CS267192A3 - Expression systems - Google Patents

Description

2^7/- 7. - 1 -

o ' >£&. «3 σ> σ i o expresní systémy

Oblast techniky Předkládaný vynález se vztahuje"“k tticlupi^e-^sxmvéhoinženýrství a zejména k metodě přípravy polypeptidů v savčíchhostitelích. Předkládaný vynález se také vztahuje k vektorůmpoužívaným v těchto metodách a k hostitelským buňkámvytvořeným těmito vektory.

Dosavadní stav techniky vzhledem genového a zavedenytakovýchtoprodukovat umo ž ňuj e buňkámPodobné vektory

Mnoho biologicky aktivních proteinů nebopolypeptidů je vytvářeno v eukaryotických buňkách, avšak vesvých původních buňkách nebo tkáních se nacházejí pouzev mizivých kvantech. Vyčistit tyto proteiny ve většímmnožství může být extremně složité nebo nákladné, častodíky vzácnosti jejich přírodního výskytu. Metodyinženýrství umožnily vytvořit sekvence komplementární DNA (cDNA),. kódující požadované proteiny. Tyto.cDNA mohou být vneseny insercí do klonovacích vektorů (spolus vhodnými regulačními oblastmi nutnými pro expresi) do vhodných hostitelských buněk. Zavedení vektorů do vhodných buněk polypeptid zakódovaný v cDNA. mohou být vytvořeny za pomoci genomových (t j. pomocí intronůa exonů) sekvencí, které vytvářejí požádovaný gen.Eukaryontní buňky (a zejména savčí buňky) jsou schopnyprovádět větší počet posttranslačních modifikací (jako např.amidaci, glykosylaci atd.), které nelze pozorovat při expresiv prokaryontních buňkách. Následkem toho savčí buňky častoprodukují proteiny které mnohem blíže připomínají přirozené,biologicky aktivní molekuly bílkovin. Velkoobjemová kultivacesavčích buněk je však drahá a pomalá ve srovnání s kultivacíprokaryontních buněk, a jsou neustále vymýšleny metody pro 2 zvýšení produktivity živočišné buňky a ke snížení časoého intervalu potřebného k vytvoření užitečného množství bílkovinného produktu živočišnou buňkou.

Obecně, zavedení cizí DNA (jako jsou např.$ výšeuvedené vektory) do živočišných buněk vede k náhodné integraci jedné nebo více kopií DNA do genomu buňky. Hladina / exprese genů z cizorodého genu je velmi závislá na místě integrace cizí DNA do hostitelského genomu ("posiční efekt").Integrace do takzvané "aktivní oblasti" obvykle poskytujeponěkud vyšší hladiny exprese, ale tyto jsou často stálenízké ve srovnání s úrovní jakou lze nalézt u nativníhochromozomálního (bez tránsfekce) genu. Úrovně u transfekováných genů nejsou obecně ve vztahu k počtu kopiíve kterékoliv buňce, což je další důsledek posičního efektu. Běžnou technikou používanou ke zvýšení produktivity ' transfektováných hostitelských buněk je in vivo amplifikace integrované cizí DNA, aby vznikly integranty o vysokém počtukopií. Při těchto postupech gen, který je středem zájmu 4 (spolu s .příslušnými řídícími sekvencemi) je V ko-transfektován spolu s genem, který může mít ochrannou *· < funkci proti nějaké toxické látce. Běžně používaný ochranný gen je gen pro dihydrofolát reduktasu (DHFR). Při aplikacizvyšující ‘ se koncentrace methotrexátu (MTX), kompetitivníhoinhibitoru esenciálního enzymu DHFR, na transfektované buňky,přežijí pouze buňky s vyšší hlladinou exprese DHFR. S dále sezvyšující hladinou MTX přežijí pouze buňky, které amplifikujípočet kopií genu DHFR (a následkem toho téžko-transfektovaný rekombinantní expresní konstrukt). Tímto «. způsobem počet kopií a tedy hladina exprese (tj. produktivita na buňku) cDNA může být zvýšena.

Nedávno byl popsán nový, zesilovači podobný,element z lokusu lidského globinu (Grosveld a kol., 1987: WO 3 89/01517), který řídí expresi heterologních genův erythroidních buňkách, a to expresi s vysokou hladinou,polohově nezávislou, závislou na počtu kopií. Tento elementje extrémně specifický k typu buněk, a funguje pouzev erythroidních buňkách. Tento element s dominantní řídícíoblastí (DCR) byl použit k překonání pozičního efektu přiexpresi lidského beta-globinu v erythroidních buňkách. Tentoodkaz, WO 89/01517, popisuje použití tohoto zesilovacíhoelementu při expresi beta-globinu z globinového promotoru.

Použití DCR pro expresi heterologních proteinů všaknenašlo široké uplatnění vzhledem k povaze erythroidníchbuněk a poznatku, že tyto buňky nejsou schopny dostatečnésekrece.

Existuje velká potřeba savčího expresního systémuschopného exprese heterologních polýpeptidů.

Existuje také potřeba zlepšených savčích expresníchsystémů, schopných vysoké hladiny exprese polýpeptidů.

Existuje také potřeba, savčího expresního systémuschopného exprese nějakého polýpeptidů s vysokou hladinouexprese a schopného sekretovat exprimovaný polypeptid.

Podstata vynálezu

Bylo nyní objeveno, že savčí expresní systémy mohoubýt použity k expresi heterologních polýpeptidů, a zejména žeurčité savčí expresní systémy, které zahrnují DCR jsouschopny exprese polýpeptidů s vysokým výtěžkem. Byly takéobjeveny savčí expresní systémy schopné docílit vysokéhladiny exprese polýpeptidů, a následné sekrece exprimovanéhopolýpeptidů. 4 Předkládaný vynález proto poskytuje savčí expresní systém schopný exprese heterologních polypeptidů.

Podle toho předkládaný vynález poskytuje expresnísystém sestávající ze savčího hostitele transformovanéhoi? vektorem, který sestává z promotoru, sekvence DNA kódující požadovaný polypeptid a z dominantní řídící oblasti.

Sekvence DNA, která kóduje požadovaný heterolognípolypeptid bude, obecně, obsahovat gen, který je heterolognímgenem v tom smyslu, že se v hostiteli v přírodě nenachází.

Promotor může zahrnovat libovolný promotor schopnýfunkce v hostitelské buňce. Například promotor může zahrnovatpromotor, který se vyskytuje v hostiteli v přírodě, nebo můžezahrnovat heterologní promotor, tzn. promotorb, který senormálně v hostiteli v přírodě nenachází. Příklady prvéhozahrnují například situaci, kdy je hostitelem erythroidníbuňka a promotor může sestávat z promotoru beta-globinu.Příklady druhého zahrnují například situaci, kdy hostitelemje erythroidní buňka, a promotorem je promotor PLA2. Příklady preferovaných savčích hostitelů zahrnujínapříklad erythroidní buňky jako jsou buňky myšíerythroleukemie (MEL), krysí erythroleukemie (REL) a lidskéerythroleukemie (HEL). Zejména vhodným hostitelem jsou buňkyMEL, jejichž produkční schopnosti a charakteristika jsoupopsány Deisserothem a kol., Proceedings of the NationalAcademy of Sciences, Vol. 72, No.3, p 1102-1106; Deisseroth . x a Hendrick, Cell, 15, 55-63, 1978; a Friend a kol.,

Proceedings of the National Academy of Sciences, Vol. 68,No.l, p 378-382, 1971.

Expresní systémy, které jsou součástí předkládanéhovynálezu byly shledány obzvláště výhodnými. Například 5 •jsou-li hostitelem erythroidní buňky (zejména buňky MEL), pakexpresní systém byl shledán překvapivě výhodným. Mezi výhodytakovéhoto expresního systému patří například skutečnost, žehostitel může být kultivován relativně snadno bez potřebyspeciálních požadavků jako je například vysoký obsah sera.Neočekávané bylo také zjištění, že systém funguje účinnéi bez potřeby selektovat individuální klony schopné vysokéexprese. Proto byl expresní systém, který je předmětempředkládaného vynálezu shledán překvapivě účinnýma flexibilním systémem. Dále bylo objeveno, že jsou-li hostitelemerythroidní buňky, může se exprese vyskytovat s překvapivouúčinností. Exprese může být intracelulární, uvnitř buněčnéstěny, nebo může být doprovázena sekrecí. To byloneočekávané. Zejména bylo neočekávané, že takovýto expresnísystém mohl být použit pro sekreci.

Byly konstruovány též expresní systémy obsahujícíheterologní promotor, , a bylo zjištěno,- že tyto systémy jsoupřekvapivě účinné. ’ ' ;

Dalším předmětem tohoto vynálezu jsou vektorypoužitelné pro vznik expresních systémů tohoto vynálezu. Výhodný vektor obsahuje sekvenci, která je schopnastabilizovat mRNA odvozenou z DNA sekvence kódujícípožadovaný polypeptid. Bylo zjištěno, že takové vektory jsouzejména výhodné v tom, že zvyšují vysoké hladiny exprese

Tak v části tohoto vynálezu je popsán vektor,takový vektor obsahující promotor, dominantní řídící oblast,DNA sekvenci kódující; požadovaný polypeptid a DNA sekvenci, λkterá je schopna propůjčit stabilitu mRNA odvozené od té DNAsekvence, která kóduje požadovaný polypeptid. 6

Je výhodné, jestliže DNA sekvence, která kóduje požadovaný polypeptid obsahuje cDNA. Výraz "dominantní řídící oblast" (nebo "DCR"), zdeužívaný, představuje sekvenci DNA, která je schopna spojenémugenovému expresnímu systému, pokud je tento integrován dogenomu hostitele kompatibilního s dominantní řídící oblastí,propůjčit schopnost exprese omezené na určitý buněčný typhostitele, nezávislé na místě integrace a závislé na počtukopií. Dominantní řídící oblast si podržuje tuto vlastnosti když je plně rekonstituována uvnitř chromozomu hostitelskébuňky, a schopnost řídit účinně expresi omezenou na určitýbuněčný typ -hostitele je -zachová vna i když dojde k plnéreformaci v heterologním pozadí jako je odlišná částhomologního chromozomu nebo dokonce odlišný chromozom. Výraz "vektor" jak je používán zde, je používán vesvém nejširším významu a zahrnuje ve svém významu jakýkolivmateriál rekombinantní DNA schopný přenášet DNA z jedné buňkydo druhé. Vektor může zahrnovat jeden kus DNA v lineární nebokruhové formě. Předkládaný vynález poskytuje tedy vektor, kterýmůže být integrován do savčích hostitelských buněk.Předkládaný vynález také poskytuje transferový vektor jako jeplasmid, což je užitečné například při konstrukci vektoru prointegraci.

Vektor může nádavkem k sekvencím DNA uvedeným výše,

zahrnovataplikace,Napříkladreplikacinapříklad E také jiné sekvence DNA vhodné pro speciálníjako jsou například vhodné řídící sekvence,může vektor zahrnovat sekvence DNA umožňujícívektoru také v bakteriálním hostiteli jako jecoli, a selekci na přítomnost tohoto vektoru v daném hostiteli. Vektor může zahrnovat "selektovatelný 7 markér", gen, který při expresi poskytuje nějakou bílkovinu vmnožství schopném chránit rekombinantní hostitelskou buňku proti toxické látce,zahrnují neomycinové aexpresní vektory budou Příklady selektovatelných markérůhygromycinové markéry. Obecné cDNAzahrnovat polyadenylační oblastkompatibilní s promotorem. Například polyadenylační oblastímůže být tato oblast beta-globinového genu, v kterémžtopřípadě může být doprovázena sekvencí ležící "po proudu" odadenylační oblasti beta-globinu, například asi 2kb sekvencesměrem od polyadenylační oblasti.

Promotor může být tvořen libovolným promotoremschopným funkce v hostitelské buňce. Například promotor můžebýt tvořen beta-globinovým promotorem nebo promotorem PLA2. Vjedné součásti vynálezu je preferováno, aby promotor byltvořen beta-globinovým promotorem, zejména pokud jsouhostitelskými buňkami buňky erythroidní. V další částipředkládaného vynálezu je preferováno, aby promotor obsahovalpromotor PLA2 a hostitelské buňky byly erythroidní buňky. X; >; 'Sekvence f DNA, , která přenáší . stabilitu na mRNAtvořenou ze sekvence DNA kódující požadovaný polypeptid, můžebýt spojena se sekvencí,DNA kódující požadovaný polypeptidtakovým způsobem, že je vytvářena hybridní mRNA, která jemnohem stabilnější než mRNA ze sekvence DNA kódujícípožadovaný polypeptid. Sekvence mohou být spojeny přímo jednas druhou nebo nepřímo (to znamená že na sebe mohoukontinuálně navazovat nebo mohou být odděleny další sekvencíDNA), za předpokladu že stabilita je přenášena na mRNAvytvářenou z DNA, která kóduje pro produkci žádanéhopolypeptidu, vytvořením hybridní mRNA, která je mnohemstabilnější než mRNA kódující pro požadovaný polypeptid.

Sekvence schopná přenést stabilitu na mRNA může svýhodou také poskytovat vhodné místo ke štěpení, což umožňujevytvářet správně sestřiženou RNA. 8 zahrnovalajeho část. Napříkladpo přirozené štěpící

Sekvence schopná přenést stabilitu na mRNA může zahrnovat exon a intron ze savčího genu. Takový exon a/anebo intron může být přítomen jako celek nebo jen v části.

Zvláštním příkladem sekvence schopné přenést stabilitu na mRNA, je sekvence sestávající z beta-globinového genu, nebo sekvence z tohoto.odvozená,která zahrnuje dva exony a jeden intron, jako je exon 2,intron 2 a exon 3. Jeden nebo každý exon a/anebo každý intronmůže mít redukovanou délku, a zejména exon 2 může mítredukovanou délku tak, že sekvence zahrnuje exon 2 nebo částexonu 2, intron 2 a exon 3.

Obecně je preferováno, aby sekvence3 -konec beta-globinového genu, nebosekvence může zahrnovat sekvenci ažmísto Xbal u base 4845 beta-globinového genu.

Beta-globinový gen byl již mnohokrát popsán {viz.,například, Lawn a kol., Cell, 21, 647-651, 1980).

Sekvence cDNA kóduje požadovaný polypeptid a můžedát vznik, například intracelulárnímu, povrchovému nebosekretovanémú polypeptidu. Příklady ;sekvence cDNA zahrnujícDNA lidského beta-globinu, cDNA lidského růstového hormonu,cDNA . lidského PLA2,- a cDNA. lidského G-CSF. .

Je preferováno, aby promotorem byl heterolognípromotor. Pokud je použit heterologní promotor, jako je třebapromotor PLA2, je získaná hladina exprese překvapivě vysoká.

Dominantní řídící oblast, neboli DCR, můžezahrnovat sekvenci definovanou ve W089/01517 (Grosveldt akol.) a která je zde zahrnuta jako citace (citovaná v tomtoodkazu jako dominantní aktivátorové sekvence).

Dominantní řídící oblast může být odvozena metodamigenového inženýrství z genového systému, který se přirozeněvyskytuje v přírodě, anebo může odpovídat přirozeně se 9 vyskytujícímu genovému systému v tom smyslu, že je vytvořenpomocí známých technik synthesy polynukleotidů podlesekvenčních dat vztahujících se k přirozeně se vyskytujícímugenovému systému. Změny v této sekvenci mohou být učiněny,tyto však nemění funkci dominantní řídící oblasti. S výhodou tímto přirozeně se vyskytujícím genovýmsystémem, z něhož je dominantní řídící oblast odvozena,a nebo jemuž tato odpovídá, je systém, který vykazujeexpresní charakteristiku velice omezenou na určitý typhostitelské buňky, nejlépe s vysokou hladinou exprese.Specifickými příklady takovýchto systémů jsou hemoglobinovésystémy jako je beta-globinový systém a lymfocytární systémyjako je systém CD2.

Dominantní řídící oblast může být tvořena, býtodvozena, nebo odpovídat jedné nebo více superhypersensitivním oblastem DNasy I, zejména jakéhokoligenového systému schopného buněčně specifické exprese. Jinésekvence mohou však také vykazovat funkční charakteristikydominantní řídí cí oblasti. Pokud. přirozeně se vyskytujícídominantní řídící oblast zahrnuje dvě nebo více podsekvencíoddělených intervenující polynukleotidovou sekvencí nebosekvencemi, dominantní řídící oblast může obsahovat dvě nebovíce subsekvencí spojených za nepřítomnosti jedné neboněkolika intervenujících sekvencí. Takže, pokud dominantnířídící oblast přirozeně se vyskytujícího genového lokusuzahrnuje dvě nebo více diskrétních podsekvencí oddělenýchintervenujícími nefunkčními sekvencemi, (například dvěmi nebovíce super hypersensitivními oblastmi) vektor, který jepředmětem vynálezu může zahrnovat dominantní řídící oblastsestávající ze dvou nebo více vzájemně spojených podsekvencíse všemi nebo s částí odstraněných intervenujících sekvencí. ' DCR může být odvozena z lokusu beta-globinového 10 genu. Jak je diskutováno ' ve WO 89/01517, lokusbeta-globinového genu obsahuje větší počet superhypersensitivních oblastí DNasy I, které vytváří DCR. Svýhodou dominantní řídící oblast obsahuje jednu nebo vícesuper hypersensitivních oblastí DNasy I identifikovanýchuvnitř beta-globinového lokusu. Pokud možno tyto od 5 koncelokusu, případné se sekvencemi 3 konce. Dominantní řídícíoblast se nachází uvnitř fragméntu o 21kb od -lkb Clal to-22kb Bglll ihned proti směru od epsilon-globinového genu vbeta-globinovém lokusu. Tato oblast obsahuje čtyři superhypersensitivní oblasti DNasy I s intervenujícímipolynukleotidy (pět oddělených oblastí z nichb dvě jsou velmiblízko u sebej. - S výhodou mohou být některé nebo všechnyintervenující nukleotidy odstraněny za použití známýchtechnik jako je štěpení exonukleasou.

Byla vytvořena redukovaná forma dominantní řídícíoblasti beta-globinového lokusu, která vykazuje výraznězvýšenou hladinu exprese připojeného systému pro expresigenů. Toto bylo vytvořeno (viz.: WO 89/01517) ligacínásledujících čtyř fragmentů.. '' 2.lkb Xbal - Xbal

1.9kb HindlII - HindlII 1.5kb KpnI . Bglll l.lkb částečný fragment Sací

Tato dominantní řídící oblast , známá jako "mikrolokus", je fragment o velikosti 6,5kb, který může být použitjako "kazeta" k aktivaci specifického genového expresníhosystému.

Dominantní -řídící oblast může být odvozena odlokusu genu CD2. Lokus genu CD2 obsahuje tři superhypersensitivní oblasti, jednu na 5 hranici lokusu a dvě u 11 3 konce lokusu. S výhodou obsahuje dominantní řídící oblastjednu nebo více super hypersensitivních oblastí DNasy Iuvnitř lokusu CD2. Ještě výhodněji dominantní řídící oblastobsahuje obě super hypersensitivní oblasti od 3 konce lokusu,případně s odstraněnými všemi nebo části intervenujícíchoblastí. Dominantní řídící oblast je obsažena v rozmezí mezi5,5kb Bamhl a Xbal fragmentů u 3 konce genu CD2. V jedné zejména zajímavé části se vektor uváděný vtomto vynálezu skládá z promotoru, dominantní řídící oblasti,cDNA sekvence kódující požadovaný polypeptid a DNA sekvence,která je spojena se zmíněnou sekvencí cDNA tak, že hybridnímRNA je v hostiteli produkována v mnohem stabilnější forměnež když k tomu dochází ze samotné cDNA. Příklady různých sekvencí jsou uvedeny výše.

Jak bylo výše uvedeno DNA sekvence mohou býtspojeny přímo nebo nepřímo. * ' Vynález , též. zahrnuje metodu přípravy polypeptidu,.která zahrnuje’způsob kultivace expresního systému, uváděnéhov tomto vynálezu.. Tak hostitel bude kultivován za příslušnýchpodmínek, které jsou nezbytné pro růst hostitele.

Jak bylo výše uvedeno, mohou být expresní systémynebo hostitelé (a tudíž vektory), uváděné v tomto vynálezu,použity k sekreci polypeptidů.

Vynález dále poskytuje vektor použitelný propřípravu polypeptidu v savčím hostiteli, tak, že polypeptidje vylučován z hostitelských buněk, zmiňovaný vektor seskládá.z promotoru, dominantní řídící oblasti a genu, kterýkóduje požadovaný polypeptid, za předpokladu, že zmíněný gennení genem pro lidský beta-globin. 12

Promotor a dominantní řídicí oblast neboli DCR mohou mít kteroukoli výšeuvedenou definici- Také výraz vektor a další volitelné sekvence jsou jak bylo definováno výše.

Vektor může být použit pro dosažení sekrecepolypeptidu ze savčího hostitele.

Podle druhého aspektu tohoto vynálezu může genzahrnovat jakoukoli sekvenci DNA schopnou exprese a takvytvářet polypeptid, který je sekretován z hostitele. Předkládaný vynález takto také poskytuje metodupřípravy polypeptidu, která zahrnuje kultivaci expresníhosystému, který je tvořen savčím hostitelem transformovanýmpomocí vektoru jak je definováno ve druhém aspektupředkládaného vynálezu tak, aby byl produkován polypeptidšekretovaný ven z hostitele. V dalším aspektu předkládaného vynálezu jeposkytována metoda produkce polypeptidu v savčím hostiteli, ’ například ;verythroidních buňkách, podle níž je polypeptid"sekretován z hostitelských buněk.

Obecně bude šekretovaný polypeptid "sklízen" pomocístandardních technik známých v oboru a může, bude-li třeba,být dále zpracováván nebo purifikován.

Hostitel může obsahovat vektor jak je definováno výše.

Hostitelem může být libovolný organismus dledefinice uvedené výše. Obecně je preferováno, aby hostitelbyl tvořen erythroidními buňkami, zejména buňkamierythroleukémie (například buňkami myší erythroleukémie). 13 -

Je též předkládán postup pro přípravu vektorupředmětu vynálezu (jak je definováno zde v předcházejícím). Předkládaný vynález také poskytuje postup napřípravu vhodného hostitele dle předkládaného vynálezu,kterýžto postup zahrnuje transformaci a transfekci savčíhohostitele pomocí vektoru dle. předmětu vynálezu.

Vektor může být transfektován do populacehostitelských buněk libovolně z většího počtu vybranoutransfekční metodou, která poskytne integraci alespoň jednékopie (ale výhodněji více kopií) expresního vektoru do genomuhostitele (ve funkční formě). Po transfekci jsou buňkykultivovány po dobu umožňující integraci DNA expresníhovektoru a expresi genu selektovatelného markéru. Populacebuněk je dále vystavena účinku dostatečně vysoké koncentracetoxické látky proti níž chrání selektovatelný markér tak,, abydošlo ke zničení buněk, které nemají stabilně integrovanouDNA expresního vektoru. ; Závěrem jsou klony buněk, kteréexprimují vysoké hladiny RNA genu produktu, nebo vysokéhladiny - produktu samotného selektovány některou z libovolnědostupných.metod, které jsou odborníkům dobře známy.

Jak je uvedeno výše, savčí hostitelskou buňkou můžebýt libovolná savčí hostitelská buňka schopná přijmout vektorpodle předkládaného vynálezu. Tak může hostitelská buňka býtbuňkou lidskou nebo živočišnou, a zejména se může jednat obuňku transgenního živočicha, jako je například myš. Protopředkládaný vynález též poskytuje popis pro transgenníhoživočicha, který byl transfektován vektorem podlepředkládaného vynálezu (jak je definováno v prvém nebo druhémaspektu předkládaného vynálezu).

Expresní systémy (nebo transformovaní hostitelé)podle předkládaného vynálezu mohou být použity pro produkci 14 požadovaného polypeptidů in vitro nebo in vivo. Předkládnývynález dle tohoto také poskytuje metodu genové terapie,kterázahrnuje odstranění kmenových buněk z těla živočicha, zničeníkmenových buněk, zbylých v těle, transformaci odstraněnýchbuněk pomocí vektoru, který je předmětem vynálezu (jak jedefinováno v prvním nebo druhém aspektu předkládanéhovynálezu), který obsahuje sekvenci DNA kódující polypeptid,potřebný pro živočicha , a umístění transformovanýchkmenových buněk v živočišném těle.

Tak tato metoda genové terapie může být použita knahrazení nebo doplnění odlišného genu v nějakém živočichovi. vynálezu, tzn.předkládaného

Vhodným zdrojem kmenových buněk je kostní dřeň,stojí za zmínku, že ' tato obsahuje jak lymfocyty, tak.erythroidní kmenové buňky. Lze kladně hodnotit, žehostitelské buňky, podle předkládaného vynálezu mohouobsahovat více než jednu kopii vektoru, který je předmětemvektoru podle prvého nebo druhého aspektuvynálezu. .Hostitelské buňky obsahující mnohočetné kopie DNA expresního vektoru mohou vznikat po dvounebo více následných opakováních procesů transfekce a selekce(za použití odlišných selektovatelných markérů pro jednotliváopakování) a nebo podrobením populace buněk, získanýchvýšeuvedeným způsobem, běžnému amplifikačnímu postupu zaúčelem zvýšení počtu kopií DNA integrovaného expresníhovektoru.

Expresní systém/vektory dle předkládaného vynálezumohou být použity k přípravě heterologních polypeptidů azejména polypeptidů, které mají užitečné farmakologickévlastnosti. Příklady takových polypeptidů zahrnují napříkladGCSF, hGH a PLA2. Předkládaný vynález poskytuje řadu výhod oproti 15 dřívějším způsobům a obecně odstraňuje mnoho problémů, kterés těmito metodami souvisí.

Obecně, předkládaný vynález popisuje expresnísystémy/vektory, které mohou být produkovány relativnévysokou rychlostí, a které poskytují vysoké hladiny expresepožadované RNA a polypeptidu. Obecně též předkládaný vynálezposkytuje popis nových rekombinantních hostitelských buněkschopných vysokých hladin exprese požadovaného polypeptidu.Obecně jsou metody uváděné v předkládaném vynálezu použitelnépro jakoukoli eukaryotickou hostitelskou buňku, pro níž jepopsána DCR sekvence nebo v níž je OCR sekvence aktivní nebomůže být uzpůsobena tak, aby byla aktivní. DCR elementy byly používány zejména v kombinacis různými typy erythroidních buněk (buňky myššíerythroleukémie [MEL],krysí erythroleukémie [RÉL] nebo lidskéerythroleukémie [HEL]) a bylo zjištěno, že tyto buňkysekretují heterologní proteiny s překvapující účinností. Bylyvytvořeny nové expresní systémy, které jsou schopny vylučovatpo dlouhou dobu vysoké hladiny 'heterologních bílkovin, tyto• expresní systémy mohou být .použity pro kultivaci, v malém ______i velkém měřítku a sekreci in vitro, a tytéž vektory mohou být použity pro in vivo produkci bílkovin, bud produkcirekombinantní bílkoviny nebo jako součást postupu při genovéterapii. Tento systém může účinně dodávat bílkoviny(s terapeutickou hodnotou) do krevního oběhu savců, nositelů vektoru.

Popis obrázků

Obr.l: Plasmidové mapy plasmidů pbetaH2, pbeta-mini a pGSE1417.

Obr. 2.: Konstrukce plasmidů pUNIVEC. 16

Obr.3: Plasmidová mapa pUNIVEC(pEC2).

Obr.4: Konstrukce HGH cDNA.

Obrázek 4a ilustruje sekvenci oligonukleotidupoužitého k obnovení 5 konce HGH cDNA, * Obrázek 4b ilustruje inzerci oligonukleotidu do 5 konce HGH cDNA. £

Obr.5: Konstrukce konečného expresního vektoru HGH cDNA.

Obr.6: Analýza indukovaných klonů MELC88 transfektovaných expresním vektorem HGH cDNA pomocí metody Nothern blot. Vtomto obrázku (i) označuje lidský růstový hormon HGH, a (ii)označuje myšší beta-globin. Řada A = klon 4, Řada B = PPI(nahromaděná populace 1), Řada C = PP2 (nahromaděná populace

' 2), Řada D = klon 1, Řada E = klon 2; Řada F = klon 3, Řada G ϋ· -/·“ . v. = Meleš8 neindukovaný, Řada H = MelC88 indukovaný. 'áX·- ' i : ás;- ' . ‘ ,

Obr.7: Konstrukce genomového expresního vektoru HGH. , Obr.8: Analýza indukovaných linií . MELC88 transfektovaných .Λ Sgeňomovým expresním vektorem HGH pomocí metody Nothern blot. v tomto obrázku (ij označuje lidský růstový hormon HGH, a(ii) označuje myšší beta-globin. Řada A = API, řada B - AP2,řada C = klon 5, řada D - klon 1, řada E = klon 3, řada F = klon 2, řada G = klon 4.

Obr.9: Změny 5 konce expresního vektoru HGH cDNA.

Obr.10: Dlouhodobá sekrece dvou HGH cDNA klonů buňkami

MelC88. f Obr.11: Klonování PLA2 cDNA.

Obr.12: Klonování genu PLA2 do expresního vektoru. 17

Obr.13: Northern blot exprese PLA2 z genomových sekvencí PLA2. V tomto obrázku NI = neindukováno, I = indukováno, MEL== MelC88, 50C-1 = PLA2 cDNA klon, PPI, PP2 = nahromaděné klony PLA2 transfektovaných MelC88 buněk a 1,2,3,4 =individuální klony PLA2 transfektovaných MelC88 buněk.Obrázek 13 (a) = s probou PLA2, (b) = s probou-myším beta globinem, a (c) = s probou GAPDH.

Obr.l4: Northern blot exprese PLA2 z "beta-globinového promotoru/PLA2 kódujícího'· konstruktu. V tomto obrázku I =indukovaný, NI = neindukovaný, Mel = MelC88, PP = nahromaděnápopulace, 1,2,3,4,5,6,7 a 8 jsou individuální klony, 50C-1= PLA2 cDNA klon.

Obr. 15:. Northern blot analýza exprese hlavní základní,bílkoviny. V tomto obrázku (i) představuje hlavní základníbílkovinu, (ii) představuje globin, PP = nahromaděnépopulace, a a,b,a,c,e a f = jednotlivé klony

Obr.16: Zobrazuje výsledky stanovení usmrcení E.coli.

Obr.17: Northern blot analýza exprese TNFalfa receptoru. V tomto obrázku (i) představuje TNFalfa receptor, (ii)představuje myší globin, U = neindukovaný, I = indukovaný,a 1,2,3,4 a 5 jsou individuální klony.

Obr.18: Ilustruje expresi receptoru TNFalfa.

Obr.19: Northern blot analýza hNK-2 receptorových transfektovaných Mel buněk s probou fragmentu exonu 2 myšíhobeta globinu. V tomto obrázku + = indukováno v přítomnostinějakého antagonisty hNK-2R.

Obr. 20: Northern blot analýza hNK-2 receptorovýchtransfektovaných Mel buněk s probou hNK-2R cDNA. V tomto obrázku + ~ indukováno v přítomnosti nějakého antagonisty hNK-2R. 18 -

Obr. 21: Nothern bJLot analýza exprese lidského sérovéhoalbuminu. V tomto obrázku (i) značí lidský sérový albumin,(ii) značí globin, I=indukováný, NI = neindukovaný, a1,2,3,4,5 a 6 jsou jednotlivé klony.

Obr.22: Northern blot analýza exprese hGH. V tomto obrázku(a) značí hGH RNA, (b) značí myší globin, U = neindukovaný,I — indukovaný, lb,lc,ld,2a,2c,2f jsou jednotlivé klony.

Obr. 23r Srovnání hGH/EC2 a hGH/EC3 v buňkách Mel. V tomtoobrázku PP = nahromaděné populace, u = neindukovaný, I =indukovaný, 1,2,3,4,5 a 6 jsou jednotlivé klony.

Podrobný popis

A) Konstrukce vektorových DNA Výsledné .expresní vektory byly příhodněkonstruovány ze dvou intermediátních plasmidů. Jeden plasmid(pGSE1417) obsahuje sekvenci DCR a gen selektovatelnéhomarkéru a druhý plasmid (odvozený z pUNIVEC) obsahujeexpresní kazetu dle výběru. Plasmidy byly připraveny dálepopsaným způsobem:

Konstrukce plasmidů pGSE1417

Tento plasmid (viz obr.lC), který obsahujemikrolokus DCR beta globinu je přesně shodný jak uvádí Talbota kol., Nátuře 338, 1989, viz také Collis a kol., EMBOJournal vol. 9, No 1, 233-240, 1990. 19

Konstrukce plasmidu pUNIVĚC (zde též označován jako pEC2)

Počínaje plasmidem pbetaH2 (obsahujícím lidskýbeta-globinový promotor od -800 do +30 a první exon myšíhogenu H2K, v kostře pBLUESCRIPT*; viz. obrázek 1A), oblastXhol 5 až k beta-globinovému promotoru byla odstraněna zavzniku plasmidu pbetaH2-X. Beta-globinový promotor byl potézkrácen na přibližně -400 prostřednictvím restrikčníhoštěpení pomocí Pstl+BamHI za vzniku plasmidu p betaH2-X. GenH2K byl potom odstraněn restrikčním štěpením pomocíHindllI+Sstl a zaměněn syntetickým polylinkerovýmoligonukleotidem jak uvedeno níže (SEQ ID. NO 1):-

5 * AGC TTG AAT TCC CCG GGT CTA GAG CGG CCG CCT CGA GGG ATC .,-:-3 ·„: AC TTA AGG GGC CCA GAT CTC GCC GGC GGA GCT CCC TAG CCT GCA GGT ACC ATC GAT GAG CT 3 GGA CGT. CCA TGG TAG CTA C 5 který obsahuje rekogniční sekvence pro HindlII, EcoRI, Smál.--Xbal^ Notl Xhol ,7' BamHI, Pstl, KpnI.7 Clal. a Šstí restrikčníendonukleasy.Toto poskytlo plasmid p betaH2-X+Poly (takéoznačovaný jako-pEC1)'. K dokončení vektoru pUNIVEC (pEC2) bylfragment genu lidského beta-globinu od přirozenéhorestrikčního místa Bamhl v exonu 2 k oblasti Pstl směrem "poproudu" (3 ) od tohoto, zahrnující exon 3 a polyadenylačníoblast, oddělen od plasmidu pbeta-mini (obrázek 1B) aklonován do p betaH2-X+Polqy mezi oblasti BamHI a Pstlpolylinkeru. Obrázek 2 naznačuje kroky zahrnuté v přípravě pUNIVEC. g pBLUESCRIPT je obecně dobře znám a dostupný. Například jedodáván firmou Stratagene. 20

Konstrukce expresních vektorů V zásadě jsou veškeré cDNA expresní vektorykonstruovány stejným způsobem. cDNA (například lidskéhorůstového hormonu) byla klonována do polylinkeru pUNIVEC stranslační startovací oblastí nejbližší k beta-globinovémupromotoru, expresní kazeta (beta-globinový promotor + cDNA +sekvence beta-globinového intronu/exonu a polyadenylačnísekvence) byly potom přeneseny do vektoru pGSE1417 (obvyklejako fragment Clal-KpnI do unikátních oblastí Clal a KpnI vpGSE1417) tak, že beta-globinový promotor byl nejblíže ksekvenci DCR a expresní kazeta byla umístěna mezi sekvenciDCR a genem selektovatelněho ukazuje konstrukci výsledného

markéru (tk-nec). Obrázek 4expresního vektoru pro cDNA lidského růstového hormonu (HGH).

Pro expresi heterologních proteinů z genomovýchsekvencí byly geny (včetně jejich přirozených polyadenylačních sekvencí) klonovány do prekursoru pUNIVECnazvaného p betaH2-X+Poly (pECj) (viz. obr. 2), · kterýpostrádá sekvence ' intron/exon. lidského beta-globinu ·. abeta-globinovou polyadenylační sekvenci. B) Transfekce a selekce

Buněčné linie V následujících příkladech byly použity buňky myšíerythroleukemie (MEL). Produkce a charakteristiky buněk MELjsou odborníkům známy a jsou popsány Deisserothem a kol.,Proceedings of the national Academy of Sciences, Vol. 72, No.3, str. 1102-1106, a Friend a kol., Proceedings of thenational Academy of Sciences, Vol. 68, No. l, str. 378-382,1971). Následující příklady se vztahují na buněčné linie myšíerythroleukemie MELC88 a 11A21, avšak přesná buněčná linie 21 není nejdůležitější a libovolná linie buněk myšíerythroleukemie ve vhodné periodě své diferenciace může býtdle následujících příkladů použita. Globinové DCR jsouaktivní v erythroidních buňkách a buňky MELC88 a 11A21 bylyindukovány aby se diferencovaly a staly se erythroidnímy zaúčelem zobrazení plné aktivity sekvence DCR.

Media

Veškeré zásobní buněčné linie byly pěstovány naneselektivních mediích, bud (A) Dulbeccovo minimálníesenciální medium (DMEM, Flow laboratories, tekuté medium suhličitanem sodným), doplněné 2mM glutaminu (Flowlaboratories), 10% zárodečného telecího sera (1% pro 11A21)a antibiotika penicilin/streptomycin (Flow laboratories),nebo (B) alfa-MEM (Flow laboratories, tekuté medium) doplněnéjak uvedeno výše.. Transfektované buněčné linie byly udržoványna výšeuvedených mediích s aminoglykosidem geneticin sulfátem(G418, Gibco-BRL Cat No 066-1811), přidaným do konečnékoncentrace lmg/ml, neBo s hygromycinem-B (BoehringerMannheim), vy konečné koncentraci 0,8mg/ml (nebo příležitostněs oběma :antibiotiky). Linie transfektantů byly selektoványjak je uvedeno dále.

Linearizace expresních plasmidů

Za účelem zavedení expresních plasmidů do buněkbyly tyto nejprve linearizovány štěpením restrikčním enzymem,který štěpí na jediném místě uvnitř plasmidů a kterýneinterferuje s transkripcí požadovaného genu nebo s genemselektovatelného markéru v savčích buňkách. Tímto enzymem bylpro většinu plasmidů Pvul, včetně pDCR/NEO/HGHcDNA apDCR/NEO/HGHgenomové. 22

Elektroporace buněk buněk) bylo10 -> lOOug

Buňky MEL byly sklizeny v exponenciální fázi růstu,dvakrát promyty pufrem pro elektrošoky (140mM NaCl, 25mMHEPES pH7,5, 0,75mM Na2HPO4) a potom resuspendovány na hustotu 104buněk/ml v čerstvém (ledovém) pufru proelektrošoky. Jeden ml buněčné suspense (107 přidáno k linearizované plasmidové DNA (obvykle DNA v diges4n9m pufru, vodě nebo lOmM Trisu, lmM EDTA pH8,0)v elektroporační komůrce (kyveta Bio-Rad Gene Pulser, délkadráhy 0,4cm) a inkubováno na ledu po dobu 5-10 minut. Směsbuněk a DNA byla potom podrobena pulsu při 250V za použitíelektroporátoru Bio-Rad GenePulser při kapacitanci 960uF.Buňky byly ponechány v klidu po dobu 5-10 minut při pokojovéteplotě a potom resuspendovány v neselektivním růstovém mediua následně naneseny na 24-jamkové destičky pro tkáňové kultury při hustotách 105 původních buněk na jamku (ldestička) a 104 původních buněk na jamku (1 destička). Pouplynutí 20-30 hodin byl přidán do každé jamky shodný objemselektivního media (obvykle lml) s obsahem 2mg/ml G418 (nebo,pokud Λje vhodné, i,6mg/ml hygromycinu-B)- Výsledné buněčnésuspense (v Ix selektivní medium) byly inkubovány při 37°C v

inkubátorech pro tkáňové kulturb s 5-10% CO 2’

Elektroporované buněčné suspense byly inkuboványpři 37°C po dobu 7-14 dní pokud nebylo možno pozorovatjednotlivé klony buněk resistentních proti antibiotiku. Tytobyly potom odebrány (pomocí pasteurovy pipety nebo pomocísemiautomatické pipety Gilson Pipetman) jednotlivě nebo ponahromadění, a namnoženy v selektivním mediu.

Transfekce suspense buněk pomocí fosforečnanu vápenatého

Metoda dle Gormana a kol. (Molecular and CellularBiology, 1044-1051, 1982) byla vždy používána a lze ji 23 stručně shrnout do následujících kroků: Roztok A bylpřipraven zředěním 20ul 70mM fosforečnanu sodného jedním ml2x HBS pH7,1 (10g/l Hepes, 16g/l NaCl). Roztok B bylpřipraven zředěním 50ug DNA určené k tranšfekci v lml vody se120ul 2M CaCL2. Dvoumililítrová sraženina byla připravenapřikapáváním roztoku B do roztoku A, který byl ponechán 20minut při- pokojové teplotě. Suspense buněk udržovaných vexponenciální fázi po dobu 2-3 dnů byla použita při hustotě6-8 x 105 buněk/ml. 2ml precipitátu bylo přidáno k 18 mlsuspense buněk a inkubováno při 37°C po dobu 4-6 hodin. Buňkybyly potom dvakrát promyty v PBS, spočítány a potom nanesenyna 24-jamkové destičky pro tkáňové kultury při hustotách2 x 104/ml a 2 x 105/ml. Destičky byly inkubovány přes nocpři 37°C a pobé bylo přidáno do každé jamky po lml roztoku2mg/ml G418 v kultivačním mediu. Destičky byly poté ponechánypři 37°C na 7-12 dní dokud se neobjevily kolonie.

Transfekce suspendovaných buněk lipofekcí . r - Suspenze buněk byla udržována v logaritmické fázirůstu po dva ' až tři dny před tranšfekci tak, aby v dentransfekce byla přibližná hustota 5 x 105/ml. transfekce bylyprováděny za použití činidla DOTMA od firmy BoehringherManheim, podle postupu popsaného v návodu soupravy, který lzestručně shrnout do následujících kroků: 1. 100 ul disperze DOTMA (lmg/ml) bylo rozpuštěno ve 4 mlmedia pro tkáňové kultury. 2. 0,1 - 10 ug DNA bylo oddělené rozpuštěno ve 4 ml media protkáňové kultury. Roztoky DNA a DOTMA byly smíchány. 3. Medium bylo odstředěním odděleno od buněk a směs DOTMA/DNAbyla přidána k buňkám, které byly poté inkubovány při 37°C po 24 dobu 3-6 hodin v přítomnosti 5-10%CO2. 4. Směs DOTMA/DNA byla oddělena od buněk odstředěním,nahrazena normálním růstovým mediem a buňky byly naneseny do24 jamkových destiček, jak bylo výše popsáno. Selektivnímedium bylo aplikováno dle výše uvedeného postupu.

INDUKCE EXPRESE

Indukce exprese byla provedena u klonůtransfektovaných buněčných linií nebo nahromaděných populacíshodným způsobem. Buňky byly udržovány v exponenciální fázirůstu každodenním naředěním na hustotu 2 x 105 bunék/ml.. Po3-4 denních naředěních byly buňky ponechány růst přes noc apoté byl k selektivnímu mediu přidán dimethylsulfoxid (DMSO)v konečné koncentraci 2%. Buňky byly poté udržovány v tomtoindukčním mediu po celou dobu trvání pokusu. PŘÍKLADY -

Přiklaď 1 - Exprese HGH cDNA Částečnou cDNA poskytl Dr.L.Hall (BristolUniversity). V této cDNA nebyl přítomen translační iniciačníkodon HGH. Počátek tohoto genu byl znovu vytvořen zabudovánímkoncensního eukaryotického translačního iniciačního místa(Kozák a kol., Molecular and Cellular Biology, Vol.7,3438-3445, 1987) za použití syntetického oligonukleotidu, který sahal od 30bp nad (5 ) translační startovní oblasti(ATG) až k přirozenému restrikčnímu místu endonukleasy AatlIblízko počátku cDNA (viz obr. 4a, 4b). Kompletní HGH cDNA odmísta HindlII (vneseného syntetickým oligonukleotidem) až kpřirozenému restrikčnímu místu Srna! byla klonována do 25 pBLUESCRIPT. Sekvence HGH cDNA obsahující přirozené sekvencesignálu sekrece HGH byly odstraněny z tohoto plasmidu jakofragment od HindlII po BamHI a klonovány do oblastí Hindlil aBamHI intermediárního vektoru pUNIVEC. Tento plasmid pakobsahoval expresní kazetu cDNA HGH. Tato kazeta bylaodstraněna z pUNIVEC štěpením pomocí Clal a KpnI a byla Vneseninzercí do oblastí Clal a KpnI plasmidu pGSE1417 za vzniku -ř· plasmidu pDCR/NEO/HGHcDNA. Tento proces je nastíněn v obrázku4c. Sekvence DNA výsledné HGHcDNA použité v těchtoexperimentech je znázorněna na obrázku 5.

Plasmid pDCR/NEO/HGHcDNA byl štěpen restrikčníendonukleasou Pvul a lineární DNA byla poté vnesena do buněkMEL C88 pomocí elektroporace, transfekce zprostředkovanéfosforečnanem vápenatým nebo lipofekcí. Monoklonálnítransfektované buněčné linie byly selektovány způsobempopsaným výše. U každé transfektované linie byla indukovánadiferenciace (a tudíž exprese řízené erythroidními elementyDCR) jak bylo popsáno, a sékretovaný růstový hormon bylstanovován za použití komerční soupravy RIA (NichollsInstitute tandem-R HGH assay kit). ' Hladiny “‘.mRNA. ? \ transfektované HGH cDNA byly stanovovány pomocí metodyNorthern blot s probou HGH cDNA za použití RNA myšíhohlavního beta globinu jako vnitřního standardu. VÝSLEDKY-Příklad 1

Stabilní buněčné linie exprimují a sekretují HGH svysokým výtěžkem. Myší krvinky nejsou známy jako sekrečníbuňky, a proto hladina sekrece z rekombinantních klonů bylasamozřejmě překvapivá. Počáteční stanovení HGH v buněčnémsupernatantu a buněčných lyzátech ukazovala, že více než 95%vytvořeného HGH bylo sekretováno do živného media. Sekrece(spíše než buněčná lyse) byla potvrzena použitím inhibitoru 26 sekrece plísňového inhibitoru sekrece, brefeldinu-A (viz obrázek 4).

Tabulka I ukazuje hladiny sekretovaného HGH získanépo čtyřdenní indukci z expresním vektorem pro HGH popsanýmvýše. Měřeny byly nahromaděné populace i monoklonální linie.

Tab. 1 : Vylučování HGH z transfektovaných MELC88 buněk buněčná linie monoklonální HGH [ug/τηΓ] elektroporace : PPI no 1,7 PP2 no 1,9 1 yes 0,8 2 yes 1,5 - 3 yes ‘ 3,5 4 yes 5,0 transfekce Ca3(PO4)2: PPI ne 5,0 PP2 ne 3,5 1 ano 2,0 2 ano 12,0 3 ano 4,5 4 ano 50,0 - 27 -

Hladina exprese byla, ve srovnání se standardnímiexperimenty exprese u savců (bez amplifikace), velmi vysoká.Northernový přenos (nothern blot) celkové mŘNA z indukovanýchbuněčných linií, se specifickou HGH sondou (probe),potvrdila, že hladiny mRNA čhimeřické globin/HGH RNA(produkované z expresního vektoru) jsou srovnatelnés hladinami endogenního myšího beta-globinu (viz Obr.6). Příklad 2 - Exprese HGH genu HGH gene byl připraven štěpením plasmidu pOGH, kterýbyl získán z Nichollsova Ústavu (viz Obr.7), restrikčnímiendonukleásami. Restrikční fragment od EcoRI místa k BamHImístu, obsahující nativní HGH genomové sekvence pro přepispřírodní RNA. od místa startu do 620 báze, byl po translokacistop kodonu. Λ subklonován?do -interemediálního vektorus"l p BH2—X+Poly, který nemá' beta-globinové intron/exon sekvence(viz Obr. .7), a který běžné obstarává sestřih a polyadenylacipro chimérickou mRNA v našich expresních vektorech.. V tomtointermediálním vektoru, expresní kazeta obsahuje promotorlidského beta-globinu vázaného na HGH genomové sekvence(intronové a exonové sekvence) a HGH polýadenylační signály.Tato expresní kazeta bala přenesena do konečného vektoru(GSE1417) jako Clal-KpnI fragment jak bylo dříve popsáno proHGH cDNA. Konečný expresní vektor, genomu pDCR/NEO/HGH,bylvnesen do MELC88 buněk elektroporací a monoklonálnítransfektantní linie a populace obsahující vektor byly selektovány jak bylo popsáno. Jako v předcházejícíchpřípadech , byly buňky každé transfektované linie rozlišeny 28

indukcí a vylučovaný HGH byl změřen za použití komerční RIA soupravy. Hladiny mRNA transfektovaného genu byl měřen nothernovým přenosem s HGH cDNA sondou. Hladiny myšího beta-globinu sloužily jako vnitřní kontrola. Výsledky - Příklad 2

Jak bylo zjištěno pro expresi HGH z HGH cDNA, stabilnítransfektantní buněčné linie HGH genu, exprimují a vylučujíHGH ve velké množství. Tab.2 ukazuje množství vylučovanéhoHGH, které bylo měřeno po 4 dnech indukc

Tab. 2 - Vylučování HGH z genů přenesených do MELC88 buněk buněčná linie monoklonální HGH [ug/ml] elektroporace

API AP2 1 2 3 4 ne ne ano ano ano ano 12,0 7,0 10,0 24,0 5,0 3,0 29

Vysoká hladina exprese a vylučování HGH bylo pozorovánove stabilně transfektovaných buněčných liniích. Množství HGHmRNA bylo měřeno nothernovým přenosem s HGH cDNA sondou aopět byly v indukovaných buňkách naměřeny hodnoty srovnatelnés množstvím myšího beta-globinu (viz Obr.8). Srovnání smnožstvím myšího beta- globinu, ukazuje, že množství HGH mRNA jsou přibližně rovna cDNA expresního vektoru (který využívábeta-globinový sestřih a polyadenylační sekvence z pUNIVEC) aHGH genomovému expresnímu vektoru (který využívá přírodníchHGH intronových sekvencí a polyadenylačních sekvencí). Rozdílv množství vylučovaných bílkovin je pravděpodobněvysvětlitelný rozdíly v translaci, které vznikajíz rozdílných způsobů polyadenylace obou mRNA. Rozdíly na5'koncích (začátek) obou mRNA nepřispívá k pozorovanýmrozdílům hladiny translace, poněvadž změna 5'konce HGH cDNA(stále se sestřihem lidského beta-globinu a polyadenylačnímisekvencemi) s mRNA začátkem z genomického HGH expresníhovektoru (viz Obr.9), neovlivnila množství ani mRNA anibílkoviny produkovaných ransfektovanou.buněčnou linií.

Přklad 3 - Dlouhodobé vylučování HGH

Hladina vylučování pozorovaná u HGH cDNA nebou genomických DNA expresních vektorů byla neočekávaná,protože červené krvinky normálně nepatří mezi sekretujícíbuňky. K získání OCR řídící exprese musí být MEL buňkyindukovány, aby došlo k rozlišení a získaly erythroidnícharakter. Tato diferenciace je komplexním procesem, kterýzahrnuje množství fyzikálních změn buněk a může vést kodstranění jader z beněk a selektivní degradaci mRNAs vbuňkách. Funkce erythroidních buněk in vivo. jako přenašečů 30 kyslíku (a rozpuštěného kysličníku -uhličitého) dosahujepřibližně doby 120 dnů, což je srovnatelné s těmito změnami.Je obecně uznáváno, že terminální diferenciace také resultujeve ztrátu bílkovinného sythetického aparátu v buňce, poněvadžto je hlavně způsobeno ztrátou jádra a mRNA degradačnímprocesem.

Ve světle našich pokusů s vysokou hladinou vylučování,jsme testovali produkci a vylučování HGH transfektovanýmiMELC88 buňkami v prodloužené časové periodě. Buňkytransfektované HGH- cDNA expresivním vektorem byly rozlišenyindukci, jak bylo popsáno dříve. Po době asi 48 hodin, bylo-induktivní medium-(selektivní medium + 2% DMSO) nahrazeno- ( stejným objemem) a v původním mediu bylo stanoveno HGH.Medium bylo poté vyměňováno každých 24-36 hodin (aby sezabránilo odumíráni buněk v důsledku vyčerpání živin) po dobuasi 80 dnů. Výsledky - Příklad 3

Obr.10 ukazuje produkované a vylučované množství HGHběhem této prodloužené doby. Není zřejmé zda kolísánímnožství HGH, které je z obrázku patrné, vyjadřuje změnysekretovaného množství stabilní populací buněk nebo zdaněkteré subpopulace buněk postrádají indukci při začátkuexperimentu a následně "dozrávají" a indukují později.Z pokusu je jasné, že indukované MELC88 transfektantníbuněčné linie mohou pokračovat v produkci vylučovaného HGHalespoň po dobu 80 dní po začátku indukce. Znova podotýkáme,že se toto, vzhledem k buněčným změnám, které jsoudoprovázeny terminální erythroidní diferenciací, nedalopředpokládat. 31

Pozorovaná doba sekrece měla za následek použitítransfektovaných buněčných linii k prodloužení procesuprodukce. Navíc, dlouhodobá sekrece nabízí možné využitísystému k produkci sekrekčních bílkovin v krevním řečištisavců buď jako vlastní produkční proces nebo jako částprotokolu genové therapie. Příklad 4 - Inhibice vylučování

Zpráva o tom, že metabolit hub, brefeldin-A. inhibujepohyb glykophorinu k buněčnému povrchu v MEL buňkáchspeciálním blokováním přechodu přes Golgiho aparát (Ulmera Palade, PNAS, 86, 6992-6996 (1989)), umožňuje zkoumání schopností erythroidních buněk sekretovat heterologníbílkoviny.

Klon MELC88 exprimující HGH byl indukován pomocí 1,5%DMSO po dobu 3 dní a poté byl přidán 1 ug/ml brefeldinu-Av ethanolu. Kontrolní kultury. obsahovaly 0,1% ethanolu. Pof. inkubaci ; při ' 37°C po dobu 2. hodin, byly kultury· promytydvakrát čerstvým mediem,aibrefeídin-A. (lug/ml) nebo ethanól(0,1%) byl ·, přidán k; pokusným resp. kontrolním kulturám.

Vzorky supernatantu a buněk byly odebrány k analýze. Výsledky - Příklad 4

Hladiny růstového hormonu v supernatantu kultura v extraktech ze sonikovaných buněk byly měřeny za využití sendvičové imunoradioaktivní metody popsané již dříve. Vzorkybyly analyzovány po 1, 2 a 4 hodině, poté co bylo mediumvyměněno. 32

Tab.3 -Vylučování HGH z buněk ošetřených brefeldinem A ČAS hod KONTROLA BREFELDIN-A supernatant ng/ml lyzát buněkng/ml buněk supernatant ng/ml lyzát buněkng/ml buněk 1 162 52,6 47,1. 183 2 209 96,0 44,0 515 3 331 71,0 54,0 777

Jak je patrno z uvedené tabulky, kontrolní kulturyhromadí HGH v supernatantu v závislosti na čase, zatímcov buňkách k tomuto zvýšení nedochází. Naopak nebyl pozorovánžádný nárůst HGH v supernatantu a zvýšený nárůst HGHu buněčnýchjlyzátů, u;buněk ošetřených brefeldinem-A. tytohodnoty jasně ukazují, že přítomnost HGH v supernatantu jezpůsobena sekrecí bílkovin přes Golgiho aparát.

Příklad - Vylučování dalších rekombinantních bílkovinlidského PLA2 cDNA

Sekrekční pokusy popsané s HGH naznačují, že systém,který jsme popsali je schpný exprimovat a vylučovat velkémnožství rekombinantní bílkoviny. Povaha systému, s velmiomezenou expresí než jsou buňky indukovány před konečnoudiferenciací, je mnohostranná a aplikovatelná na širokou paletu 33 bílkovinných typů. Dokonce bílkoviny, které jsou toxické nabo působí destruktivně na buňky, mohou být exprimovány tímto systémem. Testovali jsme expresi jedné takové bílkoviny, lidské synoviální fosfolipasy A2, v MEL buňce sekrečního systému.

Fosfolipasa je enzym zapojený do metabolismuEnzym specificky štěpí jedenfosfatidylcholinu nebo fosfatidyl v buněčných membránách za současného uvolněníkyseliny (která je částí metabolismu zánětů). membránových fosfolipidůz řetězců mastných kyselinethanolaminu arachidonové lyso-fosfolipidy majíExprese fosfolipasy A2 v buněčné stěně funkcive zvířecích buňkách je Zůstávajícídetergentů. pravděpodobně omezena díky destruktivnímu vlivu PLA2 natvorbu buněk. K dnešní době byla publikována nejvyšší hladinaexprese >200 ng/ml, v amplifikovaných CHO buňkách (Kramera kol., J.Biol.Chem. 264, 5768-5775, 1989).

Abychom mohli exprimovat. lidskou PLA2 v našem expresnímsystému MEL- buňky, museli jsme nejdříve klonovat PLA2 zlidské . plicní cDNA knihovny za použití techniky PCR'(polymerase chain reaction). Použité PCR amplimery a PLA2 cDNA sekvence jsou ukázány na Obr.11. cDNA byla potomsubklonována do intermediálního plasmidu pUNIVEC jako jeEcoRI až Sáli část (v EcoRi a Xhol místech pUNIVEC). Expresníkazeta byla potom přenesena jako Clal až KpnI část dopGSE1417, jak bylo popsáno dříve.

Transfektantní buněčné linie byly generovány jak bylopopsáno dříve, s následující indukcí, supernatanty bylytestovány na PLA2 aktivitu. 34 Výsledky - Příklad 5 -

Indukované, transfektované MELC88 kultury byly tetsoványna přítomnost fosfolipasové aktivity dvěma metodami. První(viz Pepinski a kol., J.Biol.Chem. 261, 4239-4246, 1986)používá membrány E.coli, značené in vivo [3H] olejovoukyselinou jako substrátem a druhá (viz Seilhamer a kol.,J.Biol.Chem. 264, 5335-5338, 1989) používá fosfatidylcholinu nebo fosfatidylethanolaminu jako substrátů pro PLA2.

Supernatanty z transfektovaných MEL buněčných klonů bylyaktivní v obou stanoveních a ( protože druhé stanovení dávalovíce reprodukovatelné výsledky) dávaly hladiny expresepřibližně 200 ng/ml.’ Lze konstatovat, želez dalšíhoprodlužování optimalizačních studií, transfektované MEL buňkyvylučují zrovna tolik aktivní rekombinantní lidskéfosfolipasy A2 jako jsou nejlepší publikované výsledky dodnešní doby (Kramer a kol., J.Biol.Chem. 264, 5768-5775,1989) při použití amplifikované exprese v CHO buňkách, ale vpodstatně kratší době. -Příklad 6 - Exprese PLA2 za použití nativních PLA2 , genomických sekvencí PLA2 genomové sekvence byly isolovány jako 6,2 kbHindlII fragment z lidské placentální DNA genomové knihovny(Clontech Ref HL1067J) za použití klonované PLA2 cDNA jakosondy. Tento klon byl charakterizován štěpením restrikčnímienzymy, čímž bylo prokázáno, že obsahuje PLA2 genomovésekvence. Celý fragment (obsahující PLA2 kódující a vloženéDNA sekvence, polyadenylační místa a přibližně 1,5 kbsekvencí v protisměru (5') údajného promotoru prvního exonu)byl klonován do vektoru pGSE1417. V tomto plasmidu je expresePLA2 sekvencí řízena nativním PLA2 promotorem. Plasmid byllinearizován restrikčním štěpením Pvul a zaveden do MELC88buněk, jak bylo popsáno dříve. Společné populace a 35 monoklonální linie byly selektovány a indukovány a hladinavylučované PLA2 byla měřena jako v předcházejících případech. Výsledky - Příklad 6

Exprese PLA2 z PLA2 promotoru (měřeno množstvímbílkoviny (viz Tab.4A níže) nebo množstvím RNA (viz Obr.13))byla prokazatelně vyšší než hladina exprese naměřena s PLA2cDNA za použití lidského beta-globinového promotoru. Nejvyššíhladina sekrece byla 2,5 ug/ml, což je o řád vyšší nežhladina získaná při použití konvenčních CHO/DHFR systémů.Rozdíl mezi hladinami exprese s PLA2 cDNA a genomovýmisekvencemi je pravděpodobně následkem vyšší stability mRNAzískané z genomového templátu, nebol: náhrada lidského beta-globinového promotoru za lidský PLA2 promotor v PLA2 genovémkonstruktu, viditelně neovlivňuje hladinu vylučované PLA2.Výsledky exprese PLA2 genomové sekvence za použitíbeta-globinového promotoru jsou uvedeny v Tab.4B.

Tab.4 - Stanovení PLA2 ' ;· ·

Vzorek Monoklonální ug/ml A. PLA2 gen s PLA2 promotoremPPI ne 1,5 PP2 ne 1,5 1 ano 2,3 2 ano 2,5 3 ano 0,9 4 ano 1,6 36 B. PLA2 gen s lidským beta-globinovým promotorem

PP ne 0,34 ano ano ano ano 1,72 1,10 0,38 1,66 Příklad 7 - Exprese HGH v MEL11A21 buňkách

Ukázali jsme, že MELC88 buňky jsou schopné účinnésekrece rekombinantních bílkovin. Pro jednodušší purifikacir a opětné získání rekombinantní bílkoviny, jsme také testovaliexpresi v jiné, myší buněčné linii erythroleukemických buněk.MEL buněčná linie 11A21 je udržovaná v neselektivním medius 1% zárodečného telecího sera, jak. bylo popsáno. Redukceobsahu sera z 10% na 1%, silně redukuje obsah kontaminujících .bílkovin v konečném preparátu a usnadňuje:čištění bílkoviny.Exprimovali jsme HGH v 11A21 buňkách. Expresní vektorypDCR/NEO/HGHcDNA a pDCR/NEO/HGH genomové. jsou popsány jiždříve. Transfekce a selekce probíhaly tak, jak bylo popsánodříve pro MELC88, kromě toho, že bylo používáno 1% sérum.Indukce probíhala tak, jak už bylo popsáno, kromě toho, žeindukující medium pro 11A21 transfektantní buňky obsahovalozárodečné telecí sérum a alfa MEM. Výsledky - Příklad 7

Tab.5 ukazuje hladiny vylučované HGH sledované naindukci 11A21 transfektantních buněčných liniích. Po přepočtuna počet buněk, tyto buňky, zrovna tak jako C88 37 transfektantní buňky vylučují indikují, že vektory mohouřídit expresi a, jestliže je příležitost, sekreci v rámcibuněk MEL typů. Ťab.5 - HGH exprese u 11A21 transfektantů

Buněčná linie Monoklonální HGH ug/ml PPI ne 1,2 PP2 ne 1,0 1 ano 2,0 2 and 0,9 3 ano 0,6 4 ano 1,2 Příklad 7b - Exprese HGH cDNA řízené PLA2 promotorem

Exprese lidského růstového hormonu cDNA pod kontrolouPLA2 promotoru bylo dosaženo následovně . PLA2 promotor byl isolován z lidské DNA za použití PCRmetody jak bylo popsáno výše (Příklad 5). PLA2 promotor bylzískán jako 200bp fragment za použití následujících PCRapmlimérů (SEQ ID NO.3, a NO.4) 38 5'oligonukleotid = 5' TCCGCATGCTCAACTCTGTCCTGGCCAGGCTGA 3'Sphl

3'oligonukleotid = 5' CAGAAGCTTCCAGAGTTGTATCCCCAGGCCGTC 3'HindlII PCR produkt byl použit k náhradě lidskéhobeta-globinového promotoru v pEC3 (SphI-HindlII) , za vznikunového vektoru pEC4, do kterého byla cDNA lidského růstovéhohormonu klonována za využití HindlII-BamHI míst. Konečnýexpresní vektor byl vytvořen přenesením Clal-Asp718 kazetypEC4’do "PGSE1417, za vzniku pHGH. 4GSE.

Supernatanty z buněk indukovaných čtyři dny bylytestovány na růstový hormon. Vzorky: hGH508, pozitivní kontrolahGH cDNA po směru beta-globinového promotoru, PPI a PP2,směsné populace, 1-4 jednotlivé klony.

Vzorek Indukce I .·, Indukce II Indukce III (ug/ml) (ug/ml) (ug/ml) hGH 508 17,3 15,0 18,4 PPI 7,3 9,0 9,6 PP2 9,9 11,7 14,9 1 6,5 3,2 8,9 2 6,3 7,0 9,2 3 1,9 2,4 3,1 4 12,7 - 25,6 Příklad 8

Stabilita sekreční hladiny po dlouhodobékultivaci 39

Hlavní nedostatek expresního systému založeného naamplifikaci, je stabilita amlifikovaných sekvencí. Do nedávnáse včeobecně předpokládalo, že amplifikované sekvenceintegrované do genomu by měly být stabilní bez problémů.Avšak údaje z průmyslové výzkumné skupiny ukazují,že takovéamplifikace mohou být nestabilní dokonce v přítomnostispecifického prostředí (Weidle U.H. a kol., Gene, 66,193-203 (1988)). Tyto problémy by měly být vyloučeny připoužívání DCR expresního systému, poněvadž u něho není nutnévelké množství kopií pro dosažení vysoké hladinu exprese.

Pro ověření této hypoézy, bylo pět klonů odvozeno odvysokou produkční buněčné linie D50 mnohonásobnýmlimitovanýmzředovacím klonováním. Klony byly pasážovány více než 40generací se selekčním tlakem G418 a bez něho. V důsledkumožných změn v inducibilitě klonů, produktivita byla“zjistitelná srovnáním s neindukovanými klony buněk. Běhemprodlouženého růstu bez-selekce nebyla pozorována žádná změnaproduktivity,, což ukazuje na to, že konstrukt exprese vbuňkách byl stabilní. Příklad' 9 - . Stabilita íRNALprodukované .expresním vektorem ,7. '

Jak již bylo popsáno dříve (viz Příklad 3), erythroidnídiferenciace je komplexní proces, který zahrnuje mnoho kroků avyúsťuje v selektivní degradaci mnoha mRNA v buňce, prouchování vysoké hladiny exprese heterologních cDNA nebo genů,hetrologní mRNA musí být stabilní v indukovaných červených krvinkách. Aby byla zachována celistvost mRNA v indukovanýchbuňkách, používali jsme části 3'konců beta-globinu mRNA vnašich cDNA expresních konstruktech. Tento stabilizujícíefekt může být také zajištěn částmi 3'konců jiných genů,které produkují stabilní informaci v indukovaných červenýchkrvinkách (např. HGH nebo PLA2), ale nemůže být zajištěngeny, které produkují vysoce nestabilní mRNA v indukovaných 40 buňkách (např.myší H2K). Obr.13 a 14 ilustrují tento příklada srovnávají heterologni PLA2 informaci (z různýchkonstruktů) s endogenní glyceraldehyd-3-fosfátdehydrogená-zovou (GAPDH) mRNA. PLA2 zůstávají stabilní v indukovanýchbuňkách, ale GAPDH mRNA je degradována ve všech indukovanýchvzorcích. Příklad 10 - Exprese lidského růstového hormonu v pEC3 pEC3 je shodné s pEC2, až na to, že obsahuje delšíoblast beta-globinové 3'postranní DNA než pEC2 ( tj. až kmístu přírodního Xbal místa na bázi 4845) v globinovém genu arůzná polyvazebné klonovací místa mezi HindlII a BamHI místyna pEC^ polylinkeru.; HindlII, EcoRI, Xhol, Balil, Sáli, Notla BamHI.

Hgh cDNA byl. subklonován do pEC3 (HindlII/Band HI) potomClal/Asp718 fragment z tohoto klonu byl subklonován dopGSE1417. Transfekce, indukce, RNA analýza a hGH analýzy byly•prováděny stejně jako v předcházejících případech. Výsledkyjsou znázorněny na Obr.22.. - ’

6 klonů a 2 populace, každou pro pEC2/hGH - pEC3/hGH exprimující buňky, byly indukovány a testovány na hGHexpresi. Výsledky ukazují, že hladina hGH je větší s EC3 nežs-EC2. Tedy konstrukt s delším 3' koncem dává vyšší hladinyhGH. To by mohlo být (ačkoliv my si nepřejeme být omezenitouto teorií) způsobeno tím, že delší 3'konec zlepšujetranslační schopnost. Příklad 11 - Hlavní základní bílkovina (MBP)

Exprimovali jsme MBP cDNA (viz McGrogan a kol., 41 J.Exp.Med.,1988, 168, 2295-2308, a Barker a kol., Gene, 1990,86, 285-289) za použití expresivního vektoru pEC3. MBP cDNAbyl subklonován jako BamHI fragment do pEC3, potom Clal/Asp718 fragment z tohoto konstruktu byl subklonován do pGSE1417.

Transfekce, indukce a RNA analýzy byly prováděny jako vpředchozích příkladech, Výsledky jsou znázorněny na Obr.15.

Supernatanty z indukovaných klonů 2a a 2e byly použityve stanovení smrtícího efektu na buňky E.coli (viz Obr.16) zapoužití vhodné metody stanovení jako je metoda založená nametodě Gleicha a kol., J.Exp.Med.,1974, 14Ó, 313-332. V tomtopřípadě je postup stručně popsán dále.

Kultura E.coli, kultivována přes noc, (např. E.coliDHSalfa) byla odstředěna při lOKpm 1 minutu , potomresuspendována v 1 ml destilované vody. 10 ul této kulturybylo smícháno s 90 ul: supernatantu MEL buněk a inkubováno připokojové teplotě po dobu 1 hodiny. Vzorky byly sériově ředěnya potom v bodech naneseny na povrch L-media v Petriho miskách. Příklad 12 - TNF alfa receptor

Rozpustná extracelulární část TNF alfa receptoru(A) (vizEuropean Patent Application No.422,339) byla exprimovánav Mel C88 buňkách subklonováním cDNA a fragment DNA kódující"CMYC přívěsek" (část CMYC cDNA, která kóduje aminokyseliny,na které se váže monoklonální protilátka) v pEC3 (BamHI)a potom v pGSE1417.

Transfekce, indukce a analýza RNA byly prováděny jako vpředcházejících příkladech. Výsledky jsou znázorněny naObr.17. 42 10 fcionú bylo indukována a a byla měřena hladina TNFalfa receptoru za použití vazby anticmyc-protilátka (viz Obr.18) a jejich schopnost vázat TNFalfa byl měřen za použití protilátky proti TNF (Obr.18). _______, Příklad 13 NK2 receptor cDNA (Graham a kol., Biochemical andBiophysical Research Communications, 1991, 177 No.l, 8-16)byl šubklonóván do PĚC^ a potom Clal/Ásp7l8 fragment z tohotokonstruktu byl subklonován do GSE1417 za vzniku plasmidu pGSE1417/hNK-2R (lOkb). Po růstu v E.coli a linearizaci, bylvýsledný konstrukt používán k přenosu do MELC88 buněk.Exprimující klony byly selektovány s G418 a indukovány s DMSO.

Transfekce MEL buňky .

Mell C88 buňky byly elektroporovány s Pvullinearizovaným GSE1417/hNK-2R. Po selekci s G418, 6 jednotlivých kolonií bylojpřeočkováno a zbytek byl smíchántak, aby vznikly dva smíchané klony. U nich se nechaloproběhnout 3-4 dělení, aby byla jistota, že mají resistencivůči G418. Po následující indukci s 2% DMSO rostly buňky 4dny před odstředěním jak za přítomnosti tak za nepřítomnosti50ul protilátky k NK2 receptoru. Pelety buněk bylynáslednovně použity ke stanovení vazby, přípravy RNA pronothernový přenosy a SDS/PAGE analýzu.

Nothernový přenos 20 ul celkové RNA isolované z každého klonu byloelektroporováno a přenos byl proveden s lidským NK-2receptorem cDNA. Přenos byl znova proveden s 200bp fragmentemz intřonu 2 myšího beta-globinového genu. Obr.20 ukazuje 4 43 hod expozice RNA, připravené z transfektantů MEL buněk, ses hNK-2R v nothernovém přenosu. Je zřejmé, že hNK-2R mRNA sejeví jako dva odlišné druhy l,6kb a 3 kb. Tyto proužky nejsoupřítomny v RNA z netransfektovaných indukovanýcha ko-transfektovaných neindukovaných MEL C88 kontrol. Klon2 tedy nevykazuje detegovatelné hladiny hNK-2R transkripcea to je vé shodě s velmi nízkými hladinami detegovatelnénavázané NKA. Výskyt 2 NK-2R hybridizačních proužků jepříznačný pro přítomnost jak sestřihané tak nestřihané mRNA.Obr.19 ukazuje stejný přenos vystavený, 3 hodiny pohybridizaci se sondou, beta-globinu. To ukazuje na to, že ustálený stav hladiny mRNA hNK-2R je ekvivalentní ustálenémustavu mRNA myšího globinového genu.

Stanovení vazby NKA Částečně purifikované membrány z MEL buněčných peletbylý použity v 125I Neuro-kinin A (NKA) stanovení vazby (NKAv 'koncentraci lOOnM) (Tab.3) 44

Tabulka 3 -, protilátka .... .i125nka vazba (fmol/mg) + protilátkai125nka vazba (fmol/mg) 1 329,69 990,87 2....... 1,49 252,87 3 201,85 311,20 4 ’ 154,11 ' 304,41 5 170,90 265,00 6 106,85 137,90 104 91,53 137,54 105 118,67 8,46 MelC88 indukované 11,20 18,11 MelC88 neindukované 0 Výsledky ukazují, že klon 1 exprimuje hNK-2R v nejvyššímmnožství jak v přítomnosti protilátky, tak v jejínepřítomnosti. Exprese v přítomnosti protilátky (antagonist)je v této buněčné linii třikrát vyšší. Přítomnost protilátkymá rozdílný vliv na detegovatelnou vazebnou aktivitu.Kontroly ukazují na nízké pozadí vazby NKA v tomto stanovení. Příklad 14 - Lidský sérový albumin

Lidský sérový albumin(HSA) cDNA (viz, např. Sargent akol., Proč.Nat.Acad.Sci.,USA,1981,78,243-246) byl subklonovándo pEC3 a potom Clal/Asp 718 fragment byl přenesen do pGSE 45 1417.

Transfekce, indukce a analýza RNA byly proáděny jako vpředcházejících případech. Exprese HSA v Mel buňkách bylazjištěna. - 47 - (2) ÚDAJE 0 SEQ ID NO: 1 : (i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE: (A) DÉLKA : 65+58 baží (B) TYP : nukleová kyselina (C) ŘETĚZEC: dvouvláknový (D) TOPOLOGIE : lineární AGCTTGAATT CCCCGGGTCT AGAGCGGCCG CCTCGAGGGA TCCCTGCAGG 50ACTTAA GGGGCCCAGA TCTCGCCGGC GGAGCTCCCT AGGGACGTCC 46 TACCATCGAT 65 ATGGTAGCTA C .58 (2) ÚDAJE O SEQ ID NO:2: (i) CHARAKTERTIKY SEKVENCE : (A) DÉLKA : 33 baží (B) TYP : nukleová kyselina (C) ŘETĚZEC : jednoduchý (D) TOPOLOGIE : lineární TCCGCATGCT CAACTCTGTC CTGGCCAGGC TGA 3 3 (2) ÚDAJE O SEQ ID NO:3: (i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE :. (A) DÉLKA : 34 baží (B) TYP : nukleová kyselina (C) ŘETĚZEC : jednoduchý (D) TOPOLOGIE : lineární

CAGAAGCTTCCAGAGTTGTA TCCCCAGGC CGTC 34

Claims (14)

1. PATENTOVÉ NÁROKY Ί3 TJ za > ° o < o 03 > m < r- OKY < m N «< OD LD N> σ; i í>

   1. Expresní systém, vyznačující se tím, žeobsahuje savčího hostitele, transformovaného vektorem, kterýobsahuje promotor, DNA sekvenci, která kóduje žádanýheterologní polypeptid a dominantní kontrolní oblast.
2. 2. Expresní systém podle nároku 1, vyznačujícíse t i m, že savčí hostitel obsahuje erythroidní buňky.
3. 3. Expresní systém podle nároků 1 nebo 2, vyznačuj Ι-οί se tím, že promotor obsahuje heterologní promotor.
4. 4. Expresní systém podle kteréhokoliv z předcházejícíchnároků, vyznačující se tím, že vektor obsahujevektor definovaný v kterémkoliv z nároků 5 až 12.
5. 5. Vektor, vyznačuj icí setím, že obsahujepromotor, dominantní kontrolní oblast, DNA sekvenci, kterákóduje požadovaný polypeptid a DNA sekvenci, která je schopná ' propůjčit* stabilitu mRNA vznikající přepisem uvedené DNAsekvence, která kóduje požadovaný polypeptid
6. 6. Vektor podle nároku 5, vyznačující se tím,že DNA sekvence, která kóduje požadovaný polypeptid, obsahujecDNA, a DNA sekvence, která je schopná propůjčit stabilitumRNA, je vázaná na cDNA tak, že vzniká hybridní mRNA.
7. 7. Vektor podle nárokuů 5 nebo 6, vy z natím, že DNA sekvence, která je schopnáobsahuje beta-globinový gen nebo jeho část. 8. vektor podle nároku 7, vyznačující se tím,že DNA sekvence, která je schopná stabilizovat mRNA, obsahujeexon 2 nebo jeho část, intron 2 a exon 3. čující se stabilizovat mRNA - 49 -
8. 9. Vektor podle nároků 7 nebo 8, v y z n a č u j í c í s etím, že DNA sekvence, která je schopná stabilizovat mRNAzahrnuje 3'konec beta-globinového genu nebo část 3' konce.
9. 10. Vektor ,vyznačující se tím, že se použí-vá při přípravě polypeptidu v savčím hostiteli, tak, žepolypeptid je sekretován z hostitelských buněk, uvedenývektor obsahuje promotor, dominantní kontrolní oblast a genkódující požadovaný polypeptiid, za předpokladu, že gen neníbeta-globinový gen.
10. 11. Vektor podle nároků 5 nebo 10, vyznačující setím, že dominantní kontrolní oblast je odvozena od lokusubeta-globinového genu.
11. 12. Vektor podle nároku 11, vyznačující se t í m, že dominantní kontrolní oblast obsahuje mikro lokus, kterýobsahuje 6,5 kb fragment, který může být získán ligacífragmentů:. - . 2.1 kb Xbal - Xbal . . 1,9 kb HindlII - HindlII 1,5 kb KpnI - BglII a 1.1 kb část Sací z beta globinového genu.
12. 13. Způsob přípravy expresního systému podle nároku 1, v y z-načující se tím, že zahrnuje sýčího hostiteletransformovaného vektorem , definovaným podle nároku 5 nebopodle nároku 10.
13. 14. Způsob přípravy polypeptidu, vyznačující setím, že uvedená metoda obsahuje kultivaci expresníhosystému podle nároku 1. - 50 -
14. 15. Způsob přípravy polypeptidu v savčím hostiteli,v y z n a-čující se tím, že polypepid je sekretován z hosti-tele, uvedená metoda zahrnuje kultivaci erythroidních buněktransformovaných vektorem podle nároku 10.