JP3122166B2 - セクレチンレセプターをコードするｄｎａ、および該ｄｎａにコードされているポリペプチド - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、ラットセクレチンレセ
プターをコードするＤＮＡおよび該ＤＮＡにコードされ
ているポリペプチドに関する。

【０００２】

【従来技術】セクレチンは十二指腸粘膜から分泌される
代表的な消化管ホルモンの１つであり、膵臓からの炭酸
水素イオンの分泌刺激作用、カリウムイオンおよび酵素
を含んだすい液の分泌促進作用等を有することが知られ
ている（１）。セクレチンはまた、上記炭酸水素イオン
分泌刺激作用に基づいて、胃酸分泌抑制効果を有し、ま
た、肝機能検査や十二指腸潰瘍の治療剤に用いられてい
る。

【０００３】セクレチンは消化管ホルモンの１群である
セクレチン群[バソアクティブ・インテスティナル・ペ
プチド（ＶＩＰ）、グルカゴン等]に属する。同群のホ
ルモンは様々な組織、例えばすい臓、肝臓、心臓、腸、
腎臓、脳等に対して広範な薬理作用を有することが報告
されている（３、４、５）。上記セクレチン群のホルモ
ンの内、セクレチン、ＶＩＰおよびグルカゴンは、Ｇ−
プロティンと結合したレセプターとの相互作用を介して
アデニレートシクラーゼを活性化することが知られてい
た（２、３、６、７）。また、β−アドレナリン作働性
システムでは、レセプターとＧs（シクラーゼ刺激Ｇタ
ンパク質）とが結合することでレセプターのリガンドに
対する親和性が増大すると言われている（９）。

【０００４】

【発明が解決すべき課題】これらホルモンの作用機構を
理解し、種々の分野で有効に利用するためにはレセプタ
ーの生化学的特性の同定、ホルモン−レセプター相互作
用の解明は不可欠である。しかしながら、レセプターの
量が少ないために、単離、精製が困難であることから、
上記の研究は十分になされていない状況である。近年、
生理学的に活性な物質の調製方法として、ＤＮＡ組換え
技術が利用されるようになったが、セクレチンレセプタ
ーをこの方法で調製するには、該ペプチドをコードする
ＤＮＡを単離し、その構造を決定する必要がある。本発
明者らは、発現クローニング法（８）により、セクレチ
ン受容体cＤＮＡのクローニングに成功した。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明者らはセクレチン
レセプターを比較的多量に発現するラット−マウスハイ
ブリッドＮＧ１０８−１５細胞（６）からセクレチンレ
セプターのtotalＲＮＡを単離し、poly（Ａ）ＲＮＡを
選択して２本鎖ｃＤＮＡを得、Ｇタンパク質（Ｇs）の
αサブユニットＧs−αを過剰に発現するＣＯＳ細胞
（ＣＯＳＧs１）を用いる発現クローニング法でセクレ
チンレセプターをコードするｃＤＮＡクローンを同定し
た。¹²⁵Ｉラベルセクレチンによる選択で陽性のｐＱ１
７クローンを単離した。上記ｃＤＮＡライブラリーの調
製に用いたハイブリッド細胞はマウス神経芽細胞腫細胞
Ｎ１８ＴＧ２とラット神経膠腫細胞Ｃ６Ｂu−１細胞と
のハイブリッド細胞であるが、ポリメラーゼ鎖反応法
（ＰＣＲ法）で調べた結果、このクローンはラット細胞
に由来することが分かった。

【０００６】ｐＱ１７ｃＤＮＡを哺乳類発現ベクターｐ
ＥＦ−ＢＯＳ（１２）と一緒にトランスフェクション
（形質転換）したＣＯＳ細胞から調製した膜製品は¹²⁵
Ｉセクレチンと結合した。さらに、ｐＱ１７ｃＤＮＡを
ｐＥＦ−ＢＯＳ−Ｇsと一緒に形質転換したＣＯＳ細胞
は、セクレチンに対する親和性がさらに高められる（約
１０倍）ことが分かった。

【０００７】これらの事実は、本発明により、セクレチ
ンレセプターをコードするｃＤＮＡがクローニングされ
たこと、並びに該セクレチンレセプターのセクレチンと
の結合にはＧsαタンパク質が関与していることを示す
ものである。本発明のｃＤＮＡクローンｐＱ１７のヌク
レオチド配列および推定のアミノ酸配列は図１および図
２に示されている。

【０００８】ヌクレオチド配列およびアミノ酸配列の分
析の結果、成熟セクレチンレセプターは４２７アミノ酸
からなる分子量計算値４８，６９６のポリペプチドであ
ることが明らかになった。本発明のセクレチンレセプタ
ーをコードするＤＮＡのヌクレオチド配列およびアミノ
酸配列には以下の特徴がある。 １）他のＧs結合型レセプター（例、光レセプターロド
プシン）と同様、７個の膜貫通セグメントを有する（１
８）。 ２）しかし、他のＧs−結合レセプターとのアミノ酸配
列の類似性は殆ど無く、新規なレセプターである。 ３）膜貫通セグメントＩに先行する大きい細胞外領域
（１２１アミノ酸）があり、これらの領域はシステイン
残基に富み、セクレチンの結合に関与していると考えら
れる（２２）。 ４）ＶＩＰとの弱い交差反応性がある。 これはセクレチンレセプターをコードするＤＮＡを用い
てセクレチン群の他のホルモン類のレセプターの研究を
も行うことができることを示唆している。また、セクレ
チンレセプター群のホルモンの分子レベルでの機能およ
び制御機構の解明に役立つことが予想される。

【０００９】本発明により、セクレチンレセプターをコ
ードするｃＤＮＡがクローニングされ、そのヌクレオチ
ド配列が明らかになったので、適当な宿主系内で組換え
セクレチンレセプターを発現する発現ベクターを構築す
ることは当業者にとって通常の技術範囲である。次い
で、構築した発現ベクターで宿主細胞を形質転換し、得
られた形質転換体をセクレチンレセプターをコードする
ＤＮＡの発現に適した条件下で培養することにより、組
換えセクレチンレセプターを製造することができる。こ
のようにして得られた組換えセクレチンレセプターは、
セクレチン群のホルモンの作用機構の研究および臨床面
で有用である。

【００１０】当業者ならば、図１および図２に記載のセ
クレチンレセプターをコードするcＤＮＡのヌクレオチ
ド配列に、ヌクレオチドの挿入、置換または欠失を行う
ことにより、天然のセクレチンレセプターと同様の機能
を有する誘導体を導くことができるということを理解す
るであろう。従って、そのようにして導かれるＤＮＡも
本発明の範囲に包含されるものである。

【００１１】本発明のセクレチンレセプターをコードす
るＤＮＡを含有する発現ベクターは当業者既知の方法で
構築することができる。セクレチンレセプターＤＮＡの
発現に適したベクターは、該ＤＮＡの挿入部位の直ぐ上
流に転写開始のためのプロモーターを有するものであろ
う。適当なプロモーターも当該技術分野で既知であり、
宿主細胞内での機能特性に応じて選択することができ
る。例えば、Ｔ７ポリメラーゼのプロモーター、β−ガ
ラクトシダーゼなどの細菌プロモーターを用いて、細菌
内でセクレチンレセプターを発現させることができる。

【００１２】培養動物細胞でセクレチンレセプターを発
現させるには、その発現ベクター中に薬物耐性マーカー
のような選択可能マーカーが存在することが望ましい。
特に望ましいマーカーとしてネオマイシン耐性遺伝子を
挙げることができる。あるいは、セクレチンレセプター
をコードするＤＮＡを含有する発現ベクターと別個の抗
生物質等の薬物耐性をコードするプラスミドを用いて同
時に形質転換してもよい。

【００１３】発現ベクターを構築するには本発明のセク
レチンレセプターをコードするＤＮＡを適当なベクター
に挿入する。適当なベクターは、プロモーター、polyＡ
シグナル、選択マーカーその他の条件を考慮し、当該技
術分野で既知のものから選択する。本発明のcＤＮＡを
挿入し、培養細胞に導入してこのcＤＮＡを発現する目
的に用いることができるＤＮＡベクターとして、例えば
ＣＭＶのプロモーターを用いたＣＤＭ８、ヒトピプチド
鎖延長因子１のプロモーターを用いたpＥＦ−ＢＯＳ、
ＳＶ４０のプロモーターを用いたpＫＣＲ、ウシパピロ
ーマウィルス・ベクター等を挙げることができる。

【００１４】本発明のラットセクレチンレセプターの発
現に用い得る培養細胞は複製可能で図１および図２記載
のＤＮＡを発現し得るものであればよい。例えば、大腸
菌のような原核性微生物、Ｓ.セレビシエのような真核
性微生物、さらには哺乳類細胞が用いられる。組織培養
細胞にはトリ、または哺乳類細胞、例えばネズミ、ラッ
トおよびサル細胞が含まれる。適当な宿主細胞−ベクタ
ーシステムの選択および使用方法等は、当業者に既知で
あり、それらの内から本発明のセクレチンレセプターを
コードするcＤＮＡの発現に適した系を任意に選択する
ことができる。

【００１５】以下に実施例を挙げ、本発明をさらに詳し
く説明するが、これらの実施例は本発明を制限するもの
ではない。

【実施例】実施例１ ラットセレクチンレセプターｃＤ
ＮＡのクローニング （Ａ）ｃＤＮＡライブラリーの構築 ラット−マウスハイブリッド細胞ＮＧ１０８−１５から
サムブルックらの方法（２４）でtotalＲＮＡを調製
し、oligo(dT)-セルロースカラムクロマトグラフィーを
用いてpoly(A)ＲＮＡを選択した。ランダムヘキサマー
オリゴヌクレオチド（pdＮ₆)またはoligo(dT)でプライ
ムされた２本鎖ｃＤＮＡを、ＡＭＶ逆転写酵素ではなく
Ｍ−ＭＬＶＲＮaseＨ^-逆転写酵素（ＢＲＬ）を用いる外
は文献記載の方法と同様にして合成した（８）。ＢstＸ
Ｉアダプターを加えた後、１.０kb以上のｃＤＮＡをア
ガロースゲルから回収しＢstＸＩ消化ＣＤＭ８ベクター
（１０）に結合させ、Echerichia coli(大腸菌)ＭＣ１
０６１／ｐ３細胞に電気穿孔法で導入した。７５０〜
１，０００個の形質転換体からなる４００プールを得、
アルカリ溶解法（２４）で各プールからプラスミドＤＮ
Ａを調製した。

【００１６】（Ｂ） Ｇsタンパク質のαサブユニット
を過剰に発現するＣＯＳＧｓ１細胞の樹立 ラットＧsαのｃＤＮＡ（１１）をｐＥＦ−ＢＯＳのＳ
Ｖ４０レプリコン起源をコードする０.２５kbＨindIII
断片を欠失させたｐＤＥＦ−ＢＯＳのＸｂａＩ部位に挿
入して発現プラスミドｐＥＦＧｓ１を構築した。このプ
ラスミドをネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝
子をヒトＥＦ−１αプロモーターの制御下に含有するｐ
ＥＦｎｅｏと一緒に、りん酸カルシウム共沈法でＣＯＳ
細胞に導入した。１mg／mlのＧ−４１８を含有する培地
で１４日間選択した後、１個の形質転換体（ＣＯＳＧs
１）が合理的な量のＧsαを発現していることを、ウサ
ギ抗ラットＧsα抗体を用いるウエスタンブロッティン
グ法で同定した。

【００１７】（Ｃ）直接発現法によるセクレチンレセプ
ターｃＤＮＡのクローニング ＤＥＡＥデキストラン法により１.５ｘ１０⁵ＣＯＳＧs
１細胞を１.５μｇのプラスミドＤＮＡで形質転換し
た。６０時間後、細胞を１０mg／mlＢＳＡ、２mg／mlバ
シトラシン、および２０mＭ Ｈepes（ｐＨ７．４）含
有ＤＭＥＭ１ml中、３.０x１０⁵cpmの¹²⁵Ｉ−セクレチ
ンと一緒に３７℃で９０分間インキュベーションした。
細胞を０.５mgＭgＣl₂および０.７mＭ ＣａＣl₂を含有
するりん酸緩衝化食塩水（ＰＢＳ⁺）で４回洗浄し、２
％ＰＢＳ⁺中２％グルタルアルデヒドと一緒に室温で１
５分間、固定化した。ＰＢＳ⁺で１回洗浄したのち細胞
を風乾しプレートの垂直な壁を除いてＩＰプレート（Ｆ
uji BAS 2000システム；フジフィルム株式会社）に１８
時間暴露した。結合した¹²⁵Ｉ−セクレチンをフジＢＡ
Ｓ２０００Ｂio−イメージアナライザー（フジフィルム
株式会社）を用いるオートラジオグラフィーで観察し
た。陽性クローンをＳib選択に付して単一クローンｐＱ
１７を得た。

【００１８】実施例２ クローン化セクレチンレセプタ
ーの特性 （Ａ）プラスミドｐＱ１７により形質転換された細胞か
ら調製した細胞膜へのセクレチンの結合 １）形質転換細胞からの細胞膜の調製 １５cmのプレートで培養したＣＯＳ細胞をりん酸カルシ
ウム共沈法により、ｐＱ１７各１０μｇを、哺乳類発現
ベクターｐＥＦ−ＢＯＳ（１２）またはｐＥＦ−ＢＯＳ
−Ｇｓ（ラットＧｓαのｃＤＮＡを担持するｐＥＦ−Ｂ
ＯＳ）と一緒にトランスフェクション（形質転換）し
た。

【００１９】ＣＯＳ細胞またはＮＧ１０８−１５細胞か
ら、カタダら（２５）の方法（ただし全バッファーから
ＤＴＴを除去）に従って細胞膜を調製した。膜タンパク
質１２μｇを¹²⁵Ｉセクレチンと一緒に２５mＭ Ｈｅｐ
ｅｓ（ｐＨ７．４）、５mＭＭgＣl₂、１mＭ ＥＧＴ
Ａ，５０mＭ ＮaＣl、１０mg／mlＢＳＡ，２mg／mlバ
シトラシン、０.１mＭ（ｐ−アミノフェニル）メタンス
ルホニル・フルオリド塩酸塩および１００μｇ／mlのロ
イペプチンを含有する溶液１００μl中で３７℃におい
て９０分間インキュベーションした。１４，０００ｘｇ
で３分間遠心して反応を停止した。ペレットを氷冷ＢＳ
Ａ１mlに懸濁し、懸濁液をあらかじめ０.３％ポリエチ
レンアミンに室温で２５時間浸漬しておいたWhatman Ｇ
Ｆ／Ｃフィルターでろ過した。ろ紙上の放射能をガンマ
−カウンターで測定した。

【００２０】２）親和性の測定 ペプチド合成機（ＡＢＩ４３１）でブタセクレチン（２
７）を合成し、クロラミンＴ法でＮ−末端ヒスチジン残
基を標識し基本的にはChangおよびCheyの方法（２８）
に従って精製した。¹²⁵Ｉ−セクレチンの特異的な放射
活性は５００ー１０００Ｃｉ／mmolの範囲であった。他
のセクレチン群ホルモンは以下の通りである。合成ブタ
セクレチン_5-27断片はＢachem Fine Chemicals, Inc.,
から購入した。ＶＩＰおよびグルカゴンはPeptide Inst
itute Inc.から得た。

【００２１】¹²⁵Ｉ−セクレチンの膜タンパク質への非
特異的結合を求めるため、大過剰の非標識セクレチン
（１０μＭ）をアッセイ混合物に加え全結合から差し引
いて特異的結合を求めた。結合データの解析はＭacLiga
nd Program（２６）を用いて行った。結果を図４−７に
示す。

【００２２】図４：組換えセクレチンレセプターを発現
しているＣＯＳ細胞の細胞膜と¹²⁵Ｉセクレチンの結合
活性。図中、ｐＱ１７およびｐＥＦ−ＢＯＳで形質転換
された細胞（○）、ｐＱ１７およびｐＥＦ−ＢＯＳ−Ｇ
ｓで形質転換された細胞（□）を示すグラフである。 図５：ＮＧ１０８−１５細胞の膜と¹²⁵Ｉセクレチンの
結合活性を示すグラフである。

【００２３】図６：組換えセクレチンレセプターを発現
しているＣＯＳ細胞の細胞膜と¹²⁵Ｉセクレチンの結合
活性であって、ＣＯＳ細胞の細胞膜への¹²⁵Ｉセクレチ
ンの結合が、非標識セクレチン（○）、ＶＩＰ（□）、
セクレチン_5-27（●）およびグルカゴン（△）により競
合されることを示すグラフである。 図７：ＮＧ１０８−１５細胞の細胞膜への¹²⁵Ｉセクレ
チンの結合が、非標識セクレチン（○）、ＶＩＰ
（□）、セクレチン_5-27（●）およびグルカゴン（△）
により競合されることを示すグラフである。図４から見
掛けの解離定数０.５７および２０.１nMの２個の結合部
位の存在が認められる。これらの結合部位はＮＧ１０８
細胞の解離定数（０.４４および１４.５nM）と同様であ
る（図５）。

【００２４】ＣＯＳ細胞の膜における高親和性および低
親和性結合部位の濃度はタンパク質１mgあたり０.０２
２および１.２２pmolであった。一方、ｐＱ１７ｃＤＮ
ＡをｐＥＦ−ＢＯＳ−Ｇsと一緒に用いて形質転換した
ＣＯＳ細胞は、セクレチンに対する高親和性の結合部位
の濃度がさらに高められた（約１０倍）（０.２１pmol
／mg）が、低い親和性結合部位は変化しなかった（図
４）。これらの結果はセクレチンレセプターがＧｓαタ
ンパク質と会合してセクレチンに対する親和性の結合部
位を形成することを示すものである。

【００２５】また、図６は種々の非標識ペプチドの内、
セクレチンが¹²⁵Ｉセクレチンの形質転換されたＣＯＳ
細胞の細胞膜への結合において最も強い競合作用を有す
ることを示している。ＶＩＰおよびセクレチン_5-27の結
合阻害作用はセクレチンの約１０００／１である。グル
カゴンの阻害作用は極めて弱い。見掛けの５０％最大阻
害濃度（ＩＣ₅₀）はセクレチン４.５ｎＭ、ＶＩＰ４.５
μＭ、セクレチン_5-27９.５μＭであった。これらの値
はＮＧ１０８細胞の膜から得た値（図７）とよく一致す
る。

【００２６】（Ｂ）ＣＯＳ細胞によって発現されたクロ
ーン化セクレチンレセプターのアデニレートシクラーゼ
活性の刺激 Ｚhouら(２９）の方法に従って細胞内ｃＡＭＰ濃度を測
定した。ＣＯＳＧｓ１細胞を７５ｃｍ²のフラスコで培
養しＤＥＡＥデキストラン法で６μｇのｐＱ１７または
ＣＤＭ８で形質転換した。グリセリンショックの２４時
間後、細胞を６ウエルのマイクロタイタープレートに分
配し１０％ＦＣＳ補充ＤＭＥＭ培地で４０時間培養し
た。細胞をインキュベーションバッファー（１mg／mlＢ
ＳＡおよび０.５mＭ １ーメチルー３ーイソブチルキサ
ンチン（ＩＢＭＸ）含有ＤＭＥＭ）で２回洗浄した後、
様々な濃度のペプチドホルモン（セクレチン、ＶＩＰ、
またはグルカゴン）を含有するインキュベーションバッ
ファー中で３７℃において４５時間インキュベーション
した。バッファーを吸引除去した後エタノール１mlを加
えて反応を停止し、１.５mlのエッペンドルフ管に入れ
た。１４，０００ｘｇで３分間遠心したのち上清を乾燥
しｃＡＭＰ濃度をＡmersham社のｃＡＭＰアッセイシス
テムを用いて測定した。結果を図８に示す。図はラット
セクレチンレセプターを発現するＣＯＳＧｓ１細胞のｃ
ＡＭＰ蓄積に対するセクレチン（○）、ＶＩＰ（□）、
グルカゴン（△）の刺激作用に対する用量−応答曲線で
ある。対照実験ではＣＤＭ８で形質転換されたＣＯＳＧ
ｓ１細胞を１０μＭのセクレチン（●）、ＶＩＰ
（■）、グルカゴン（▲）で処理した。

【００２７】セクレチンはｐＱ１７で形質転換されたＣ
ＯＳＧｓ１細胞内でのｃＡＭＰ蓄積を刺激したが、形質
転換されないＣＯＳＧｓ１細胞はセクレチンの細胞内ｃ
ＡＭＰ蓄積刺激に応答しなかった。応答は用量依存性で
あり１／２最大応答 はセクレチン１ｎＭで得られ、Ｎ
Ｇ１０８細胞で得られた値と近似している。ＶＩＰはｐ
Ｑ１７形質転換細胞でのアデニレートシクラーゼ刺激作
用にアゴニストとして作用すると思われる。しかしＶＩ
Ｐの１／２最大応答はセクレチンの約６０倍の濃度が必
要であった。以上の結果は、ｐＱ１７ｃＤＮＡが機能的
なセクレチンレセプターをコードしていることを証明し
ている。

【００２８】（Ｃ）クローン化セクレチンレセプターｃ
ＤＮＡのヌクレオチド配列 セクレチンレセプターｃＤＮＡのヌクレオチド配列およ
び推定のアミノ酸配列は図１および２に示されている。
また、推定のアミノ酸配列のヒドロパシープロットをカ
イトらの方法（３０）で得た（図３参照）。これらの図
からセクレチンレセプターペプチドは１，７９６ヌクレ
オチド長さのＤＮＡにコードされており４４９アミノ酸
からなることが分かる。ヌクレオチド配列の分析によ
り、開始コドンはヌクレオチド２１３−２１５位にあ
り、ヒドロパシー分析の結果、Ｎ末端にシグナル配列を
有し、かつそれぞれ２０〜２４アミノ酸からなる７個の
膜貫通領域を有することが明らかになった。成熟セクレ
チンは２３位のアラニンをＮ末端とする４２７アミノ酸
ペプチドであって分子量は４８，６９６と計算された。
ラット消化腺や膵腺房から¹²⁵Ｉ−セクレチンとの化学
的架橋法（１６、１７）で算定された値より２〜１３Ｋ
Ｄａ少ないが、これはグリコシル化の相違によるもので
あろう。７個の膜貫通領域は光レセプターロドプシンな
どのＧ−タンパク質結合型レセプターと同様である。し
かし、セクレチンレセプターのアミノ酸配列は他のいず
れのＧ−タンパク質結合レセプターとも類似しないこと
から、本発明のセクレチンレセプターは７ー膜貫通領域
を有する新規なレセプターと考えられる。

【００２９】膜貫通領域１に隣接してシステインに富む
長い細胞外領域（１２１アミノ酸）があり、これはセク
レチンの結合部位と考えられる。ところで、ＮＧ１０８
−１５細胞はマウス神経芽細胞腫Ｎ１８ＴＧ２とラット
Ｃ６Ｂｕ１神経膠腫細胞のハイブリド細胞である。上記
のヌクレオチド配列に基づいて合成したオリゴヌクレオ
チド（順プライマーとしてヌクレオチド番号１，４７６
−１，４９５、逆プライマーとしてヌクレオチド番号
１，７０５−１，７２４）をプライマーとして用い、ラ
ットおよびマウスのゲノムＤＮＡをＰＣＲ法で解析し
た。ラットおよびマウスゲノムＤＮＡの増幅でそれぞれ
約２５０ヌクレオチドの単一バンドが認められた。そこ
で、これらＤＮＡフラグメントの部分ヌクレオチド配列
をｐＵＣ１１９にサブクローニングした後、決定した。
ラットゲノムＤＮＡから増幅したＤＮＡ断片はｐＱ１７
と完全に一致するヌクレオチド配列を有したがマウスゲ
ノムＤＮＡからのＤＮＡ断片はｐＱ１７と１７％の不一
致を示した。

【００３０】これらの結果は、ｐＱ１７ｃＤＮＡに対応
するセクレチンレセプターｍＲＮＡはＮＧ１０８ハイブ
リッド細胞のラットゲノム由来の遺伝子から転写された
ものであることを示し、本発明のセクレチンレセプター
ｃＤＮＡがラット由来であることが明らかになった。プ
ラスミドｐＱ１７で形質転換された形質転換体Ｅscheri
chia coli. ｐＱ１７は受託番号、微工研菌寄第１２２
８６号の下、通商産業省工業技術院微生物工業技術研究
所に寄託されている(受託日：平成３年６月３日)。

【００３１】（Ｄ） 組換えラットセクレチンレセプタ
ーペプチドの作用 セクレチンはすい臓、心臓、腸、腎臓、脳等に対して広
範な薬理作用を有することが報告されている。ｐＱ１７
ｃＤＮＡをプローブとして用いるノーザンハイブリダイ
ゼーションで様々なラット組織のtotalＲＮＡを分析し
た。その結果、約２.５kbにハイブリダイゼーションバ
ンドが認められた。セクレチンレセプターｍＲＮＡは心
臓に最も多量に発現されており、胃やすい臓には少なく
肺、肝臓および腎臓には検出されなかった。セクレチン
レセプターｍＲＮＡはハイブリッドＮＧ１０８−１５お
よびその親マウスＮ１８ＴＧ２細胞に検出されたが親ラ
ットＣ６神経膠腫細胞からは検出されなかった。この結
果は¹²⁵Ｉセクレチン結合に関する研究と一致する
（６）。しかるに、本発明のセクレチンレセプターｃＤ
ＮＡはハイブリッドＮＧ１０８−１５細胞のラットｍＲ
ＮＡ由来のｃＤＮＡであるという実験結果が得られてい
る（上記（Ｃ）参照）。従ってＣ６細胞からのセクレチ
ンレセプター遺伝子は、ラット−マウスハイブリッドＮ
Ｇ１０８−１５細胞内で転写活性化を受けていると考え
られる。

【００３２】

【効果】本発明によりラットセクレチンレセプターをコ
ードするＤＮＡのクローニングがなされたので、該ＤＮ
Ａを用いて例えばＤＮＡ組換え法により十分な量のセク
レチンレセプターを得ることができ、セクレチンおよび
セクレチン類似のホルモンの作用機構の解明に向けての
研究が容易になる。本発明の効果をさらに詳しく述べる
と以下の通りである。

【００３３】（１） セクレチンを種々の治療剤として
臨床応用するには、体内におけるセクレチンの定量法を
確立することが必須である。しかし、現在までのところ
セクレチンを特異的に簡便に定量する方法は知られてい
ない。本発明で単離され、構造の決定されたセクレチン
受容体はセクレチンと特異的に結合し、アデニルシクラ
ーゼを活性化する。このことは、セクレチン受容体cＤ
ＮＡを発現する培養細胞や、精製した組み換えセクレチ
ン受容体を用いて、セクレチンの簡便な定量法を確立で
きることを示している。

【００３４】（２） また、セクレチンには炭酸水素イ
オン分泌刺激作用、胃酸分泌抑制効果があり、臨床面で
もその有効性が検討されている。本発明で、このような
セクレチンの作用を媒介するセクレチン受容体cＤＮＡ
が単離され、その構造が明らかとなった。この受容体c
ＤＮＡを用いて、セクレチンの結合部位が明らかにな
り、セクレチンとその受容体の相互作用が解析されれ
ば、より強い活性をもつセクレチン誘導体の開発、セク
レチンとの拮抗的に作用し、セクレチンの作用を抑制す
るペプチドの開発などが容易となろう。

【００３５】（３） さらに、本発明で単離したセクレ
チン受容体には弱いながらもＶＩＰが結合し、アデニル
シクラーゼを活性化した。このことは、セクレチン受容
体とＶＩＰ受容体の構造が類似していることを示唆して
おり、セクレチンレセプターcＤＮＡを用いてＶＩＰな
ど他のセクレチン群のレセプターcＤＮＡを単離できる
ことを示している。そして、これらのレセプターはＶＩ
Ｐ、グルカゴンなどのセクレチンレセプター群のホルモ
ンの分子レベルでの機能および制御機構の解明に役立つ
であろう。

【００３６】以下に本明細書中で引用した文献を示す。 （１）バイリスら（Bayliss,W.M.) J.Physiol. 28: 253
-353 (1902) （２）ロッセリン（Rosselin, G.) Peptides 7, Suppl
1, 89-100 (1986) （３）クリストフェ(Christophe, J.)ら、 Peptides 5,
341-353(1984) （４）クリストフェ(Christophe,J.)ら、 J.Arc.Int.Ph
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【図面の簡単な説明】

【図１】 セクレチンレセプターｃＤＮＡのヌクレオチ
ド配列のＮ−末端側および推定のアミノ酸配列。

【図２】 セクレチンレセプターｃＤＮＡのヌクレオチ
ド配列のＣ−末端側および推定のアミノ酸配列。

【図３】 ラットセクレチンレセプターの推定のアミノ
酸配列のヒドロパシープロットを示すグラフ。

【図４】 プラスミドｐＱ１７により形質転換されたＣ
ＯＳ細胞から調製した膜とセクレチンとの親和性

【図５】 ＮＧ１０８−１５細胞膜と¹²⁵Ｉセクレチン
の結合活性を示すグラフ。

【図６】 ｐＱ１７で形質転換されたＣＯＳ細胞の膜と
¹²⁵Ｉセクレチンとの結合に対する他のホルモンの拮抗
作用を示すグラフ。

【図７】 ＮＧ１０８−１５細胞の膜と¹²⁵Ｉセクレチ
ンとの結合に対する他のホルモンの拮抗作用を示すグラ
フ。

【図８】 ラットセクレチンレセプターを発現するＣＯ
ＳＧｓ１細胞のｃＡＭＰ蓄積刺激作用へのセクレチン、
ＶＩＰ、グルカゴンの影響を示すグラフ。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ //(Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C12N 15/00 - 15/90 C07K 14/00 - 14/825 C12N 1/00 - 5/28 C12P 21/00 - 21/08 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ（Ｇ ＥＮＥＴＹＸ) ＭＥＤＬＩＮＥ（ＳＴＮ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (5)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 以下の（ａ）、（ｂ）または（ｃ）のポ
   リペプチドをコードするＤＮＡ: （ａ）図１および図２に記載のアミノ酸配列において、
   アミノ酸番号−２２〜４２７までの４４９アミノ酸から
   なるポリペプチド； （ｂ）図１および図２に記載のアミノ酸配列において、
   アミノ酸番号１〜４２７までの４２７アミノ酸からなる
   ポリペプチド； （ｃ）上記（ａ）および（ｂ）に記載の４４９または４
   ２７アミノ酸からなるアミノ酸配列において、１乃至数
   個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸
   配列からなり、かつラットセクレチンレセプター活性を
   有するポリペプチド。
2. 【請求項２】 請求項１記載のＤＮＡを含有する発現ベ
   クター。
3. 【請求項３】 請求項２記載の発現ベクターを含有する
   形質転換体。
4. 【請求項４】 請求項３記載の形質転換体を培地で培養
   することを特徴とするラットセクレチンレセプター活性
   を有するポリペプチドの製造方法。
5. 【請求項５】 以下の（ａ）、（ｂ）または（ｃ）で示
   され、ラットセクレチンレセプター活性を有する組換え
   ポリペプチド: （ａ）図１および図２に記載のアミノ酸配列において、
   アミノ酸番号−２２〜４２７までの４４９アミノ酸から
   なる組換えポリペプチド； （ｂ）図１および図２に記載のアミノ酸配列において、
   アミノ酸番号１〜４２７までの４２７アミノ酸からなる
   組換えポリペプチド； （ｃ）上記（ａ）および（ｂ）に記載の４４９または４
   ２７アミノ酸からなるアミノ酸配列において、１乃至数
   個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸
   配列からなり、かつラットセクレチンレセプター活性を
   有する組換えポリペプチド。