JP3127079B2 - 恒温核酸増幅反応に関する内部対照 - Google Patents
恒温核酸増幅反応に関する内部対照Info
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、恒温インビトロ核酸増
幅法に関し、特定すれば、サンプルの増幅活性を評価す
るための方法またはサンプル中に存在する標的配列の量
を定量するための方法に関する。
幅法に関し、特定すれば、サンプルの増幅活性を評価す
るための方法またはサンプル中に存在する標的配列の量
を定量するための方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】インビトロ核酸増幅技術は、少量の核酸
の検出および分析のための有力な道具を提供した。この
ような方法の究極の感度は感染性疾患および遺伝的疾患
の診断の開発のための試みに通じてきた。核酸増幅技術
は、方法の温度要求性により分類されうる。ポリメラー
ゼチェインリアクション法（ＰＣＲ；サイキ（Ｒ．Ｋ．
Ｓａｉｋｉ）ら、１９８５、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３０，
１３５０−１３５４）、ライゲーステェインリアクショ
ン（ＬＣＲ；ウー（Ｄ．Ｙ．Ｗｕ）ら、１９８９、Ｇｅ
ｎｏｍｉｃｓ ４，５６０−５６９；バリンガー（Ｋ．
Ｂａｒｒｉｎｇｅｒ）ら、１９９０、Ｇｅｎｅ ８９，
１１７−１２２；バラニー（Ｆ．Ｂａｒａｎｙ）、１９
９１、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ
８８，１８９−１９３）および転写に基づく増幅（コ
ー（Ｄ．Ｙ．Ｋｗｏｈ）ら、１９８９、Ｐｒｏｃ．Ｎａ
ｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６，１１７３−１
１７７）は温度循環を必要とする。対照的に、鎖置換増
幅（ＳＤＡ；ウオーカー（Ｇ．Ｔ．Ｗａｌｋｅｒ）ら、
１９９２、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ
ＳＡ ８９、３９２−３９６；ウオーカー（Ｇ．Ｔ．Ｗ
ａｌｋｅｒ）ら、１９９２、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅ
ｓ．２０，１６９１−１６９６）、自己保持配列複製
（３ＳＲ；グアテリ（Ｊ．Ｃ．Ｇｕａｔｅｌｌｉ）ら、
１９９０、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ
ＳＡ ８７，１８７４−１８７８）およびＱβレプリカ
ーゼシステム（リザルディ（Ｐ．Ｍ．Ｌｉｚａｒｄｉ）
ら、１９８８、ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６，１１
９７−１２０２）のような方法は、恒温反応である。さ
らに、国際公開第９０／１００６４号および国際公開第
９１／０３５７３号は、核酸の恒温複製に関するバクテ
リオファージ、ファイ２９の複製オリジンの使用を記載
している。
の検出および分析のための有力な道具を提供した。この
ような方法の究極の感度は感染性疾患および遺伝的疾患
の診断の開発のための試みに通じてきた。核酸増幅技術
は、方法の温度要求性により分類されうる。ポリメラー
ゼチェインリアクション法（ＰＣＲ；サイキ（Ｒ．Ｋ．
Ｓａｉｋｉ）ら、１９８５、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３０，
１３５０−１３５４）、ライゲーステェインリアクショ
ン（ＬＣＲ；ウー（Ｄ．Ｙ．Ｗｕ）ら、１９８９、Ｇｅ
ｎｏｍｉｃｓ ４，５６０−５６９；バリンガー（Ｋ．
Ｂａｒｒｉｎｇｅｒ）ら、１９９０、Ｇｅｎｅ ８９，
１１７−１２２；バラニー（Ｆ．Ｂａｒａｎｙ）、１９
９１、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ
８８，１８９−１９３）および転写に基づく増幅（コ
ー（Ｄ．Ｙ．Ｋｗｏｈ）ら、１９８９、Ｐｒｏｃ．Ｎａ
ｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６，１１７３−１
１７７）は温度循環を必要とする。対照的に、鎖置換増
幅（ＳＤＡ；ウオーカー（Ｇ．Ｔ．Ｗａｌｋｅｒ）ら、
１９９２、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ
ＳＡ ８９、３９２−３９６；ウオーカー（Ｇ．Ｔ．Ｗ
ａｌｋｅｒ）ら、１９９２、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅ
ｓ．２０，１６９１−１６９６）、自己保持配列複製
（３ＳＲ；グアテリ（Ｊ．Ｃ．Ｇｕａｔｅｌｌｉ）ら、
１９９０、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ
ＳＡ ８７，１８７４−１８７８）およびＱβレプリカ
ーゼシステム（リザルディ（Ｐ．Ｍ．Ｌｉｚａｒｄｉ）
ら、１９８８、ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６，１１
９７−１２０２）のような方法は、恒温反応である。さ
らに、国際公開第９０／１００６４号および国際公開第
９１／０３５７３号は、核酸の恒温複製に関するバクテ
リオファージ、ファイ２９の複製オリジンの使用を記載
している。
【０００３】通常、これらの核酸増幅技術は、診断アッ
セイにおける定性結果を得るために用いられた。しかし
ながら、定量的核酸増幅法およびサンプルの増幅活性
（即ち、効率）を測定する方法の開発における多大な興
味が存在する。これらの可能性は、核酸に基づく増幅診
断アッセイにおける改良された信頼性および正確さを提
供するはずである。
セイにおける定性結果を得るために用いられた。しかし
ながら、定量的核酸増幅法およびサンプルの増幅活性
（即ち、効率）を測定する方法の開発における多大な興
味が存在する。これらの可能性は、核酸に基づく増幅診
断アッセイにおける改良された信頼性および正確さを提
供するはずである。
【０００４】多くの場合、核酸増幅は対数的工程である
ため、内部対照配列の共増幅による特異的標的の絶対量
の定量が困難であった。この理由から、対照および標的
配列の増幅効率におけるわずかな差が、増幅産物の収量
における大きな差および誤った定量比較をもたらしう
る。内部対照配列の共増幅は、サンプル中に存在する標
的配列の量を定量するためにＰＣＲにおいて用いられ
た。何年かの間、この方法の正確さは、標的配列と同じ
増幅効率を示す内部対照配列を選択するための可能性に
依存すると認識されてきた。最初に、共増幅技術は異な
るＰＣＲプライマー対により増幅された標的配列および
対照配列を用いたため、増幅効率とこの方法の正確さの
低下のバランスを困難にした。例えば、テェリー（Ｊ．
Ｃｈｅｌｌｙ）ら（（１９８８）、Ｎａｔｕｒｅ ３３
３，８５８−８６０は、ヒト組織におけるアルドラーゼ
ＡリセプターのｍＲＮＡおよびジストロフィンのｍＲＮ
Ａの共増幅を報告した。ジストロフィンのｍＲＮＡの絶
対量は直接測定できなかったが、この方法は、アルドラ
ーゼＡ増幅産物をジストロフィン増幅産物と比較するこ
とにより相対量を評価した。全ｍＲＮＡのパーセンテー
ジとしてのジストロフィン標的ｍＲＮＡの量の評価は、
アルドラーゼＡのｍＲＮＡを評価するための公表された
計算を用いて得られた。したがって、これらの著者は、
標的配列と関連しない内部対照配列を用い、そして２つ
の配列は異なるプライマー対を用いて共増幅された。さ
らに、対照配列と増幅配列の増幅産物は異なるサイズで
あった。
ため、内部対照配列の共増幅による特異的標的の絶対量
の定量が困難であった。この理由から、対照および標的
配列の増幅効率におけるわずかな差が、増幅産物の収量
における大きな差および誤った定量比較をもたらしう
る。内部対照配列の共増幅は、サンプル中に存在する標
的配列の量を定量するためにＰＣＲにおいて用いられ
た。何年かの間、この方法の正確さは、標的配列と同じ
増幅効率を示す内部対照配列を選択するための可能性に
依存すると認識されてきた。最初に、共増幅技術は異な
るＰＣＲプライマー対により増幅された標的配列および
対照配列を用いたため、増幅効率とこの方法の正確さの
低下のバランスを困難にした。例えば、テェリー（Ｊ．
Ｃｈｅｌｌｙ）ら（（１９８８）、Ｎａｔｕｒｅ ３３
３，８５８−８６０は、ヒト組織におけるアルドラーゼ
ＡリセプターのｍＲＮＡおよびジストロフィンのｍＲＮ
Ａの共増幅を報告した。ジストロフィンのｍＲＮＡの絶
対量は直接測定できなかったが、この方法は、アルドラ
ーゼＡ増幅産物をジストロフィン増幅産物と比較するこ
とにより相対量を評価した。全ｍＲＮＡのパーセンテー
ジとしてのジストロフィン標的ｍＲＮＡの量の評価は、
アルドラーゼＡのｍＲＮＡを評価するための公表された
計算を用いて得られた。したがって、これらの著者は、
標的配列と関連しない内部対照配列を用い、そして２つ
の配列は異なるプライマー対を用いて共増幅された。さ
らに、対照配列と増幅配列の増幅産物は異なるサイズで
あった。
【０００５】ＰＣＲの内部対照の改良は、標的配列と同
じプライマーを用いて増幅されうる内部対照配列を選択
することにより報告された。例えば、国際公開第９３／
０２２１５号および国際公開第９２／１１２７３号を参
照されたい。特定の研究において、標的配列と対照配列
を異なる長さにしてゲル上での同定を促進することが薦
められた（アイゼナッハ（Ｋ．Ｄ．Ｅｉｓｅｎａｃｈ）
ら、１９９１、Ａｍｅｒ．Ｒｅｖ．Ｒｅｓｐ．Ｄｉｓ．
１４４，１１６０−１１６３；ワング（Ａ．Ｍ．Ｗａｎ
ｇ）ら、１９８９、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓ
ｃｉ．ＵＳＡ８６，９７１７−９７２１；国際特許出願
国際公開番号第９１／０２８１７号）。ギリランド
（Ｇ．Ｇｉｌｌｉｌａｎｄ）ら（１９８９，Ｊ．Ｃｅｌ
ｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１３，Ｓｕｐｐｌ．Ｅ．，２７
０；（１９９０） Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓ
ｃｉ．ＵＳＡ ８７，２７２５−２７２９）は、内部対
照配列が標的とほぼ同じサイズであり、かつ、同じプラ
イマーにより複製開始する競合ＰＣＲ反応を記載してい
る。ギリランドらは、標的および内部配列が可変物の数
を減らすことに関連するべきであると教示しているが、
増幅される配列の長さを、増幅効率に顕著に影響する可
変物のひとつとして記載しておらず、ＰＣＲの速度は標
的の長さにより相対的に影響されないことは公知のとお
りである。
じプライマーを用いて増幅されうる内部対照配列を選択
することにより報告された。例えば、国際公開第９３／
０２２１５号および国際公開第９２／１１２７３号を参
照されたい。特定の研究において、標的配列と対照配列
を異なる長さにしてゲル上での同定を促進することが薦
められた（アイゼナッハ（Ｋ．Ｄ．Ｅｉｓｅｎａｃｈ）
ら、１９９１、Ａｍｅｒ．Ｒｅｖ．Ｒｅｓｐ．Ｄｉｓ．
１４４，１１６０−１１６３；ワング（Ａ．Ｍ．Ｗａｎ
ｇ）ら、１９８９、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓ
ｃｉ．ＵＳＡ８６，９７１７−９７２１；国際特許出願
国際公開番号第９１／０２８１７号）。ギリランド
（Ｇ．Ｇｉｌｌｉｌａｎｄ）ら（１９８９，Ｊ．Ｃｅｌ
ｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１３，Ｓｕｐｐｌ．Ｅ．，２７
０；（１９９０） Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓ
ｃｉ．ＵＳＡ ８７，２７２５−２７２９）は、内部対
照配列が標的とほぼ同じサイズであり、かつ、同じプラ
イマーにより複製開始する競合ＰＣＲ反応を記載してい
る。ギリランドらは、標的および内部配列が可変物の数
を減らすことに関連するべきであると教示しているが、
増幅される配列の長さを、増幅効率に顕著に影響する可
変物のひとつとして記載しておらず、ＰＣＲの速度は標
的の長さにより相対的に影響されないことは公知のとお
りである。
【０００６】ＰＣＲ反応の内部対照に関連する文献は、
標的および対照配列の間の等しい増幅効率を保証するよ
うに可変物が制御されるべきであることを記載してい
る。一部には、これらは、プライマー対の長さおよびヌ
クレオチド配列、ポリメラーゼ、ｄＮＴＰｓ、ＭｇＣｌ
2、鋳型核酸およびプライマーの濃度、プライマーダイ
マー形成の速度、核酸の変成温度、および鋳型核酸の濃
度および長さを含む。上記国際公開番号第９１／０２８
１７号を参照されたい。増幅効率と、含まれる可変物の
バランスの重要性はＰＣＲにおいて評価されてきたが、
恒温システム、例えばＳＤＡにおける増幅速度に影響す
る因子（および、したがって適切な対照配列の選択）
は、ＰＣＲに影響するものとは異なると期待される。
標的および対照配列の間の等しい増幅効率を保証するよ
うに可変物が制御されるべきであることを記載してい
る。一部には、これらは、プライマー対の長さおよびヌ
クレオチド配列、ポリメラーゼ、ｄＮＴＰｓ、ＭｇＣｌ
2、鋳型核酸およびプライマーの濃度、プライマーダイ
マー形成の速度、核酸の変成温度、および鋳型核酸の濃
度および長さを含む。上記国際公開番号第９１／０２８
１７号を参照されたい。増幅効率と、含まれる可変物の
バランスの重要性はＰＣＲにおいて評価されてきたが、
恒温システム、例えばＳＤＡにおける増幅速度に影響す
る因子（および、したがって適切な対照配列の選択）
は、ＰＣＲに影響するものとは異なると期待される。
【０００７】ＰＣＲにおいて顕著に異なる特徴は以下の
単一増幅サイクルからなる３つの工程からなる：（１）
二本鎖核酸の熱変成、（２）今一本鎖になった標的への
プライマーのハイブリダイゼーション、および（３）ハ
イブリダイズしたプライマーを伸長合成して工程（１）
において変成した二本鎖標的の同一コピーを形成する。
ＰＣＲにおいては、工程のうちの一つが任意の与えられ
た時間において生じうるようにこれらの工程を同調させ
る。一つの工程が終われば、反応温度を変更した後にの
み、次が始まりうる。したがって、ひとつの完全なサイ
クルは幾度かの温度変更を必要とする。即ち、ＰＣＲ増
幅は、まとまった相（ｃｏｈｅｒｅｎｔｐｈａｓｅ）に
おいて、すべての標的分子が同じときに同じ工程を経る
ように進行する。与えられた標的が増幅される効率は、
構成する３つの工程の総合された効率に直接依存する。
単一増幅サイクルからなる３つの工程からなる：（１）
二本鎖核酸の熱変成、（２）今一本鎖になった標的への
プライマーのハイブリダイゼーション、および（３）ハ
イブリダイズしたプライマーを伸長合成して工程（１）
において変成した二本鎖標的の同一コピーを形成する。
ＰＣＲにおいては、工程のうちの一つが任意の与えられ
た時間において生じうるようにこれらの工程を同調させ
る。一つの工程が終われば、反応温度を変更した後にの
み、次が始まりうる。したがって、ひとつの完全なサイ
クルは幾度かの温度変更を必要とする。即ち、ＰＣＲ増
幅は、まとまった相（ｃｏｈｅｒｅｎｔｐｈａｓｅ）に
おいて、すべての標的分子が同じときに同じ工程を経る
ように進行する。与えられた標的が増幅される効率は、
構成する３つの工程の総合された効率に直接依存する。
【０００８】２つ以上の標的配列をＰＣＲにより増幅す
る場合、各配列の増幅効率は、同じく、構成する工程に
関する効率の結果である。したがって、ＰＣＲにおいて
等しい効率で増幅される２つの等しくない配列に関して
は、各構成工程はその工程に割り当てられた時間の終わ
りに２つの配列に関して同時にのみ終了する。与えられ
た反応（即ち、プライマー伸長合成）が両方の標的に関
して同じ速度で生じる必要はない。全反応がサイクルの
次の工程（例えば、変成）に移行する前に、反応が同じ
範囲で生じることのみが必要とされる。即ち、２つの標
的の反応速度は任意の与えられた工程においてわずかに
異なってよく、次の反応工程が開始する前にゆっくりと
反応を完了させるのに十分な時間が提供される。結果と
して、ＰＣＲにおいては、基本的分子加工速度（即ち、
サイクルを構成する工程の速度）が単に温度循環を調整
することにより異なっていてさえも、２つの標的に関す
るすべての増幅効率を同一にすることができる。２つの
標的配列の増幅特性は、生じる増幅の等しい範囲に関し
て、精巧にバランスをとる必要はない。
る場合、各配列の増幅効率は、同じく、構成する工程に
関する効率の結果である。したがって、ＰＣＲにおいて
等しい効率で増幅される２つの等しくない配列に関して
は、各構成工程はその工程に割り当てられた時間の終わ
りに２つの配列に関して同時にのみ終了する。与えられ
た反応（即ち、プライマー伸長合成）が両方の標的に関
して同じ速度で生じる必要はない。全反応がサイクルの
次の工程（例えば、変成）に移行する前に、反応が同じ
範囲で生じることのみが必要とされる。即ち、２つの標
的の反応速度は任意の与えられた工程においてわずかに
異なってよく、次の反応工程が開始する前にゆっくりと
反応を完了させるのに十分な時間が提供される。結果と
して、ＰＣＲにおいては、基本的分子加工速度（即ち、
サイクルを構成する工程の速度）が単に温度循環を調整
することにより異なっていてさえも、２つの標的に関す
るすべての増幅効率を同一にすることができる。２つの
標的配列の増幅特性は、生じる増幅の等しい範囲に関し
て、精巧にバランスをとる必要はない。
【０００９】恒温システム、例えばＳＤＡにおいて、増
幅がまとまった相（ｃｏｈｅｒｅｎｔ ｐｈａｓｅ）で
進行する場合はない。各標的分子の増幅は、そのような
システムにおける一致した一連の反応を通して、時間内
の与えられた点において生じるが、異なる個々の標的分
子は増幅サイクルの異なる相にある。このような連続増
幅システムにおいて、１つの標的配列に関して反応工程
を遅延させることにより第２標的配列を含む遅れた反応
を追いつかせることは不可能である。代わりに、いかに
遅い速度であっても、２つの標的配列に関する反応の基
本速度の不均衡は、増幅効率を直接異なったものに変え
る。前に言及されたとおり、増幅効率におけるわずかな
差異でさえも、対数的増幅システム、例えばＰＣＲおよ
びＳＤＡにおける生成物の収量に大きな差異がもたらさ
れる。わずかな反応速度の不均衡は、したがって、恒温
増幅システム、例えばＳＤＡにおいて膨大になるが、Ｐ
ＣＲにおける同様な不均衡は、適切な温度循環の選択に
より効果的に否定される。これらの理由により、適切に
バランスをとった増幅効率を有する対照配列の選択はよ
り決定的であり、かつ、異なる反応工程において実施さ
れるシステムよりも恒温システムにおいて、より困難で
ある。例えば、ＳＤＡの効率は、標的または対照配列の
長さが約６０ヌクレオチド以上に増加すると低下する。
対照的に、数百ヌクレオチド長さの違うＰＣＲ標的が同
様な効率で増幅されうる。ＳＤＡおよび他の恒温増幅反
応の低い増幅温度は、プライマーおよび標的配列の二次
構造の程度を増加させ、ひるがえって増幅反応速度に影
響する。
幅がまとまった相（ｃｏｈｅｒｅｎｔ ｐｈａｓｅ）で
進行する場合はない。各標的分子の増幅は、そのような
システムにおける一致した一連の反応を通して、時間内
の与えられた点において生じるが、異なる個々の標的分
子は増幅サイクルの異なる相にある。このような連続増
幅システムにおいて、１つの標的配列に関して反応工程
を遅延させることにより第２標的配列を含む遅れた反応
を追いつかせることは不可能である。代わりに、いかに
遅い速度であっても、２つの標的配列に関する反応の基
本速度の不均衡は、増幅効率を直接異なったものに変え
る。前に言及されたとおり、増幅効率におけるわずかな
差異でさえも、対数的増幅システム、例えばＰＣＲおよ
びＳＤＡにおける生成物の収量に大きな差異がもたらさ
れる。わずかな反応速度の不均衡は、したがって、恒温
増幅システム、例えばＳＤＡにおいて膨大になるが、Ｐ
ＣＲにおける同様な不均衡は、適切な温度循環の選択に
より効果的に否定される。これらの理由により、適切に
バランスをとった増幅効率を有する対照配列の選択はよ
り決定的であり、かつ、異なる反応工程において実施さ
れるシステムよりも恒温システムにおいて、より困難で
ある。例えば、ＳＤＡの効率は、標的または対照配列の
長さが約６０ヌクレオチド以上に増加すると低下する。
対照的に、数百ヌクレオチド長さの違うＰＣＲ標的が同
様な効率で増幅されうる。ＳＤＡおよび他の恒温増幅反
応の低い増幅温度は、プライマーおよび標的配列の二次
構造の程度を増加させ、ひるがえって増幅反応速度に影
響する。
【００１０】欧州特許第０５２５８８２号は、標的核酸
と変異配列の競合増幅による核酸配列に基づく増幅（Ｎ
ｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｂａｓｅ
ｄＡｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ：ＮＡＳＢＡ）反応にお
ける標的核酸の定量法を記載している。この方法は、一
定量のサンプルと変異配列の希釈シリーズを用いて実施
される。分析は、標的配列からのシグナルを５０％低下
させる添加変異配列量を測定することにより実施される
が、この５０％という値は、変異配列と標的配列が等量
存在することを示す。正確な定量を生じさせるために、
欧州特許第０５２５８８２号に記載された増幅反応は、
少なくとも一つの試薬が完全に消費されるまで、即ち、
限定された試薬の競合が生じうる、反応の後対数相（ｐ
ｏｓｔ−ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ ｐｈａｓｅ）まで続
けられなければならない。さらに、試薬と、標的の増幅
との競合および変異配列の増幅との競合の２つの反応が
起こる場合に限って、計算が正確である。結果は、した
がって、第３の反応、例えばバックグラウンド増幅が生
じる場合は信頼できない。本質的なこととして、すべて
の増幅反応はある程度のバックグラウンド増幅を含み、
欧州特許第０５２５８８２号の定量法は高いレベルの標
的配列に関してのみ正確である。低い標的レベルにおい
ては、バックグラウンドの増幅反応の競合が顕著に計算
の正確さを妨害する。標的配列による変異配列のさまざ
まな希釈物の増幅に依存するため、欧州特許第０５２５
８８２号の方法は、変異配列と標的配列の量のチューブ
間の変化にも敏感である。標的配列の量のわずかな差異
またはチューブ間の変異配列の希釈物のわずかな不正確
さが次の増幅反応において対数的に増幅され、そして定
量の計算に反映される。対照的に、本発明の方法は、試
薬に関して対照配列と標的配列を競合させる必要はな
く、反応を後対数相に導く必要もない。増幅反応の対数
相および後対数相は両方とも正確である。本発明の方法
における標的配列／対照配列の比は、したがって、生じ
るかもしれないバックグラウンド増幅反応により逆に影
響されず、そして、バックグラウンド反応の程度いかん
に拘わらず同じままである。したがって、結果は増幅反
応の初期においても得られ、一連の反応よりむしろ単一
標的／対照共増幅反応の使用により可変性は減る。
と変異配列の競合増幅による核酸配列に基づく増幅（Ｎ
ｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｂａｓｅ
ｄＡｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ：ＮＡＳＢＡ）反応にお
ける標的核酸の定量法を記載している。この方法は、一
定量のサンプルと変異配列の希釈シリーズを用いて実施
される。分析は、標的配列からのシグナルを５０％低下
させる添加変異配列量を測定することにより実施される
が、この５０％という値は、変異配列と標的配列が等量
存在することを示す。正確な定量を生じさせるために、
欧州特許第０５２５８８２号に記載された増幅反応は、
少なくとも一つの試薬が完全に消費されるまで、即ち、
限定された試薬の競合が生じうる、反応の後対数相（ｐ
ｏｓｔ−ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ ｐｈａｓｅ）まで続
けられなければならない。さらに、試薬と、標的の増幅
との競合および変異配列の増幅との競合の２つの反応が
起こる場合に限って、計算が正確である。結果は、した
がって、第３の反応、例えばバックグラウンド増幅が生
じる場合は信頼できない。本質的なこととして、すべて
の増幅反応はある程度のバックグラウンド増幅を含み、
欧州特許第０５２５８８２号の定量法は高いレベルの標
的配列に関してのみ正確である。低い標的レベルにおい
ては、バックグラウンドの増幅反応の競合が顕著に計算
の正確さを妨害する。標的配列による変異配列のさまざ
まな希釈物の増幅に依存するため、欧州特許第０５２５
８８２号の方法は、変異配列と標的配列の量のチューブ
間の変化にも敏感である。標的配列の量のわずかな差異
またはチューブ間の変異配列の希釈物のわずかな不正確
さが次の増幅反応において対数的に増幅され、そして定
量の計算に反映される。対照的に、本発明の方法は、試
薬に関して対照配列と標的配列を競合させる必要はな
く、反応を後対数相に導く必要もない。増幅反応の対数
相および後対数相は両方とも正確である。本発明の方法
における標的配列／対照配列の比は、したがって、生じ
るかもしれないバックグラウンド増幅反応により逆に影
響されず、そして、バックグラウンド反応の程度いかん
に拘わらず同じままである。したがって、結果は増幅反
応の初期においても得られ、一連の反応よりむしろ単一
標的／対照共増幅反応の使用により可変性は減る。
【００１１】出願人らは、最初に、バックグラウンドの
妨害とは本質的に独立した恒温核酸増幅反応において生
じた増幅産物量から前増幅（ｐｒｅ−ａｍｐｌｉｆｉｃ
ａｔｉｏｎ）標的レベルを減じるためのいくつかの方法
を提供する。これらの方法は、個々の増幅反応が十分な
増幅活性を有することにより特定された最小数の標的分
子を検出可能にすることを実証するのに有用なことと並
んで、最初に存在した標的量を定量するのにも有用であ
る。これらの方法は、恒温増幅反応における対照配列と
標的配列との増幅速度のバランスをとるために制御され
なければならない反応可変物を出願人らが発見したこと
により可能となった。他の増幅法のように、ＳＤＡおよ
び他の恒温反応の対数性は、増幅速度にわずかな変化を
生じさせることにより生じた標的コピー数に大きな変化
を生じさせる。増幅速度および効率は、実験におけるさ
まざまなパラメーター、例えば温度、イオン強度および
非標的ＤＮＡの存在の検出に敏感であることが知られて
いる。結果として、これら（および他の）パラメーター
におけるわずかな変化が、名目上同一のサンプルからの
増幅標的の劇的に異なる収量をもたらしうる。このサン
プルからサンプルへの変化は、低い増幅活性により標的
がサンプル中に存在しなかったといゆう誤った結果を導
くならば、最初の標的レベルの定量を極めて困難なもの
にし、そして、誤った診断結果をもたらしうる。
妨害とは本質的に独立した恒温核酸増幅反応において生
じた増幅産物量から前増幅（ｐｒｅ−ａｍｐｌｉｆｉｃ
ａｔｉｏｎ）標的レベルを減じるためのいくつかの方法
を提供する。これらの方法は、個々の増幅反応が十分な
増幅活性を有することにより特定された最小数の標的分
子を検出可能にすることを実証するのに有用なことと並
んで、最初に存在した標的量を定量するのにも有用であ
る。これらの方法は、恒温増幅反応における対照配列と
標的配列との増幅速度のバランスをとるために制御され
なければならない反応可変物を出願人らが発見したこと
により可能となった。他の増幅法のように、ＳＤＡおよ
び他の恒温反応の対数性は、増幅速度にわずかな変化を
生じさせることにより生じた標的コピー数に大きな変化
を生じさせる。増幅速度および効率は、実験におけるさ
まざまなパラメーター、例えば温度、イオン強度および
非標的ＤＮＡの存在の検出に敏感であることが知られて
いる。結果として、これら（および他の）パラメーター
におけるわずかな変化が、名目上同一のサンプルからの
増幅標的の劇的に異なる収量をもたらしうる。このサン
プルからサンプルへの変化は、低い増幅活性により標的
がサンプル中に存在しなかったといゆう誤った結果を導
くならば、最初の標的レベルの定量を極めて困難なもの
にし、そして、誤った診断結果をもたらしうる。
【００１２】
【発明が解決しようとする課題】恒温反応における増幅
速度の可変性に貢献するすべての反応パラメーターは、
しかしながら、知られていない。さらに、このような可
変物の制御および増幅速度のバランスは、恒温増幅法に
おいてはより決定的でありより困難であるが、それは、
それらの連続性がＰＣＲの場合のようにわずかな不均衡
を調整する機会を与えないからである（上記参照）。結
果として、反応速度におけるわずかな差異が最初の標的
レベルの定量を極めて不正確にし、そして低い増幅活性
により標的がサンプル中に存在しなかったという誤った
結果を導くならば、誤った結果をもたらしうる。
速度の可変性に貢献するすべての反応パラメーターは、
しかしながら、知られていない。さらに、このような可
変物の制御および増幅速度のバランスは、恒温増幅法に
おいてはより決定的でありより困難であるが、それは、
それらの連続性がＰＣＲの場合のようにわずかな不均衡
を調整する機会を与えないからである（上記参照）。結
果として、反応速度におけるわずかな差異が最初の標的
レベルの定量を極めて不正確にし、そして低い増幅活性
により標的がサンプル中に存在しなかったという誤った
結果を導くならば、誤った結果をもたらしうる。
【００１３】本発明は、（１）増幅反応効率を測定し、
そして（２）前増幅標的レベルを定量するための、恒温
核酸増幅反応における内部オリゴヌクレオチド標準物の
使用法を提供する。内部対照配列は、標的配列と同じ反
応混合物中で増幅されるから、可変物、例えばイオン強
度、非標的核酸のレベルおよび温度は一定である。恒温
増幅反応における標的配列および対照配列の増幅速度の
バランスをとるためには、標的配列および対照配列は実
質的に同じ長さであり、かつ、実質的に同じＧ＋Ｃ含有
量を有するべきである。Ｇ＋Ｃ含有量以外にはヌクレオ
チドレベルにおいてこれら配列は密接に関連している必
要はない。これにより、標的配列と同様の変成特性を有
する内部対照配列が提供される。さらに、増幅温度にお
いて最小限の二次構造を有するように内部対照配列を選
択すべきことが見いだされた。
そして（２）前増幅標的レベルを定量するための、恒温
核酸増幅反応における内部オリゴヌクレオチド標準物の
使用法を提供する。内部対照配列は、標的配列と同じ反
応混合物中で増幅されるから、可変物、例えばイオン強
度、非標的核酸のレベルおよび温度は一定である。恒温
増幅反応における標的配列および対照配列の増幅速度の
バランスをとるためには、標的配列および対照配列は実
質的に同じ長さであり、かつ、実質的に同じＧ＋Ｃ含有
量を有するべきである。Ｇ＋Ｃ含有量以外にはヌクレオ
チドレベルにおいてこれら配列は密接に関連している必
要はない。これにより、標的配列と同様の変成特性を有
する内部対照配列が提供される。さらに、増幅温度にお
いて最小限の二次構造を有するように内部対照配列を選
択すべきことが見いだされた。
【００１４】
【課題を解決するための手段】本発明は、（１）増幅反
応効率を測定し、そして（２）前増幅標的レベルを定量
するための、恒温核酸増幅反応における内部標準物また
は対照としてのオリゴヌクレオチドの使用法に関する。
内部対照オリゴヌクレオチドも「誤った陰性」結果を同
定する手段を提供するが、その際、増幅された標的配列
に関しても陰性であるサンプル中の増幅された対照配列
の不在は、標的配列の不在よりむしろ増幅反応の失敗を
示唆する。与えられた増幅反応において生じた標的コピ
ー数は、増幅前に存在した標的の量および増幅反応自身
の全効率および速度に依存する。本発明の方法は、サン
プル中の標的分子の存在または不在とは独立して、個々
の反応混合物の増幅活性を評価する手段を提供する。既
知量の内部対照オリゴヌクレオチドを各混合物に添加
し、そして、この分子を、もしも存在するならば標的配
列と共に増幅する。この内部対照配列を選択することに
より、標準セットの反応条件下における増幅速度を標的
配列の増幅速度に近似させる。この方法において、標的
の濃度に対する対照の濃度の比は全増幅反応を通して一
定に保たれる。次に、最初に存在した標的配列の量を増
幅後の標的と対照のレベルの比および添加された対照配
列の既知量から計算する。
応効率を測定し、そして（２）前増幅標的レベルを定量
するための、恒温核酸増幅反応における内部標準物また
は対照としてのオリゴヌクレオチドの使用法に関する。
内部対照オリゴヌクレオチドも「誤った陰性」結果を同
定する手段を提供するが、その際、増幅された標的配列
に関しても陰性であるサンプル中の増幅された対照配列
の不在は、標的配列の不在よりむしろ増幅反応の失敗を
示唆する。与えられた増幅反応において生じた標的コピ
ー数は、増幅前に存在した標的の量および増幅反応自身
の全効率および速度に依存する。本発明の方法は、サン
プル中の標的分子の存在または不在とは独立して、個々
の反応混合物の増幅活性を評価する手段を提供する。既
知量の内部対照オリゴヌクレオチドを各混合物に添加
し、そして、この分子を、もしも存在するならば標的配
列と共に増幅する。この内部対照配列を選択することに
より、標準セットの反応条件下における増幅速度を標的
配列の増幅速度に近似させる。この方法において、標的
の濃度に対する対照の濃度の比は全増幅反応を通して一
定に保たれる。次に、最初に存在した標的配列の量を増
幅後の標的と対照のレベルの比および添加された対照配
列の既知量から計算する。
【００１５】信頼性に関して、対照および標的の増幅速
度は可能な限り同一にするべきである。このことは、標
的配列を増幅するために用いられるのと同じプライマー
により増幅されうる対照配列を選択することにより、恒
温増幅反応において達成されることが好ましい。単一セ
ットのプライマーの使用は、多種類のプライマーセット
を単一増幅反応において用いた場合に遭遇するかもしれ
ない非特異的バックグラウンド増幅反応のレベルを低下
させる。同じ増幅速度を達成するためには、対照配列を
選択して、最小限の二次構造（したがって、最小限のフ
ォールディング）および標的配列と同じ長さを有するよ
うにすることが好ましい。さらに、対照配列の内部領域
（プライマー結合部位の間）を標的配列と十分に異なら
せることにより、オリゴヌクレオチドプローブによるハ
イブリダイゼーションにより２つの分子を区別すること
が好ましい。標的配列および対照配列は、しかしなが
ら、おおまかに等しいＧ＋Ｃ含有量を有することによ
り、ハイブリダイゼーションおよび変成の特性を同様に
することが好ましい。
度は可能な限り同一にするべきである。このことは、標
的配列を増幅するために用いられるのと同じプライマー
により増幅されうる対照配列を選択することにより、恒
温増幅反応において達成されることが好ましい。単一セ
ットのプライマーの使用は、多種類のプライマーセット
を単一増幅反応において用いた場合に遭遇するかもしれ
ない非特異的バックグラウンド増幅反応のレベルを低下
させる。同じ増幅速度を達成するためには、対照配列を
選択して、最小限の二次構造（したがって、最小限のフ
ォールディング）および標的配列と同じ長さを有するよ
うにすることが好ましい。さらに、対照配列の内部領域
（プライマー結合部位の間）を標的配列と十分に異なら
せることにより、オリゴヌクレオチドプローブによるハ
イブリダイゼーションにより２つの分子を区別すること
が好ましい。標的配列および対照配列は、しかしなが
ら、おおまかに等しいＧ＋Ｃ含有量を有することによ
り、ハイブリダイゼーションおよび変成の特性を同様に
することが好ましい。
【００１６】内部対照オリゴヌクレオチドは化学的に合
成するか、クローン化配列から増幅するか、または当該
分野において公知の他の手段により単離してよい。便利
なのは、規定された核酸配列の公知のあらゆる合成法を
用いてオリゴヌクレオチドを合成することが好ましい。
例えば、カルサーズ（Ｃ．Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ）ら、１
９８２、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ Ｓ
ｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．４７，４１１−４１
８；アダムス（Ａｄａｍｓ）ら、１９８３、Ｊ．Ａｍ．
Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１０５，６０１；フロエラー（Ｆｒ
ｏｅｈｌｅｒ）ら、１９８６、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒ
ｅｓ．１４，５３９９；ナラン（Ｎａｒａｎｇ）ら、１
９７９、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚ．６８，９０；オギル
ビー（Ｏｇｉｌｖｉｅ）ら、１９８８、ＰＮＡＳ ８
５，５７６４を参照されたい。上記パラメーターに従っ
た、選択された標的配列に関する内部対照配列の生産に
続いて、既知量の対照配列を恒温核酸増幅反応、例えば
ＳＤＡ、３ＳＲまたはＱβレプリカーゼ増幅に添加す
る。ＳＤＡは、上記内部対照を用いた使用に好ましい。
反応に加えられる対照配列の量は、増幅を行う時間の長
さおよび反応の見積もり速度に依存する。与えられた量
の標的配列に関する対照配列のダイナミックレンジは、
極めて広い（例えば、５０マイコバクテリウムツベルク
ロシス（Ｍｔｂ）ゲノムの増幅に関して少なくとも１０
０，０００分子以上の対照配列）。増幅された対照配列
の正確に検出しうる量を、与えられた増幅反応において
算出することを保証するためには、対照濃度の範囲を含
む反応混合物の希釈物を調製し、そして競合ＰＣＲに関
するギリランド（Ｇｉｌｌｉｌａｎｄ）ら（１９８９お
よび１９９０、前記）に記載された方法と同様の様式で
平行に操作する。別法としては、期待される増幅の程度
が見積もられるならば、対照配列を単一量、単一反応に
加える。
成するか、クローン化配列から増幅するか、または当該
分野において公知の他の手段により単離してよい。便利
なのは、規定された核酸配列の公知のあらゆる合成法を
用いてオリゴヌクレオチドを合成することが好ましい。
例えば、カルサーズ（Ｃ．Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ）ら、１
９８２、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ Ｓ
ｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．４７，４１１−４１
８；アダムス（Ａｄａｍｓ）ら、１９８３、Ｊ．Ａｍ．
Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１０５，６０１；フロエラー（Ｆｒ
ｏｅｈｌｅｒ）ら、１９８６、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒ
ｅｓ．１４，５３９９；ナラン（Ｎａｒａｎｇ）ら、１
９７９、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚ．６８，９０；オギル
ビー（Ｏｇｉｌｖｉｅ）ら、１９８８、ＰＮＡＳ ８
５，５７６４を参照されたい。上記パラメーターに従っ
た、選択された標的配列に関する内部対照配列の生産に
続いて、既知量の対照配列を恒温核酸増幅反応、例えば
ＳＤＡ、３ＳＲまたはＱβレプリカーゼ増幅に添加す
る。ＳＤＡは、上記内部対照を用いた使用に好ましい。
反応に加えられる対照配列の量は、増幅を行う時間の長
さおよび反応の見積もり速度に依存する。与えられた量
の標的配列に関する対照配列のダイナミックレンジは、
極めて広い（例えば、５０マイコバクテリウムツベルク
ロシス（Ｍｔｂ）ゲノムの増幅に関して少なくとも１０
０，０００分子以上の対照配列）。増幅された対照配列
の正確に検出しうる量を、与えられた増幅反応において
算出することを保証するためには、対照濃度の範囲を含
む反応混合物の希釈物を調製し、そして競合ＰＣＲに関
するギリランド（Ｇｉｌｌｉｌａｎｄ）ら（１９８９お
よび１９９０、前記）に記載された方法と同様の様式で
平行に操作する。別法としては、期待される増幅の程度
が見積もられるならば、対照配列を単一量、単一反応に
加える。
【００１７】増幅後、生成された標的配列および対照配
列のレベルは、特定の核酸配列を検出するための当該分
野において公知のあらゆる方法により測定される。例え
ば、増幅産物は、検出可能な標識をつけたオリゴヌクレ
オチドへのハイブリダイゼーションにより検出され、そ
の際、一方のプローブは対照配列に特異的にハイブリダ
イズし、他方のプローブは標的配列に特異的にハイブリ
ダイズする。標的特異的プローブおよび対照特異的プロ
ーブが同様に増幅産物にハイブリダイズすれば、対照と
標的のそれぞれの量の区別を促進するために、標識は別
々に同定されるべきである。さもなくば、増幅反応の別
々のアリコートを、同じ標識をつけた標的特異的プロー
ブおよび対照特異的プローブに別々にハイブリダイズさ
せる。検出可能な標識は、合成後に結合させるか、また
は合成中にプローブに取り込むが、例えば、標識誘導ヌ
クレオチドの形態である。このような標識は当該分野に
おいて公知であり、直接または間接に検出可能な標識を
含む。直接検出可能な標識は、さらなる化学反応を必要
とせずにシグナルを生じ、蛍光色素、放射性標識および
染料を含む。間接検出可能な標識は、さらなる化学反応
を必要とするか、または検出可能なシグナルを生じる試
薬の付加を必要とする。例えば、これらは、酵素、例え
ばホースラディッシュパーオキシダーゼおよびアルカリ
ホスファターゼ、リガンド、例えば標識結合アビジンへ
の結合により検出されるビオチン、および化学発光分子
を含む。プローブは、溶液、ゲル、または固相支持体に
おいてそれぞれの増幅産物にハイブリダイズしてよい。
ハイブリダイズ後、関連した標識によるシグナルを生じ
させ、選択された標識およびハイブリダイゼーションプ
ロトコルに適切な方法を用いて検出および別々に定量さ
れる。各増幅産物に関して検出されるシグナルの量は、
存在量を反映する。
列のレベルは、特定の核酸配列を検出するための当該分
野において公知のあらゆる方法により測定される。例え
ば、増幅産物は、検出可能な標識をつけたオリゴヌクレ
オチドへのハイブリダイゼーションにより検出され、そ
の際、一方のプローブは対照配列に特異的にハイブリダ
イズし、他方のプローブは標的配列に特異的にハイブリ
ダイズする。標的特異的プローブおよび対照特異的プロ
ーブが同様に増幅産物にハイブリダイズすれば、対照と
標的のそれぞれの量の区別を促進するために、標識は別
々に同定されるべきである。さもなくば、増幅反応の別
々のアリコートを、同じ標識をつけた標的特異的プロー
ブおよび対照特異的プローブに別々にハイブリダイズさ
せる。検出可能な標識は、合成後に結合させるか、また
は合成中にプローブに取り込むが、例えば、標識誘導ヌ
クレオチドの形態である。このような標識は当該分野に
おいて公知であり、直接または間接に検出可能な標識を
含む。直接検出可能な標識は、さらなる化学反応を必要
とせずにシグナルを生じ、蛍光色素、放射性標識および
染料を含む。間接検出可能な標識は、さらなる化学反応
を必要とするか、または検出可能なシグナルを生じる試
薬の付加を必要とする。例えば、これらは、酵素、例え
ばホースラディッシュパーオキシダーゼおよびアルカリ
ホスファターゼ、リガンド、例えば標識結合アビジンへ
の結合により検出されるビオチン、および化学発光分子
を含む。プローブは、溶液、ゲル、または固相支持体に
おいてそれぞれの増幅産物にハイブリダイズしてよい。
ハイブリダイズ後、関連した標識によるシグナルを生じ
させ、選択された標識およびハイブリダイゼーションプ
ロトコルに適切な方法を用いて検出および別々に定量さ
れる。各増幅産物に関して検出されるシグナルの量は、
存在量を反映する。
【００１８】標的および対照増幅産物の検出のための好
ましいひとつの方法は、標的配列または対照配列に特異
的にハイブリダイズするプライマーのポリメラーゼ伸長
合成による。プライマーは上記のとおり、好ましくは放
射性同位体により標識されて、プライマーの標識を伸長
反応産物に取り込む。この方法は、ウオーカー（Ｗａｌ
ｋｅｒ）ら（１９９２）Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．
およびＰＮＡＳ（上記）に詳しく記載されている。
ましいひとつの方法は、標的配列または対照配列に特異
的にハイブリダイズするプライマーのポリメラーゼ伸長
合成による。プライマーは上記のとおり、好ましくは放
射性同位体により標識されて、プライマーの標識を伸長
反応産物に取り込む。この方法は、ウオーカー（Ｗａｌ
ｋｅｒ）ら（１９９２）Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．
およびＰＮＡＳ（上記）に詳しく記載されている。
【００１９】増幅された標的および対照配列を検出する
ための他の好ましい方法は、ビオチン化取得オリゴデオ
キシヌクレオチドプローブおよび酵素結合検出用オリゴ
デオキシヌクレオチドプローブを用いて増幅産物を検出
する化学発光方法である。これら２つのプローブを増幅
標的配列の異なる部位にハイブリダイゼーションさせた
後、複合体はストレプトアビジンでコートされたマイク
ロタイタープレート上で取得され、そして化学発光が生
じ、そして発光メーターにおいて読み取られる。この検
出法は２時間未満で実施でき、そしてひとつの前増幅標
的配列と同じ量を検出するのに十分な感度を有する。
ための他の好ましい方法は、ビオチン化取得オリゴデオ
キシヌクレオチドプローブおよび酵素結合検出用オリゴ
デオキシヌクレオチドプローブを用いて増幅産物を検出
する化学発光方法である。これら２つのプローブを増幅
標的配列の異なる部位にハイブリダイゼーションさせた
後、複合体はストレプトアビジンでコートされたマイク
ロタイタープレート上で取得され、そして化学発光が生
じ、そして発光メーターにおいて読み取られる。この検
出法は２時間未満で実施でき、そしてひとつの前増幅標
的配列と同じ量を検出するのに十分な感度を有する。
【００２０】本発明の方法を用いて標的配列の最初のレ
ベルを定量する場合、標的および対照の増幅後のレベル
は、シグナル発生法により測定され、そして標的特異的
／対照特異的シグナルのレベル（Ｒ）が計算される。こ
の比（Ｒ：標的シグナル／対照シグナル）は、標的／対
照初期濃度（即ち、増幅前）の比に対して直線的に変化
することが見いだされる。この直線関係は、初期標的／
対照比の１００，０００倍の範囲以上にわたって保たれ
ることが示された。原則として、時間０において存在す
る標的の濃度は、増幅後の対照に対する標的シグナル比
Ｒと、標準プロットの上記Ｒを、初期のマイコバクテリ
ウムツベルクロシス（Ｍｔｂ）のレベルと比較すること
により、測定される。
ベルを定量する場合、標的および対照の増幅後のレベル
は、シグナル発生法により測定され、そして標的特異的
／対照特異的シグナルのレベル（Ｒ）が計算される。こ
の比（Ｒ：標的シグナル／対照シグナル）は、標的／対
照初期濃度（即ち、増幅前）の比に対して直線的に変化
することが見いだされる。この直線関係は、初期標的／
対照比の１００，０００倍の範囲以上にわたって保たれ
ることが示された。原則として、時間０において存在す
る標的の濃度は、増幅後の対照に対する標的シグナル比
Ｒと、標準プロットの上記Ｒを、初期のマイコバクテリ
ウムツベルクロシス（Ｍｔｂ）のレベルと比較すること
により、測定される。
【００２１】本発明の方法を用いてサンプルの効率を測
定する場合、反応混合物に添加される対照配列の量は、
通常、陽性サンプルにおいて検出されるはずの最小数の
標的分子量に相当するように選択される。この方法にお
いて、対照配列は増幅反応自体に関する対照として機能
し、反応感度の最低閾値における量で存在する対照配列
の検出可能な増幅物は、標的配列に関する陰性の結果を
確証するために機能する。対照配列の増幅を検出する不
可能性は、サンプルが本当に陰性ではないが、増幅反応
の失敗のために陰性になったに過ぎないという事実を、
使用者に警告する。
定する場合、反応混合物に添加される対照配列の量は、
通常、陽性サンプルにおいて検出されるはずの最小数の
標的分子量に相当するように選択される。この方法にお
いて、対照配列は増幅反応自体に関する対照として機能
し、反応感度の最低閾値における量で存在する対照配列
の検出可能な増幅物は、標的配列に関する陰性の結果を
確証するために機能する。対照配列の増幅を検出する不
可能性は、サンプルが本当に陰性ではないが、増幅反応
の失敗のために陰性になったに過ぎないという事実を、
使用者に警告する。
【００２２】マイコバクテリウムツベルクロシス（Ｍｙ
ｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ：
Ｍｔｂ）の検出に関する増幅反応に用いられる、特に好
ましい対照オリゴヌクレオチド配列（配列番号：１）
は、５’−ＡＣＴＧＡＧＡＴＣＣＣＣＴＡＧＣＧＡＣＧ
ＡＴＧＴＣＴＧＡＧＧＣＡＡＣＴＡＧＣＡＡＡＧＣＴＧ
ＧＴＣＧＡＧＴＡＣＧＣＣ−３’である。このオリゴヌ
クレオチドは、ＩＳ６１１０の挿入配列の第９７２番目
〜第１０２３番目に由来するＭｔｂ標的配列（配列番
号：２）：５’ＡＣＴＧＡＧＡＴＣＣＣＣＴＡＴＣＣＧ
ＴＡＴＧＧＴＧＧＡＴＡＡＣＧＴＣＴＴＴＣＡＧＧＴＣ
ＧＡＧＴＡＣＧＣＣ−３’を含む対照−標的混合物に適
合している。
ｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ：
Ｍｔｂ）の検出に関する増幅反応に用いられる、特に好
ましい対照オリゴヌクレオチド配列（配列番号：１）
は、５’−ＡＣＴＧＡＧＡＴＣＣＣＣＴＡＧＣＧＡＣＧ
ＡＴＧＴＣＴＧＡＧＧＣＡＡＣＴＡＧＣＡＡＡＧＣＴＧ
ＧＴＣＧＡＧＴＡＣＧＣＣ−３’である。このオリゴヌ
クレオチドは、ＩＳ６１１０の挿入配列の第９７２番目
〜第１０２３番目に由来するＭｔｂ標的配列（配列番
号：２）：５’ＡＣＴＧＡＧＡＴＣＣＣＣＴＡＴＣＣＧ
ＴＡＴＧＧＴＧＧＡＴＡＡＣＧＴＣＴＴＴＣＡＧＧＴＣ
ＧＡＧＴＡＣＧＣＣ−３’を含む対照−標的混合物に適
合している。
【００２３】
実施例１ 上記内部対照配列およびＭｔｂ標的配列の共増幅は、上
記ウオーカーら（１９９２）に記載された条件下で、以
下の修飾をして、ＳＤＡ手段により実施された。各５０
μｌ反応混合物は３０，０００コピーの一本鎖対照配列
分子（配列番号：１）および０から３００，０００コピ
ーの範囲の濃度で存在するゲノミックのＭｔｂのＤＮＡ
を、反応あたり、含んだ。各反応混合物は、５０ｍＭリ
ン酸カリウム（ｐＨ７．４）、６ｍＭ塩化マグネシウ
ム、０．１ｍｇウシ血清アルブミン、１２％グリセロー
ル（ｖ／ｖ）、２５０ｎｇヒト胎盤ＤＮＡ（シグマケミ
カル（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ）社、セントルイ
ス、ＭＯ）、１５０ユニットＨｉｎｃＩＩ（ニューイン
グランドバイオラブズ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉ
ｏｌａｂｓ）社、ビバリー、ＭＡ）および２．５ユニッ
トｅｘｏ-クレノーＤＮＡポリメラーゼ（ユナイテドス
テーツバイオケミカル（Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ
Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ）社、クリーブランド、ＯＨ）
も含んだ。反応物は、ウオーカーらにより記載されたＳ
1，Ｓ2，Ｂ1およびＢ2オリゴデオキシヌクレオチドプラ
イマーも含んだ（５００ｎＭのＳ1およびＳ2，５０ｎＭ
のＢ1およびＢ2）。
記ウオーカーら（１９９２）に記載された条件下で、以
下の修飾をして、ＳＤＡ手段により実施された。各５０
μｌ反応混合物は３０，０００コピーの一本鎖対照配列
分子（配列番号：１）および０から３００，０００コピ
ーの範囲の濃度で存在するゲノミックのＭｔｂのＤＮＡ
を、反応あたり、含んだ。各反応混合物は、５０ｍＭリ
ン酸カリウム（ｐＨ７．４）、６ｍＭ塩化マグネシウ
ム、０．１ｍｇウシ血清アルブミン、１２％グリセロー
ル（ｖ／ｖ）、２５０ｎｇヒト胎盤ＤＮＡ（シグマケミ
カル（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ）社、セントルイ
ス、ＭＯ）、１５０ユニットＨｉｎｃＩＩ（ニューイン
グランドバイオラブズ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉ
ｏｌａｂｓ）社、ビバリー、ＭＡ）および２．５ユニッ
トｅｘｏ-クレノーＤＮＡポリメラーゼ（ユナイテドス
テーツバイオケミカル（Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ
Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ）社、クリーブランド、ＯＨ）
も含んだ。反応物は、ウオーカーらにより記載されたＳ
1，Ｓ2，Ｂ1およびＢ2オリゴデオキシヌクレオチドプラ
イマーも含んだ（５００ｎＭのＳ1およびＳ2，５０ｎＭ
のＢ1およびＢ2）。
【００２４】ＨｉｎｃＩＩおよびｅｘｏ-クレノー以外
の全増幅反応成分を混合して、該混合物を９５℃にて２
分間加熱して二本鎖標的ＤＮＡを変成した。３９℃に冷
却した後（３−５分）、ＨｉｎｃＩＩおよびｅｘｏ-ク
レノーポリメラーゼを添加して、混合物を３９℃におい
て２時間保ち、そして、増幅は９５℃において２分間加
熱することにより完了した。冷却後、上記ウオーカーら
により記載された32Ｐプライマー伸長合成法を用いて、
増幅された標的分子または対照分子のいずれかの存在に
関して各反応の３．８μｌアリコートを分析した。標的
の検出に関しては、上記ウオーカーらにより記載された
32Ｐ標識プローブを用いた。対照配列の検出に関して
は、以下のプローブを用いた：５’−32Ｐ−ＧＣＴＴＴ
ＧＣＴＡＧＴＴＧＣＣ−３’（配列番号：３）。プライ
マー伸長合成の成分はポリアクリルアミドゲル電気泳動
により分離し、そして標的または対照に特異的な伸長合
成バンドに相当するバンドをゲルから切り出し、32Ｐ放
射活性の減衰を液体シンチレーションカウンティングす
ることにより定量した。
の全増幅反応成分を混合して、該混合物を９５℃にて２
分間加熱して二本鎖標的ＤＮＡを変成した。３９℃に冷
却した後（３−５分）、ＨｉｎｃＩＩおよびｅｘｏ-ク
レノーポリメラーゼを添加して、混合物を３９℃におい
て２時間保ち、そして、増幅は９５℃において２分間加
熱することにより完了した。冷却後、上記ウオーカーら
により記載された32Ｐプライマー伸長合成法を用いて、
増幅された標的分子または対照分子のいずれかの存在に
関して各反応の３．８μｌアリコートを分析した。標的
の検出に関しては、上記ウオーカーらにより記載された
32Ｐ標識プローブを用いた。対照配列の検出に関して
は、以下のプローブを用いた：５’−32Ｐ−ＧＣＴＴＴ
ＧＣＴＡＧＴＴＧＣＣ−３’（配列番号：３）。プライ
マー伸長合成の成分はポリアクリルアミドゲル電気泳動
により分離し、そして標的または対照に特異的な伸長合
成バンドに相当するバンドをゲルから切り出し、32Ｐ放
射活性の減衰を液体シンチレーションカウンティングす
ることにより定量した。
【００２５】図１は、増幅前の混合物中に存在するＭｔ
ｂゲノムコピー数に対してプロットされた各バンドから
測定された放射活性を示す（カウント／分）。このプロ
ットは、広い（１０5倍）範囲の初期Ｍｔｂレベルにわ
たる、標的および対照配列の効果的共増幅を示す。さら
に、標的シグナル／対照シグナル比は増幅前のＭｔｂレ
ベルの全範囲に対して直線である。サンプル中に存在す
るＭｔｂのＤＮＡの増幅前のレベルは、（ｉ）既知量の
対照分子を増幅前にサンプルに加え、（ｉｉ）ＳＤＡ手
段により標的および対照配列を共増幅し、（ｉｉｉ）標
的／対照特異的シグナルレベルを測定し、そして（ｉ
ｖ）図１のＭｔｂゲノムのプロットに対する比（Ｒ）の
ような標準カーブを用いることにより、標的特異的／対
照特異的シグナルレベルの増幅後の比から増幅前の標的
レベルを査定することにより測定される。
ｂゲノムコピー数に対してプロットされた各バンドから
測定された放射活性を示す（カウント／分）。このプロ
ットは、広い（１０5倍）範囲の初期Ｍｔｂレベルにわ
たる、標的および対照配列の効果的共増幅を示す。さら
に、標的シグナル／対照シグナル比は増幅前のＭｔｂレ
ベルの全範囲に対して直線である。サンプル中に存在す
るＭｔｂのＤＮＡの増幅前のレベルは、（ｉ）既知量の
対照分子を増幅前にサンプルに加え、（ｉｉ）ＳＤＡ手
段により標的および対照配列を共増幅し、（ｉｉｉ）標
的／対照特異的シグナルレベルを測定し、そして（ｉ
ｖ）図１のＭｔｂゲノムのプロットに対する比（Ｒ）の
ような標準カーブを用いることにより、標的特異的／対
照特異的シグナルレベルの増幅後の比から増幅前の標的
レベルを査定することにより測定される。
【００２６】実施例２ 培養によりＭｔｂに関して陽性または陰性とされた患者
の痰の臨床サンプルを以下のとおりに処理した。痰サン
プルに対して、等体積の液体試薬（水酸化カリウム／Ｎ
−アセチルシステイン）を加えた。渦巻き撹拌により混
合物を簡単に混合し、４，０００×ｇにて１５分間遠心
分離した。上清をデカントし、そして沈殿物を２回、２
５ｍＭ ＫＰＯ4、ｐＨ７．６で洗浄した。これら洗浄
物からの沈殿物は同じバッファーで５００μｌにしてオ
ートクレーブした。オートクレーブされたサンプルは、
２５μｌの臨床サンプルを用いて、全５０μｌの標準Ｓ
ＤＡ反応において分析した。反応に含まれたのは１０，
０００分子の合成内部対照配列（配列番号：１）であっ
た。２時間３７℃において増幅後、９５℃に２分間加熱
することにより反応を停止し、そしてＩＳ６１１０（Ｍ
ｔｂ）からの産物および内部対照増幅の独立の検出のた
めに分離した。
の痰の臨床サンプルを以下のとおりに処理した。痰サン
プルに対して、等体積の液体試薬（水酸化カリウム／Ｎ
−アセチルシステイン）を加えた。渦巻き撹拌により混
合物を簡単に混合し、４，０００×ｇにて１５分間遠心
分離した。上清をデカントし、そして沈殿物を２回、２
５ｍＭ ＫＰＯ4、ｐＨ７．６で洗浄した。これら洗浄
物からの沈殿物は同じバッファーで５００μｌにしてオ
ートクレーブした。オートクレーブされたサンプルは、
２５μｌの臨床サンプルを用いて、全５０μｌの標準Ｓ
ＤＡ反応において分析した。反応に含まれたのは１０，
０００分子の合成内部対照配列（配列番号：１）であっ
た。２時間３７℃において増幅後、９５℃に２分間加熱
することにより反応を停止し、そしてＩＳ６１１０（Ｍ
ｔｂ）からの産物および内部対照増幅の独立の検出のた
めに分離した。
【００２７】増幅産物を化学発光分析において検出し
た。オリゴヌクレオチド取得プローブは、ＤＮＡ合成機
（モデル３８０Ｂ、Ａｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ
ｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）ＢＩＯＴＩＮ−Ｏ
Ｎホスホルアミダイト（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ
Ａｌｔｏ，ＣＡ）を用いて合成した。対照配列に関する
取得プローブ（配列番号：４）は５’−ＧＣＴＴＴＧＣ
ＴＡＧＴＴＧＣＣ−３’であり、Ｍｔｂ ＩＳ６１１０
標的配列番号に関する取得プローブ（配列番号：６）は
５’−ＣＣＴＧＡＡＡＧＡＣＧＴＴＡＴ−３’であっ
た。オリゴヌクレオチドは、逆相高速液体クロマトグラ
フィー（ＨＰＬＣ）（Ｂｒｏｗｎｌｅｅ Ｌａｂ Ａｑ
ｕａｐｏｒｅ ＲＰ３００カラム ２２０×４．６ｍ
ｍ、Ｃ８カラム、７粒子、３００Åポアサイズ）によ
り、２５４ｎｍにおけるＵＶモニターを用いて、バッフ
ァーＡ中の１４−４４％バッファーＢの勾配を用いて、
１時間（バッファーＢ：０．１Ｍトリエチルアミン−ア
セテート、ｐＨ７および５０％アセトニトリル；バッフ
ァーＡ：０．１Ｍトリエチルアミン−アセテート、ｐＨ
７）、流速１ｍｌ／分で精製した。
た。オリゴヌクレオチド取得プローブは、ＤＮＡ合成機
（モデル３８０Ｂ、Ａｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ
ｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）ＢＩＯＴＩＮ−Ｏ
Ｎホスホルアミダイト（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ
Ａｌｔｏ，ＣＡ）を用いて合成した。対照配列に関する
取得プローブ（配列番号：４）は５’−ＧＣＴＴＴＧＣ
ＴＡＧＴＴＧＣＣ−３’であり、Ｍｔｂ ＩＳ６１１０
標的配列番号に関する取得プローブ（配列番号：６）は
５’−ＣＣＴＧＡＡＡＧＡＣＧＴＴＡＴ−３’であっ
た。オリゴヌクレオチドは、逆相高速液体クロマトグラ
フィー（ＨＰＬＣ）（Ｂｒｏｗｎｌｅｅ Ｌａｂ Ａｑ
ｕａｐｏｒｅ ＲＰ３００カラム ２２０×４．６ｍ
ｍ、Ｃ８カラム、７粒子、３００Åポアサイズ）によ
り、２５４ｎｍにおけるＵＶモニターを用いて、バッフ
ァーＡ中の１４−４４％バッファーＢの勾配を用いて、
１時間（バッファーＢ：０．１Ｍトリエチルアミン−ア
セテート、ｐＨ７および５０％アセトニトリル；バッフ
ァーＡ：０．１Ｍトリエチルアミン−アセテート、ｐＨ
７）、流速１ｍｌ／分で精製した。
【００２８】オリゴヌクレオチド検出用プローブは、モ
デル３８０ＢＤＮＡ合成機および３’−アミノ−修飾Ｃ
３カラム（Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｓｔｅｒｌｉ
ｎｇ，ＶＡ）を用いて合成した。これにより、次にアル
カリホスファターゼに結合させるための３’アミノ末端
を有するオリゴヌクレオチドが生成された。対照配列に
関する検出用プローブ（配列番号：５）は５’−ＴＣＡ
ＧＡＣＡＴＣＧＴＣＧＣＴ−ａｌ2−ＡＰ−３’（ａｌ2
とはアミノ結合２である）であった。ＩＳ６１１０標的
配列番号に関する検出用プローブ（配列番号：７）は
５’−ＣＣＡＣＣＡＴＡＣＧＧＡＴＡＧＴ−ａｍ−ＡＰ
−３’（ａｍはアミノ修飾である）であった。子ウシ腸
アルカリホスファターゼ（ＡＰ）（ＥＩＡ ｇｒａｄ
ｅ，Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｉｎｄ
ｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＤ）は、一晩４℃において５０
ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ７．５）に対して透析し、凝
集物を除くために次に遠心分離した。４ｍｌの１０ｍｇ
／ｍｌ ＡＰを、Ｎ，Ｎ’−ジメチルホルムアミド（Ｄ
ＭＦ）（Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ）
に溶解した４０μｌの５０ｍＭサクシニミジル−４−
（ｐ−マレイミドフェニル）ブチレート（ＳＭＰＢ）
（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）と混合し、
そして、暗所で室温において３０分間反応させた。誘導
されたＡＰおよび過剰のＳＭＰＢは、ＮＡＰ−２５カラ
ム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）および５０ｍＭリン酸カリウ
ム（ｐＨ７．５）（脱気してＮ2でパージ）を用いて分
離した。ＮＡＰ−２５カラム画分の吸光は、２６０ｎｍ
および２８０ｎｍにおいて読み、そしてボイド体積のピ
ークを保存した。誘導されたアルカリホスファターゼの
濃度は、０ｍ７５ｍｌ／μｍｏｌｅ-1の吸光係数を用い
て２８０ｎｍにおける吸光により測定した。得られた誘
導化ＡＰは、誘導化オリゴデオキシヌクレオチドに結合
するまで、２時間未満氷上に置いた。
デル３８０ＢＤＮＡ合成機および３’−アミノ−修飾Ｃ
３カラム（Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｓｔｅｒｌｉ
ｎｇ，ＶＡ）を用いて合成した。これにより、次にアル
カリホスファターゼに結合させるための３’アミノ末端
を有するオリゴヌクレオチドが生成された。対照配列に
関する検出用プローブ（配列番号：５）は５’−ＴＣＡ
ＧＡＣＡＴＣＧＴＣＧＣＴ−ａｌ2−ＡＰ−３’（ａｌ2
とはアミノ結合２である）であった。ＩＳ６１１０標的
配列番号に関する検出用プローブ（配列番号：７）は
５’−ＣＣＡＣＣＡＴＡＣＧＧＡＴＡＧＴ−ａｍ−ＡＰ
−３’（ａｍはアミノ修飾である）であった。子ウシ腸
アルカリホスファターゼ（ＡＰ）（ＥＩＡ ｇｒａｄ
ｅ，Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｉｎｄ
ｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＤ）は、一晩４℃において５０
ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ７．５）に対して透析し、凝
集物を除くために次に遠心分離した。４ｍｌの１０ｍｇ
／ｍｌ ＡＰを、Ｎ，Ｎ’−ジメチルホルムアミド（Ｄ
ＭＦ）（Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ）
に溶解した４０μｌの５０ｍＭサクシニミジル−４−
（ｐ−マレイミドフェニル）ブチレート（ＳＭＰＢ）
（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）と混合し、
そして、暗所で室温において３０分間反応させた。誘導
されたＡＰおよび過剰のＳＭＰＢは、ＮＡＰ−２５カラ
ム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）および５０ｍＭリン酸カリウ
ム（ｐＨ７．５）（脱気してＮ2でパージ）を用いて分
離した。ＮＡＰ−２５カラム画分の吸光は、２６０ｎｍ
および２８０ｎｍにおいて読み、そしてボイド体積のピ
ークを保存した。誘導されたアルカリホスファターゼの
濃度は、０ｍ７５ｍｌ／μｍｏｌｅ-1の吸光係数を用い
て２８０ｎｍにおける吸光により測定した。得られた誘
導化ＡＰは、誘導化オリゴデオキシヌクレオチドに結合
するまで、２時間未満氷上に置いた。
【００２９】５０ｎｍｏｌｅのオリゴデオキシヌクレオ
チドを１３．４μｌの１Ｍリン酸カリウム（ｐＨ７．
２）で希釈し、そしてＤＭＦで希釈した２６．８μｌの
５０ｍＭ ｎ−サクシニミジル−３−（２−ピリジルヂ
チオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒ
ｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）と混合した。この混合物を暗所
で１時間、室温にてインキュベートした。ジチオスレイ
トール（ＤＴＴ）を５０ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ７．
５）で希釈して１Ｍの濃度にし、そして最終濃度０．１
Ｍになるまでオリゴデオキシヌクレオチド／ＤＭＦに加
え、そして室温にて１５分間インキュベートした。過剰
のＤＴＴおよびＳＰＤＰを誘導化オリゴデオキシヌクレ
オチドから分離したが、その際、ＮＡＰ−２５カラムを
用いて、５０ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ７．５）により
溶出した（脱気およびＮ2でパージ）。この誘導化オリ
ゴデオキシヌクレオチドは１６０ｎｍおよび１８０ｎｍ
における吸光により判断してボイド体積を溶出した。酸
化を避けるために還元されたオリゴデオキシヌクレオチ
ドを誘導化ＡＰと１０分以内反応させた。誘導化オリゴ
デオキシヌクレオチドおよび誘導化ＡＰは、室温におい
て１−４時間、次に４℃において一晩インキュベートし
た。５０ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ７．５）中の５０ｍ
Ｍベータ−メルカプトエタノールを１／１００倍の体積
用いてこの溶液をクエンチした。粗結合物を製造者の指
示にしたがって、ＣＥＮＴＲＩＰＲＥＰ３０（Ａｍｉｃ
ｏｎ）を用いて、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）で
約２ｍｌに濃縮した。粗結合物は、ＤＥＡＥ−５ＰＷカ
ラム（７．５ｍｍ×７．５ｃｍ）およびバッファーＡ中
の０〜６６％のバッファーＢの勾配を用いて、流速１ｍ
ｌ／分で、ＨＰＬＣにより精製した（バッファーＢ：２
０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１ＭＮａＣｌ（ｐＨ７．５）；バッ
ファーＡ：２０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５））。吸光
は２５４ｎｍにおいてモニターした。Ａ260およびＡ280
における吸光は、スペクトロフォトメーターを用いて測
定し、Ａ260／Ａ280＝１の画分を集めた。結合オリゴデ
オキシヌクレオチドの蛋白質濃度を測定した（ＢＣＡ
Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ，Ｐｉｅｒｃｅ，
Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）。
チドを１３．４μｌの１Ｍリン酸カリウム（ｐＨ７．
２）で希釈し、そしてＤＭＦで希釈した２６．８μｌの
５０ｍＭ ｎ−サクシニミジル−３−（２−ピリジルヂ
チオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒ
ｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）と混合した。この混合物を暗所
で１時間、室温にてインキュベートした。ジチオスレイ
トール（ＤＴＴ）を５０ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ７．
５）で希釈して１Ｍの濃度にし、そして最終濃度０．１
Ｍになるまでオリゴデオキシヌクレオチド／ＤＭＦに加
え、そして室温にて１５分間インキュベートした。過剰
のＤＴＴおよびＳＰＤＰを誘導化オリゴデオキシヌクレ
オチドから分離したが、その際、ＮＡＰ−２５カラムを
用いて、５０ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ７．５）により
溶出した（脱気およびＮ2でパージ）。この誘導化オリ
ゴデオキシヌクレオチドは１６０ｎｍおよび１８０ｎｍ
における吸光により判断してボイド体積を溶出した。酸
化を避けるために還元されたオリゴデオキシヌクレオチ
ドを誘導化ＡＰと１０分以内反応させた。誘導化オリゴ
デオキシヌクレオチドおよび誘導化ＡＰは、室温におい
て１−４時間、次に４℃において一晩インキュベートし
た。５０ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ７．５）中の５０ｍ
Ｍベータ−メルカプトエタノールを１／１００倍の体積
用いてこの溶液をクエンチした。粗結合物を製造者の指
示にしたがって、ＣＥＮＴＲＩＰＲＥＰ３０（Ａｍｉｃ
ｏｎ）を用いて、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）で
約２ｍｌに濃縮した。粗結合物は、ＤＥＡＥ−５ＰＷカ
ラム（７．５ｍｍ×７．５ｃｍ）およびバッファーＡ中
の０〜６６％のバッファーＢの勾配を用いて、流速１ｍ
ｌ／分で、ＨＰＬＣにより精製した（バッファーＢ：２
０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１ＭＮａＣｌ（ｐＨ７．５）；バッ
ファーＡ：２０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５））。吸光
は２５４ｎｍにおいてモニターした。Ａ260およびＡ280
における吸光は、スペクトロフォトメーターを用いて測
定し、Ａ260／Ａ280＝１の画分を集めた。結合オリゴデ
オキシヌクレオチドの蛋白質濃度を測定した（ＢＣＡ
Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ，Ｐｉｅｒｃｅ，
Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）。
【００３０】アルカリホスファターゼ（ＡＰ）検出用オ
リゴデオキシヌクレオチドプローブの活性は、以下のと
おりに測定した。結合物を、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣ
ｌ，１００ｍＭ ＮａＣｌ，１ｍＭ ＭｇＣｌ2，１ｍ
ｇ／ｍｌ ＢＳＡ（ｐＨ７．５）中で５μｇ／ｍｌに希
釈した。基質、４−ニトロフェニルリン酸（ｐＮＰ
Ｐ）、濃度５ｍＭ、を１Ｍジエタノールアミン、１ｍＭ
ＭｇＣｌ2（ｐＨ９．８）中に調製した。ＡＰの活性
は以下のとおりに２５℃において分析した。結合物（５
μｌ）をピペットで２ｍｌの基質溶液中に入れ、吸光の
変化を４０５ｎｍにおいてモニターした。初期速度は、
直線領域から計算し、そして反応速度は、４０５ｎｍに
おける産物ｐ−ニトロフェノールの吸光係数を１８５０
０Ｍ-1ｃｍ-1に等しいものとして用いて、計算した。Ａ
Ｐ検出用オリゴデオキシヌクレオチドの比活性は、μｍ
ｏｌｅ／分／ｍｇで計算した。ＡＰ検出用プローブは、
２０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５），１Ｍ ＮａＣｌ，
５０μｇ／ｍｌ音波処理サケ精子ＤＮＡ、０．０５％ア
ジ化ナトリウム中で２μＭに希釈し、以後４℃において
保存した。２０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５），１Ｍ
ＮａＣｌバッファーは、他の成分の添加前にオートクレ
ーブした。
リゴデオキシヌクレオチドプローブの活性は、以下のと
おりに測定した。結合物を、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣ
ｌ，１００ｍＭ ＮａＣｌ，１ｍＭ ＭｇＣｌ2，１ｍ
ｇ／ｍｌ ＢＳＡ（ｐＨ７．５）中で５μｇ／ｍｌに希
釈した。基質、４−ニトロフェニルリン酸（ｐＮＰ
Ｐ）、濃度５ｍＭ、を１Ｍジエタノールアミン、１ｍＭ
ＭｇＣｌ2（ｐＨ９．８）中に調製した。ＡＰの活性
は以下のとおりに２５℃において分析した。結合物（５
μｌ）をピペットで２ｍｌの基質溶液中に入れ、吸光の
変化を４０５ｎｍにおいてモニターした。初期速度は、
直線領域から計算し、そして反応速度は、４０５ｎｍに
おける産物ｐ−ニトロフェノールの吸光係数を１８５０
０Ｍ-1ｃｍ-1に等しいものとして用いて、計算した。Ａ
Ｐ検出用オリゴデオキシヌクレオチドの比活性は、μｍ
ｏｌｅ／分／ｍｇで計算した。ＡＰ検出用プローブは、
２０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５），１Ｍ ＮａＣｌ，
５０μｇ／ｍｌ音波処理サケ精子ＤＮＡ、０．０５％ア
ジ化ナトリウム中で２μＭに希釈し、以後４℃において
保存した。２０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５），１Ｍ
ＮａＣｌバッファーは、他の成分の添加前にオートクレ
ーブした。
【００３１】標的／プローブ複合体の取得に関する、コ
ートされたマイクロタイタープレートは以下のとおりに
調製した。ビオチン化ウシ血清アルブミン（ビオチン＊
ＢＳＡ）（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）を
０．３Ｍグリシン（ｐＨ９．６）中に５μｇ／ｍｌに希
釈し（オートクレーブされた水を用いて調製した）、そ
してＭＩＣＲＯＬＩＴＥＩプレート（Ｄｙｎａｔｅｃ
ｈ，Ｃｈａｎｔｉｌｌｙ，ＶＡ）の各ウエル（２００μ
ｌ／ウエル）にピペットで入れた。プレートは４℃にお
いて一晩インキュベートし、そしてオートクレーブされ
た水を用いて調製したＦＴＡ赤血球凝集バッファー（Ｂ
ｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ
ｏｇｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ）（ｐＨ７．２）を用いて２回
洗浄した（３７５μｌ／洗浄）。赤血球凝集バッファー
中のストレプトアビジン（５０μｇ／ｍｌ）（ＢＲＬ，
Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ）を、ビオチン＊ＢＳＡでコー
トされたマイクロタイターウエル（１００μｌ／ウエ
ル）に加えた。プレートをカバーし、そして１時間３７
℃においてインキュベートした。未結合ストレプトアビ
ジンは、倒置および手による撹拌により捨てた。ブロッ
キングバッファー（３００μｌ／ウエル）（赤血球凝集
バッファー（ｐＨ７．２）、０．０５％ ｗ／ｖウシ血
清アルブミン）を次に加えた。プレートをカバーし、そ
して３０分間３７℃においてインキュベートした。ブロ
ッキングバッファーは、倒置および手による撹拌により
捨てた。プレートは赤血球凝集バッファー（３７５μｌ
／ウエル）を用いて２回洗浄し、そして２％ ｗ／ｖト
レハロース（３７５μｌ／ウエル）（Ｆｌｕｋａ，Ｒｏ
ｎｋｏｎｋｏｍａ，ＮＹ）を含む赤血球凝集バッファー
で１回洗浄した。プレートを激しくたたいて手による操
作で乾燥し、そして≦０．５Ｔｏｒｒの真空下で２５℃
において約４時間乾燥し、乾燥剤を含むマイラーパウチ
（ｍｙｌａｒ ｐｏｕｃｈ）でシールし、そして使用前
に、室温において一晩保存した。以後、プレートは２−
８℃において保存した。
ートされたマイクロタイタープレートは以下のとおりに
調製した。ビオチン化ウシ血清アルブミン（ビオチン＊
ＢＳＡ）（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）を
０．３Ｍグリシン（ｐＨ９．６）中に５μｇ／ｍｌに希
釈し（オートクレーブされた水を用いて調製した）、そ
してＭＩＣＲＯＬＩＴＥＩプレート（Ｄｙｎａｔｅｃ
ｈ，Ｃｈａｎｔｉｌｌｙ，ＶＡ）の各ウエル（２００μ
ｌ／ウエル）にピペットで入れた。プレートは４℃にお
いて一晩インキュベートし、そしてオートクレーブされ
た水を用いて調製したＦＴＡ赤血球凝集バッファー（Ｂ
ｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ
ｏｇｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ）（ｐＨ７．２）を用いて２回
洗浄した（３７５μｌ／洗浄）。赤血球凝集バッファー
中のストレプトアビジン（５０μｇ／ｍｌ）（ＢＲＬ，
Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ）を、ビオチン＊ＢＳＡでコー
トされたマイクロタイターウエル（１００μｌ／ウエ
ル）に加えた。プレートをカバーし、そして１時間３７
℃においてインキュベートした。未結合ストレプトアビ
ジンは、倒置および手による撹拌により捨てた。ブロッ
キングバッファー（３００μｌ／ウエル）（赤血球凝集
バッファー（ｐＨ７．２）、０．０５％ ｗ／ｖウシ血
清アルブミン）を次に加えた。プレートをカバーし、そ
して３０分間３７℃においてインキュベートした。ブロ
ッキングバッファーは、倒置および手による撹拌により
捨てた。プレートは赤血球凝集バッファー（３７５μｌ
／ウエル）を用いて２回洗浄し、そして２％ ｗ／ｖト
レハロース（３７５μｌ／ウエル）（Ｆｌｕｋａ，Ｒｏ
ｎｋｏｎｋｏｍａ，ＮＹ）を含む赤血球凝集バッファー
で１回洗浄した。プレートを激しくたたいて手による操
作で乾燥し、そして≦０．５Ｔｏｒｒの真空下で２５℃
において約４時間乾燥し、乾燥剤を含むマイラーパウチ
（ｍｙｌａｒ ｐｏｕｃｈ）でシールし、そして使用前
に、室温において一晩保存した。以後、プレートは２−
８℃において保存した。
【００３２】微小遠心管中のＳＤＡ反応物（５０μｌ）
を５μｌの１ｍｇ／ｍｌキャリアーＤＮＡ（音波処理に
より裁断された）（サケ精子、Ｓｉｇｍａ，セントルイ
ス、ＭＯ）と混合した。サンプルを５分間９５℃におい
て加熱してＤＮＡを変成して室温にて５分間冷却した。
４５μｌのハイブリダイゼーション混合物（０．５Ｍリ
ン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）、０．１％ ｗ／ｖ ウ
シ血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ，セントルイス、Ｍ
Ｏ））、２ｐｍｏｌｅのビオチン化取得オリゴデオキシ
ヌクレオチドプローブ、および０．５−１ｐｍｏｌｅの
ＡＰ検出用オリゴデオキシヌクレオチドプローブを各サ
ンプルに加え、最終体積を１００μｌにした。サンプル
を５分間、３７℃においてインキュベートしてＤＮＡを
ハイブリダイズさせた。個々のサンプルを各マイクロタ
イタープレートウエルに加え、カバーし、そして３０分
間３７℃においてインキュベートした。３つのストリン
ジェンシーな洗浄（３００μｌ／ウエル）（１０ｍＭリ
ン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）、０．１％ ｗ／ｖ ウ
シ血清アルブミン、０．０５％ ｖ／ｖ ＮＯＮＩＤＥ
Ｔ ４０）を、室温において実施した。各洗浄は、マイ
クロタイターウエルに１分間放置して除去した。ＬＵＭ
ＩＰＨＯＳ５３０（１００μｌ）（Ｌｕｍｉｇｅｎ，Ｉ
ｎｃ．，デトロイト、ＭＩ）基質を加え、そしてプレー
トをカバーし、３０分間３７℃においてインキュベート
した。発光は相対光ユニット（Ｒｅｌａｔｉｖｅ Ｌｉ
ｇｈｔ Ｕｎｉｔｓ：ＲＬＵ）においてマイクロタイタ
ープレートルミノメーター（Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ，Ｒ
ｅｓｅａｒｃｈ ＴｒｉａｎｇｌｅＰａｒｋ，ＮＣ）上
で３７℃において２秒／ウエルインテグレーション時間
を用いて読んだ。
を５μｌの１ｍｇ／ｍｌキャリアーＤＮＡ（音波処理に
より裁断された）（サケ精子、Ｓｉｇｍａ，セントルイ
ス、ＭＯ）と混合した。サンプルを５分間９５℃におい
て加熱してＤＮＡを変成して室温にて５分間冷却した。
４５μｌのハイブリダイゼーション混合物（０．５Ｍリ
ン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）、０．１％ ｗ／ｖ ウ
シ血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ，セントルイス、Ｍ
Ｏ））、２ｐｍｏｌｅのビオチン化取得オリゴデオキシ
ヌクレオチドプローブ、および０．５−１ｐｍｏｌｅの
ＡＰ検出用オリゴデオキシヌクレオチドプローブを各サ
ンプルに加え、最終体積を１００μｌにした。サンプル
を５分間、３７℃においてインキュベートしてＤＮＡを
ハイブリダイズさせた。個々のサンプルを各マイクロタ
イタープレートウエルに加え、カバーし、そして３０分
間３７℃においてインキュベートした。３つのストリン
ジェンシーな洗浄（３００μｌ／ウエル）（１０ｍＭリ
ン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）、０．１％ ｗ／ｖ ウ
シ血清アルブミン、０．０５％ ｖ／ｖ ＮＯＮＩＤＥ
Ｔ ４０）を、室温において実施した。各洗浄は、マイ
クロタイターウエルに１分間放置して除去した。ＬＵＭ
ＩＰＨＯＳ５３０（１００μｌ）（Ｌｕｍｉｇｅｎ，Ｉ
ｎｃ．，デトロイト、ＭＩ）基質を加え、そしてプレー
トをカバーし、３０分間３７℃においてインキュベート
した。発光は相対光ユニット（Ｒｅｌａｔｉｖｅ Ｌｉ
ｇｈｔ Ｕｎｉｔｓ：ＲＬＵ）においてマイクロタイタ
ープレートルミノメーター（Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ，Ｒ
ｅｓｅａｒｃｈ ＴｒｉａｎｇｌｅＰａｒｋ，ＮＣ）上
で３７℃において２秒／ウエルインテグレーション時間
を用いて読んだ。
【００３３】図２のＡは、Ｍｔｂ（ＴＢ）および内部対
照（対照）増幅産物の両者に関して、６つの別々の臨床
的陰性サンプルのＲＬＵの結果を示す。ＲＬＵ ＴＢ軸
上の破線は、Ｍｔｂ標的配列が存在しなかった場合の標
準カーブからのＲＬＵを示す。この値（５０ＲＬＵ未
満）は、サンプルが陰性であると期待されるはずであ
る。ＲＬＵ対照軸上の破線は、増幅産物の阻害がない場
合の内部対照配列の値を示す。陰性サンプルのひとつの
み（Ｎ１）が、内部対照配列の増幅の阻害のないことを
示す。このサンプルからの対応するＴＢシグナルは標準
カーブから０以下であり、このことから、このサンプル
は真にＭｔｂに関して陰性であることを示唆する。残り
の各サンプル（特にＮ２，Ｎ４，Ｎ５およびＮ６）は、
内部対照の阻害並びに低いＴＢ値を示す。内部対照が存
在しない場合、これらのサンプルはＤＮＡプローブセッ
トｎｉｙｏｒｉＴＢ陰性であると誤って考えられるかも
しれない。即ち、この内部対照配列により、まちがった
陰性であることが避けられる。約９５％の臨床サンプル
がＴｂに関して陰性であるから、使用者に真の陰性を捨
てさせるためのこの内部対照の値は意義がある。
照（対照）増幅産物の両者に関して、６つの別々の臨床
的陰性サンプルのＲＬＵの結果を示す。ＲＬＵ ＴＢ軸
上の破線は、Ｍｔｂ標的配列が存在しなかった場合の標
準カーブからのＲＬＵを示す。この値（５０ＲＬＵ未
満）は、サンプルが陰性であると期待されるはずであ
る。ＲＬＵ対照軸上の破線は、増幅産物の阻害がない場
合の内部対照配列の値を示す。陰性サンプルのひとつの
み（Ｎ１）が、内部対照配列の増幅の阻害のないことを
示す。このサンプルからの対応するＴＢシグナルは標準
カーブから０以下であり、このことから、このサンプル
は真にＭｔｂに関して陰性であることを示唆する。残り
の各サンプル（特にＮ２，Ｎ４，Ｎ５およびＮ６）は、
内部対照の阻害並びに低いＴＢ値を示す。内部対照が存
在しない場合、これらのサンプルはＤＮＡプローブセッ
トｎｉｙｏｒｉＴＢ陰性であると誤って考えられるかも
しれない。即ち、この内部対照配列により、まちがった
陰性であることが避けられる。約９５％の臨床サンプル
がＴｂに関して陰性であるから、使用者に真の陰性を捨
てさせるためのこの内部対照の値は意義がある。
【００３４】図２のＢは、一連の陽性臨床サンプルに関
する結果を示す。それぞれのサンプルは内部対照増幅の
いくつかの阻害を示す。しかしながら、低いＲＬＵ（１
６００ＲＬＵ，Ｐ１）のサンプルに関するＴＢシグナル
でさえも、ゼロ値を上回り（約５０ＲＬＵ）、このこと
から、これらサンプルが陽性であることが迅速に確認さ
れる。
する結果を示す。それぞれのサンプルは内部対照増幅の
いくつかの阻害を示す。しかしながら、低いＲＬＵ（１
６００ＲＬＵ，Ｐ１）のサンプルに関するＴＢシグナル
でさえも、ゼロ値を上回り（約５０ＲＬＵ）、このこと
から、これらサンプルが陽性であることが迅速に確認さ
れる。
【００３５】図３は、図２のＡおよびＢにおけるサンプ
ルのＴＢ／対照シグナル比の使用により、増幅阻害の結
果を補償または補正することを示す。高いＴＢ／対照比
を有するサンプルは真に陽性であり、あおして、低い比
を有するサンプルは真に陰性である。陽性に関する適切
な最小比は、既知量の標的配列のシリーズ（標的配列を
含まない場合も）を一定量の対照配列と共に増幅するこ
とにより生じる標準曲線から測定される。この標準曲線
も、サンプル中に最初に存在した標的配列の量を定量す
るために用いられる。
ルのＴＢ／対照シグナル比の使用により、増幅阻害の結
果を補償または補正することを示す。高いＴＢ／対照比
を有するサンプルは真に陽性であり、あおして、低い比
を有するサンプルは真に陰性である。陽性に関する適切
な最小比は、既知量の標的配列のシリーズ（標的配列を
含まない場合も）を一定量の対照配列と共に増幅するこ
とにより生じる標準曲線から測定される。この標準曲線
も、サンプル中に最初に存在した標的配列の量を定量す
るために用いられる。
【００３６】実施例３ 内部対照配列を、さまざまなレベルのＭｔｂゲノミック
ＤＮＡと共増幅した。生成されたＭｔｂのＤＮＡ、０、
５、１０、２５または５０ゲノミックコピーのサンプル
を、２５，０００コピーの合成内部対照配列（配列番
号：１）と共に、ＳＤＡ反応により共増幅した。ＳＤＡ
に続き、上記のとおりに、化学発光により二通りに生成
物の検出を実施した。図４は、Ｍｔｂシグナルをバーで
示し、対応する反応に関する内部対照を黒丸で示す。特
別のチューブはわずかに高いかまたは低い内部対照レベ
ルを示したが、全体の流れとしては、標的配列に対する
対照配列の初期比にかかわらず、著しく一定している。
ＤＮＡと共増幅した。生成されたＭｔｂのＤＮＡ、０、
５、１０、２５または５０ゲノミックコピーのサンプル
を、２５，０００コピーの合成内部対照配列（配列番
号：１）と共に、ＳＤＡ反応により共増幅した。ＳＤＡ
に続き、上記のとおりに、化学発光により二通りに生成
物の検出を実施した。図４は、Ｍｔｂシグナルをバーで
示し、対応する反応に関する内部対照を黒丸で示す。特
別のチューブはわずかに高いかまたは低い内部対照レベ
ルを示したが、全体の流れとしては、標的配列に対する
対照配列の初期比にかかわらず、著しく一定している。
【００３７】
配列番号：１ 配列の長さ：５７ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列 ACTGAGATCC CCTAGCGACG ATGTCTGAGG CAACTAGCAA AGCTGGTCGA GTACGCC 57 配列番号：２ 配列の長さ：５２ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ 起源 生物名：マイコバクテリウムツベルクロシス（Ｍｙｃｏ
ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ） 配列 ACTGAGATCC CCTATCCGTA TGGTGGATAA CGTCTTTCAG GTCGAGTACG CC 52 配列番号：３ 配列の長さ：１５ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列 GCTTTGCTAG TTGCC 15 配列番号：４ 配列の長さ：１５ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の特徴 特徴を表す記号：ｍｉｓｃ ｆｅａｔｕｒｅ 存在位置：１ 他の情報：標準名＝５’ビオチン標識 ：記号＝５’−ＢＢＢ− 配列 GCTTTGCTAG TTGCC 15 配列番号：５ 配列の長さ：１５ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の特徴 特徴を表す記号：ｍｉｓｃ ｆｅａｔｕｒｅ 存在位置：１５ 他の情報：標準名＝３’アミノのアルカリホスファター
ゼへの結合 ：記号＝５’−ＢＢＢ− 配列 TCAGACATCG TCGCT 15 配列番号：６ 配列の長さ：１５ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の特徴 特徴を表す記号：ｍｉｓｃ ｆｅａｔｕｒｅ 存在位置：１ 他の情報：標準名＝５’ビオチン標識 ：記号＝５’−ＢＢＢ− 配列 CCTGAAAGAC GTTAT 15 配列番号：７ 配列の長さ：１６ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の特徴 特徴を表す記号：ｍｉｓｃ ｆｅａｔｕｒｅ 存在位置：１５ 他の情報：標準名＝３’アミノのアルカリホスファター
ゼへの結合 ：記号＝５’−ＢＢＢ− 配列 CCACCATACG GATAGT 16
ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ） 配列 ACTGAGATCC CCTATCCGTA TGGTGGATAA CGTCTTTCAG GTCGAGTACG CC 52 配列番号：３ 配列の長さ：１５ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列 GCTTTGCTAG TTGCC 15 配列番号：４ 配列の長さ：１５ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の特徴 特徴を表す記号：ｍｉｓｃ ｆｅａｔｕｒｅ 存在位置：１ 他の情報：標準名＝５’ビオチン標識 ：記号＝５’−ＢＢＢ− 配列 GCTTTGCTAG TTGCC 15 配列番号：５ 配列の長さ：１５ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の特徴 特徴を表す記号：ｍｉｓｃ ｆｅａｔｕｒｅ 存在位置：１５ 他の情報：標準名＝３’アミノのアルカリホスファター
ゼへの結合 ：記号＝５’−ＢＢＢ− 配列 TCAGACATCG TCGCT 15 配列番号：６ 配列の長さ：１５ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の特徴 特徴を表す記号：ｍｉｓｃ ｆｅａｔｕｒｅ 存在位置：１ 他の情報：標準名＝５’ビオチン標識 ：記号＝５’−ＢＢＢ− 配列 CCTGAAAGAC GTTAT 15 配列番号：７ 配列の長さ：１６ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の特徴 特徴を表す記号：ｍｉｓｃ ｆｅａｔｕｒｅ 存在位置：１５ 他の情報：標準名＝３’アミノのアルカリホスファター
ゼへの結合 ：記号＝５’−ＢＢＢ− 配列 CCACCATACG GATAGT 16
【００３８】
【００３９】
【図１】図１は、マイコバクテリウムツベルクロシス
（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉ
ｓ）の内部対照配列およびＩＳ６１１０配列断片の共増
幅を示す。
（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉ
ｓ）の内部対照配列およびＩＳ６１１０配列断片の共増
幅を示す。
【００４０】
【図２】図２は、増幅阻害を検出するため、および「間
違った陰性」を同定するために、臨床サンプルの恒温核
酸増幅において対照として内部対照配列を含む場合の利
点を示す。Ａは、培養により臨床的に陰性であったサン
プルの分析を示す。Ｂは、培養により臨床的に陽性であ
ったサンプルの分析を示す。
違った陰性」を同定するために、臨床サンプルの恒温核
酸増幅において対照として内部対照配列を含む場合の利
点を示す。Ａは、培養により臨床的に陰性であったサン
プルの分析を示す。Ｂは、培養により臨床的に陽性であ
ったサンプルの分析を示す。
【００４１】
【図３】図３は、臨床サンプルにおける増幅の阻害を修
正するための標的／対照配列比の使用を示し、結果の正
確な解釈の助けとなる。
正するための標的／対照配列比の使用を示し、結果の正
確な解釈の助けとなる。
【００４２】
【図４】図４は、さまざまな量の標的配列存在下におけ
る一定量の対照配列の増幅の一致性を示す。
る一定量の対照配列の増幅の一致性を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (73)特許権者 595117091 １ ＢＥＣＴＯＮ ＤＲＩＶＥ， ＦＲ ＡＮＫＬＩＮ ＬＡＫＥＳ， ＮＥＷ ＪＥＲＳＥＹ 07417−1880， ＵＮＩ ＴＥＤ ＳＴＡＴＥＳ ＯＦ ＡＭＥＲ ＩＣＡ (72)発明者 ジェームズ・ジー・ナドュー アメリカ合衆国ノース・カロライナ州 27514，チャペル・ヒル，コッカー・レ ーン 710 (72)発明者 マイケル・シー・リトル アメリカ合衆国ノース・カロライナ州 27610，ローリー，ウィンウェイ・ドラ イブ 1729 (56)参考文献 特表 平２−500565（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12Q 1/68
Claims (6)
- 【請求項１】（ａ）既知量の配列番号：１のヌクレオチ
ド配列を有する内部対照ヌクレオチド配列及び、もしも
存在するのならば配列番号：２のヌクレオチド配列を有
する標的ヌクレオチド配列を恒温増幅により共増幅し；
そして （ｂ）内部対照標的配列の増幅を検出することによりサ
ンプルの増幅効率を測定する； 工程を含む、上記サンプルの増幅効率を測定する方法。 - 【請求項２】増幅を化学発光分析により検出する、請求
項１に記載の方法。 - 【請求項３】標的配列の増幅が配列番号：７を有するプ
ローブにより検出され、そして内部対照配列の増幅が配
列番号：５を有するプローブにより検出される、請求項
１又は２に記載の方法。 - 【請求項４】（ａ）恒温核酸増幅反応において、増幅前
の量が既知の配列番号：１のヌクレオチド配列を有する
内部対照ヌクレオチド配列を、もしも存在するのならば
配列番号：２のヌクレオチド配列を有する標的ヌクレオ
チド配列と共増幅して、検出可能な量の後増幅対照配列
を生成し； （ｂ）前記対照配列の増幅後の量および、もし存在する
ならば前記標的配列の増幅後の量を測定し； （ｃ）前記標的配列の増幅後の量と前記対照配列の増幅
後の量の比を計算し；そして （ｄ）上記比、ならびに増幅前の内部対照配列の量を用
いて、増幅前の標的ヌクレオチドの量を計算する工程を
含む、サンプル中の標的ヌクレオチド配列の増幅前の量
を定量するための方法。 - 【請求項５】増幅を化学発光分析により検出する、請求
項４に記載の方法。 - 【請求項６】標的配列の増幅が配列番号：７を有するプ
ローブにより検出され、そして内部対照配列の増幅が配
列番号：５を有するプローブにより検出される、請求項
４又は５に記載の方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US08/058,648 US5457027A (en) | 1993-05-05 | 1993-05-05 | Internal controls for isothermal nucleic acid amplification reactions |
| US058648 | 1993-05-05 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH06343497A JPH06343497A (ja) | 1994-12-20 |
| JP3127079B2 true JP3127079B2 (ja) | 2001-01-22 |
Family
ID=22018080
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP06092181A Expired - Fee Related JP3127079B2 (ja) | 1993-05-05 | 1994-04-28 | 恒温核酸増幅反応に関する内部対照 |
Country Status (8)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US5457027A (ja) |
| EP (1) | EP0623682B1 (ja) |
| JP (1) | JP3127079B2 (ja) |
| AU (1) | AU675503B2 (ja) |
| CA (1) | CA2121658C (ja) |
| DE (1) | DE69420454T2 (ja) |
| ES (1) | ES2136137T3 (ja) |
| SG (1) | SG50707A1 (ja) |
Families Citing this family (46)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| ZA936015B (en) * | 1992-08-24 | 1994-03-10 | Akzo Nv | Elimination of false negatives in nuleic acid detection. |
| US5470723A (en) | 1993-05-05 | 1995-11-28 | Becton, Dickinson And Company | Detection of mycobacteria by multiplex nucleic acid amplification |
| US5457027A (en) * | 1993-05-05 | 1995-10-10 | Becton, Dickinson And Company | Internal controls for isothermal nucleic acid amplification reactions |
| AT401270B (de) * | 1994-09-26 | 1996-07-25 | Immuno Ag | Verfahren zur quantifizierung von genomischer dna |
| CA2223241C (en) * | 1995-06-07 | 2009-11-17 | Gen-Probe Incorporated | Methods and kits for determining pre-amplification levels of a nucleic acid target sequence from post-amplification levels of product |
| US5705365A (en) * | 1995-06-07 | 1998-01-06 | Gen-Probe Incorporated | Kits for determining pre-amplification levels of a nucleic acid target sequence from post-amplification levels of product |
| US5710029A (en) * | 1995-06-07 | 1998-01-20 | Gen-Probe Incorporated | Methods for determining pre-amplification levels of a nucleic acid target sequence from post-amplification levels of product |
| US5882867A (en) * | 1995-06-07 | 1999-03-16 | Dade Behring Marburg Gmbh | Detection of nucleic acids by formation of template-dependent product |
| US5736333A (en) * | 1996-06-04 | 1998-04-07 | The Perkin-Elmer Corporation | Passive internal references for the detection of nucleic acid amplification products |
| US6558901B1 (en) | 1997-05-02 | 2003-05-06 | Biomerieux Vitek | Nucleic acid assays |
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