／ｍｌの３−β−インド
ールアクリル酸を添加して、ｔｒｐプロモーターを誘導
して、培養物を一夜３０℃で増殖した。１４から１８時
間後に、Ａ550を測定して、１単位吸光度の細胞ペレッ
トを１００μｌのＳＤＳ含有ポリアクリルアミドゲル負
荷用緩衝液に再懸濁して、煮沸した。得た１０μｌの上
清を１５％のアルクリアミド−ＳＤＳゲルに負荷して、
電気泳動にかけた。ゲルをクーマシーブルーで染色し
た。図７は、レーン１に分子量マーカーを伴った染色し
たゲルの写真である。レーン２および３に、ｐＴｓＦ−
９Δβｇａｌ形質転換細胞の２つの培養物から抽出した
タンパク質を負荷した。レーン４および５に、ｐＴｓＦ
−９Δβｇａｌ（ＭＡＧＳ）形質転換細胞の２つの培養
物から抽出したタンパク質を負荷した。レーン６は、ｂ
ＦＧＦ標準を含有する。レーン４および５のｂＦＧＦ
（ＭＡＧＳ）に対応するバンドは、レーン２および３の
ｂＦＧＦに対応するバンドより視覚的に暗い。
【００６９】レーン２から５の、様々な種類のタンパク
質の相対濃度をスキャニング濃度計により測定した。図
８Ａから８Ｄはレーン２から５のそれぞれの濃度をプロ
ットしたものである。ｂＦＧＦまたはｂＦＧＦ（ＭＡＧ
Ｓ）のピークは矢印で示されている。全細胞タンパク質
に比例して発現するｂＦＧＦまたはｂＦＧＦ（ＭＡＧ
Ｓ）の量は、濃度計によるプロットのカーブの下の面積
に基づいて各培養物について計算される。ｐＴｓＦ−９
Δβｇａｌで形質転換された２つの培養物（図８Ａ−８
Ｂ）の平均発現レベルは、全細胞タンパク質の６．７％
であり、一方、ｐＴｓＦ−９Δβｇａｌ（ＭＡＧＳ）で
形質転換された２つの培養物（図８Ｃ−８Ｄ）の平均発
現レベルは、全細胞タンパク質の１０．８％であった。
【００７０】（実施例７） （ｂＦＧＦ（ＭＡＧＳ）のＮ末端配列の決定）実施例６
と同様の手順により、ｐＴｓＦ−９Δβｇａｌ（ＭＡＧ
Ｓ）で形質転換されたＥ．ｃｏｌｉＢ細胞をカサミノ酸
および５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＭ９培
地２リットルで増殖した。培養物を光学濃度が０．５８
（５５０ｎｍで測定）になるまで増殖し、５０μｇ／ｍ
ｌの３−β−インドールアクリル酸で誘導し、その後振
盪させながら一夜３０℃でインキュベートした。培養物
を遠心分離機にかけ、細胞ペレットを、２０ｍＭのＴｒ
ｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、５ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭ
のフェニルメチルスルフォニルフルオライド、および
０，５ｍｇ／ｍｌのリゾチーム含有溶液３０ｍｌに再懸
濁した。氷の上に３０分置いた後、上清に超音波をあて
て細胞を破砕した。ＲＮアーゼおよびＤＮアーゼを各１
００μｇ添加した。氷の上に３０分置いた後、混合物を
遠心分離機にかけ、上清を精製のため取り除いた。
【００７１】上清を、２０ｍＭのリン酸ナトリウムｐＨ
７、５ｍＭのＥＤＴＡで平衡化したＳＰ−セファデック
スのカラム（２．５ｃｍ×２ｃｍ）に供した。カラム
を、２８０ｎｍでの吸光度が基準レベルに戻るまで同じ
緩衝液で洗浄した。タンパク質を２０ｍＭのリン酸ナト
リウムｐＨ７、５ｍＭのＥＤＴＡ、５００ｍＭのＮａＣ
ｌでカラムから溶離させた。
【００７２】ＳＰ−セファデックスカラムから５００ｍ
ＭのＮａＣｌをぬいて、２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣＬ、
ｐＨ７．５、５ｍＭのＥＤＴＡ、６００ｍＭのＮａＣｌ
で平衡化したヘパリン−セファロースのカラム（２．５
ｃｍ×２ｃｍ）に負荷した。カラムを、２８０ｎｍでの
吸光度が基準レベルに戻るまで同じ緩衝液で洗浄した。
タンパク質を２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．
５、５ｍＭのＥＤＴＡ、２ＭのＮａＣｌで溶離させた。
【００７３】このようにして得られたｂＦＧＦ（ＭＡＧ
Ｓ）を自動ガス相シークエネーターを用いてエドマン分
解法によりＮ末端アミノ酸配列を分析した。多量のタン
パク質をシークエネーターに負荷すると、極少量の、す
なわち１〜２％の、Ｎ末端配列Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−を有す
るタンパク質が検出され、残りは、Ｎ末端配列Ａｌａ−
Ｇｌｙ−Ｓｅｒを有するタンパク質であった。ｂＦＧＦ
をｐＴｓＦ−９Δβｇａｌで形質転換されたＥ．ｃｏｌ
ｉＢ細胞を用いて、本質的に同様の方法で生産して精製
すると、得られたタンパク質は約７０％のＡｌａ−Ａｌ
ａ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−および３０％のＡｌａ−Ｇｌｙ−
Ｓｅｒ−を含有する混合Ｎ末端配列を示した。
【００７４】
【発明の効果】本発明によれば、異なるＮ末端アミノ酸
配列を有するヒト塩基性繊維芽細胞増殖因子のどの種も
実質的に含んでいない、Ｎ末端にアミノ酸配列Ａｌａ−
Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−を有するヒト塩基性繊維芽細胞増殖因
子が提供される。
【００７５】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１Ａ】図１Ａは、ヒトｂＦＧＦコードする単離され
た天然のｃＤＮＡ配列、ならびに１５５−残基一次翻訳
産物の推定アミノ酸配列を示す（配列番号１および配列
番号２）。
【図１Ｂ】図ｌＢは、ウシｂＦＧＦコードする単離され
た天然のｃＤＮＡ配列、ならびに１５５−残基一次翻訳
産物の推定アミノ酸配列を示す（配列番号３および配列
番号４）。
【図２】図２は、ｂＦＧＦをコードするＤＮＡ配列を示
す（配列番号５および配列番号６）。このＤＮＡ配列
は、図１Ｂのウシ配列の５’末端の部分（図示されてい
るＨｈａＩ部位から上流）を、天然のウシ配列と比較し
てＧ＋Ｃの含有量が少ない合成ＤＮＡ配列と置き換え、
Ｎ末端メチオニンの直後にある２つのアラニン残基のう
ちの１つの残基のコドンを欠失させ、図１Ｂのコドン１
２１および１３７を、それぞれＡＣＣおよびＴＣＣに変
換させ、ｃＤＮＡ配列が（ｉ）Ｎ末端アラニンの１つを
欠失しているヒトｂＦＧＦをコードし、（ｉｉ）その
５’および３’末端を、それぞれＮｄｅＩ部位およびＨ
ｉｎｄＩＩＩ部位ではさまれるように、翻訳終止コドン
の３’側にＨｉｎｄＩＩＩ制限エンドヌクレアーゼ部位
を形成することによって、生産された。
【図３】図３は、本発明のＤＮＡ配列の制御発現に使用
されるｔｒｐプロモーター／オペレーター配列（Ｂ）
（配列番号９および配列番号１０）を結合することによ
り形成した、一連の合成オリゴデオキシヌクレオチド
（Ａ）（配列番号７および配列番号８）を示す。
【図４】図４は、ヒトｂＦＧＦをコードするＤＮＡ配列
が挿入されてｐＴｓＦ１１を形成する、ｐＴｒｐ−２３
３の構築を示す。
【図５Ａ】図５Ａは、ヒトｂＦＧＦの発現ベクターであ
る、ｐＴｓＦ−９Δβｇａｌの調製を模式的に示す。
【図５Ｂ】図５Ｂは、図５Ａの続きである。
【図６】図６は、ｂＦＧＦ（ＭＡＧＳ）コーディング配
列の挿入に適した発現ベクターである、ｐＴｓＦ−９Δ
βｇａｌ−ＧＭ−２の調製を模式的に示す。
【図７】図７は、クーマシーブルーで染色したＳＤＳ−
ＰＡＧＥゲルの写真である。このゲル上では、ヒトｂＦ
ＧＦをコードするＤＮＡ配列で形質転換されたＥ．ｃｏ
ｌｉの発現産物が、ヒトｂＦＧＦのアラニン欠失形態を
コードする本発明のＤＮＡ配列で形質転換されたＥ．ｃ
ｏｌｉの発現産物に沿って電気泳動された。
【図８Ａ】図８Ａ、８Ｂ、８Ｃおよび８Ｄは、図７のＳ
ＤＳ−ＰＡＧＥゲルのレーン２から５におけるそれぞれ
のタンパク質の一連の走査デンシトメトリーによるプロ
ットである。
【図８Ｂ】図８Ａ、８Ｂ、８Ｃおよび８Ｄは、図７のＳ
ＤＳ−ＰＡＧＥゲルのレーン２から５におけるそれぞれ
のタンパク質の一連の走査デンシトメトリーによるプロ
ットである。
【図８Ｃ】図８Ａ、８Ｂ、８Ｃおよび８Ｄは、図７のＳ
ＤＳ−ＰＡＧＥゲルのレーン２から５におけるそれぞれ
のタンパク質の一連の走査デンシトメトリーによるプロ
ットである。
【図８Ｄ】図８Ａ、８Ｂ、８Ｃおよび８Ｄは、図７のＳ
ＤＳ−ＰＡＧＥゲルのレーン２から５におけるそれぞれ
のタンパク質の一連の走査デンシトメトリーによるプロ
ットである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 25/00 Ａ６１Ｐ 25/16 25/16 25/28 25/28 29/00 29/00 43/00 １０５ 43/00 １０５ Ｃ０７Ｋ 14/50 Ｃ０７Ｋ 14/50 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ // Ａ６１Ｋ 38/22 Ａ６１Ｋ 37/24 (72)発明者 スチュワート エイ．トンプソン アメリカ合衆国 カリフォルニア 94040 マウンテン ビュー，ナンバー 1005, ライト アベニュー 928 (72)発明者 ジュディス エイ． エイブラハム アメリカ合衆国 カリフォルニア 94086 サニーベイル，＃アイ−207，エス． フェアオークス アベニュー 655 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA80 CA04 CA05 DA06 EA04 GA11 HA01 4C084 AA02 AA06 AA07 BA01 BA08 BA22 BA23 CA53 CA56 DB54 NA14 ZA012 ZA022 ZA162 ZA542 ZA892 ZA962 ZB112 ZB222 ZC352 4H045 AA10 BA10 CA40 EA20 FA74 GA15 GA23 GA26

Claims (5)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 Ｎ末端メチオニン残基が翻訳後欠失され
    る宿主細胞内で、該Ｎ末端メチオニンの直後の２個のア
    ラニン残基のうち少なくとも１個がない、哺乳類の塩基
    性繊維芽増殖因子の前駆体型の１５５アミノ酸をコード
    するＤＮＡ配列を発現する、工程；および該Ｎ末端メチ
    オニン残基のない発現されたタンパク質を回収する、工
    程によって生産される、塩基性繊維芽増殖因子。
  2. 【請求項２】 前記発現されるＤＮＡコーディング配列
    は、Ｎ末端メチオニン残基の直後にある２個のアラニン
    残基の１個が欠失されたヒト塩基性繊維芽細胞増殖因子
    の前駆体型の１５５アミノ酸をコードする配列を含有す
    る、請求項１に記載の塩基性繊維芽増殖因子。
  3. 【請求項３】 前記発現されるＤＮＡコーディング配列
    は、塩基７から９のアラニン（ＧＣＣ）コドンを除いた
    図１のコーディング配列を含有する、請求項１に記載の
    塩基性繊維芽増殖因子。
  4. 【請求項４】 前記発現されるＤＮＡコーディング配列
    は、配列番号５のコーディング配列である、請求項１に
    記載の塩基性繊維芽増殖因子。
  5. 【請求項５】 前記塩基性繊維芽細胞増殖因子は、宿主
    細胞によって発現された全タンパク質の少なくとも１０
    ％のレベルで発現される、請求項１に記載の塩基性繊維
    芽増殖因子。
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