JP3148237B2 - 形質転換されたマウス赤白血病細胞 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 技術分野 本発明は、組換えDNA技術、殊に哺乳動物宿主中でポ
リペプチドを製造する方法に関する。更に、本発明は、
このような方法に使用するためのベクター及びこのよう
なベクターから製造される宿主細胞に関する。

発明の背景 多くの生物学的に活性の蛋白質又はポリペプチドは、
真核細胞中で製造されるが、それらの天然の細胞又は組
織中には微少量でのみ発見されている。これら蛋白質
は、しばしば天然供給の不足に基づき、多量に精製する
ことは極めて困難であるか又は経費がかかる。組換えDN
A法は、重要な蛋白質をコードする相補的DNA（cDNA）配
列の発生を許している。これらcDNAは、クローニングベ
クター中に（表現のために必要な適切な調節領域に沿っ
て）挿入でき、かつ適切な宿主細胞中に導入することが
できる。適切な細胞中へのこのようなベクターの導入
は、細胞がcDNAでコードされたポリペプチドを製造せし
める。類似のベクターは、所望遺伝子を形成するゲノム
性（即ちイントロン及びエキソンを有する）配列を用い
て製造できる。真核細胞（及び特に哺乳動物細胞中の）
は、原核細胞中での表現では観察されない多くの転写後
装飾（例えばアミド化、グリコシル化等）を実施するこ
とができる。結果として、哺乳動物細胞は、しばしば、
生物学的に活性の天然蛋白質分子により近似している蛋
白質を生産する。しかしながら、哺乳動物細胞の大規模
培養は高価であり、原核細胞の培養よりも遅く、従って
１動物細胞当りの生産性を増加させ、動物細胞により生
産された蛋白質の有用な量を生ぜしめる時間を減少させ
る方法がしきりに探求されている。

一般に、異種DNA（例えば前記のベクター）の動物細
胞中に導入は、細胞のゲノム中への１以上のDNAコピー
のランダム組込みをもたらす。異種遺伝子からの遺伝子
表現のレベルは、宿主ゲノム中への異種DNAの組込みの
位置に非常に依存する（位置効果）。いわゆる活性領域
内への組込みは、通例、いくらか高いレベルの表現を生
成するが、これらは、しばしば、天然の染色体（トラン
スフェクトされていない）遺伝子で見られるレベルに比
べてなお低い。このトランスフェクトされた遺伝子のレ
ベルは、一般に、任意の１細胞のコピー数即ち位置効果
のもう１つの結果とは関連しない。

トランスフェクトされた宿主細胞の生産性を増すため
に使用される一般的技術は、高コピー数組込み体を生産
するための組込まれた異種DNAの生体内増幅である。こ
の方法で、当該遺伝子（適当な対照配列を伴なう）を、
毒性物質に対する保護作用を有してよい遺伝子で、共に
トランスフェクトさせる。通例使用される保護遺伝子
は、ジヒドロフォレートレダクターゼ（DHFR）遺伝子で
ある。メトトレキサート（MTX）、主要酵素DHFRの競争
的抑制剤の増加性濃度をこのトランスフェクトされた細
胞に適用すると、DHFRの高表現レベルを有する細胞のみ
が生存する。MTXレベルが増幅すると、DHFR遺伝子のコ
ピー数を増幅する（結果的に共−トランスフェクトされ
た組換え表現構成）細胞のみが生存する。こうして、cD
NAのコピー数及び従って表現レベル（即ち１細胞当りの
生産性）は増大されうる。

最近、ヒトグロビン座からの新規エンハンサー類似エ
レメントが文献に記載され（Grosveld等1987、国際特許
89/01517）、これは、赤芽細胞（Erythroid cell）中
の非相同遺伝子の位置無関係で、コピー数依存性の高レ
ベル表現を指向する。このエレメントは極めて細胞型特
異的であり、赤芽細胞中でのみ機能する。この優性コン
トロール領域（DCR）エレメントは、赤芽細胞内のヒト
β−グロビンの表現における位置効果を克服するために
使用されている。これに関して、国際特許（WO）89/015
17は、グロビンプロモーターからのβ−グロビンの表現
におけるこのエンハンサーエレメントの使用を記載して
いる。

しかしながら、赤芽細胞の特性及びこの細胞が有意の
レベルの分泌が不可能であることが理解されているの
で、非相同蛋白質の表現のためにDCRを使用することは
広く行きわたってはいない。

非相同ポリペプチドを表現することのできる哺乳動物
表現系（expression system＝発現系とも言う）に対す
る要求が存在する。

高レベルでポリペプチドを表現することのできる改良
された哺乳動物表現系も必要となっている。

高レベルでポリペプチドを表現し、この表現ポリペプ
チドを分泌することのできる哺乳動物表現系に対する要
求も存在する。

発明の詳細 ところで、今般、哺乳動物表現系を非相同ポリペプチ
ドを表現するために使用することができ、殊にDCRを有
する特定の哺乳動物表現系は、高レベルでポリペプチド
を表現することができることを発見した。高レベルでポ
リペプチドを表現することができ、かつこの表現された
ポリペプチドを分泌することのできる哺乳動物系をも発
見した。

従って、本発明は、非相同ポリペプチドを表現するこ
とのできる哺乳動物表現系を提供する。

従って、本発明は、プロモーター、所望の異種ポリペ
プチド及び優性コントロール領域をコードするDNA配列
を有するベクターで哺乳動物宿主を形質転換することよ
りなる、表現系を提供する。

所望の非相同ポリペプチドをコードするこのDNA配列
は、一般に、天然の宿主中に発見されていないような非
相同遺伝子である遺伝子より成る。

プロモータは、宿主細胞中で機能することのできる任
意のプロモータより成っていてよい。例えば、このプロ
モータは、天然の宿主中に認められるプロモータより成
っていてよいか又は、非相同プロモータ即ち、天然の宿
主中には通例認められないプロモータより成っていてよ
い。例えば宿主が赤芽細胞である場合の前者の例では、
このプロモータはβ−グロビンプロモータより成ってい
てよい。宿主が赤芽細胞のような細胞である場合の後者
の例では、プロモータは、例えばPAL2プロモータであ
る。

有利な哺乳動物宿主の例には、例えば、赤芽細胞例え
ばマウス赤白血病（MEL）、ラット赤白血病（REL）及び
ヒト赤白血病（HEL）の細胞が包含される。特に好適な
宿主は、MEL細胞であり、これの生産及び特徴付けは、
ディセロース（Deisseroth）等によるプロシーディング
ス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミィ・オブ・サイエ
ンシス（Proceedings of the National Academy of
Sciences）72巻、No.3、P1102−1106;ディセロース及び
ヘンドリック（Hentrick）のセル（Cell）15、55−63、
1978及びフレンド（Friend）等のプロシーディングス・
オブ・ザ・ナショナル・アカデミィ・オブ・サイエンシ
ス、68巻、P378−382、1971に記載されている。

本発明の表現系は、特に有利であることが判明した。
宿主が赤芽細胞（殊にMEL細胞）である場合の例で、そ
の表現系は、極めて有利であることが判明した。このよ
うな表現系の利点には、例えば、宿主は、高血清などを
特別に要求する必要なしに、相対的に容易に培養するこ
とができることが包含される。予想外に、この系は、高
度に表現することのできる個々のクローンを選択する必
要なしに、有効に機能することも判明した。従って、本
発明の表現系は、意想外に有効でありかつフレキシブル
な系であることが判明した。

更に、宿主が赤芽細胞である場合に、その表現は意想
外の効果を有して起こりうることが判明した。表現は、
細胞壁内に局在する細胞内であってよいか又は、分泌を
伴なってもよい。このことは予想外のことであった。特
に、このような表現系を分泌を得るために使用できると
は、予想されていなかった。

表現系は、それが非相同プロモータより成るように構
成されてもおり、このような系は、意想外の作用効果を
有することが判明した。

本発明の表現系を提供するために有用なベクターは、
本発明のもう１つの態様である。

有利なベクターには、所望のポリペプチドをコードす
るDNA配列から生産されたmRNAを安定化することのでき
る配列を包含する。このようなベクターは、それらが高
レベルの表現を生ぜしめることに特に有利であることが
判明した。

本発明の有利な１態様によれば、プロモータ、優性コ
ントロール領域、所望のポリペプチドをコードするDNA
配列及び所望のポリペプチドをコードする前記DNA配列
から製造されたmRNA上に安定性を与えることのできるDN
A配列より成るベクターが提供される。

所望のポリペプチドをコードするDNAは、cDNAより成
ることが有利である。

ここで使用されている用語“優性コントロール領域
（dominant control region）（又はDCR）”とは、優
性コントロール領域と相容性の宿主のゲノム中に組み込
まれた際に、連結された遺伝子表現系上に、宿主細胞型
制限され、組込み部位無関係で、コピー数依存性の表現
の特性を与えることのできるDNAの配列を意味する。こ
の優性コントロール領域は、完全に再構成される際に宿
主細胞の染色体内でこの特性を保留し、直接有効宿主細
胞型制限された表現への能力は、非相同バックグラウン
ド例えば相同染色体の異なる部分中又は異なる染色体中
で完全に再形成される場合でも、保持される。

ここで使用されている「ベクター」なる用語は、広い
意味で用いられており、この中には、１つの細胞から他
へDNAを移行することのできる任意の組換えDNA物質も包
含される。このベクターは、線状又は環状のDNAの単一
片より成っていてよい。

従って、本発明は、哺乳動物宿主細胞内に組み込むこ
とのできるベクターを提供する。本発明は、転移ベクタ
ー例えば組込み用ベクターの構成で有用であるプラスミ
ドをも提供する。

前記のDNA配列に加えて、このベクターは、他の特別
の用途に好適なDNA配列例えば適当なコントロール配列
を包含してもよい。例えば、このベクターは、細菌宿主
例えばE.コリー中のベクターの複製及び選択を許容する
DNA配列を有していてもよい。このベクターは、表現時
に、組換え宿主細胞を毒性物質に対して保護することの
できるような量で蛋白質を生ぜしめる「選択可能なマー
カー」遺伝子を包含していてよい。選択可能なマーカー
の例には、ネオマイシン及びヒドロマイシンマーカーが
包含される。一般に、このcDNA表現ベクターは、プロモ
ータと相容性であるポリアデニル化部位を包含する。例
えば、このポリアデニル化部位は、β−グロビン遺伝子
のそれであってよく、この場合には、これは、β−グロ
ビンポリアデニル化部位の下流の配列例えばポリアデニ
ル化部位の下流の約2kbの配列を伴なっていてよい。

プロモータは、宿主細胞中で機能することのできる任
意のプロモータより成っていてよい。例えば、このプロ
モータは、β−グロビンプロモータ又はPLA2プロモータ
より成っていてよい。本発明の１態様では、特に宿主が
赤芽細胞である場合には、このプロモータがβ−グロビ
ンプロモータより成るのが有利である。本発明のもう１
つの態様では、このプロモータがPLA2プロモータより成
り、宿主細胞が赤芽細胞より成るのが有利である。

所望のポリペプチドをコードするDNA配列から製造さ
れたmRNA上に安定性を与えるDNA配列は、所望のポリペ
プチドをコードするDNA配列に結合させることができ、
こうして、所望のポリペプチドをコードするDNA配列か
らのmRNAよりもより安定であるハイブリドmRNAが製造さ
れる。この配列は、直接、相互に又は間接的に結合する
ことができる（即ち、これらは、連続的であってよいか
又は他のDNA配列により分けられていてよい）、但し、
所望のポリペプチドをコードするDNAから製造されたmRN
Aよりも安定であるハイブリドmRNAを製造することによ
り、所望のポリペプチドをコードするDNAから製造され
るmRNA上に安定性を与えることを前提とする。

mRNA上に安定性を与えることのできる配列は、有利
に、正確にスプライスされたRNAを生ぜしめる適当なス
プライス部位をも提供することができる。

mRNA上に安定性を与えることのできる配列は、哺乳動
物遺伝子からのエキソン及びイントロンより成っていて
よい。このようなイントロン及び／又はエキソンは、全
体として又は部分的に存在していてよい。

mRNA上に安定性を与えることのできる配列の特別な例
は、β−グロビン遺伝子よりなる配列又はこれから誘導
された配列（例えばβ−グロビン遺伝子の部分）、殊
に、これから誘導された２個のエキソン及び１個のイン
トロン例えばエキソン２、イントロン２及びエキソン３
より成る配列である。この又は各々のエキソン及び／又
はイントロンは、長さが減少されていてよく、殊にエキ
ソン２は、配列がエキソン２又はエキソン２の１部分即
ちイントロン２とエキソン３より成っていてよいような
長さに減少されていてよい。

この配列は、β−グロビン遺伝子の３′末端又はその
１部分を包含するのが一般に有利である。例えば、この
配列は、β−グロビン遺伝子中の塩基4845の所に天然Xb
a I部位に到るまでの配列を包含していてよい。

β−グロビン遺伝子は、広く報告されている（例えば
Lawn等のCell21、647−651、1980参照）。

cDNA配列は、所望のポリペプチドをコードし、これ
は、例えば細胞内、細胞表面又は分泌ポリペプチドのも
とでありうる。cDNA配列の例には、ヒトβ−グロビンcD
NA、ヒト生長ホルモンcDNA、ヒトPLA2cDNA及びヒトＧ−
CSFcDNAが包含される。

プロモータは非相同プロモータであるのが有利であ
る。非相同プロモータ例えばPLA2プロモータが使用され
る場合には、得られる表現のレベルは、意想外に高い。

優性コントロール領域又はDCRは、国際特許（WO）89/
01517（Grosveld等）に規定された配列より成っていて
よい（この文献中優性アクチベータ配列と称されてい
る）。

この優性コントロール領域は、組換えDNA技術によ
り、天然起源遺伝子系から誘導することができるか又
は、天然起源遺伝子系に関連する配列データからのポリ
ヌクレオチド合成の公知技術を用いて製造される意味で
天然起源遺伝子系に相当しうる。優性コントロール領域
の機能を変えない配列の変更を行なうことができる。

有利に、それから優性コントロール領域が誘導される
か又はこれと調和する天然起源遺伝子系は、有利に高度
に宿主細胞型制限された表現特性を高レベルで示す系で
ある。このような系の特別な例は、ヘモグロビン系例え
ばβ−グロビン系及びリンパ系例えばCD2系である。

優性コントロール領域は、１以上のDNアーゼＩ超増感
部位（super hypersinsitive site）から成るか又は
それから誘導されているか又はそれに相当し、有利に細
胞特異的表現可能な任意の遺伝子系より成っていてよ
い。しかしながら、他の配列が優性コントロール領域の
機能的特徴を提示することもできる。天然起源優性コン
トロール領域が介在ポリヌクレオチド配列により分けら
れた２個以上の配列より成る場合、この優性コントロー
ル領域は、１以上の介在配列の全て又は１部の不存在で
連結された２個以上の亜配列より成っていてよい。従っ
て、天然起源の遺伝子座の優性コントロール領域が介在
非機能配列（例えば２個以上の超増感部位）で分離され
た２個以上の不連続の亜配列から成る場合には、本発明
のベクターは、除去された介在配列の全て又は１部分と
連結した２以上の亜配列より成る優性コントロール領域
より成っていてよい。

DCRは、β−グロビン遺伝子座から誘導できる。国際
特許（WO）89/01517号に記載のように、β−グロビン遺
伝子座は、DCRを構成する多くのDNアーゼＩ超過敏部位
を有する。特に、この優性コントロール領域は、β−グ
ロビン座内で同定されたDNアーゼＩ超増感部位１以上を
有する。これらは、場合によっては３′境界配列を有し
て座の５′境界からのものであるのが有利である。この
優性コントロール領域は、β−グロビン座内のイプシロ
ン−グロビン遺伝子の直ぐ上流で−1kb Cla I〜−22kb
Bg IIIの21kbのフラグメント内に存在する。この領域
は、介在ポリヌクレオチドを有する４個のDNアーゼＩ超
増感部位を有する（この５個の明確な部位の２つは非常
に相互に近接している）。介在ヌクレオチドの全て又は
いくつかを公知方法例えばエキソヌクレアーゼを用いる
消化により除去するのが有利である。連結された遺伝子
表現系の表現の有意に増加されたレベルを示す、還元形
のβ−グロビン優性コントロール領域が製造された。こ
れは、次の４個のフラグメントの連結により製造された
（WO89/01517参照）： 2.1kb Xba I−Xba I 1.9kb Hind III−Hind III 1.5kb Kpn I−Bgl II 1.1kb 部分Sac Iフラグメント。

マイクロ座（micro locus）として公知のこの優性コ
ントロール領域は、特異的遺伝子表現系を活性化するた
めにカセット（cassette）として使用することのできる
6.5kbフラグメントである。

この優性コントロール領域は、CD2遺伝子座から誘導
することができる。CD2遺伝子座は、３個の超増感部
位、この座の５′境界に１個、この座の３′境界に２個
を有する。この優性コントロール領域は、CD2座内に１
個以上のDNアーゼＩ超増感部位を有するのが有利であ
る。この優性コントロール領域は、双方共、場合により
任意の欠失された介在配列の全て又は１部分と共に座の
３′境界からの超増感部位を有するのが最も有利であ
る。この優性コントロール領域は、5.5kbBam III−Xba
I内に、CD2遺伝子に対するフラグメント３′を有してい
る。

特に重要な１態様において、本発明によるベクター
は、プロモータ、優性コントロール領域、所望のポリペ
プチドをコードするcDNA配列及び該cDNA配列に結合して
cDNA単独からのmRNAよりも宿主中でより安定であるハイ
ブリドmRNAを生成するDNA配列より成る。

種々の配列の例は、前記のものである。

前記のように、DNA配列は、直接的又は間接的に結合
されうる。

本発明は、ポリペプチドの製造法をも包含し、この方
法は、本発明の表現系を培養することより成る。従っ
て、宿主を、宿主の生長に必要な適当な条件下で培養す
る。

前記のように、本発明の表現系又は宿主（及び従って
ベクター）は、ポリペプチドの分泌を得るために使用す
ることができる。

従って、本発明は、哺乳動物宿主中で、ポリペプチド
を該宿主細胞から分泌させてポリペプチドを製造するた
めに使用するベクターも提供され、このベクターは、プ
ロモータ、優性コントロール領域及び所望ポリペプチド
をコードしている遺伝子より成る、但し、該遺伝子はヒ
トβ−グロビン遺伝子ではない。

プロモータ及び優性コントロール領域又はDCRは、前
記定義を有する。用語「ベクター」及び任意の付加的配
列も前記定義のものである。

ベクターは、哺乳動物宿主からのポリペプチド分泌を
得るために使用できる。

本発明の第２の態様において、遺伝子は、宿主細胞か
ら分泌されうるポリペプチドを生産するように表現する
ことのできる任意のDNA配列より成っていてよい。

従って、本発明は、ポリペプチドの製法をも提供し、
この方法は、本発明の第２の態様で定義されているよう
なベクターを用いて形質転換された哺乳動物宿主より成
る表現系を培養して、この宿主から分泌されるポリペプ
チドを生産させることよりなる。

本発明のもう１つの態様においては、哺乳動物宿主例
えば赤芽細胞（この中でこの宿主細胞からポリペプチド
が分泌される）中でポリペプチドを生成する方法が提供
される。

一般に、分泌されたポリペプチドを、当業者に周知の
標準的方法で収穫し、必要な場合には、更に処理又は精
製することができる。宿主は、前記定義のようなベクタ
ーを含有していてよい。

宿主は前記定義のような宿主より成っていてよい。一
般に、この宿主は赤芽細胞特に赤白血病細胞（例えばマ
ウス赤白血病細胞）より成るのが有利である。

本発明のベクター（前記定義のような）を製造する方
法も提供される。

本発明により、本発明の宿主を製造する方法も提供さ
れ、この方法は、哺乳動物宿主を、本発明のベクターを
用いて形質転換又はトランスフェクトさせることより成
る。

このベクターは、表現ベクターの少なくとも１個のコ
ピー（有利には複数個のコピー）を宿主ゲノム中に（機
能形で）組み込む多くのトランスフェション法の任意の
１つにより、宿主細胞のポピュレーション中にトランス
フェクトすることができる。トランスフェクトの後に、
細胞を表現ベクターDNAの組込み及び選択可能なマーカ
ー遺伝子の表現を許容する時間培養する。次いで、細胞
のポピュレーションを、安定に表現ベクターDNAを組込
んでいない細胞を移すために、選択可能なマーカーが保
護するのに充分な濃度の毒性物質に露呈する。最後に、
生成遺伝子のRNAの高レベルを表現する細胞のクローン
又は高レベルの生成物それ自体を、当業者に周知の多く
の方法の任意の利用しうる方法により選択する。

前記のように、哺乳動物宿主細胞は、本発明のベクタ
ーを取り入れることのできる任意の哺乳動物宿主細胞で
あってよい。従って、宿主細胞は、生きているヒト又は
動物の細胞殊に遺伝子転移動物（transgenic animal）
例えばマウスの細胞より成っていてよい。従って、本発
明は、本発明のベクター（本発明の第１又は第２態様で
定義されたような）で転移された遺伝子転移動物をも提
供する。

本発明の表現系（又は形質転換された宿主）は、試験
管内又は生体内で所望ポリペプチドを製造するために使
用することができる。従って、本発明は、動物の体から
幹細胞を除去し、体内に残っている幹細胞を殺し、除か
れた細胞を、動物により要求されるポリペプチドをコー
ドするDNA配列を有する本発明のベクター（本発明の第
１又は第２態様で定義されたような）で形質転換し、こ
の形質転換された幹細胞を動物体内で置き換えることよ
り成る遺伝子治療法も提供することができる。

従って、この遺伝子治療法を、動物中の種々の遺伝子
を置き換え又は補充するために使用することができる。

幹細胞の好適な源は、骨髄であり、これは、リンパ球
及び赤芽幹細胞の双方を含有することに依る。

本発明の宿主細胞は、本発明のベクターの即ち、本発
明の第１態様又は第２態様のベクターのコピー１以を含
有していてよい。表現ベクターDNAの複数コピーを有す
る宿主細胞は、トランスフェクション及び選択の２以上
の連続的ラウンドにより（各ラウンドに対して異なる選
択可能なマーカーを用いて）又は前記のようにして製造
された細胞のポピュレーションを慣用の増幅プロトコル
に呈して、組込まれた表現ベクターDNAのコピー数を増
加させることにより発生させることができる。

本発明の表現系／ベクターは、非相同ポリペプチド特
に有用な薬物学的特性を有するポリペプチドを製造する
ために使用することができる。このようなポリペプチド
の例には、GCSF、hGH及びPLA₂が包含される。

本発明は、先行文献よりも多くの利点を有し、一般
に、これら方法に付随する多くの問題を避けることがで
きる。

一般に、本発明は、比較的迅速に生成でき、所望のRN
A及びポリペプチドの高い表現レベルを与える表現系／
ベクターを提供する。一般に、本発明は、所望ポリペプ
チドの高表現レベルを有する新規組換え宿主細胞をも提
供する。一般に、本発明の方法は、それに関するDCR配
列が記載されているか又はその中でDCR配列が活性であ
るか又は活性にすることのできる任意の真核宿主細胞に
適用可能である。

特に、DCRエレメントは、赤芽細胞型（マウス赤白血
病［MEL］、ラット赤白血病［REL］又はヒト赤白血病
［HEL］細胞）と、組み合せて使用されており、これら
の細胞は、意想外の効率で非相同蛋白質を分泌すること
が判明した。非相同蛋白質を高レベルで長時間分泌する
ことが可能である新規表現系が製造された。これら表現
系は、小規模又は大規模な培養のため、及び試験管内で
の分泌に使用でき、同じベクターは、組換え蛋白質の生
産のため又は遺伝子治療プロトコルの１部分として生体
内蛋白質生産のために使用することができる。この系
は、有効に、蛋白質（治療価値のある）をこのベクター
を有する哺乳動物の血流中に伝達することができる。

図面の説明 第１図：プラスミドｐβH2、ｐβ−ミニ及びpGSE1417の
プラスミド地図。

第２図：プラスミドpUNIVECの構成。

第３図:pUNIVEC（pEC₂）のプラスミド地図。

第４図:HGHcDNAの構成。

第4a図は、HGHcDNAの５′末端を再構成するために使
用されるオリゴヌクレオチドの配列を説明している。

第4b図、HGHcDNAの５′末端へのオリゴヌクレオチド
の挿入を説明している。

第５図：最終HGHcDNA表現ベクターの構成。

第６図:HGHcDNA表現ベクターでトランスフェクトされた
誘導MELC88クローンのノーザンブロット分析。この図中
で（ｉ）ヒト生長ホルモン、（ii）マウスβ−グロビン
を示している。Ａ＝クローン４、Ｂ＝PP1（プールされ
たポピュレーション１）Ｃ＝PP2（プールされたポピュ
レーション２）、Ｄ＝クローン１、Ｅ＝クローン３、Ｆ
＝クローン２、Ｇ＝クローン４。

第７図:HGHゲノム表現ベクターの構成。

第８図:HGHゲノム表現ベクターでトランスフェクトされ
た誘導MELC88のノーザンブロット分析。この図中で
（ｉ）はヒト生長ホルモン、（ii）はマウスβ−グロビ
ンを示している。Ａ＝AP1、Ｂ＝AP2、Ｃ＝クローン５、
Ｄ＝クローン１、Ｅ＝クローン３、Ｆ＝クローン２、Ｇ
＝クローン４。

第９図:HGHcDNA表現ベクターの５′末端の変化。

第10図:MELC88細胞中での２個のHGHcDNAクローンの長時
間分泌。

第11図:PLA₂cDNAのクローニング。

第12図:PLA₂遺伝子の表現ベクター内へのクローニン
グ。

第13図:PLA₂ゲノム配列からのPLA₂表現のノーザンブロ
ット。この図中で、NI＝非誘導、Ｉ＝誘導、MEL＝MELC8
8、50C−１＝PLA₂cDNAクローン、PP1,PP2＝PLA₂トラン
スフェクトされたMELC88細胞のプールされたポピュレー
ション、１、２、３及び４＝それぞれPLA₂トランスフェ
クトされたMELC88細胞の個々のクローン、第13図（ａ）
＝PLA₂で試験、（ｂ）＝マウスβ−グロビンで試験、
（ｃ）＝GAPDHで試験。

第14図：β−グロビンプロモータ/PLA₂コーディング構
成からのPLA₂表現のノーザンブロット。この図中で、Ｉ
＝誘導、NI＝非誘導、MEL＝MELC88、PP＝プールされた
ポピュレーション、１、２、３、４、５、６、７及び８
＝個々のクローン、50C−１＝PLA₂cDNAクローン。

第15図：メジャー塩基性蛋白質表現のノーザンブロット
分析。この図中で、（ｉ）はメジャー塩基性蛋白質を示
し、（ii）はグロビンを示している。PP＝プールされた
ポピュレーション、ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ及びｆは個々の
クローン。

第16図:E.コリーキリング検定結果を説明。

第17図:TNFαレセプター表現のノーザンブロット分析。
この図中で（ｉ）はTNFαレセプターを示し、（ii）は
マウスグロビンを示す。Ｕ＝非誘導、Ｉ＝誘導、１、
２、３、４及び５は個々のクローン。

第18図:TNFαレセプター表現を説明。

第19図：マウスβ−グロビンエキソン２フラグメントを
用いて試料化されたhNK−２レセプタートランスフェク
トされたMEL細胞のノーザンブロット分析。この図中
で、＋＝hNK−2Rの存在で誘導された。

第20図:hNK−2RcDNAで試料化されたhNK−２レセプター
トランスフェクトされたMEL細胞のノーザンブロット分
析。この図中で、＋＝hNK−2Rの拮抗剤の存在において
誘導された。

第21図：ヒト血清アルブミン表現のノーザンブロット分
析。この図中で、（ｉ）はヒト血清アルブミンを、（i
i）はグロビンを示している。Ｉ＝誘導、NI＝非誘導、
１、２、３、４、５及び６は個々のクローンである。

第22図:hGH表現のノーザンブロット分析。この図中で、
（ａ）はhGHRNAを示し、（ｂ）はマウスグロビンを示
す。Ｕ＝非誘導、Ｉ＝誘導、1b、1c、1d、2a、2c、2fは
個々のクローンである。

第23図:MEL細胞中のhGH/EC2とhGH/EC3との比較、この図
中で、PP1＝プールされたポピュレーション、Ｕ＝非誘
導、Ｉ＝誘導、１、２、３、４、５及び６は個々のクロ
ーンである。

詳細な説明 Ａ） ベクターDNAの構成 最終表現ベクターは、（有利には）２個の中間プラス
ミドより構成されていた。１個のプラスミド（pGSE141
7）は、DCR配列及び選択可能なマーカー遺伝子を有し、
第２のプラスミド（pUNIVECから誘導）は、選択の表現
カセットを有する。これらプラスミドは、次のようにし
て製造した： プラスミドpGSE1417の構成 β−グロビンDCR分子を有するプラスミド（第1c図）
は、タルボット（Talbot）等によりNature338、1989
に、正確に記載されており、コリス（Collis）等のEmbo
Journal第９巻、No.1 233−240、1990も参照された
い。

プラスミドpUNIVEC（ここでpEC₂とも称される）の構成 プラスミドｐβH₂（pBLUESCRIPT＊バックボーン中に
−800から＋30までのヒトβ−グロビンプロモータ及び
マウスH2K遺伝子の第１エキソンを含有；第1A図参照）
を用いて出発し、β−グロビンプロモータに対するXho
I部位５′を除去してプラスミドｐβH2−ｘを生ぜしめ
た。次いで、このβ−グロビンプロモータを、Pst I＋B
am III制限消化により約−400短縮して、プラスミドｐ
△βH2−ｘを生ぜしめた。次いでH2K遺伝子を、Hind II
I＋Sst I制限消化により除去し、次の記載（SEQID No
1）のような合成ポリリンカーオリゴヌクレオチドで置
き換えた： （これは、Hind III、EcoR I、Sma I、Xba I、Not I、X
ho I、BamH I、Pst I、Kpn I、Cla I及びSst I制限エン
ドヌクレアーゼに関する認識配列を有する）。これは、
プラスミドＰ△βH2−ｘ＋ポリ（pEC¹とも称される）に
なった。ベクターpUNIVEC（PEC₂）を完成させるため、
エキソン３及びポリアデニル化部位を取り囲んでいるこ
のエキソン２中の天然Bam III部位からこれの下流
（３′）Pst I部までのヒトβ−グロビン遺伝子のフラ
グンメントを、プラスミドｐβ−ミニ（第1B図）から除
去し、クローン化によりｐ△βH2−ｘポリ中にポリリン
カーのBamH IとPst I部位の間に入れた。第２図はpUNIV
ECの製造に包含される工程を示している。

＊pBLUESCRIPTは一般に周知であり、入手可能であ
る。例えば、これは、スタラタジエン（Stratagene）か
ら入手されうる。

表現ベクターの構成 本質的に、全てのcDNA表現ベクターを同様な方法で構
成した。cDNA（例えばヒト生長ホルモン）をクローニン
グにより、β−グロビンプロモータに最も近くに翻訳開
始部位を有するpUNIVECのポリリンカー中に入れた。次
いで、表現カセット（β−グロビンプロモータ＋cDNA＋
β−グロビンイントロン／エキソン配列及びポリアデニ
ル化配列）をベクターpGSE1417中に（通例Cla I−Kpn I
フラグメントとしてpGES1417の独特なCla I及びKpn I部
位中に）移行させて、β−グロビンプロモータをDCR配
列に最も近く、かつ表現カセットをDCR配列と選択可能
なマーカー（tk−neo）遺伝子との間に存在せしめた。
第４図は、ヒト生長ホルモン（HGH）cDNAに関する最終
表現ベクターの構成を示している。

ゲノム配列からの非相同蛋白質の表現のために、遺伝
子（その天然のポリアデニル化配列を包含）をクローニ
ングにより、ヒトβ−グロビンイントロン／エキソン配
列及びβ−グロビンポリアデニル化配列を欠いているｐ
△βH2−ｘ−ポリ（pEC₁）（第２図参照）と称されてい
るpUNIVECの先駆体中に入れた。

Ｂ） トランスフェクション及び選択 細胞系 以下の実施例では、マウス赤白血病細胞系（MEL）を
用いた。MEL細胞の製造及び特徴付けは、当業者に周知
であり、ディセロース（Deisseroth）等によりプロシー
ディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミィ・オブ
・サイエンシーズ（Proceedings of the National Aca
demy of Sciences）Vol.72、No.3、P1102−1106に；
フレンド（Friend）等によりプロシーディングス・オブ
・ザ・ナショナル・アカデミィ・オブ・サイエンシーズ
Vol.68、P378−382、1971中に記載されている。以下の
実施例は、MELC88及び11A21マウス赤白血病細胞系に関
連しているが、正確な細胞系は厳密ではなく、適当な分
化の時期のマウス赤白血病細胞系を以下の実施例で使用
することができる。グロビンDCRは、赤芽細胞中で活性
であり、MELC88及び11A21細胞は分化誘導されており、D
CR配列の全活性を見るための赤芽細胞になった。

培 地 全てのストック細胞系を非選択的培地 （Ａ）グルタミン（Flow Lads）2mM、牛胎児血清10％
（11A21に対しては１％）及びペニシリン／ストレプト
マイシン抗生物質（Flow Labs）の補充されたデュルベ
ッコ（Dulbeccos'）最小必須培地（DMEM、Flow Labs;
重炭酸ナトリウムを有する液体培地）中で、又は （Ｂ）前記と同様に補充されたα−MEM（Flow Labs;液
体培地）中で、生長させた。トランスフェクトされた細
胞系を、最終濃度1mg/mlまで添加されたアミノグリコシ
ドゲネチシンスルフェート（G418;Gibco−BRL Cat No.
066−1811）を有するか又は最終濃度0.8mg/mlでハイグ
ロマイシン−Ｂ（Boehringer Mannheim）を有する（又
は場合によっては双方の抗生物質を有する）前記培地中
に保持した。トランスフェクタント細胞系を以下の記載
のように選択した。

表現系プラスミドの線状化 表現プラスミドを細胞中に導入するために、これらを
まず、プラスミド中の単一部位で切断し、重要な遺伝子
又は選択しうるマーカー遺伝子の哺乳動物細胞内への転
写を邪魔しない制限酵素を用いる消化により線状化し
た。これは、大抵のプラスミドpDCR/NEO/HGHcDNA及びpD
CR/NEO/HGHゲノムに関するPvu Iであった。

細胞の電気ポレーション MEL細胞を、指数的生長の間に収穫し、電気ショック
緩衝液（140mMNaCl、25mM HEPES、pH7.5、0.75mM Na₂H
PO₄）中で２回洗浄し、次いで、細胞17⁷個/mlの密度で
新製（氷冷）電気ショック緩衝液中に再懸濁させた。細
胞懸濁液（細胞10⁷個）1mlを、電気ポレーション室（Bi
o−Rad Pulserキュベット；通路長0.4cm）中の線状化さ
れたDNA（典型的にはこの消化緩衝液、水又は10mM TRI
S、1mM EDTA pH8.0中のDNAの10→100μｇ）に添加
し、氷上で５−10分間インキュベートした。次いで細胞
−DNA混合物に容量960μＦのBio−Rad・ゲン・パルサー
・エレクトロポレター（Bio−Rad Gene Pulser electro
porator）を用いて250Vでパルスを与えた。細胞を室温
で５−10分間放置し、次いで、非選択性生長培地中に再
懸させ、引続き当初細胞10⁵個／ウエル（１プレート）
及び当初細胞10⁴個／ウエル（１プレート）の密度で24
−ウエル組織培養プレート中に塗沫した。20−30時間後
に、G414 2mg/ml（又は適当な場合にはハイグロマイシ
ン−B1.6mg/ml）を含有する選択培地（典型的には1ml）
等量を、各々のウエルに添加した。得られる細胞懸濁液
（1x選択培地中）を、CO₂5−10％を有する組織培養イン
キュベーター中で37℃でインキュベートした。

電気ポレートされた細胞懸濁液を、薬剤耐性細胞の個
々のクローンが認められるまで７−14日間、37℃でイン
キュベートした。次いで、これらを（パスツールピペッ
ト又はGilson Pipetman semi−automatic Pipettorを
用いて）、個々に又はプール状態で取り出し、選択培地
中で拡げた。

懸濁細胞の燐酸カルシウム介在トランスフェクション 全体的にゴルマン（Gorman）等の方法（Molecular an
d Cellular Biology P1044−1051、1982）を用い、簡
単には、次の工程より成る。70mM燐酸ナトリウム20μ
を2xHBS pH7.1（HEPES10g/、NaCl16g/）1mlと一緒
にすることにより溶液Ａを作った。水1ml中のトランス
フェクトすべきDNA50μｇを2M CaCl₂120μと一緒にす
ることにより溶液Ｂを作った。溶液Ｂを溶液Ａに滴加す
ることにより沈殿2mlを作り、これを室温で20分間放置
した。指数相中に２−３日間保持された懸濁細胞を６−
８×10⁵/mlの細胞密度で取り出した。沈殿2mlを懸濁細
胞18mlに添加し、37℃で４−６日間インキュベートし
た。次いで、細胞をPBS中で２回洗浄し、計数し、次い
で、1mlを２×10⁴/ml及び２×10⁵/mlで24−ウエル組織
培養プレート中に入れた。このプレートを37℃で１晩イ
ンキュベートし、その後、培養培地中のG414 2mg/ml/
ウエルを添加した。次いでプレートを37℃で７−12日間
放置してコロニーを出現させた。

懸濁細胞のリポフェクショントランスフェクション 懸濁細胞をトランスフェクションの前に対数生長相に
２−３日間保持して、トランスフェクションの日に、約
５×10⁵/mlの密度とした。ベーリンガー・マンハイム
（Boehringer Mannheim）DOTMA試薬を用い、キットに
記載の次の工程より成る方法を用いて、トランスフェク
ションを実施した： 1.DOTMA分散液（1mg/ml）100μを組織培養培地4ml中
で稀釈した 2.別に、DNA0.1−10μｇを組織培養培地4ml中で稀釈し
た。DNA及びDOTMA溶液を混合した 3.遠心により細胞から培地を除去し、DOTMA/DNAミック
スを細胞に添加し、次いでこれを、37℃、CO₂5−10％で
３−６時間インキュベートした 4.遠心により細胞からDOTMA/DNAミックスを除去し、通
常の生長培地で代え、細胞を、前記のような24ウエルプ
レート中に入れた。前記のような選択培地を使用した。

表現の誘導 クローナルトランスフェクション細胞系又はプールさ
れたポピュレーションを、同様な方法で誘導させた。細
胞を、選択培地中での毎日稀釈により指数生長させ、細
胞２×10⁵/mlにした。毎日稀釈３−４回の後に、細胞を
１晩放置生長させ、この選択培地にジメチルスルホキシ
ド（DMSO）を、２％の最終濃度で添加した。次いで、細
胞を、この実験の期間中、この誘導培地中に保持した。

実施例 例１−HGHcDNAの表現 Dr.L.Hall（Bristol大学）から部分HGHcDNAを入手し
た。このcDNAは、天然HGH翻訳開始コドンを欠いてい
た。翻訳開始部位（ATG）の約30bp上流（５′）からcDN
Aの開始に近い天然Aat II制限ヌクレアーゼ部位まで伸
びている合成オリゴヌクレオチドを用いて、遺伝子の開
始は、コンセンサス真核性翻訳開始部位を結合して再構
成させた（第4A図及び第4B図参照）。Hind III部位（合
成オリゴヌクレオチドにより供給された）から、天然Sm
a I制限部位までの完全HGHcDNAをクローン化により、pB
LUESCRIPT内に入れた。天然HGH分泌信号配列を有するHG
HcDN配列を、このプラスミドから、Hind III−BamH Iフ
ラグメントとして除き、クローニングにより中間ベクタ
ーpUNIVECのHind III及びBamH III部位内に入れた。こ
うして、このプラスミドは、HGHcDNA表現カセットを含
有した。このカセットをCla II及びKpn Iを用いる消化
によりpUNIVECから除去し、pGSE1417のCla I及びKpn I
部位に挿入して、プラスミドpDCR/NEO/HGHcDNAを生ぜし
めた。これを第4C図に示す。この実験で用いた最終HGHc
DNAのDNA配列を第５図に示す。

プラスミドpDCR/NEO/HGHcDNAを、制限エンドヌクレア
ーゼpvu Iを用いて消化し、次いで、線状DNAをMELC88細
胞内に、電気ポレーション燐酸カルシウム介在トランス
フェクション又はリポフェクションにより導入した。モ
ノクローナルトランスフェクタント細胞系及びプールさ
れたポピュレーションを記載のように選択した。各々の
トランスフェクタント系を記載のように分化誘導させ
（従って、エリトロイドDCRエレメントのコントロール
下に表現する）、市販のRIAキット（Nicholls Institut
e Tandem−Ｒ HGH検定キット）を用いて、分泌された
生長ホルモンを測定した。トランスフェクタントHGHcDN
AのmRNAレベルを、内部対照としてのマウスβ−メジャ
ーグロビンRNAレベルを用いて、HGHcDNA試料でのノーザ
ンブロッティングにより測定した。

結果−例１ 安定な細胞系が表現し、HGHを高レベルで分泌した。
マウス赤白血球細胞は、分泌細胞としては知られておら
ず、組換え体クローンからの分泌のこのレベルは、実際
に意想外であった。細胞上澄み上及び細胞リゼート上で
の当初HGH検定は、生産されたHGHの＞95％が細胞培養培
地中に分泌されたことを示していた。分泌の真菌性抑制
剤ブレフェルディンＡ（brefeldin−Ａ）を用いて、分
泌（細胞溶解よりもむしろ）が確認された（例４参
照）。

第１表に、前記のHGH表現ベクターを用いる誘導の４
日後に得られた分泌HGHのレベルを示す。プールされた
ポピュレーション及びモノクローナル系の双方を測定し
た。

認められたこの表現レベルは、標準（増幅されていな
い）哺乳動物表現実験と比べて非常に高い。HGH特異性
プローブで試験された誘導された細胞系からの全mRNAの
ノーザンブロットは、キメリックグロビン/HGH RNA
（表現ベクターから製造された）のmRNAレベルが、内因
性マウスβ−メジャーグロビンのレベルに匹敵すること
を確認した（第６図参照）。

例2:HGH遺伝子の表現 Nicholls Instituteから入手されたプラスミドpOGH
の制限エンドヌクレアーゼ消化により、HGH遺伝子を製
造した（第７図参照）。天然mRNA開始部位から翻訳停止
のコドンの後620塩基までの天然HGHゲノム配列を有する
EcoR I−BamH I制限フラグメントを、サブクローニング
により、通例、本発明の表現ベクター内で、キメラ性mR
NAを得るためのスプライス及びポリアデニル化機能を提
供するβ−グロブリンイントロン／エキソン配列を欠い
ている中間ベクターｐ△βH2−ｘ＋ポリ中に入れる。こ
の中間ベクター中で、表現カセットは、HGHゲノム配列
（イントロン及びエキソン配列）及びHGHポリアデニル
化信号に結合しているβ−グロビンプロモータより成
る。この表現カセットを、前記のHGHcDNAに関する記載
と同様に、最終ベクター（GSE1417）中に、Cla I−Kpn
Iフラグメントとして導入した。最終表現ベクターpDCR/
NEO/HGHゲノムを、電気ポレーションによりMELC88細胞
内に導入し、モノクローナルトランスフェクタント系及
びプールされたポピュレーションを記載のように選択し
た。前記のように、各々のトランスフェクトされた系を
分化誘導させ、分泌されたHGHを、市販のRIAキットを用
いて測定した。このトランスフェクトされた遺伝子のmR
NAレベルを、内部対照としてのマウスβ−メジャーグロ
ビンレベルを用いて、HGHcDNAプローブでのノーザンブ
ロットにより測定した。

結果−例２ HGHcDNAからのHGHの表現で認められたように、安定な
HGH遺伝子トランスフェクタント細胞系が高レベルで表
現し、HGHを分泌した。

第２表に、誘導４日後に測定した分泌HGHのレベルを
示す。

安定なトランスフェクトされた細胞系中に、高レベル
のHGHの表現及び分泌が認められた。HGHcDNAに対するノ
ーザンブロットにより、HGHmRNAレベルを測定し、再び
誘導細胞中のマウスβ−グロビンのレベルにほぼ等しい
ことが判明した（第８図参照）。マウスβ−メジャーグ
ロビンレベルとの比較は、 HGHmRNAのレベルがcDNA表現ベクター（これは、β−
グロビンスプライス及びpUNIVECからのポリアデニル化
配列をプロセッシングのために利用する）及びHGH遺伝
子表現ベクター（これは天然HGHイントロン配列及びポ
リアデニル化配列をプロセッシングのために利用する）
とほぼ等しいことを示している。分泌された蛋白質レベ
ルの差は、おそらく、２種のmRNAのポリアデニル化のち
がいから生じる翻訳のレベルのちがいに帰因する。mRNA
の５′末端（開始）でのちがいは、観察された異なる翻
訳レベルに寄与しない。それというのも、HGHcDNA（な
おヒトβ−グロブリンスプライス及びポリアデニル化配
列を有する）の５′末端とゲノム表現ベクターからのmR
NA開始との交換（第９図参照）は、トランスフェクトさ
れた細胞系から生産されるmRN又は蛋白質のレベルに影
響しなかったからである。

例3:HGHの長時間分泌 HGHcDNA又はゲノムDNA表現ベクターで観察された分泌
のこのレベルは予想外であった。それというのも、赤血
球細胞は、通常は分泌細胞ではないからである。DCR誘
導表現を得るために、MEL細胞を分化し誘導させるべき
であり、赤芽（Erythroid）の特性を示した。この分化
はこの細胞への多くの生理的変換を包含する複雑なプロ
セスであり、細胞の脱核及び細胞内でのmRNAの選択的破
壊をもたらすことができる。生体内での約120日の寿命
にわたる酵素−（及び溶解二酸化炭素）の搬送体として
の赤芽細胞の機能は、これらの変化と一致している。末
端分化も、一般に、細胞内での蛋白質合成機構を欠失さ
せると解釈されている。それというのも、これは本質的
に、脱核及びmRNA破壊工程により余分とされているから
である。

高レベルの分泌実験において、トランスフェクトされ
たMELC88によるHGHの生産及び分泌を長時間にわたり検
査した。HGHcDNA表現ベクターでトランスフェクトされ
た細胞を前記のようにして分化誘導させた。約48時間後
に、誘導培地（選択培地＋２％DMSO）を交換し（同量
で）、オリジナル培地をHGHに関して検定した。引続
き、この培地を24−36時毎に、約80日間にわたり交換し
た（栄養／因子消耗に依る細胞死をさけるため）。

結果−例３ 第10図は、この長い誘導期間にわたり生産され、分泌
されたHGHのレベルを示している。認められるHGHレベル
の変動が、細胞の安定なポピュレーションからの分泌の
レベルにおける変化を示しているか又は細胞のいくつか
の亜ポピュレーションがこの実験の開始時に誘導を失敗
し、結果として後の成熟及び誘導を失敗するかは明瞭で
はない。この実験から明らかなことは、誘導されたMELC
88トランスフェクタント細胞系は、誘導開始後少なくと
も80日間にわたり分泌HGHを生産し続けることができる
ことである。更に、このことは、末端−赤芽分化（term
inal erythroiddifferentiation）を伴なう細胞変化に
依り、予想外であった。

観察された分泌期間は、トランスフェクトされた細胞
系の延長された生産法での使用のために関連を示してい
る。更に、この長時間分泌は、この系が、哺乳動物の血
流中での分泌蛋白質を生産するために生産方法として
も、遺伝子治療プロトコルの部分としても有用でありう
る。

例４−分泌の抑制 真菌代謝物ブレフェルディンＡが、ゴルギ装置（Golg
i apparatus;Ulmer ＆ Polade PNAS 86 6992−6996
（1989））を通る特異的ブロッキングフラックスによ
り、MEL細胞中の細胞表面へのグリコフォリン移動を抑
制するという報告は、赤芽細胞の非相同蛋白質を分泌す
る能力の調査を許容する。

HGHを表現するMELC88のクローンを、1.5％DMSOを用い
て３日間誘導させ、次いで、エタノール中のブレフェル
ディン−A1μg/mlを添加する。対照培養液は、エタノー
ル0.1％を含有した。37℃で２時間インキュベーション
の後に、培養物を新鮮培地で２回洗浄し、ブレフェルデ
ィンＡ（１μg/ml）又はエタノール（0.1％）を処理さ
れた培養物及び対照にそれぞれ添加した。上澄み及び細
胞の試料を分析のために取った。

結果−例４ 培養上澄み中及び超音波処理された細胞エキス中の生
長ホルモンレベルを、先に記載のサンドイッチイムノラ
ジオメトリイ検定を用いて測定した。培地を変えた後１
時間、２時間及び４時間に試料を分析した。

これから認められるように、対照培養物は、上澄み中
にHGHを時間に応じて集積しているが、細胞レベルでは
増加が認められなかった。逆に、ブレフェルディンＡで
処理された培養物中では上澄み中でHGHレベルの増加は
認められないが、細胞中でHGHレベルの増加が認められ
た。このデータは、明らかに、上澄み中でのHGHの出現
は、ゴルギィ装置を通る蛋白質の分泌に帰因することを
示している。

例５−他の組換え蛋白質−ヒトPLA₂cDNA₂の分泌 HGHを用いて記載された分泌実験は、ここに記載の系
が、多量の組換え蛋白質の表現及び分泌が可能であるこ
とを示している。細胞が末端分化を誘導されるまでの非
常に限られた表現を有するこの系の特性は、変わりやす
く、広い種々の型の蛋白質に適応できる。細胞に対して
毒性であるか又は破壊的な蛋白質でも、この系中で表現
されうる。このようなものの１つであるヒト滑液ホスホ
リパーゼA₂の表現を、MEL細胞分泌系で試験した。

ホスホリパーゼA₂は、膜燐脂質の代謝に包含される酵
素である。この酵素は、殊に、細胞膜内のホスファチジ
ルコリン又はホスファチジルエタノールアミンの脂肪酸
連鎖の１つを破断してアラキドン酸（これは炎症経路の
１部である）を放出する。残りのリソ−燐脂質は、細胞
膜中で界面活性特性を有する。動物細胞中のホスホリパ
ーゼA₂の表現は、おそらく生産細胞上のPLA₂の破壊効果
により限定される。現在まで報告されている最大のレベ
ルの表現は、増幅されたCHO細胞中で＞200ng/mlである
（Kramer等のJ.Biol.Chem.264、5768−5775、1989）。

MEL細胞表現系中でヒトPLA₂を表現するために、ま
ず、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）技術を用いて、ヒト
肺cDNAライブラリィからのPLA₂をクローニングした。使
用PCRアンプライマー及びPLA₂cDNA配列を第11図に示
す。次いで、cDNAをサブクローニングして、中間プラス
ミドpUNIVEC中にEcoR I−Sal Iフラグメントとして入れ
た（pUNIVECのEcoR I及びXho I部位に）。次いで、この
表現カセットをCla I−Kpn IフラグメントとしてpGSE14
17中に前記のように導入した。

トランスフェクタント細胞系を前及び次の緒言に記載
のようにして発生させ、上澄みをPLA₂活性に関して検定
した。

結果−例５ 誘導され、トランスフェクトされたMELC88培養物を２
つの方法を用いて、ホスホリパーゼ活性に関して検査し
た。第１の方法（Papinsk等のJ.Biol.Chem.261、4239−
4246;1986参照）は、生体内で、［³H］オレイン酸基質
でラベルされたE.コリー膜を使用し、第２の方法（Seil
hamer等のJ.Biol.Chem.264、5335−5338、1989参照）
は、PLA₂に関する基質としてホスファチジルコリン又は
ホスファチジルエタノールアミンを用いる。トランスフ
ェクトされたMEL細胞クローンからの上澄みは、双方の
検定で活性であり、（第２検定法はより再現性の結果を
示したの）約200ng/mlの表現レベルを示した。長い至適
化研究をする必要なしに、トランスフェクトされたMELC
88細胞は、CHO細胞中であるがかなり短かい時間での増
幅表現を用いて、今日まで公開されているものと同様な
活性組換えヒトホスホリパーゼA₂を分泌したことが判る
（Kramer等のJ.Biol.Chem.264、5768−5775、1989）。

例６−天然PLA₂ゲノム配列を用いるPLA₂の表現 プローブとしてクローン化されたPLA₂cDNAを用いてヒ
ト胎盤ゲノムDNAライブラリィ（Clontech Ref HL1067
J）から、6.2kb Hind IIIフラグメントを単離した。こ
のクローンを、制限酵素消化により特徴付けすると、PL
A₂ゲノム配列を有することが判った。全フラグメント
（配列DNAをコードし、介在するPLA₂、ポリアデニル化
部位及び第１エキソンの上流［５′］に推定プロモータ
配列の約1.5kbを有する）を、クローニングによりベク
ターpGSE1417中に導入した。このプラスミド中で、PLA₂
配列の表現は、天然PLA₂プロモータによりコントロール
される。このプラスミドを、Pvu Iを用いる制限消化に
より線状化し、先の記載のようにMELC88細胞中に導入し
た。プールされたポピュレーション及びモノクローナル
系を選択し、誘導されかつ分泌されたPLA₂レベルを前記
のように測定した。

結果−例６ このPLA₂プロモータからのPLA₂の表現（蛋白質レベル
（第4A表参照）又はRNAレベル（第13図参照）により測
定された）は、ヒトβ−グロブリンプロモータを用いて
PLA₂cDNAで認められた表現レベルよりも著しく高かっ
た。分泌の最高レベルは、2.5μg/mlであり、これは、
慣用のCHO/DHFR系を用いて観察されたレベルよりも著る
しく大きい。PLA₂cDNAとゲノム配列を用いて観察された
表現レベルとの間の差は、おそらく、ゲノム鋳型から製
造されたmRNAの高安定性の結果である。それというの
も、ヒトβ−グロビンプロモータPLA₂遺伝子構造中のヒ
トPLA₂プロモータに代えることは、分泌PLA₂のレベルに
何の影響も認められないからである。β−グロブリンプ
ロモータを用いるPLA₂ゲノムの配列の表現の結果を、第
4B表に示す。

例７−MEL11A21細胞中のHGHの表現 MELC88細胞が組換え蛋白質を分泌する能力があること
を立証した。蛋白質精製及び組換蛋白質を容易に回収す
るために、他のマウス真核白血球細胞系中における表現
をも試験した。MEL細胞系11A21を、記載のとおり牛胎児
血清１％を有する非選択的培地中に保持する。10％から
１％への血清中含有率の低下は、最終製品中の汚染蛋白
質を著るしく低下し、蛋白質精製を促進する。11A21細
胞中にHGHを表現させた。表現ベクターpDCR/NEO/HGHcDN
A及びpDCR/NEO/HGHゲノミックは、先に記載と同様であ
る。トランスフェクション及び選択は、血清１％を使用
することを除き、MELC88に関する記載と同様であった。
1121トランスフェクタント細胞に関する誘導培地が牛胎
児血清１％＋αMEMを有することを除いて、誘導を記載
のように実施した。

結果−例７ 第５表は、11A21トランスフェクタント細胞系の誘導
により観察された分泌HGHレベルを示している。細胞数
に関して修正すると、これらの細胞は、C88トランスフ
ェクタントと同様に分泌し、このベクターが表現を推進
し、適当な場合には、MEL細胞型の範囲の分泌を推進す
ることができることを示している。

第５表−11A21トランスフェクタント からのHGH表現 細胞系 モノクローナル ［HGH］μg/ml PP1 なし 1.2 PP2 なし 1.0 1 あり 2.0 2 あり 0.9 3 あり 0.6 4 あり 1.2 例7b−PLA₂プロモータのコントロール下におけるhGHcDN
Aの表現 PLA₂プロモータのコントロール下におけるヒト生長ホ
ルモンcDNNの表現を次のようにして達成した。

前記（例５）のように、PCR技術を用いて、ヒトDNAか
らPLA₂プロモータを単離した。このPLA₂プロモータは、
次のPCRアンプリファイアー（SEQ ID No.3及びNo.4）
を用いて、200bpフラグメントとして得られた。

このPCR生成物を、pEC3（Sph I−Hind III）中のヒト
β−グロブリンプロモータを置換して新しいベクターpE
C4（この中にHind III−BamH I部位を用いてヒト生長ホ
ルモンcDNAがクローン化導入された）を製造するために
使用した。最終表現ベクターは、pEC4のCla I−Asp718
カセットをpGSE1417中に移してphGH・4GSEを生じること
により形成させた。

４日間誘導された細胞からの上澄みを、生長ホルモン
に関して試験した。試料:hGH508＝β−グロブリンプロ
モータの下流のhGHcDNAのポジチブコントロール;PP1及
びPP2＝プールされたポピュレーション;1−４＝個々の
クローン。

例８−長時間培養後の分泌レベルの安定性 表現系をベースとする増幅の主要欠点は、増幅された
配列の安定性である。最近まで、ゲノム中に挿入された
増幅配列は、圧力なしでは安定であると一般に認められ
ていた。しかしながら、工業研究グループからのデータ
は、このような増幅が選択圧力の存在時でさえも不安定
でありうることを示している（Weidle U.H.等のGene 6
6、193−203（1988）参照）。これらの問題は、高レベ
ル表現のために大コピー数は必要でないので、DCR表現
系では遭遇するはずはなかった。

この仮説を試験するために、マルチプル限定希釈クロ
ーニングにより、高生産性細胞系D50から５クローンを
誘導した。次いで、これらのクローンを選択圧を用いて
又は用いずに40世代にわたり継代培養した。これらクロ
ーンの誘導性の可能な変化に依り、細胞の非誘導クロー
ンと比較して再現性を確認した。選択の不在時に、拡大
生長にわたり、再現性の変化は認められなかったし、こ
のことは、細胞内の表現構造が安定であることを示して
いる。

例９−表現ベクターから製造されたRNAの安定性 前記（例３）のように、赤芽（Erythroid）分化は、
複雑な方法であり、これは多くのプロセスを含み、結果
として、細胞内の多くのmRNAの選択的分解をする。非相
同cDNA又は遺伝子の高レベル表現を保持するために、非
相同mRNAは、誘導された赤血球細胞中で安定であるべき
である。誘導された細胞中のmRNA組込み性を保持するた
めに、cDNA表現構造中で、β−グロブリンmRNAの３′末
端の部分を使用した。この安定化効果は、誘導された赤
血球細胞中で安定なメッセージを生じる他の遺伝の３′
末端の蛋白質（例えばHGH又はPLA₂）により提供されう
るが、誘導された細胞（例えばマウスH2K）中に高い不
安定なmRNAを生じる遺伝子によっては提供され得ない。
第13図及び14図はこのことを説明しており、種々の構造
からの非相同PLA₂メッセージと内因性グリセルアルデヒ
ド３ホスフェートデヒドロゲナーゼ（GAPDH）mRNAと比
較している。PLA₂mRNAは誘導細胞中に安定に残るが、GA
PDHmRNAは、全ての誘導細胞中で分解される。

例10−pEC₃中でのヒト成長ホルモンの表現 pEC₃は、β−グロブリン遺伝子中にpEC₂よりも長いβ
−グロブリン３′突出DNA領域（例えば4845塩基の所の
天然Xba Iまで）を有し、pEC₁ポリリンカーのHind III
とBamH I部位との間に異なるポリリンカークローニング
部位即ちHind III、EcoR II、Xho I、Bal II、Sal I、N
ot I及びBamH Iを有することを除きpEC₂と同である。

このHGHcDNAをサブクローニングによりpEC₃（Hind II
I/BamH I）中に入れ、次いで、このクローンからのCla
I/Asp718フラグメントをサブクローニングして、pGSE14
17中に入れた。トランスフェクション、誘導RNA分析及
びGHG分析を前記のように実施した。結果を第22図で説
明する。

各々pEC₂/hGH−pEC₃/hGH表現細胞に関する６クローン
及び２ポピュレーションを誘導させ、hGH表現に関して
検定した。結果は、EC₃を用いて観察されたhGHのレベル
が、EC₂を用いる場合よりも大きいことを示している。
従って、長い３′末端を有する構成は、高レベルのhGH
を生じる。これは、長い３′末端が翻訳効率を改良する
ことによるらしい（この理論に束ばくされることは望ま
ないが）。

例11−メジャー塩基性蛋白質（MBP） 表現ベクターpEC₃を用いて、MBPcDNAを表現させた（M
cgrogan等のJ.Exp.Med.1988、168、2295−2308;及びBra
ke等のGene1990、86、285−289参照）。このMBPcDNAをB
amH IフラグメントとしてサブクローニングによりpEC₃
中に入れ、次いで、この構成からのCla I/Asp718フラグ
メントをサブクローニングによりpGSE1417中に入れた。
トランスフェクション、誘導及びRNA分析を、先の例に
おけると同様に実施した。結果を第15図に示す。

誘導されたクローン2a及び2eからの上澄みを、グライ
ヒの方法（Gleich等J.Exp.Med.1974、140、313−332）
に依る適当なE.コリーキリング検定を用いるE.コリーキ
リング検定で使用した（第16図参照）。この場合に使用
した方法を次に略記する。

E.コリー（例えばE.コリーDHSα）の１晩培養物を、1
0Kpmで１分間遠心し、次いで、蒸溜水1ml中に再懸濁さ
せた。この培養物の10μとMEL細胞上澄み90μとを
混合し、室温で１時間インキュベートした。次いで試料
を系統的に稀釈し、次いでＬ−ブイヨンプレート上にス
ポットさせた。

例12−TNFαレセプター TNFαレセプター（Ａ）の可溶性細胞外ドメイン（欧
州特許公開第422339号参照）をcDNA及びCMYC tag（CMYC
cDNAの部分、これはモノクローナル抗体が結合するアミ
ノ酸の伸びを暗号化する）を暗号化するDNAフラグメン
トをサブクローニングによりpEC₃（BamH I）中に、次い
でpGSE1417中に入れることにより、MELC88細胞中に表現
させた。

トランスフェクション、誘導及びRNA分析は、前記の
ように実施した。結果を第17図に示す。

10クローンが誘導され、TNFαレセプターを抗cmyc−
抗体への結合（第18図参照）を用いて測定し、TNFα結
合能を抗TNF抗体を用いて測定した（第18図参照）。

例13 NK₂レセプターcDNA（graham等のBiochemical ＆ Biop
hysical research Commumication1991、177、No.1、
８−16）をサブクローニングによりpEC₃中に入れ、次い
でこの構成からのCla I/Asp718フラグメントを、サブク
ローニングによりGSE1417中に入れ、プラスミドpGSE141
7/hNK−2R（10kb）を生ぜしめた。E.コリー中での生長
及び線状化の後に、生じる構成をMELC88細胞をトランス
フェクトするために使用した。表現クローンをG418を用
いて選択し、DMSOを用いて誘導した。

MEL細胞トランスフェクション Pvu I線状化GSE1417/hNK−2RでMELC88細胞を電気ポレ
ートした。G418を用いて４日間の選択の後に、６シング
ルコロニーを取り、残りをプールして２個のクローンプ
ールを得た。これらを３−４スプリット生長させてG418
抵抗を確保した。DMSO2％を用いる誘導に引続き、この
細胞を、収穫前にNK2レセプター拮抗剤50μＭの存在及
び不在で、４日間生長させた。引続きセルペレットを、
結合検定、ノーザンブロット用のRNA調製及びSDS/PAG分
析のために用いた。

ノーザンブロット 各々のクローンから単離された全RNAの20μｇを電気
泳動にかけ、ブロッティングし、ヒトNK−２レセプター
cDNAを用いてプローブした。このブロットはマウスβ−
グロビン遺伝子（マウス特異性）のイントロン２からの
200bpフラグメントを有するか又はこれで再プローブし
た。第20図は、hNK−2Rを用いてプローブ化されたMEL細
胞トランスフェクタントから製造されたRNAのノーザン
ブロットの４時間露呈を示している。特にhNK−2RmRNA
は２個の異なるもの1bk及び3bkとして現われる。これら
のバンドは、非トランスフェクト誘導及び共トランスフ
ェクト非誘導MELC88コントロールからのRNA中には不在
である。クローン２も検出可能なレベルのhNK−2R転写
を示さず、これは、検出可能なNKA結合の非常に低いレ
ベルに相当する。2NK−2Rハイブリド形成バンドの出現
は、スプライスされたメッセージ及びスプライスされな
かったメッセージの双方の存在に帰因する。第19図は、
β−グロビンでのプローブ化の後の３時間露呈した同じ
ブロットを示している。これはhNK−2Rの定常状態mRNA
レベルは、マウスグロビン遺伝子のそれと均等であるこ
とを示している。

NKA結合検定 MEL細胞ペレットからの部分的に精製された膜を、¹²⁵
IニューローキニンＡ（NKA）結合（100nMでNKA）アッセ
イに使用した（第３表）。

結果は、クローン＃１は、拮抗剤の存在でも不在でも
hNK−2Rを最高レベルで表現することを示している。拮
抗剤の存在での表現は、この細胞系では３倍高いことが
明らかである。拮抗剤の存在は、検出可能な結合活性へ
の種々の作用を有することが明らかである。対照は、こ
の検定におけるNKA結合の低いバックグラウンドを示し
ている。

例14−ヒト血清アルブミン ヒト血清アルブミン（HSA）cDNA（例えばSargent等の
Proc.Nat.Acad.Sci.USA、1981、78、243−246参照）
を、サブクローニングによりpEC₃中に入れ、次いで、Cl
a I/Asp718フラグメントをpGSE1417中に移した。

トランスフェクション、誘導及びRNA分析は前記のよ
うであり、その結果、MEL細胞中のHSAの表現が得られ
た。

フロントページの続き (72)発明者 ニーダム，モーリス ロナルド チャー ルズ イギリス国 ジービー―エスケイ10 ４ ティージー チェシャー マクレスフィ ールド オールダリー パーク （番地 なし) (72)発明者 グディング，クレア イギリス国 ジービー―エスケイ10 ４ ティージー チェシャー マクレスフィ ールド オールダリー パーク （番地 なし) (72)発明者 グロウスヴェルト，フランクリン ジェ レイドゥス イギリス国 ジービー―エヌダヴリュー ７ １エイディー ロンドン ミル ヒ ル メディカル リサーチ カウンシル （番地なし) (72)発明者 アントニオ，マイケル イギリス国 ジービー―エヌダヴリュー ７ １エイディー ロンドン ミル ヒ ル メディカル リサーチ カウンシル （番地なし) (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C12N 15/63 - 15/90 C12N 5/10 C12P 21/00 - 21/02 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＭＥＤＬＩＮＥ（ＳＴＮ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (6)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】（ｉ）ヒトβ−グロビンプロモータ、（i
   i）マウス赤白血病細胞に対して非相同のポリペプチド
   をコードするゲノムDNA配列及び（iii）優性コントロー
   ル領域を有するベクターで形質転換されたマウス赤白血
   病細胞であって、ここで、前記マウス赤白血病細胞の分
   化の誘導の後に、前記ポリペプチドが前記マウス赤白血
   病細胞により分泌される、形質転換されたマウス赤白血
   病細胞。
2. 【請求項２】優性コントロール領域は、次のフラグメン
   ト： β−グロビン遺伝子からの 2.1kb Xba I−Xba I; 1.9kb Hind III−Hind III 1.5kb Kpn I−Bgl II及び 1.1kb 部分Sac I を連結することにより得られた6.5kbフラグメントを有
   するマイクロ座を有する、請求項１に記載のマウス赤白
   血病細胞。
3. 【請求項３】ポリペプチドを製造する方法において、こ
   の方法は、請求項１に記載のマウス赤白血病細胞を培養
   することよりなることを特徴とする、ポリペプチドの製
   法。
4. 【請求項４】（ｉ）ヒトβ−グロビンプロモータ、（i
   i）第２エキソン／イントロン、第３エキソン及びポリ
   アデニル化配列、全てのヒトβ−グロビン遺伝子、（ii
   i）ポリペプチドをコードするcDNA配列及び（iv）優性
   コントロール領域を有するベクターで形質転換されたマ
   ウス赤白血病細胞であって、ここで、前記マウス赤白血
   病細胞の分化の誘導の後に、前記ポリペプチドが前記マ
   ウス赤白血病細胞により分泌される、形質転換されたマ
   ウス赤白血病細胞。
5. 【請求項５】優性コントロール領域は、次のフラグメン
   ト： β−グロビン遺伝子からの 2.1kb Xba I−Xba I; 1.9kb Hind III−Hind III 1.5kb Kpn I−Bgl II及び 1.1kb 部分Sac I を連結することにより得られた6.5kbフラグメントを有
   するマイクロ座を有する、請求項４に記載のマウス赤白
   血病細胞。
6. 【請求項６】請求項４に記載のマウス赤白血病細胞を培
   養することよりなる、ポリペプチドの製法。