JPH04360688A - セクレチンレセプターをコードするｄｎａ、および該ｄｎａにコードされているポリペプチド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、ラットセクレチンレセ
プターをコードするＤＮＡおよび該ＤＮＡにコードされ
ているポリペプチドに関する。

【０００２】

【従来技術】セクレチンは十二指腸粘膜から分泌される
代表的な消化管ホルモンの１つであり、膵臓からの炭酸
水素イオンの分泌刺激作用、カリウムイオンおよび酵素
を含んだすい液の分泌促進作用等を有することが知られ
ている（１）。セクレチンはまた、上記炭酸水素イオン
分泌刺激作用に基づいて、胃酸分泌抑制効果を有し、ま
た、肝機能検査や十二指腸潰瘍の治療剤に用いられてい
る。

【０００３】セクレチンは消化管ホルモンの１群である
セクレチン群［バソアクティブ・インテスティナル・ペ
プチド（ＶＩＰ）、グルカゴン等］に属する。同群のホ
ルモンは様々な組織、例えばすい臓、肝臓、心臓、腸、
腎臓、脳等に対して広範な薬理作用を有することが報告
されている（３、４、５）。上記セクレチン群のホルモ
ンの内、セクレチン、ＶＩＰおよびグルカゴンは、Ｇ−
プロティンと結合したレセプターとの相互作用を介して
アデニレートシクラーゼを活性化することが知られてい
た（２、３、６、７）。また、β−アドレナリン作働性
システムでは、レセプターとＧｓ（シクラーゼ刺激Ｇタ
ンパク質）とが結合することでレセプターのリガンドに
対する親和性が増大すると言われている（９）。

【０００４】

【発明が解決すべき課題】これらホルモンの作用機構を
理解し、種々の分野で有効に利用するためにはレセプタ
ーの生化学的特性の同定、ホルモン−レセプター相互作
用の解明は不可欠である。しかしながら、レセプターの
量が少ないために、単離、精製が困難であることから、
上記の研究は十分になされていない状況である。近年、
生理学的に活性な物質の調製方法として、ＤＮＡ組換え
技術が利用されるようになったが、セクレチンレセプタ
ーをこの方法で調製するには、該ペプチドをコードする
ＤＮＡを単離し、その構造を決定する必要がある。本発
明者らは、発現クローニング法（８）により、セクレチ
ン受容体ｃＤＮＡのクローニングに成功した。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明者らはセクレチン
レセプターを比較的多量に発現するラット−マウスハイ
ブリッドＮＧ１０８−１５細胞（６）からセクレチンレ
セプターのｔｏｔａｌＲＮＡを単離し、ｐｏｌｙ（Ａ）
ＲＮＡを選択して２本鎖ｃＤＮＡを得、Ｇタンパク質（
Ｇｓ）のαサブユニットＧｓ−αを過剰に発現するＣＯ
Ｓ細胞（ＣＯＳＧｓ１）を用いる発現クローニング法で
セクレチンレセプターをコードするｃＤＮＡクローンを
同定した。１２５Ｉラベルセクレチンによる選択で陽性
のｐＱ１７クローンを単離した。上記ｃＤＮＡライブラ
リーの調製に用いたハイブリッド細胞はマウス神経芽細
胞腫細胞Ｎ１８ＴＧ２とラット神経膠腫細胞Ｃ６Ｂｕ−
１細胞とのハイブリッド細胞であるが、ポリメラーゼ鎖
反応法（ＰＣＲ法）で調べた結果、このクローンはラッ
ト細胞に由来することが分かった。

【０００６】ｐＱ１７ｃＤＮＡを哺乳類発現ベクターｐ
ＥＦ−ＢＯＳ（１２）と一緒にトランスフェクション（
形質転換）したＣＯＳ細胞から調製した膜製品は１２５
Ｉセクレチンと結合した。さらに、ｐＱ１７ｃＤＮＡを
ｐＥＦ−ＢＯＳ−Ｇｓと一緒に形質転換したＣＯＳ細胞
は、セクレチンに対する親和性がさらに高められる（約
１０倍）ことが分かった。

【０００７】これらの事実は、本発明により、セクレチ
ンレセプターをコードするｃＤＮＡがクローニングされ
たこと、並びに該セクレチンレセプターのセクレチンと
の結合にはＧｓαタンパク質が関与していることを示す
ものである。本発明のｃＤＮＡクローンｐＱ１７のヌク
レオチド配列および推定のアミノ酸配列は図１および図
２に示されている。

【０００８】ヌクレオチド配列およびアミノ酸配列の分
析の結果、成熟セクレチンレセプターは４２７アミノ酸
からなる分子量計算値４８，６９６のポリペプチドであ
ることが明らかになった。本発明のセクレチンレセプタ
ーをコードするＤＮＡのヌクレオチド配列およびアミノ
酸配列には以下の特徴がある。 １）他のＧｓ結合型レセプター（例、光レセプターロド
プシン）と同様、７個の膜貫通セグメントを有する（１
８）。 ２）しかし、他のＧｓ−結合レセプターとのアミノ酸配
列の類似性は殆ど無く、新規なレセプターである。 ３）膜貫通セグメントＩに先行する大きい細胞外領域（
１２１アミノ酸）があり、これらの領域はシステイン残
基に富み、セクレチンの結合に関与していると考えられ
る（２２）。 ４）ＶＩＰとの弱い交差反応性がある。 これはセクレチンレセプターをコードするＤＮＡを用い
てセクレチン群の他のホルモン類のレセプターの研究を
も行うことができることを示唆している。また、セクレ
チンレセプター群のホルモンの分子レベルでの機能およ
び制御機構の解明に役立つことが予想される。

【０００９】本発明により、セクレチンレセプターをコ
ードするｃＤＮＡがクローニングされ、そのヌクレオチ
ド配列が明らかになったので、適当な宿主系内で組換え
セクレチンレセプターを発現する発現ベクターを構築す
ることは当業者にとって通常の技術範囲である。次いで
、構築した発現ベクターで宿主細胞を形質転換し、得ら
れた形質転換体をセクレチンレセプターをコードするＤ
ＮＡの発現に適した条件下で培養することにより、組換
えセクレチンレセプターを製造することができる。この
ようにして得られた組換えセクレチンレセプターは、セ
クレチン群のホルモンの作用機構の研究および臨床面で
有用である。

【００１０】当業者ならば、図１に記載のセクレチンレ
セプターをコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列に、
ヌクレオチドの挿入、置換または欠失を行うことにより
、天然のセクレチンレセプターと同様の機能を有する誘
導体を導くことができるということを理解するであろう
。従って、そのようにして導かれるＤＮＡも本発明の範
囲に包含されるものである。

【００１１】本発明のセクレチンレセプターをコードす
るＤＮＡを含有する発現ベクターは当業者既知の方法で
構築することができる。セクレチンレセプターＤＮＡの
発現に適したベクターは、該ＤＮＡの挿入部位の直ぐ上
流に転写開始のためのプロモーターを有するものであろ
う。適当なプロモーターも当該技術分野で既知であり、
宿主細胞内での機能特性に応じて選択することができる
。例えば、Ｔ７ポリメラーゼのプロモーター、β−ガラ
クトシダーゼなどの細菌プロモーターを用いて、細菌内
でセクレチンレセプターを発現させることができる。

【００１２】培養動物細胞でセクレチンレセプターを発
現させるには、その発現ベクター中に薬物耐性マーカー
のような選択可能マーカーが存在することが望ましい。 特に望ましいマーカーとしてネオマイシン耐性遺伝子を
挙げることができる。あるいは、セクレチンレセプター
をコードするＤＮＡを含有する発現ベクターと別個の抗
生物質等の薬物耐性をコードするプラスミドを用いて同
時に形質転換してもよい。

【００１３】発現ベクターを構築するには本発明のセク
レチンレセプターをコードするＤＮＡを適当なベクター
に挿入する。適当なベクターは、プロモーター、ｐｏｌ
ｙＡシグナル、選択マーカーその他の条件を考慮し、当
該技術分野で既知のものから選択する。本発明のｃＤＮ
Ａを挿入し、培養細胞に導入してこのｃＤＮＡを発現す
る目的に用いることができるＤＮＡベクターとして、例
えばＣＭＶのプロモーターを用いたＣＤＭ８、ヒトピプ
チド鎖延長因子１のプロモーターを用いたｐＥＦ−ＢＯ
Ｓ、ＳＶ４０のプロモーターを用いたｐＫＣＲ、ウシパ
ピローマウィルス・ベクター等を挙げることができる。

【００１４】本発明のラットセクレチンレセプターの発
現に用い得る培養細胞は複製可能で第２図記載のＤＮＡ
を発現し得るものであればよい。例えば、大腸菌のよう
な原核性微生物、Ｓ．セレビシエのような真核性微生物
、さらには哺乳類細胞が用いられる。組織培養細胞には
トリ、または哺乳類細胞、例えばネズミ、ラットおよび
サル細胞が含まれる。適当な宿主細胞−ベクターシステ
ムの選択および使用方法等は、当業者に既知であり、そ
れらの内から本発明のセクレチンレセプターをコードす
るｃＤＮＡの発現に適した系を任意に選択することがで
きる。

【００１５】以下に実施例を挙げ、本発明をさらに詳し
く説明するが、これらの実施例は本発明を制限するもの
ではない。

【実施例】実施例１　　ラットセレクチンレセプターｃ
ＤＮＡのクローニング （Ａ）ｃＤＮＡライブラリーの構築 ラット−マウスハイブリッド細胞ＮＧ１０８−１５から
サムブルックらの方法（２４）でｔｏｔａｌＲＮＡを調
製し、ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）−セルロースカラムクロマト
グラフィーを用いてｐｏｌｙ（Ａ）ＲＮＡを選択した。 ランダムヘキサマーオリゴヌクレオチド（ｐｄＮ６）ま
たはｏｌｉｇｏ（ｄＴ）でプライムされた２本鎖ｃＤＮ
Ａを、ＡＭＶ逆転写酵素ではなくＭ−ＭＬＶＲＮａｓｅ
Ｈ−逆転写酵素（ＢＲＬ）を用いる外は文献記載の方法
と同様にして合成した（８）。ＢｓｔＸＩアダプターを
加えた後、１．０ｋｂ以上のｃＤＮＡをアガロースゲル
から回収しＢｓｔＸＩ消化ＣＤＭ８ベクター（１０）に
結合させ、Ｅｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ（大腸菌）
ＭＣ１０６１／ｐ３細胞に電気穿孔法で導入した。７５
０〜１，０００個の形質転換体からなる４００プールを
得、アルカリ溶解法（２４）で各プールからプラスミド
ＤＮＡを調製した。

【００１６】（Ｂ）　　Ｇｓタンパク質のαサブユニッ
トを過剰に発現するＣＯＳＧｓ１細胞の樹立ラットＧｓ
αのｃＤＮＡ（１１）をｐＥＦ−ＢＯＳのＳＶ４０レプ
リコン起源をコードする０．２５ｋｂＨｉｎｄＩＩＩ断
片を欠失させたｐＤＥＦ−ＢＯＳのＸｂａＩ部位に挿入
して発現プラスミドｐＥＦＧｓ１を構築した。このプラ
スミドをネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子
をヒトＥＦ−１αプロモーターの制御下に含有するｐＥ
Ｆｎｅｏと一緒に、りん酸カルシウム共沈法でＣＯＳ細
胞に導入した。１ｍｇ／ｍｌのＧ−４１８を含有する培
地で１４日間選択した後、１個の形質転換体（ＣＯＳＧ
ｓ１）が合理的な量のＧｓαを発現していることを、ウ
サギ抗ラットＧｓα抗体を用いるウエスタンブロッティ
ング法で同定した。

【００１７】（Ｃ）直接発現法によるセクレチンレセプ
ターｃＤＮＡのクローニング ＤＥＡＥデキストラン法により１．５ｘ１０５ＣＯＳＧ
ｓ１細胞を１．５μｇのプラスミドＤＮＡで形質転換し
た。６０時間後、細胞を１０ｍｇ／ｍｌＢＳＡ、２ｍｇ
／ｍｌバシトラシン、および２０ｍＭ　　Ｈｅｐｅｓ（
ｐＨ７．４）含有ＤＭＥＭ１ｍｌ中、３．０ｘ１０５ｃ
ｐｍの１２５Ｉ−セクレチンと一緒に３７℃で９０分間
インキュベーションした。 細胞を０．５ｍｇＭｇＣｌ２および０．７ｍＭ　　Ｃａ
Ｃｌ２を含有するりん酸緩衝化食塩水（ＰＢＳ＋）で４
回洗浄し、２％ＰＢＳ＋中２％グルタルアルデヒドと一
緒に室温で１５分間、固定化した。ＰＢＳ＋で１回洗浄
したのち細胞を風乾しプレートの垂直な壁を除いてＩＰ
プレート（Ｆｕｊｉ　ＢＡＳ　２０００システム；フジ
フィルム株式会社）に１８時間暴露した。結合した１２
５Ｉ−セクレチンをフジＢＡＳ２０００Ｂｉｏ−イメー
ジアナライザー（フジフィルム株式会社）を用いるオー
トラジオグラフィーで観察した。陽性クローンをＳｉｂ
選択に付して単一クローンｐＱ１７を得た。

【００１８】実施例２　　クローン化セクレチンレセプ
ターの特性 （Ａ）プラスミドｐＱ１７により形質転換された細胞か
ら調製した細胞膜へのセクレチンの結合１）形質転換細
胞からの細胞膜の調製 １５ｃｍのプレートで培養したＣＯＳ細胞をりん酸カル
シウム共沈法により、ｐＱ１７各１０μｇを、哺乳類発
現ベクターｐＥＦ−ＢＯＳ（１２）またはｐＥＦ−ＢＯ
Ｓ−Ｇｓ（ラットＧｓαのｃＤＮＡを担持するｐＥＦ−
ＢＯＳ）と一緒にトランスフェクション（形質転換）し
た。

【００１９】ＣＯＳ細胞またはＮＧ１０８−１５細胞か
ら、カタダら（２５）の方法（ただし全バッファーから
ＤＴＴを除去）に従って細胞膜を調製した。膜タンパク
質１２μｇを１２５Ｉセクレチンと一緒に２５ｍＭ　　
Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７．４）、５ｍＭＭｇＣｌ２、１ｍＭ
　　ＥＧＴＡ，５０ｍＭ　　ＮａＣｌ、１０ｍｇ／ｍｌ
ＢＳＡ，２ｍｇ／ｍｌバシトラシン、０．１ｍＭ（ｐ−
アミノフェニル）メタンスルホニル・フルオリド塩酸塩
および１００μｇ／ｍｌのロイペプチンを含有する溶液
１００μｌ中で３７℃において９０分間インキュベーシ
ョンした。１４，０００ｘｇで３分間遠心して反応を停
止した。ペレットを氷冷ＢＳＡ１ｍｌに懸濁し、懸濁液
をあらかじめ０．３％ポリエチレンアミンに室温で２５
時間浸漬しておいたＷｈａｔｍａｎ　ＧＦ／Ｃフィルタ
ーでろ過した。ろ紙上の放射能をガンマ−カウンターで
測定した。

【００２０】２）親和性の測定 ペプチド合成機（ＡＢＩ４３１）でブタセクレチン（２
７）を合成し、クロラミンＴ法でＮ−末端ヒスチジン残
基を標識し基本的にはＣｈａｎｇおよびＣｈｅｙの方法
（２８）に従って精製した。１２５Ｉ−セクレチンの特
異的な放射活性は５００ー１０００Ｃｉ／ｍｍｏｌの範
囲であった。他のセクレチン群ホルモンは以下の通りで
ある。合成ブタセクレチン５−２７断片はＢａｃｈｅｍ
　Ｆｉｎｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，　Ｉｎｃ．，から購
入した。ＶＩＰおよびグルカゴンはＰｅｐｔｉｄｅ　Ｉ
ｎｓｔｉｔｕｔｅ　Ｉｎｃ．から得た。

【００２１】１２５Ｉ−セクレチンの膜タンパク質への
非特異的結合を求めるため、大過剰の非標識セクレチン
（１０μＭ）をアッセイ混合物に加え全結合から差し引
いて特異的結合を求めた。結合データの解析はＭａｃＬ
ｉｇａｎｄ　Ｐｒｏｇｒａｍ（２６）を用いて行った。 結果を図４−７に示す。

【００２２】図４：組換えセクレチンレセプターを発現
しているＣＯＳ細胞の細胞膜と１２５Ｉセクレチンの結
合活性。図中、ｐＱ１７およびｐＥＦ−ＢＯＳで形質転
換された細胞（○）、ｐＱ１７およびｐＥＦ−ＢＯＳ−
Ｇｓで形質転換された細胞（□）を示すグラフである。 図５：ＮＧ１０８−１５細胞の膜と１２５Ｉセクレチン
の結合活性を示すグラフである。

【００２３】図６：組換えセクレチンレセプターを発現
しているＣＯＳ細胞の細胞膜と１２５Ｉセクレチンの結
合活性であって、ＣＯＳ細胞の細胞膜への１２５Ｉセク
レチンの結合が、非標識セクレチン（○）、ＶＩＰ（□
）、セクレチン５−２７（●）およびグルカゴン（△）
により競合されることを示すグラフである。 図７：ＮＧ１０８−１５細胞の細胞膜への１２５Ｉセク
レチンの結合が、非標識セクレチン（○）、ＶＩＰ（□
）、セクレチン５−２７（●）およびグルカゴン（△）
により競合されることを示すグラフである。図４から見
掛けの解離定数０．５７および２０．１ｎＭの２個の結
合部位の存在が認められる。これらの結合部位はＮＧ１
０８細胞の解離定数（０．４４および１４．５ｎＭ）と
同様である（図５）。

【００２４】ＣＯＳ細胞の膜における高親和性および低
親和性結合部位の濃度はタンパク質１ｍｇあたり０．０
２２および１．２２ｐｍｏｌであった。一方、ｐＱ１７
ｃＤＮＡをｐＥＦ−ＢＯＳ−Ｇｓと一緒に用いて形質転
換したＣＯＳ細胞は、セクレチンに対する高親和性の結
合部位の濃度がさらに高められた（約１０倍）（０．２
１ｐｍｏｌ／ｍｇ）が、低い親和性結合部位は変化しな
かった（図４）。これらの結果はセクレチンレセプター
がＧｓαタンパク質と会合してセクレチンに対する親和
性の結合部位を形成することを示すものである。

【００２５】また、図６は種々の非標識ペプチドの内、
セクレチンが１２５Ｉセクレチンの形質転換されたＣＯ
Ｓ細胞の細胞膜への結合において最も強い競合作用を有
することを示している。ＶＩＰおよびセクレチン５−２
７の結合阻害作用はセクレチンの約１０００／１である
。グルカゴンの阻害作用は極めて弱い。見掛けの５０％
最大阻害濃度（ＩＣ５０）はセクレチン４．５ｎＭ、Ｖ
ＩＰ４．５μＭ、セクレチン５−２７９．５μＭであっ
た。これらの値はＮＧ１０８細胞の膜から得た値（図７
）とよく一致する。

【００２６】（Ｂ）ＣＯＳ細胞によって発現されたクロ
ーン化セクレチンレセプターのアデニレートシクラーゼ
活性の刺激 Ｚｈｏｕら（２９）の方法に従って細胞内ｃＡＭＰ濃度
を測定した。ＣＯＳＧｓ１細胞を７５ｃｍ２のフラスコ
で培養しＤＥＡＥデキストラン法で６μｇのｐＱ１７ま
たはＣＤＭ８で形質転換した。グリセリンショックの２
４時間後、細胞を６ウエルのマイクロタイタープレート
に分配し１０％ＦＣＳ補充ＤＭＥＭ培地で４０時間培養
した。細胞をインキュベーションバッファー（１ｍｇ／
ｍｌＢＳＡおよび０．５ｍＭ　　１ーメチルー３ーイソ
ブチルキサンチン（ＩＢＭＸ）含有ＤＭＥＭ）で２回洗
浄した後、様々な濃度のペプチドホルモン（セクレチン
、ＶＩＰ、またはグルカゴン）を含有するインキュベー
ションバッファー中で３７℃において４５時間インキュ
ベーションした。バッファーを吸引除去した後エタノー
ル１ｍｌを加えて反応を停止し、１．５ｍｌのエッペン
ドルフ管に入れた。１４，０００ｘｇで３分間遠心した
のち上清を乾燥しｃＡＭＰ濃度をＡｍｅｒｓｈａｍ社の
ｃＡＭＰアッセイシステムを用いて測定した。結果を図
８に示す。図はラットセクレチンレセプターを発現する
ＣＯＳＧｓ１細胞のｃＡＭＰ蓄積に対するセクレチン（
○）、ＶＩＰ（□）、グルカゴン（△）の刺激作用に対
する用量−応答曲線である。対照実験ではＣＤＭ８で形
質転換されたＣＯＳＧｓ１細胞を１０μＭのセクレチン
（●）、ＶＩＰ（■）、グルカゴン（▲）で処理した。

【００２７】セクレチンはｐＱ１７で形質転換されたＣ
ＯＳＧｓ１細胞内でのｃＡＭＰ蓄積を刺激したが、形質
転換されないＣＯＳＧｓ１細胞はセクレチンの細胞内ｃ
ＡＭＰ蓄積刺激に応答しなかった。応答は用量依存性で
あり１／２最大応答　はセクレチン１ｎＭで得られ、Ｎ
Ｇ１０８細胞で得られた値と近似している。ＶＩＰはｐ
Ｑ１７形質転換細胞でのアデニレートシクラーゼ刺激作
用にアゴニストとして作用すると思われる。しかしＶＩ
Ｐの１／２最大応答はセクレチンの約６０倍の濃度が必
要であった。以上の結果は、ｐＱ１７ｃＤＮＡが機能的
なセクレチンレセプターをコードしていることを証明し
ている。

【００２８】（Ｃ）クローン化セクレチンレセプターｃ
ＤＮＡのヌクレオチド配列 セクレチンレセプターｃＤＮＡのヌクレオチド配列およ
び推定のアミノ酸配列は図１および２に示されている。 また、推定のアミノ酸配列のヒドロパシープロットをカ
イトらの方法（３０）で得た（図３参照）。これらの図
からセクレチンレセプターペプチドは１，７９６ヌクレ
オチド長さのＤＮＡにコードされており４４９アミノ酸
からなることが分かる。ヌクレオチド配列の分析により
、開始コドンはヌクレオチド２１３−２１５位にあり、
ヒドロパシー分析の結果、Ｎ末端にシグナル配列を有し
、かつそれぞれ２０〜２４アミノ酸からなる７個の膜貫
通領域を有することが明らかになった。成熟セクレチン
は２３位のアラニンをＮ末端とする４２７アミノ酸ペプ
チドであって分子量は４８，６９６と計算された。 ラット消化腺や膵腺房から１２５Ｉ−セクレチンとの化
学的架橋法（１６、１７）で算定された値より２〜１３
ＫＤａ少ないが、これはグリコシル化の相違によるもの
であろう。７個の膜貫通領域は光レセプターロドプシン
などのＧ−タンパク質結合型レセプターと同様である。 しかし、セクレチンレセプターのアミノ酸配列は他のい
ずれのＧ−タンパク質結合レセプターとも類似しないこ
とから、本発明のセクレチンレセプターは７ー膜貫通領
域を有する新規なレセプターと考えられる。

【００２９】膜貫通領域１に隣接してシステインに富む
長い細胞外領域（１２１アミノ酸）があり、これはセク
レチンの結合部位と考えられる。ところで、ＮＧ１０８
−１５細胞はマウス神経芽細胞腫Ｎ１８ＴＧ２とラット
Ｃ６Ｂｕ１神経膠腫細胞のハイブリド細胞である。上記
のヌクレオチド配列に基づいて合成したオリゴヌクレオ
チド（順プライマーとしてヌクレオチド番号１，４７６
−１，４９５、逆プライマーとしてヌクレオチド番号１
，７０５−１，７２４）をプライマーとして用い、ラッ
トおよびマウスのゲノムＤＮＡをＰＣＲ法で解析した。 ラットおよびマウスゲノムＤＮＡの増幅でそれぞれ約２
５０ヌクレオチドの単一バンドが認められた。そこで、
これらＤＮＡフラグメントの部分ヌクレオチド配列をｐ
ＵＣ１１９にサブクローニングした後、決定した。 ラットゲノムＤＮＡから増幅したＤＮＡ断片はｐＱ１７
と完全に一致するヌクレオチド配列を有したがマウスゲ
ノムＤＮＡからのＤＮＡ断片はｐＱ１７と１７％の不一
致を示した。

【００３０】これらの結果は、ｐＱ１７ｃＤＮＡに対応
するセクレチンレセプターｍＲＮＡはＮＧ１０８ハイブ
リッド細胞のラットゲノム由来の遺伝子から転写された
ものであることを示し、本発明のセクレチンレセプター
ｃＤＮＡがラット由来であることが明らかになった。プ
ラスミドｐＱ１７で形質転換された形質転換体Ｅｓｃｈ
ｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ．　ｐＱ１７は受託番号、微
工研菌寄第１２２８６号の下、通商産業省工業技術院微
生物工業技術研究所に寄託されている（受託日：平成３
年６月３日）。

【００３１】（Ｄ）　　組換えラットセクレチンレセプ
ターペプチドの作用 セクレチンはすい臓、心臓、腸、腎臓、脳等に対して広
範な薬理作用を有することが報告されている。ｐＱ１７
ｃＤＮＡをプローブとして用いるノーザンハイブリダイ
ゼーションで様々なラット組織のｔｏｔａｌＲＮＡを分
析した。その結果、約２．５ｋｂにハイブリダイゼーシ
ョンバンドが認められた。セクレチンレセプターｍＲＮ
Ａは心臓に最も多量に発現されており、胃やすい臓には
少なく肺、肝臓および腎臓には検出されなかった。セク
レチンレセプターｍＲＮＡはハイブリッドＮＧ１０８−
１５およびその親マウスＮ１８ＴＧ２細胞に検出された
が親ラットＣ６神経膠腫細胞からは検出されなかった。 この結果は１２５Ｉセクレチン結合に関する研究と一致
する（６）。しかるに、本発明のセクレチンレセプター
ｃＤＮＡはハイブリッドＮＧ１０８−１５細胞のラット
ｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡであるという実験結果が得られ
ている（上記（Ｃ）参照）。従ってＣ６細胞からのセク
レチンレセプター遺伝子は、ラット−マウスハイブリッ
ドＮＧ１０８−１５細胞内で転写活性化を受けていると
考えられる。

【００３２】

【効果】本発明によりラットセクレチンレセプターをコ
ードするＤＮＡのクローニングがなされたので、該ＤＮ
Ａを用いて例えばＤＮＡ組換え法により十分な量のセク
レチンレセプターを得ることができ、セクレチンおよび
セクレチン類似のホルモンの作用機構の解明に向けての
研究が容易になる。本発明の効果をさらに詳しく述べる
と以下の通りである。

【００３３】（１）　　セクレチンを種々の治療剤とし
て臨床応用するには、体内におけるセクレチンの定量法
を確立することが必須である。しかし、現在までのとこ
ろセクレチンを特異的に簡便に定量する方法は知られて
いない。本発明で単離され、構造の決定されたセクレチ
ン受容体はセクレチンと特異的に結合し、アデニルシク
ラーゼを活性化する。このことは、セクレチン受容体ｃ
ＤＮＡを発現する培養細胞や、精製した組み換えセクレ
チン受容体を用いて、セクレチンの簡便な定量法を確立
できることを示している。

【００３４】（２）　　また、セクレチンには炭酸水素
イオン分泌刺激作用、胃酸分泌抑制効果があり、臨床面
でもその有効性が検討されている。本発明で、このよう
なセクレチンの作用を媒介するセクレチン受容体ｃＤＮ
Ａが単離され、その構造が明らかとなった。この受容体
ｃＤＮＡを用いて、セクレチンの結合部位が明らかにな
り、セクレチンとその受容体の相互作用が解析されれば
、より強い活性をもつセクレチン誘導体の開発、セクレ
チンとの拮抗的に作用し、セクレチンの作用を抑制する
ペプチドの開発などが容易となろう。

【００３５】（３）　　さらに、本発明で単離したセク
レチン受容体には弱いながらもＶＩＰが結合し、アデニ
ルシクラーゼを活性化した。このことは、セクレチン受
容体とＶＩＰ受容体の構造が類似していることを示唆し
ており、セクレチンレセプターｃＤＮＡを用いてＶＩＰ
など他のセクレチン群のレセプターｃＤＮＡを単離でき
ることを示している。そして、これらのレセプターはＶ
ＩＰ、グルカゴンなどのセクレチンレセプター群のホル
モンの分子レベルでの機能および制御機構の解明に役立
つであろう。

【００３６】以下に本明細書中で引用した文献を示す。 （１）バイリスら（Ｂａｙｌｉｓｓ，Ｗ．Ｍ．）　Ｊ．
Ｐｈｙｓｉｏｌ．　２８：　２５３−３５３　（１９０
２） （２）ロッセリン（Ｒｏｓｓｅｌｉｎ，　Ｇ．）　Ｐｅ
ｐｔｉｄｅｓ　７，　Ｓｕｐｐｌ　１，　８９−１００
　（１９８６） （３）クリストフェ（Ｃｈｒｉｓｔｏｐｈｅ，　Ｊ．）
ら、　Ｐｅｐｔｉｄｅｓ　５，　３４１−３５３（１９
８４） （４）クリストフェ（Ｃｈｒｉｓｔｏｐｈｅ，Ｊ．）ら
、　　Ｊ．Ａｒｃ．Ｉｎｔ．Ｐｈａｒｍａｃｏｄｙｎ．
　３０３，　５１−６６（１９９０）（５）ピンカス（
Ｐｉｎｃｕｓ，Ｄ．Ｗ．）ら、　Ｎａｔｕｒｅ　３４３
，　５６３−１１５２　（１９９０） （６）ロス（Ｒｏｔｈ，Ｂ．Ｌ．）ら、　　Ｊ．Ｎｅｕ
ｒｏｃｈｅｍ．　４２，　１１４５−１１５２　（１９
８４） （７）ゲスパッハ（Ｇｅｓｐａｃｈ，Ｃ．）ら、　Ｐｅ
ｐｔｉｄｅｓ７、　Ｓｕｐｐｌ．　１，　１５５−１６
３（１９８６） （８）フクナガら（Ｆｕｋｕｎａｇａ，　Ｒ．）、　Ｃ
ｅｌｌ　６１，　３４１−３５０　（１９９０） （９）セリオネら（Ｃｅｒｉｏｎｅ，Ｒ．）、　Ｂｉｏ
ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　２３，　４５１９−４５２５　（
１９８４） （１０）シード（Ｓｅｅｄ，Ｂ．）、　Ｎａｔｕｒｅ　
３２９、　８４０ー８４２　（１９８７）

【００３７】（１１）イトウら（Ｉｔｏｈ，Ｈ．），　
Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳ
Ａ　８３，　３７７６−３７８０　（１９８６）（１２
）ミズシマら（Ｍｉｚｕｓｈｉｍａ，Ｓ）、　Ｎｕｃｌ
．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．　１８，　５３２２　（１９９
０） （１６）ベワブら（Ｂｅｗａｂ，Ｗ．）、　Ｌｉｆｅ　
Ｓｃｉ．　４２，　７９１−７９８　（１９８８） （１７）ゴッセンら（Ｇｏｓｓｅｎｎ，Ｄ．），　ＦＥ
ＢＥＳ　Ｌｅｔｔ．　２４３，　２０５−２０８　（１
９８９） （１８）オドワドら（Ｏ’Ｄｏｗｄ，Ｂ．Ｆ．）、　Ａ
ｎｎ．Ｒｅｖ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．　１２，　６７−８
３　（１９８９） （２２）ロベレヒトら（Ｒｏｂｅｒｅｃｈｔ，Ｊ．）、
　Ｊ．Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．　
７７３，　２７１−２７８　（１９８４）（２３）フレ
ミューら（Ｆｒｅｍｅａｕ　Ｊｒ．，Ｒ．Ｔ．）、　Ｊ
．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．　４６，　１９４７−１９５５
　（１９８６）（２４）サムブルックら（Ｓａｍｂｒｏ
ｏｋ，Ｊ．）、　ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：
　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｎｕａｌ，　２ｎ
ｄ　ｅｄｄｉｔｉｏｎ　（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈ
ａｂｏｒ，　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ：　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉ
ｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）（１９８
９）

【００３８】（２５）カタダら（Ｋａｔａｆａ，Ｔ．）
、　Ｊ．Ｂｉｏ．Ｃｈｅｍ．　２５７，　３７３９−３
７４６　（１９８２）（２６）ムンソンら（Ｍｕｎｓｏ
ｎ，Ｐ．Ｊ．）、　　Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．　１
０７，　２２０−２３９　（１９８０） （２７）ムットら（Ｍｕｔｔ，Ｖ．）、　Ｅｕｒ．Ｊ．
Ｂｉｏｃｈｅｍ．　１５，　５１３−５１９　（１９７
０） （２８）チャンら（Ｃｈａｎｇ，Ｔ．−Ｍ．）、　Ｄｉ
ｇ．Ｄｉｓ．Ｓｃｉ．２５，　５２９−５３２　（１９
８０） （２９）ゾウら（Ｚｈｏｕ，Ｑ．−Ｙ．）、　Ｎａｔｕ
ｒｅ　３４７，　７６−８０　（１９９０） （３０）カイトら（Ｋｙｔｅ，Ｔ．）、　Ｊ．Ｍｏｌ．
Ｂｉｏｌ．　１５７，１０５−１３２　（１９８２）

【図面の簡単な説明】

【図１】　　セクレチンレセプターｃＤＮＡのヌクレオ
チド配列のＮ−末端側および推定のアミノ酸配列。

【図２】　　セクレチンレセプターｃＤＮＡのヌクレオ
チド配列のＣ−末端側および推定のアミノ酸配列。

【図３】　　ラットセクレチンレセプターの推定のアミ
ノ酸配列のヒドロパシープロットを示すグラフ。

【図４】　　プラスミドｐＱ１７により形質転換された
ＣＯＳ細胞から調製した膜とセクレチンとの親和性

【図
５】　　ＮＧ１０８−１５細胞膜と１２５Ｉセクレチン
の結合活性を示すグラフ。

【図６】　　ｐＱ１７で形質転換されたＣＯＳ細胞の膜
と１２５Ｉセクレチンとの結合に対する他のホルモンの
拮抗作用を示すグラフ。

【図７】　　ＮＧ１０８−１５細胞の膜と１２５Ｉセク
レチンとの結合に対する他のホルモンの拮抗作用を示す
グラフ。

【図８】　　ラットセクレチンレセプターを発現するＣ
ＯＳＧｓ１細胞のｃＡＭＰ蓄積刺激作用へのセクレチン
、ＶＩＰ、グルカゴンの影響を示すグラフ。

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】　　ラットセクレチンレセプターをコード
   するＤＮＡ。
2. 【請求項２】　　ラットセクレチンレセプターが図１お
   よび図２のアミノ酸配列によって示されるものである請
   求項１のＤＮＡ。
3. 【請求項３】　　図１および図２のアミノ酸配列によっ
   て示されるラットセクレチンレセプターペプチド。