JP3139085B2 - イオン濃度の定量装置および定量方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、生態細胞等の組織内の
特定の化学物質を対象とするイオン濃度の定量装置なら
びに定量方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】生態細胞内の特定の化学物質、例えばカ
ルシウムを対象とするイオン濃度の定量は、細胞を研究
するうえで重要な技術である。

【０００３】すなわち、細胞の刺激応答反応は、細胞内
に存在する無機イオンの濃度勾配を利用した機構によっ
て営まれており、中でもカルシウムイオンは、生態細胞
の組織内の情報伝達物質の一つで、細胞活動を制御する
ためには、カルシウムイオン濃度を調節することが必要
であるといわれている。言い換えれば、カルシウムイオ
ン等のイオン濃度の定量は生理機能解明の一助となる重
要な研究手段である。

【０００４】イオンの励起濃度の定量は、一般に蛍光試
薬を組織に添加し、発する蛍光を解析することにより行
なうのが一般的である。例えばカルシウムイオン濃度の
定量は、Indo-1あるいはFura-2と呼ばれる蛍光試薬が用
いられる。Indo-1の場合、紫外(UV)の１波長光励起によ
り発した蛍光を２つの異なった蛍光波長で強度検出す
る。Fura-2の場合、UVの２つの異なった波長光励起によ
り発した蛍光を各々の励起波長について強度検出する。
それぞれの場合において、検出した２つの蛍光強度信号
のレシオ値は励起光量や蛍光試薬による褪色の影響を受
けずカルシウムイオン濃度に比例しており、カルシウム
イオン濃度の定量が可能となる。

【０００５】従来、前記のような２つの蛍光強度信号か
らレシオ値を取る場合、アナログ割り算器によりハード
的に実行するか、Ａ／Ｄ変換した後にマイクロコンピュ
ータによりソフト的に割り算を実行し、カルシウムイオ
ン濃度の定量値を得ていた。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】しかしながら、このよ
うな従来の技術では、アナログ割り算器によりハード的
にレシオ値を算出する前者では、分母にある電圧範囲の
制限や周波数特性のために高精度を望めず、また、動態
を得るために必要な１０ＭHz以上でレシオ演算をするこ
とも困難で、精度と速度とで性能が不足する場合があ
り、また、ソフト的にレシオ値を算出する後者では、高
精度の演算は可能であるが、演算時間がかかり、演算速
度は極端に遅い。

【０００７】近年、生物，医学界では、組織内のカルシ
ウムイオン濃度分布の変化をリアルタイムで画像として
とらえたいという要望が高まっており、そのためにはレ
シオ演算を数ＭHz〜数十ＭHzで演算処理しなければなら
ず、前記のごときイオン濃度の求め方では、このような
要望に応えることができないという問題点があった。

【０００８】本発明は、このような従来の技術が有する
問題点に着目してなされたもので、イオン濃度をあらわ
すレシオ値を高速かつ正確に求め、生態細胞等の組織内
のカルシウム等のイオン濃度の定量を数十ＭHzでも高精
度に求めることができるようにして上記問題点を解決し
たイオン濃度の定量装置および定量方法を提供すること
を目的としている。

【０００９】

【課題を解決するための手段】かかる目的を達成するた
めの本発明の要旨とするところは、 １ 組織内の特定の化学物質に反応して２つの蛍光強度
信号を検出する蛍光試薬を前記組織内に添加し、該２つ
の蛍光強度信号を基にイオン濃度を定量するイオン濃度
の定量装置であって、検出された２つの蛍光強度信号を
それぞれデジタルデータに変換するＡ／Ｄ変換器（２
３，２５）と、演算により予め算出されたイオン濃度を
表す値をルックアップテーブルとして記憶する記憶手段
（２６）とを有し、該記憶手段（２６）は、前記Ａ／Ｄ
変換器（２３，２５）で変換された２つのデジタルデー
タ（Ｄ１，Ｄ２）により前記イオン濃度の値が読み出さ
れるものであることを特徴とするイオン濃度の定量装
置。

【００１０】２ 項１に記載のイオン濃度の定量装置に
おいて、前記組織の被検体を走査し、次々に蛍光強度信
号を検出する走査検出手段（６，８）とを備えることを
特徴とするイオン濃度の定量装置。 ３ 項１に記載のイオン濃度の定量装置において、照明
光を発生する照明光源（２）と、該照明光を集光する集
光レンズ（３）と、標本（１１）の上方に設けられた対
物レンズ（１０）と、前記照明光が前記標本（１１）に
照射され、前記標本（１１）から発生した蛍光を通過方
向と反射方向との２方向に分岐させるダイクロイックミ
ラー（１２）と、該通過方向の蛍光を検出する第１の検
出器（１８）と、前記反射方向の蛍光を検出する第２の
検出器（１５）とを有することを特徴とするイオン濃度
の定量装置。

【００１１】４ 組織内の特定の化学物質を対象とする
イオン濃度の定量方法であって、対象とする化学物質に
反応して２つの蛍光強度信号を検出する蛍光試薬を組織
に添加し、前記２つの蛍光強度信号に対応して所定の計
算式で演算されたイオン濃度を表わす値をルックアップ
テーブルとしてあらかじめ記憶手段（２６）に記憶し、
組織から検出した２つの蛍光強度信号をアドレスとして
前記記憶手段からイオン濃度を読み出すようにしたこと
を特徴とするイオン濃度の定量方法に存する。

【００１２】

【作用】蛍光試薬を生態細胞等の組織に添加すると蛍光
試薬は組織内の特定の化学物質と反応し、２つの蛍光強
度信号を検出することができる。この２つの蛍光強度信
号から次のようにして演算処理することによりイオン濃
度を検出することができる。

【００１３】２つの蛍光強度信号はアナログ値であるの
で、Ａ／Ｄ変換器（２３，２５）によりそれぞれデジタ
ルデータに変換される。Ａ／Ｄ変換器（２３，２５）で
変換された２つのデジタルデータは記憶手段（２６）の
アドレス信号となり、記憶手段（２６）にはあらかじめ
演算して算出されたイオン濃度を表わす値がルックアッ
プテーブルとして記憶されているので、２つのデジタル
データにより定まるアドレスの記憶値を読み出せばその
ときの組織のイオン濃度を知ることができる。

【００１４】アドレス信号によりルックアップテーブル
の記憶値を読み出すだけなので、動作速度は早く、か
つ、記憶値はあらかじめもとめてあるのできわめて正確
なものにすることができる。

【００１５】走査検出手段（６，８）により組織の被検
体を走査すれば、走査に従い高速で次々に蛍光強度信号
を検出し、組織内のカルシウム等のイオン濃度の定量を
数十ＭHzでも高精度に求めることができ、組織内のカル
シウムイオン濃度分布の変化をリアルタイムで画像とし
てとらえたいという要望に応えることができる。

【００１６】

【実施例】以下、図面に基づき本発明の一実施例を説明
する。図１および図２は本発明の一実施例を示してい
る。

【００１７】イオン濃度の定量装置は、照明光学系１Ａ
と、対物系１Ｂと、データ処理系１Ｃとを有しており、
組織内の特定の化学物質であるカルシウムを対象とし、
カルシウムイオンに反応して２つの蛍光強度信号を検出
する蛍光試薬としてIndo-1あるいはFura-2を組織に添加
し、この２つの蛍光強度信号からの演算処理値によりイ
オン濃度を検出するものである。以下では、説明の便宜
上Indo-1を用いたものとし、また、被検体を走査して画
面に表示するものを説明する。

【００１８】照明光学系１Ａは、照明光源２、集光レン
ズ３および励起フィルター４を備えて成る。照明光源２
は水銀，キセノン，ＵＶレーザ等から成り、集光レンズ
３は照明光源２の焦点調節のために光軸方向に移動可能
に設けられている。励起フィルター４は蛍光試薬のIndo
-1の励起波長である３６０〜３８０nmの光のみを通過さ
せる特性を有している。ただし、ＵＶレーザの場合は集
光レンズ３に代えてビームエキスパンダを用いる。

【００１９】対物系１Ｂとデータ処理系１Ｃとの間にダ
イクロイックミラー５が配設され、照明光学系１Ａから
のＵＶ励起照明光ａはダイクロイックミラー５に入射し
ている。ダイクロイックミラー５は、４００nmより短波
長の光を反射させる特性を有するものである。

【００２０】対物系１Ｂは、ダイクロイックミラー５で
反射した光を受ける水平走査器６から順次、第１のリレ
ーレンズ７，垂直走査器８，第２のリレーレンズ９，対
物レンズ１０を配置して成る。対物レンズ１０は組織被
検体の標本１１を臨んでいる。

【００２１】水平走査器６は、例えば振動型ミラーある
いは多面回転ミラーのようなもので、ＵＶ励起照明光ａ
を水平方向に高速で走査するものである。垂直走査器８
は、一画面で一走査するだけなので水平走査器６に比し
て低速走査で済み、例えば振動型ミラーを用いてＵＶ励
起照明光ａをさらに垂直方向に走査することにより、２
次元的に走査されたＵＶ励起光ｂとするものである。ま
た、水平走査器６と垂直走査器８とは同期制御回路２１
により同期が取れて走査を繰り返すようになっている。

【００２２】第１のリレーレンズ７，第２のリレーレン
ズ９は、対物レンズ１０により標本１１上に２次元走査
するようスポットが結像されるので、対物レンズ１０の
瞳を水平走査器６，垂直走査器８の偏向中心位置にリレ
ーするものであり、走査角が狭い場合などは省略可能で
ある。

【００２３】ダイクロイックミラー５を間にして対物系
１Ｂの反対側にデータ処理系１Ｃの光学系が配設されて
いる。該光学系は、標本１１で発生した蛍光強度信号が
ダイクロイックミラー５を通過するのを受け、波長選択
性を有していて蛍光強度信号の波長に応じて通過方向と
反射方向との２方向に蛍光を分岐させるダイクロイック
ミラー１２と、反射方向と通過方向とにそれぞれ配設さ
れたバンドパスフィルタ１３，結像レンズ１４，光検出
器１５の組および、バンドパスフィルタ１６，結像レン
ズ１７，光検出器１８の組より成る。

【００２４】バンドパスフィルタ１３は、ダイクロイッ
クミラー１２よりさらに波長選択性の巾が狭く、波長λ
１（例えば４０５nm）を選択し、バンドパスフィルタ１
６は波長λ２（例えば４８５nm）を選択するよう設定さ
れている。バンドパスフィルタ１３，１６で選択された
光を受けて検出する光検出器１５，１８の後に、演算増
幅器２２およびＡ／Ｄ変換器２３の組および、演算増幅
器２４およびＡ／Ｄ変換器２５の組が設けられている。
Ａ／Ｄ変換器２３，２５には同期制御回路２１が接続
し、水平走査器６，垂直走査器８に同期したデジタルデ
ータＤ１，Ｄ２が出力するようになっている。

【００２５】Ａ／Ｄ変換器２３，２５の後に記憶手段と
してメモリ２６が設けられている。デジタルデータＤ
１，Ｄ２は、メモリ２６の上位，下位のアドレスとなる
よう設定されている。メモリ２６は、あらかじめ所定の
計算式で演算されたイオン濃度を表わす値をルックアッ
プテーブルとして記憶している。

【００２６】すなわち、メモリ２６はＲＯＭまたはＲＡ
Ｍであり、デジタルデータＤ１，Ｄ２によりアクセスさ
れるメモリ空間に、デジタルデータＤ１，Ｄ２の値に応
じた２つの蛍光強度信号のレシオ値が記憶されている。
ＲＯＭの場合はＲＯＭ自体の差し替えによって記憶値を
変えるしかないが、ＲＡＭの場合は、ディスク等から読
み込ませることにより被検体に応じ、あるいは蛍光試薬
に応じた値に容易に変更することができる。

【００２７】メモリ２６の後には、メモリ２６で読み出
したレシオ値を一旦記憶するフレームメモリ２７が設け
られ、さらに、モニタ３０でデータ処理画像を観察でき
るようＤ／Ａ変換器２８とビデオ信号変換回路２９とが
設けられている。

【００２８】次に作用を説明する。

【００２９】蛍光試薬としてIndo-1を生態細胞等の組織
に添加すると蛍光試薬は組織内の特定の化学物質である
カルシウムのイオンと反応し、２つの蛍光強度信号を発
生させる。この２つの蛍光強度信号からイオン濃度を検
出する。

【００３０】照明光学系１Ａにおいて照明光源２で発光
した光は集光レンズ３を移動させて調節することで適切
に焦点調節されて励起フィルター４に入り、励起フィル
ター４は蛍光試薬のIndo-1の励起波長である３６０〜３
８０nmの光のみを通過させてＵＶ励起照明光ａをダイク
ロイックミラー５に放射する。

【００３１】ダイクロイックミラー５は、４００nmより
短波長の光を反射させるので、ＵＶ励起照明光ａを対物
系１Ｂ側に反射される。対物系１Ｂでは、水平走査器６
でＵＶ励起照明光ａを水平方向に高速で走査し、第１の
リレーレンズ７を通して垂直走査器８でＵＶ励起照明光
ａが垂直に走査されてＵＶ励起光ｂとなり、ＵＶ励起光
ｂは第２のリレーレンズ９を通して対物レンズ１０から
２次元走査されるスポットとして生態細胞被検体の標本
１１に結像する。対物レンズ１０の瞳は、第１のリレー
レンズ７，第２のリレーレンズ９により水平走査器６，
垂直走査器８の偏向中心位置に案内されている。水平走
査器６と垂直走査器８とは同期制御回路２１により同期
が取れて走査を繰り返す。

【００３２】標本１１からは、ＵＶ励起光ｂの照射を受
けて蛍光が励起され、励起された蛍光ｃは、対物レンズ
１０，第２のリレーレンズ９，第１のリレーレンズ７，
水平走査器６を通り、ダイクロイックミラー５を透過
し、ダイクロイックミラー５を間にして対物系１Ｂの反
対側に配設されているデータ処理系１Ｃの光学系に入射
する。標本１１で発生した蛍光強度信号がダイクロイッ
クミラー５を通過するとダイクロイックミラー１２に入
り、波長選択性を有しているダイクロイックミラー１２
は蛍光強度信号の波長に応じて通過方向と反射方向との
２方向に蛍光を分岐させる。

【００３３】反射側のバンドパスフィルタ１３は、ダイ
クロイックミラー１２よりさらに波長選択性の巾を狭め
て波長λ１（例えば４０５nm）が選択され、選択された
光は結像レンズ１４を通して光検出器１５に結像して光
電変換され、同様に透過側のバンドパスフィルタ１６に
より波長λ２（例えば４８５nm）を選択され、選択され
た光は結像レンズ１７により光検出器１８に結像して光
電変換される。

【００３４】光検出器１５，１８の後では、演算増幅器
２２が光電アナログ信号を後段のＡ／Ｄ変換器２３の入
力範囲にあった電圧レベルに増幅し、Ａ／Ｄ変換器２３
はこの光電アナログ信号を同期制御回路２１により水平
走査器６，垂直走査器８による２次元走査に同期したク
ロック信号によりデジタルデータＤ１に変換して出力す
る。同様に、演算増幅器２４が光電アナログ信号を後段
のＡ／Ｄ変換器２５の入力範囲にあった電圧レベルに増
幅し、Ａ／Ｄ変換器２５はこの光電アナログ信号を同期
制御回路２１により２次元走査に同期したクロック信号
によりデジタルデータＤ２に変換して出力する。

【００３５】デジタルデータＤ１はメモリ２６の上位の
アドレスを示し、デジタルデータＤ２はメモリ２６の下
位のアドレスとなるよう設定されているので、メモリ２
６が構成するルックアップテーブルのアドレス信号であ
るデジタルデータＤ１，Ｄ２で定まるアドレス位置のメ
モリ値はあらかじめ所定の計算式で演算されたイオン濃
度を表わしている。

【００３６】すなわち、メモリ２６のアドレス位置のメ
モリ値は、例えば蛍光波長λ１の蛍光強度信号と蛍光波
長λ２の蛍光強度信号とのレシオ値を示しており、この
演算結果だけが記憶されているので、逐次的な演算を要
することなく、デジタルデータＤ１，Ｄ２でアドレッシ
ングするだけであたかも割り算をしたかのようなレシオ
値が精度よく求められる。メモリ２６の記憶内容はルッ
クアップテーブルとして認識することができ、レシオ演
算時間は、Ａ／Ｄ変換時間にメモリアクセス時間を加え
たものに極端に短くなり、繰り返しサンプリングに要す
る２０ＭＨｚ程度のサンプリング周期を容易に得ること
ができる。

【００３７】メモリ２６で読み出されたレシオ値はフレ
ームメモリ２７に一旦記憶され、Ｄ／Ａ変換器２８によ
りアナログ信号に変換され、該アナログ信号はビデオ信
号変換回路２９で画像信号に変換され、当該画像信号に
基づきモニタ３０がデータ処理画像を観察可能に表示す
る。これにより視覚的に組織のカルシウムイオン濃度を
知ることができる。

【００３８】２０ＭＨｚ程度のサンプリング周期を容易
に得ることができるので、動的にカルシウムイオン濃度
を観察することにより組織の実体を仔細に観察して研究
開発に貢献する。

【００３９】走査検出手段により組織の被検体を走査す
れば、走査に従い高速で次々に蛍光強度信号を検出し、
２０ＭＨｚ程度のサンプリング周期を容易に得ることが
できるので、動的にカルシウムイオン濃度の定量を数十
ＭHzでも高精度に求めることができ、組織内のカルシウ
ムイオン濃度分布の変化をリアルタイムで画像としてと
らえたいという要望に応えることができる。

【００４０】なお、前記実施例においては、蛍光試薬と
してIndo-1を用いたものを示したが、２つの蛍光強度信
号を得てそれからイオン濃度を算出するような場合一般
に応用できることはいうまでもない。イオンとしては近
来研究対象としてカルシウムイオンが注目されていると
ころであるが、他の化学物質のイオンとそれを検出する
蛍光試薬がある場合にも一般的に適用することができる
のも当然である。

【００４１】

【発明の効果】本発明に係るイオン濃度の定量装置およ
び定量方法によれば、イオン濃度をあらわすレシオ値を
高速かつ正確に求め、生態細胞等の組織内のカルシウム
等のイオン濃度の定量を数十ＭHzでも高精度に求めるこ
とができるようにしたので、迅速かつ正確にイオン濃度
を知ることができる。

【００４２】組織の被検体を走査して次々に蛍光強度信
号を検出する走査検出手段を備えれば、組織内のカルシ
ウムイオン等の濃度分布の変化をリアルタイムで画像と
して把握することが可能になり、生物，医学界の研究開
発に貢献することができる。

【００４３】

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の一実施例に係るイオン濃度の定量装置
の部分ブロック図である。

【図２】本発明の一実施例に係るイオン濃度の定量装置
の部分ブロック図である。

【符号の説明】

１Ａ…照明光学系 １Ｂ…対物系 ６…水平走査器 ８…垂直走査器 １０…対物レンズ １１…標本 １Ｃ…データ処理系 １３，１６…バンドパスフィルタ １５，１８…光検出器 ２１…同期制御回路 ２３，２５…Ａ／Ｄ変換器 ２６…メモリ ２７…フレームメモリ ２８…Ｄ／Ａ変換器 ２９…ビデオ信号変換回路 ３０…モニタ

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) G01N 21/75 - 21/83 G01N 33/48 - 33/52 G01N 33/58 - 33/98

Claims (4)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】組織内の特定の化学物質に反応して２つの
   蛍光強度信号を検出する蛍光試薬を前記組織内に添加
   し、該２つの蛍光強度信号を基にイオン濃度を定量する
   イオン濃度の定量装置であって、 検出された２つの蛍光強度信号をそれぞれデジタルデー
   タに変換するＡ／Ｄ変換器と、演算により予め算出され
   たイオン濃度を表す値をルックアップテーブルとして記
   憶する記憶手段とを有し、該記憶手段は、前記Ａ／Ｄ変
   換器で変換された２つのデジタルデータにより前記イオ
   ン濃度の値が読み出されるものであることを特徴とする
   イオン濃度の定量装置。
2. 【請求項２】請求項１に記載のイオン濃度の定量装置に
   おいて、前記組織の被検体を走査し、次々に蛍光強度信
   号を検出する走査検出手段とを備えることを特徴とする
   イオン濃度の定量装置。
3. 【請求項３】請求項１に記載のイオン濃度の定量装置に
   おいて、照明光を発生する照明光源と、該照明光を集光
   する集光レンズと、標本の上方に設けられた対物レンズ
   と、前記照明光が前記標本に照射され、前記標本から発
   生した蛍光を通過方向と反射方向との２方向に分岐させ
   るダイクロイックミラーと、該通過方向の蛍光を検出す
   る第１の検出器と、前記反射方向の蛍光を検出する第２
   の検出器とを有することを特徴とするイオン濃度の定量
   装置。
4. 【請求項４】組織内の特定の化学物質を対象とするイオ
   ン濃度の定量方法であって、 対象とする化学物質に反応して２つの蛍光強度信号を検
   出する蛍光試薬を組織に添加し、 前記２つの蛍光強度信号に対応して所定の計算式で演算
   されたイオン濃度を表わす値をルックアップテーブルと
   してあらかじめ記憶手段に記憶し、 組織から検出した２つの蛍光強度信号をアドレスとして
   前記記憶手段からイオン濃度を読み出すようにしたこと
   を特徴とするイオン濃度の定量方法。