JP3058505B2 - １３ｃ標識化合物の製造方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、¹³Ｃ標識化合物の製造
方法に関し、詳しくは特定位置の炭素が¹³Ｃで特異的に
標識された¹³Ｃ標識化合物の製造方法に関する。

【０００２】

【従来の技術およびその課題】例えば、¹³Ｃ標識フルク
トース−６−リン酸の製造方法として、従来化学的合成
法が知られているが、フルクトースには４個の不斉炭素
があり、それによって１６種の光学異性体が存在するた
め位置特異的に標識したフルクトースを化学的に合成す
るには数多くの反応ステップが必要で、生産物の光学純
度は必ずしも高くない。

【０００３】特開昭６２−１３０６９２号公報には、¹³
ＣラベルＣ₁ 化合物を含む増殖炭素源を含有する栄養培
地中でメチロトローフ性微生物を培養することからな
る、同位体でラベルされた生化学製品の製造方法が開示
されている。

【０００４】特開昭６２−１３０６９２号公報には同化
性Ｃ_n 化合物と¹³ＣラベルＣ₁ 化合物とを含有する栄養
培地中でメチルトローフ性微生物を培養して、蓄積した
量の¹³ＣラベルＣ_n+1 縮合生成物を得ることからなる、
生物学的転化方法（ただしｎは２以上の整数を意味す
る）が開示されている。

【０００５】特開昭６２−１３０６９２号公報には、第
５頁右上欄第８行〜同第１２行において、『本明細書で
使用した「リブロース−リン酸経路」（ＲＭＰ）とは、
ホルムアルデヒド３分子が縮合してピルビン酸１分子
か、またはジヒドロキシアセトンリン酸１分子のいずれ
かを生成する生化学回路を意味する。』と記載されてい
る。

【０００６】特開昭６２−１３０６９２号公報には、第
７頁左下欄第１６行〜同右下欄第５行において、ヘキシ
ュロース−６−リン酸がヘキシュロースリン酸シンター
ゼの触媒作用による生成物であること、およびヘキシュ
ロース−６−リン酸はヘキシュロースリン酸イソメラー
ゼによりグルコース６−リン酸に転化されることについ
て教示されている。

【０００７】しかしながら、特開昭６２−１３０６９２
号公報には、特定の酵素系に¹³Ｃ標識メタノールあるい
は¹³Ｃ標識ホルムアルデヒドおよびリボース−５−リン
酸を添加反応させてＣ−１位が特異的に¹³Ｃで標識され
たフルクトース−６−リン酸あるいは、Ｃ−１位が特異
的に¹³Ｃで標識されたグルコース−６−リン酸が得られ
ることについては具体的な記載も、それを示唆する記載
もない。ちなみに、上記特開昭６２−１３０６９２号公
報に記載された方法は、¹³Ｃ−メタノールを栄養源とし
て、ユニホームのグルコースを製造する方法であって、
Ｃ−１位が特異的に標識されたものを得ることは不可能
である。

【０００８】特開昭６２−１３０６９２号公報には、実
施例において、¹³Ｃ−メタノールを増殖炭素源、すなわ
ち栄養源として使用して一定条件下に醗酵させて¹³Ｃ−
グルコースを主成分とするエキソ多糖を得ることができ
る旨記載されているが、ここに得られる¹³Ｃ−グルコー
スは¹³Ｃで均一に標識されたものであって、Ｃ−１位の
炭素が¹³Ｃで特異的に標識されたグルコースを得ること
は不可能である。

【０００９】特定位置の炭素が¹³Ｃで特異的に標識され
た¹³Ｃ標識化合物は、¹³Ｃで均一に標識されたもの、¹⁴
Ｃ標識化合物などに比較して、核磁気共鳴装置、質量分
析計などを用いて生物のエネルギー代謝系の研究を行な
う場合、より多くの定性的かつ定量的な有益な情報を得
ることが可能となり、生体反応の研究から医療分野へと
様々な分野で利用することが可能であって、その工業的
に有利な製造方法が要望されている。

【００１０】例えば、そのＣ−１位が特異的に¹³Ｃで標
識された¹³Ｃ標識フルクトース−６−リン酸または¹³Ｃ
標識グルコース−６−リン酸は、解糖系の代謝中間体で
もあり、生物のエネルギー代謝系の研究を行なう際に有
用であり、生体内でのフルクトース−６−リン酸または
グルコース−６−リン酸の変化の過程を質量分析計、核
磁気共鳴装置などを用いて追跡する際には、フルクトー
ス−６−リン酸またはグルコース−６−リン酸の特定位
置の炭素が¹³Ｃで特異的に標識されたものが望ましく、
その工業的に有利な製造方法が要望されている。

【００１１】本発明は、特定位置の炭素が特異的に¹³Ｃ
で標識された¹³Ｃ標識化合物、例えばＣ−１位が特異的
に¹³Ｃで標識された¹³Ｃ標識フルクトース−６−リン酸
または¹³Ｃ標識グルコース−６−リン酸の工業的に有利
な製造方法を提供することを目的としている。

【００１２】

【問題点を解決するための手段】本発明は第１に、ＥＣ
１群に属し、アルコール系¹³Ｃ標識炭素源化合物をアル
デヒド系¹³Ｃ標識炭素源化合物とするオキシダーゼ酵
素、好ましくはさらにカタラーゼおよび過酸化水素と、
ＥＣ４群に属し、炭素−炭素結合を合成できるリアーゼ
酵素と、ＥＣ５群に属し、反応基質を異性化できるイソ
メラーゼ酸素の少くとも１種とよりなる酵素系、¹³Ｃ標
識炭素源化合物および反応基質を反応させて特定位置の
炭素が¹³Ｃで特異的に標識された¹³Ｃ標識化合物を得る
ことを特徴とする¹³Ｃ標識化合物の製造方法を提供する
ものである。

【００１３】本発明は、第１の発明の好ましい態様とし
て、アルコールオキシダーゼ好ましくはさらにカタラー
ゼおよび過酸化水素と、ホスホリボイソメラーゼ、ヘキ
シュロースリン酸シンターゼおよびホスホヘキシュロイ
ソメラーゼよりなるメタノール資化性細菌のホルムアル
デヒド固定酵素系との存在下、¹³Ｃ標識メタノールおよ
びリボース−５−リン酸を反応させてＣ−１位が特異的
に¹³Ｃで標識されたフルクトース−６−リン酸を得るこ
とを特徴とする¹³Ｃ標識化合物の製造方法を提供するも
のである。

【００１４】本発明は、第１の発明の好ましいもう一つ
の態様として、アルコールオキシダーゼ好ましくはさら
にカタラーゼおよび過酸化水素と、ホスホリボイソメラ
ーゼ、ヘキシュロースリン酸シンターゼ、ホスホヘキシ
ュロイソメラーゼおよびホスホグルコイソメラーゼより
なるメタノール資化性細菌のホルムアルデヒド固定酸素
系との存在下、¹³Ｃ標識メタノールおよびリボース−５
−リン酸を反応させてＣ−１位が特異的に¹³Ｃで標識さ
れたグルコース−６−リン酸を得ることを特徴とする¹³
Ｃ標識化合物の製造方法を提供するものである。

【００１５】本発明は、第２に第１のイソメラーゼ酵素
を用いて反応基質を異性化し、異性化された反応基質
に、リアーゼ酵素の存在下、アルコール系¹³Ｃ標識炭素
源化合物をオキシダーゼ酵素、好ましくはさらにカタラ
ーゼおよび過酸化水素の存在下に反応させて得られるア
ルデヒド系¹³Ｃ標識炭素源化合物を添加・反応させて特
定位置の炭素が¹³Ｃで特異的に標識された中間体を得、
次いで第２のイソメラーゼ酵素を添加・反応させて特定
位置の炭素が¹³Ｃで標識された¹³Ｃ標識化合物を得るこ
とを特徴とする¹³Ｃ標識化合物の製造方法を提供するも
のである。

【００１６】本発明は、第２の発明の好ましい態様とし
て、リボース−５−リン酸をホスホリボイソメラーゼに
より異性化してリブロース−５−リン酸とし、次いでヘ
キシュロースリン酸シンターゼと¹³Ｃ標識メタノールを
アルコールオキシダーゼ好ましくはさらにカタラーゼお
よび過酸化水素の存在下に反応させて得られる¹³Ｃ標識
ホルムアルデヒドとを添加・反応させてＣ−１位が特異
的に¹³Ｃで標識された¹³Ｃ標識ヘキシュロース−６−リ
ン酸を生成させ、次いでホスホヘキシュロイソメラーゼ
により異性化してＣ−１位が特異的に¹³Ｃで標識された
フルクトース−６−リン酸を得ることを特徴とする¹³Ｃ
標識化合物の製造方法を提供するものである。

【００１７】本発明は、第３に、第１のイソメラーゼ酵
素を用いて反応基質を異性化し、異性化された反応基質
に、リアーゼ酵素の存在下、アルコール系¹³Ｃ標識炭素
源化合物をオキシダーゼ酵素、好ましくはさらにカタラ
ーゼおよび過酸化水素の存在下に反応させて得られるア
ルデヒド系¹³Ｃ標識炭素源化合物を添加・反応させて特
定位置の炭素が¹³Ｃで特異的に標識された第１中間体を
得、次いで第２のイソメラーゼ酵素を添加・反応させて
特定位置の炭素が¹³Ｃ標識された第２中間体を得、次い
で第３のイソメラーゼ酵素を添加・反応させて特定位置
の炭素が¹³Ｃで標識された¹³Ｃ標識化合物を得ることを
特徴とする¹³Ｃ標識化合物の製造方法を提供するもので
ある。

【００１８】本発明は、第３の発明の好ましい態様とし
て、リボース−５−リン酸をホスホリボイソメラーゼに
より異性化してリブロース−５−リン酸とし、次いでヘ
キシュロースリン酸シンターゼと¹³Ｃ標識メタノールを
アルコールオキシダーゼ好ましくはさらにカタラーゼお
よび過酸化水素の存在下に反応させて得られる¹³Ｃ標識
ホルムアルデヒドとを添加・反応させてＣ−１位が特異
的に¹³Ｃで標識された¹³Ｃ標識ヘキシュロース−６−リ
ン酸を生成させ、次いでホスホヘキシュロイソメラーゼ
により異性化してＣ−１位が特異的に¹³Ｃで標識された
フルクトース−６−リン酸を生成させ、次いでホスホグ
ルコイソメラーゼにより異性化してＣ−１位が特異的に
¹³Ｃで標識されたグルコース−６−リン酸を得ることを
特徴とする¹³Ｃ標識化合物の製造方法を提供するもので
ある。

【００１９】本発明は、第４に、ＥＣ４群に属し、炭素
−炭素結合を合成できるリアーゼ酵素と、ＥＣ５群に属
し、反応基質を異性化できるイソメラーゼ酸素の少くと
も１種とよりなる酵素系、アルデヒド系¹³Ｃ標識炭素源
化合物および反応基質を反応させて特定位置の炭素が¹³
Ｃで特異的に標識された¹³Ｃ標識化合物を得ることを特
徴とする¹³Ｃ標識化合物の製造方法を提供するものであ
る。

【００２０】本発明は、第４の本発明の好ましい態様と
して、ホスホリボイソメラーゼ、ヘキシュロースリン酸
シンターゼ、ホスホヘキシュロイソメラーゼおよびホス
ホグルコイソメラーゼよりなるメタノール資化性細菌の
ホルムアルデヒド固定酵素系、¹³Ｃ標識ホルムアルデヒ
ドおよびリボース−５−リン酸を反応させてＣ−１位が
特異的に¹³Ｃで標識されたグルコース−６−リン酸を得
ることを特徴とする¹³Ｃ標識化合物の製造方法を提供す
るものである。

【００２１】本発明は、第５に第１のイソメラーゼ酵素
を用いて反応基質を異性化し、異性化された反応基質に
アルデヒド系¹³Ｃ標識炭素源化合物を添加・反応させて
特定位置の炭素が¹³Ｃで特異的に標識された第１の中間
体を得、次いで第２のイソメラーゼ酵素を添加・反応さ
せて特定位置の炭素が¹³Ｃで特異的に標識された第２の
中間体を得、次いで第３のイソメラーゼ酵素を添加・反
応させて特定位置の炭素が¹³Ｃで特異的に標識された¹³
Ｃ標識化合物を得ることを特徴とする¹³Ｃ標識化合物の
製造方法を提供するものである。

【００２２】本発明は、第５の発明の好ましい態様とし
て、リボース−５−リン酸をホスホリボイソメラーゼに
より異性化してリブロース−５−リン酸とし、次いでヘ
キシュロースリン酸シンターゼおよび¹³Ｃ標識ホルムア
ルデヒドを添加・反応させてＣ−１位が特異的に¹³Ｃで
標識された¹³Ｃ標識ヘキシュロース−６−リン酸を生成
させ、次いでホスホヘキシュロイソメラーゼにより異性
化してＣ−１位が特異的に¹³Ｃで標識されたフルクトー
ス−６−リン酸を生成させ、次いでホスホグルコイソメ
ラーゼにより異性化してＣ−１位が特異的に¹³Ｃで標識
されたグルコース−６−リン酸を得ることを特徴とする
¹³Ｃ標識化合物の製造方法を提供するものである。

【００２３】本発明において、ＥＣ１群に属し、アルコ
ール系¹³Ｃ標識化合物をアルデヒド系¹³Ｃ標識化合物と
するオキシダーゼ酵素としては、例えば¹³Ｃ標識メタノ
ールを¹³Ｃ標識ホルムアルデヒドとなしうるものとし
て、アルコールデヒドロゲナーゼおよびアルコールオキ
シダーゼがあげられる。該オキシダーゼ酵素は、カタラ
ーゼおよび過酸化水素の共存下に使用するのが好まし
い。

【００２４】本発明において、ＥＣ４群に属し、炭素−
炭素結合を合成できるリアーゼ酵素の例として、ヘキシ
ュロースリン酸シンターゼ、ホスホリボシルアミノイミ
ダゾールカルボキシラーゼ、ホスホエノールビルビン酸
カルボキシキラーゼ、リブロースビスリン酸カルボキシ
ラーゼ、ケトテトロースリン酸アルドラーゼ、トレオニ
ンアルドラーゼ、フルクトースビスリン酸アルドラー
ゼ、ホスホ−２−ケト−３デオキシグルコネートアルド
ラーゼ、フクロースリン酸アルドラーゼ、２−ケト−３
−デオキシ−Ｌ−ペントネートアルドラーゼ、Ｌ−ラム
ニュロース−１−−リン酸アルドラーゼ、２−ケト−３
−デオキシ−Ｄ−グルカル酸アルドラーゼ、６−ホスホ
−２−ケト−３−デオキシ−ガラクトネートアルドラー
ゼ、フルクトース−６−リン酸ホスホケトラーゼ、３−
デオキシ−Ｄ−マンノ−オクチュロリン酸アルドラー
ゼ、フェニルセリンアルドラーゼ、２−ケト−３−デオ
キシ−Ｄ−ペントネートアルドラーゼ、ホスホ−５−ケ
ト−２−デオキシ−グルコネートアルドラーゼ、１７α
−ヒドロキシプロゲステロンアルドラーゼ、２−オキソ
−４−ヒドロキシグルタル酸アルドラーゼ、トリメチル
アミン−オキシドアルドラーゼ、イソクエン酸リアー
ゼ、マレートシンセターゼ、Ｎ−アセチルノイラミン酸
リアーゼ、クエン酸リアーゼ、クエン酸シンテターゼ、
３−ヒドロキシアスパレートアルドラーゼ、４−ヒドロ
キシ−２−オキソグルタレートアルドラーゼ、Ｎ−アセ
チルノイラミネートシンターゼ、マリールＣｏＡリアー
ゼ、３−ヒドロキシ−３−イソヘキセニルグルタリル−
ＣｏＡリアーゼ、メチル酢酸シンターゼ、デオキシリポ
ジプリミジンホトリアーゼ、フマル酸ヒドラターゼ、カ
ーボネイトジヒドラターゼ、アコニット酸ヒドラター
ゼ、シスタチオニン−β−シンターゼ、ラクトイルグル
タチオンリアーゼなどがあげられるが、これらのうち増
炭反応による¹³Ｃ標識化合物の合成の場合には、反応基
質の一方が¹³Ｃ標識炭素源として容易に合成できる点
で、ヘキシュロースリン酸シンターゼ、リプロースビス
リン酸カルボキシラーゼ、ケトテトロースリン酸アルド
ラーゼ、フルクトースビスリン酸アルドラーゼ、フクロ
ースリン酸アルドラーゼ、２−ケト−３−デオキシ−Ｄ
−グルカル酸アルドラーゼ、６−ホスホ−２−ケト−３
−デオキシ−ガラクトネートアルドラーゼ、３−デオキ
シ−Ｄ−マンノ−オクチュロリン酸アルドラーゼ、ホス
ホ−５−ケト−２−デオキシ−グルコネートアルドラー
ゼ、２−オキソ−４−ヒドロキシグルタル酸アルドラー
ゼなどが好ましい。

【００２５】本発明において、ＥＣ群５に属し、反応基
質を異性化できるイソメラーゼ酵素の例として、ホスホ
ヘキシュロイソメラーゼ、ホスホリボイソメラーゼ、マ
レートイソメラーゼ、マレイルアセトールアセテートイ
ソメラーゼ、レチナールイソメラーゼ、マレイルピルベ
ートイソメラーゼ、リノレートイソメラーゼ、フリルフ
ラミドイソメラーゼ、トリオスホスフェイトイソメラー
ゼ、アラビノースイソメラーゼ、キシロースイソメラー
ゼ、マンノースイソメラーゼ、マンノースリン酸イソメ
ラーゼ、グルコサミンリン酸イソメラーゼ、グルクロン
酸イソメラーゼ、アラビノースリン酸イソメラーゼ、ラ
ムノースイソメラーゼ、リキソースケトールイソメラー
ゼ、ステロイドイソメラーゼ、イソペンテニルジリン酸
イソメラーゼ、プロスタグランジンイソメラーゼ、プロ
テインジサルファイジイソメラーゼ、ハイドロパーオキ
サイドイソメラーゼ、リブロースリン酸３−エピメラー
ゼ、ＵＤＰグルコース４−エピメラーゼ、アルドース１
−エピメラーゼ、Ｌ−リブロースリン酸４−エピメラー
ゼ、ＵＤＰアラビノース４−エピメラーゼ、ＵＤＰグル
クロン酸４−エピメラーゼ、ＵＤＰアセチルグルコサミ
ン４−エピメラーゼ、アシルグルコサミン２−エピメラ
ーゼ、ホスホグルコイソメラーゼなどがあげられるが、
異性化反応による糖の作製の場合には、反応基質への特
異性の点で、ホスホヘキシュロイソメラーゼ、ホスホリ
ボイソメラーゼ、アラビノースイソメラーゼ、キシロー
スイソメラーゼ、マンノースイソメラーゼ、マンノース
リン酸イソメラーゼ、ホスホグルコイソメラーゼなどが
好ましい。

【００２６】本発明方法に用いられるメタノール資化性
細菌のホルムアルデヒド固定酵素系は、好ましくはホス
ホリボイソメラーゼ、ヘキシュロースリン酸シンターゼ
およびホスホヘキシュロイソメラーゼより構成される
か、あるいはさらにホスホグルコイソメラーゼを包含す
る。

【００２７】本発明方法で用いられるホスホリボイソメ
ラーゼは、リボース−５−リン酸をリブロース−５−リ
ン酸に転換させる酵素であって、例えばシグマ社製の市
販品などを用いることができる。

【００２８】本発明方法で用いられるヘキシュロースリ
ン酸シンターゼは、リブロース−５−リン酸と¹³Ｃ標識
ホルムアルデヒドとを反応させてＣ−１位が¹³Ｃで標識
されたヘキシュロース−６−リン酸を生成せしめる酵素
であって、例えば、偏性メタノール資化性細菌、メチロ
モナス・アミノファシエンス ７７ａ（ Methylomonas
aminofaciens ７７ａ）（微工研菌寄第１２０１９
号）、メチロコッカス・カプサラタス（ Methylococcus
capsulatus）（ＡＴＣＣ菌寄第１９０６９号）などの微
生物をメタノールまたはメタンなどを用いて培養し、各
種クロマトグラフィーを利用して単離することにより得
られる。該ヘキシュロースリン酸シンターゼを有する微
生物の他の例として、メチロモナス・メタニカ（Methyl
omonas methanica）、メチロモナス・アギレおよびメチ
ロモナス・ロサセウス（Methylomonas agileおよび M.
rosaceous)、メチロモナス・ルブラム（Methylomonas r
ubrum ）、メチロモナスＧＢ３およびＧＢ８（Methylom
onas ＧＢ３およびＧＢ８）、メチロコッカス・ミニマ
ス（Methylococcus minimus ）、メチロコッカス・ウク
ライニクスおよびメチロコッカス・サーモフィラス（Me
thylococcus ucrainicusおよびM. thermophilus ）、メ
チロバクター・カプサラタス（Methylobacter capsulat
us）、メチロバクター・ボビスおよびメチロバクター・
ビネランディー（Methylobacter bovis およびM.vinela
ndii）、メチロバクター・クロコカム（Methylobacter
chroococcum ）、シュードモナスＷ１（Pseudomonas Ｗ
１）、オーガニズム４Ｂ６（Organism４Ｂ６）、シュー
ドモナスＣ（Pseudomonas Ｃ）、シュードモナスＷ６
（Pseudomonas Ｗ６）、オーガニズムＣ２Ａ１（Organi
smＣ２Ａ１）、オーガニズムＷ３Ａ１およびＷ６Ａ（Or
ganisms Ｗ３Ａ１およびＷ６Ａ）、メチロモナスＭ１５
（MethylomonasＭ１５）、メチロフィラス・メチロトロ
ファス（Methylophilus methylotrophus）、オーガニズ
ムＬ３（OrganismＬ３）、アースロバクター（Arthroba
cter）、バシラスｓｐ．ＰＭ６およびＳ２Ａ１（Bacill
us sp.ＰＭ６およびＳ２Ａ１）、アースロバクター・グ
ロビホルミス（Arthrobacter globiformis）、ストレプ
トミセスｓｐ．２３９（Streptomyces sp.２３９）、シ
ュードモナス・オレオボランス（Pseudomonas oleovora
ns）、オーガニズムＭＢ５３，５５，５６，５７，５
８，５９および６０（Organisms ＭＢ５３，５５，５
６，５７，５８，５９および６０）、ブレビバクテリウ
ム・フスカム２４（Brevibacterium fuscum ２４）、マ
イコバクテリウム・バカエ１０（Mycobacterium vaccae
１０）、アースロバタクーＰ１（ Arthrobacter Ｐ
１）、ノカルジア２３９（ Nocardia ２３９）などがあ
げられる。

【００２９】本発明方法において用いられるホスホヘキ
シュロイソメラーゼは、¹³Ｃ標識ヘキシュロース−６−
リン酸を¹³Ｃ標識フルクトース−６−リン酸に異性化す
る酵素であって、例えばMethylomonas aminofaciens ７
７ａ（微工研菌寄第１２０１９号）をメタノールを用い
て培養して得られる無細胞抽出液をさらに精製・単離し
て得られる。

【００３０】本発明における前記ホルムアルデヒド固定
酵素系として、メタノールを単一炭素源とする液体培地
にMethylomonas aminofaciens ７７ａ菌株（微工研菌寄
第１２０１９号）を植菌・培養して得られるMethylomon
as aminofaciens ７７ａ菌株の無細胞抽出液を用いるこ
とができる。該無細胞抽出液には、ホスホリボイソメラ
ーゼ、ヘキシュロースリン酸シンターゼおよびホスホヘ
キシュロイソメラーゼが含まれているが、その他にホス
ホグルコイソメラーゼも含まれているので、生成するフ
ルクトース−６−リン酸は一部グルコース−６−リン酸
に異性化されることになる。

【００３１】本発明における菌株の培養は、生育に最小
限必要な無機栄養を添加した溶液に、生育の阻害になら
ない程度のメタノールを加えて、３０℃前後の温度に保
温して、振とうや通気などをして、充分に酸素を供給し
て培養をすることにより行なわれる。

【００３２】本発明方法において用いられるホスホグル
コイソメラーゼは、¹³Ｃ標識フルクトース−６−リン酸
を¹³Ｃ標識グルコース−６−リン酸に異性化する酵素で
あって、例えばシグマ社製品Type IIIなどの市販品を用
いることができる。

【００３３】本発明における反応基質は、生体化合物で
あってその具体例としてホスホエノールビルビン酸、３
−ホスホグリセリン酸、ジヒドロキシアセトンリン酸、
アセトアルデヒド、グリセルアルデヒド３−リン酸、エ
リスロース−４−リン酸、タルトロン酸セミアルデヒ
ド、アラビノース、ベンズアルデヒド、ピルビン酸、ジ
メチルアミン、グリオキシル酸、コハク酸、アセチルコ
エンザイムＡ，Ｎ−アセチルマンノサミン、プロピオニ
ル−ＣｏＡ、フマル酸、リブロース−５−リン酸、リボ
ース−５−リン酸など、好ましくは、ホスホエノールビ
ルビン酸、３−ホスホグリセリン酸、アセトアルデヒ
ド、グリセルアルデヒド−３−リン酸、ビルビン酸、リ
ブロース−５−リン酸、リボース−５−リン酸などがあ
げられる。これらのうち、グルコース−６−リン酸、フ
ルクトース−６−リン酸などの６炭糖リン酸たるヘキソ
ース−６−リン酸を生合成するためには、原料として安
価な点でリボース−５−リン酸を用いるのが好ましい。

【００３４】本発明における¹³Ｃ標識炭素源化合物は、
化学合成で容易に¹³Ｃ標識できる化合物であって、その
具体例として、それぞれ¹³Ｃで標識された、二酸化炭
素、メタノール、ホルムアルデヒド、アセトアルデヒ
ド、ジヒドロキシアセトンリン酸、ピルビン酸、ホスホ
エノールピルビン酸、Ｌ−ラクトアルデヒド、グリコー
ルアルデヒド、マロネートセミアルデヒド、グリオキシ
ル酸、コハク酸、アセチルＣｏＡ、酢酸、オキサロ酢酸
など、好ましくは、二酸化炭素、メタノール、ホルムア
ルデヒド、アセトアルデヒド、ピルビン酸、酢酸、オキ
サロ酢酸などがあげられる。

【００３５】本発明方法で用いられる¹³Ｃ標識メタノー
ルは、例えばＭＳＤアイソトープ社製製品（濃度９９
％）などを用いることができる。

【００３６】本発明方法で用いられる¹³Ｃ標識ホルムア
ルデヒドは、例えばＭＳＤアイソープ社製、¹³Ｃ濃度９
９％のホルムアルデヒドなど市販品を用いることができ
る。

【００３７】本発明方法によって生成される特定位置す
なわちＣ−１位の炭素が¹³Ｃで特異的に標識された¹³Ｃ
標識化合物は、生体成分であって、その具体例としてオ
キサロアセテート、リブロース−１，５−リン酸、ヘキ
シュロース−６−リン酸、エリトルロース−１−リン
酸、スレオニン、フルクトース−１，６−ジリン酸、６
−ホスホ−２−ケト−３デオキシグルコン酸、７−ホス
ホ−２−ケト−３−デオキシアラビノヘプトネート、フ
クロース−１−リン酸、２−ケト−３−デオキシペント
ネート、ラムニュロース−１−リン酸、２−ケト−３−
デオキシ−グルカル酸、エリスローフェニルセリル、６
−ホスホ−５−ケト−２−デオキシグルコン酸、２−オ
キソ−４−ヒドロキシグルタル酸、トリメチルアラニン
Ｎ−オキサイド、イソクエン酸、リンゴ酸、Ｎ−アセチ
ルノイラミン酸、クエン酸、フルクトース−６−リン
酸、リブロース−５−リン酸、グルコース−６−リン酸
など、好ましくは、リブロース−１，５−リン酸、ヘキ
シュロース−６−リン酸、エリトルロース−１−リン
酸、スレオニン、フルクトース−１，６−リン酸、クエ
ン酸、フルクトース−６−リン酸、リブロース−５−リ
ン酸、グルコース−６−リン酸などがあげられる。これ
らのうち、フルクトース−６−リン酸は、生体内での中
間物であり、グルコース−６−リン酸は、解糖系やペン
トースリン酸回路などで代謝されるものであり、生体に
応用する際に有効であって特に好ましい。

【００３８】

【発明の効果】本発明によれば、従来の化学合成法にお
けるように、数多くの反応ステップを必要とすることな
く、１段または数段の反応ステップで光学純度が極めて
高く、特定位置の炭素が特異的に¹³Ｃで標識された¹³Ｃ
標識化合物、例えばＣ−１位が特異的に¹³Ｃで標識され
た¹³Ｃ標識フルクトース−６−リン酸または¹³Ｃ標識グ
ルコース−６−リン酸を選択率よく高収率で得ることが
できる。

【００３９】本発明によれば、¹³Ｃで均一に標識された
化合物、¹⁴Ｃ標識化合物などに比べて、核磁気共鳴装
置、質量分析計などを用いて生物のエネルギー代謝系の
研究を行なう場合、より多くの定性的かつ定量的な有益
な情報を得ることが可能であって、生体反応の研究から
医療分野へと様々な分野で利用できる、特定位置の炭素
が¹³Ｃで特異的に標識された化合物、例えばＣ−１位が
特異的に¹³Ｃで標識され、解糖系の代謝中間体でもあ
り、生物のエネルギー代謝系の研究を行なう際に有用で
ある¹³Ｃ標識フルクトース−６−リン酸または¹³Ｃ標識
グルコース−６−リン酸の工業的に有利な製造方法が提
供される。

【００４０】

【実施例】以下実施例により本発明を詳細に説明する。
実施例において、¹³Ｃ標識フルクトース−６−リン酸、
¹³Ｃ標識グルコース−６−リン酸などの¹³Ｃ標識化合物
の定量法、単離精製法などであって、¹³Ｃで標識されな
いものについても同様の結果が得られるものについて
は、簡便のため、¹³Ｃで標識されないものを用いて実験
を行なった。

【００４１】

【実施例１】試験管に、¹³Ｃ標識メタノール、リボース
−５−リン酸（Ｒｉ５Ｐ）、アルコールオキシダーゼ
（ＡＯＤ）、ホスホリボイソメラーゼ（ＰＲＩ）、３−
ヘキシュロースリン酸シンターゼ（ＨＰＳ）、ホスホヘ
キシュロイソメラーゼ（ＰＨＩ）、ホスホグルコイソメ
ラーゼ（ＰＧＩ）、塩化マグネシウムおよびpH７．５カ
リウムリン酸緩衝液〔ＫＰＢ（pH７．５）〕を表１に示
す割合で装入し、３０℃で３０分間反応を行なった。

【００４２】

【表１】

【００４３】表１において、¹³Ｃメタノールとして、Ｍ
ＳＤ社製（濃度９９％）の製品を用い、リボース−５−
リン酸として、協和発酵株式会社製の製品を用い、アル
コールオキシダーゼとして、東洋紡績社製製品III を用
い、ホスホリボイソメラーゼとして、シグマ社製の製品
Type IIIを用いた。

【００４４】表１において、ヘキシュロースリン酸シン
ターゼおよびホスホヘキシュロイソメラーゼは、メタノ
ールを単一炭素源とする液体培地にMethylomonas amino
faciens ７７ａ菌株（微工研菌寄第１２０１９号）をメ
タノールを用いて培養し、各種クロマトグラフィーを利
用して単離したものを用いた。上記した培養および単離
について以下詳しく説明する。

【００４５】

【表２】

【００４６】上記表２に示されるメタノールを単一炭素
源とする液体培地にMethylomonas aminofaciens ７７ａ
を植菌し、３０℃で７２時間振盪培養した。

【００４７】Methylomonas aminofaciens ７７ａのヘキ
シュロースリン酸シンターゼおよびホスホヘキシュロイ
ソメラーゼについてMethylomonas aminofaciens ７７ａ
の無細胞抽出液より、ＤＥＡＥ−セファセルカラムクロ
マトグラフィーで先ずヘキシュロースリン酸シンターゼ
とホスホヘキシュロイソメラーゼを分画し、次いで各酵
素についてＤＥＡＥ−セファセルの再クロマトグラフィ
ーを行なったところ、図１および

【００４８】

【表３】

【００４９】に示される結果が得られ、かくして得られ
たヘキシュロースリン酸シンターゼおよびホスホヘキシ
ュロイソメラーゼの標品は、それぞれ活性（μmol ／mi
n ／mg）として０．２％および１．７％のホスホグルコ
イソメラーゼ（以下ＰＧＩと略称することがある。）を
含有した。上記ＤＥＡＥ−セファセルカラムクロマトグ
ラフィーは、下記の通り実施した。すなわち、１０mM T
ris-HCl(pH 8.2）で緩衝化したカラム（５×２０cm）に
無細胞抽出液４７０mlを導入し、同じ緩衝液２リットル
で洗浄後、緩衝液濃度を段階的に上げて酵素を溶出させ
た。図１に示したように、１００mM Tris-HCl （pH 8.
2）でＨＰＳが、さらに１００mM NaCl を含む１００mM
Tris-HCl （pH 8.2）でＰＨＩが溶出した。

【００５０】表１において、ホスホグルコイソメラーゼ
として、シグマ社製品Type IIIを用いた。

【００５１】上記反応の結果、Ｃ−１位が¹³Ｃで特異的
に標識された¹³Ｃ標識グルコース−６−リン酸が６３mM
得られ、対¹³Ｃメタノール収率６３％であり、Ｃ−１位
が¹³Ｃで特異的に標識された¹³Ｃ標識フルクトース−６
−リン酸が１３mM得られ、対¹³Ｃメタノール収率１３％
であった。

【００５２】¹³Ｃ標識グルコース−６−リン酸（Ｇ６
Ｐ）の定量：Ｇ６Ｐは、表４に示されるような反応組成
およびグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼを用
い、酵素法、すなわちミッチェル（Michal) らの方法に
より定量した。

【００５３】

【表４】

【００５４】測定方法： １．ブランクは、試料の代りに蒸留水０．５mlを添加し
た。 ２．酵素類を加える前に、０点を測定した。 ３．グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼを加え、
３４０nmでの吸光度の増加を測定し、吸光度が頭打ちに
なった時点で０点との差をΔＡ_340/G6P として記録し
た。この値よりグルコース６−リン酸の濃度Ｘ（mM) は
下記式により求められる。 式中、６．２２はＮＡＤＰＨ（ニコチンアミドアデニン
ジヌクレオチドリン酸、還元型）の３４０nmでの分子吸
光係数（μmol ／ml）であり、ａは反応液体積（ml）で
あり、ｂは試料体積（ml）である。

【００５５】¹³Ｃ標識フルクトース−６−リン酸（Ｆ６
Ｐ）の単離精製：¹³Ｃ標識Ｆ６Ｐの単離方法を図３に示
した。図４にＤＥＡＥトヨパール充填剤（東ソー株式会
社製、商品名）のカラムクロマトグラフィーの溶出パタ
ーンを示した。回収率は約５４％であった。純度は６４
％であった。

【００５６】¹³Ｃ標識Ｆ６Ｐの¹³Ｃ−ＮＭＲ分析：Ｈ¹³
ＣＨＯを基質として酵素合成したＦ６Ｐにシグマ（Sigm
a ）社製のＦ６Ｐを混合し、１０％¹³Ｃとなるようにし
た。これを¹³Ｃ−エンリッチドＦ６Ｐとし、シグマ（Si
gma ）社製のものを純Ｆ６Ｐとして、¹³ＣＮＭＲ分析を
行なった。図２はＦ６ＰのＣ−１とＣ−６のピークを比
較したものである。¹³Ｃ−エンリッチドＦ６ＰのＣ−１
／Ｃ−６のピーク比は純Ｆ６Ｐの比の約１０倍であり、
このことは、酵素合成で得たＦ６ＰのＣ−１位は特異的
に¹³Ｃに標識されていることを示している。

【００５７】¹³Ｃ標識フルクトース−６−リン酸（¹³Ｃ
Ｆ６Ｐ）の定量：Ｆ６Ｐは、表５に示されるような反応
組成を用い、ホスホグルコイソメラーゼ（ＰＧＩ）とグ
ルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ６ＰＤＨ）
を用いる酵素法、すなわちミチャル（Michal）らの方法
〔メソッヅ・イン・エンチマチック・アナリシス・サー
ド・第３巻・ベルラグ・ヘミー・ジーエムビーエッチ・
ワインハイム・１９１−１９８頁（Methods in Enzymat
ic Analysis ３ｒｄ Vol.３，Verlag Chemic GmbH Wein
heim, P 191-198）〕で定量した。

【００５８】

【表５】

【００５９】測定方法 １．ブランクは、試料に対して蒸留水を０．５mlを加え
た。 ２．酵素類を加える前に、Ｏ点を測定した。 ３．グルコース６リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ６ＰＤ
Ｈ）、ホスホグロコイソメラーゼ（ＰＧＩ）の順に加
え、３４０nmでの吸光度の増加を測定した。吸光度が頭
打ちになった時点でＯ点との差をΔＡ_340/F6P として記
録した。この値より下に示す方法で濃度を計算した。 ＊ここで、グルコース６リン酸とフルクトース６リン酸
が混在するときは、まずＧ６ＰＤＨだけを加えて上記と
同様にΔＡ_340/G6P を測定した。次いでＰＧＩを加えて
ΔＡ_340/F6P を測定した。

【００６０】濃度測定 Ｆ６Ｐ（又はＧ６Ｐ）の濃度（ｘｍＭ）決定は以下の通
り ＊６．２２：ＮＡＤＰＨの３４０nmでの分子吸光係数
（μmol ／ml） ａ：反応液体積（ml） ｂ：試料体積（ml）

【００６１】リボース−５−リン酸（Ｒ５Ｐ）の測定：
Ｒ５Ｐはフロログリシン−酢酸法で測定した。

【００６２】ヘキシュロースリン酸シンターゼ（ＨＰ
Ｓ）の活性測定：ＨＰＳの活性測定を、表６の反応組成
を用いて行なった。

【００６３】

【表６】

【００６４】測定方法 １．ブランクはＲ５Ｐの代わりに蒸留水を加えた。 ２．ＨＣＨＯを加えて反応を開始し、５分後に１Ｎ塩酸
で反応を停止した。 ３．２．の反応液０．１mlに対し蒸留水１．９mlで２０
倍希釈の後、２．０mlのナッシュ（Ｎａｓｈ）試薬を加
え、３０℃で３０分放置し着色させた。 ４．４１０nmでの吸光度を測定し検量線よりＨＣＨＯの
濃度を決定。以下の計算方法により活性を求めた。 ＊ナッシュ（Ｎａｓｈ）試薬：酢酸アンモニウム １５ｇ 酢酸 ０．３ml アセチルアセトン ０．２ml 以上の試薬は蒸留水に溶解し体積を１００mlとする。検
量線は０．０４，０．０８，０．１２，０．１６，０．
２mMのＨＣＨＯを用いて作成した。

【００６５】活性決定 活性（Ｕ／ml）＝｛（Ａ−Ｂ）×Ｃ｝×Ｄ×（１／Ｅ）
×（１／Ｆ）×（０．６／０．５）×０．５ Ａ：ブランクのＨＣＨＯ濃度 ｍＭ Ｂ：反応液中のＨＣＨＯ濃度 ｍＭ Ｃ：使用酵素（Enzyme) 希釈率 Ｄ：ナッシュ（Ｎａｓｈ）法の時の反応液希釈率 Ｅ：反応に使用した酵素体積 ml Ｆ：反応時間 min ０．６／０．５：ＨＣｌを加える前のＨＣＨＯ濃度を決定するための定数 ０．５：反応液体積 ml

【００６６】ホスホヘキシュロイソメラーゼ（ＰＨＩ）
の活性決定：ＰＨＩの活性決定を、表７に示す反応組成
を用いて行なった。

【００６７】

【表７】

【００６８】測定方法 １．基準キュヴエットはＨＣＨＯの代わりに蒸留水を加
えた。 ２．ＨＣＨＯを加えて反応を開始。ＮＡＤＰＨの増加を
３４０nmでブラックセルを用いて測定した。 ３．吸光度の増加が直線的になっている部分を確認し、
その傾き（ΔＡ３４０nm／min ）より以下に示す計算方
法により活性を求めた。 ★ＨＰＳの活性は精製状態により異なるので、最終活性
が上記反応組成に示すように約１．０Ｕ／mlになるよう
加えた。またこの場合反応液体積が１．０mlになるよう
にＨ₂ Ｏの添加量で調節した。無細胞抽出液内の本酵素
の活性を測定する場合は、ＨＰＳを蒸留水０．９mlに置
き換えた。

【００６９】活性決定 活性（Ｕ／ml）＝（Ａ／６．２２）×（１／Ｂ）×Ｃ×
Ｄ Ａ：ΔＡ３４０nm／min Ｂ：反応に使用した酵素体積 Ｃ：使用酵素（Enzyme) 希釈率 Ｄ：反応液体積 ６．２２：ＮＡＤＰＨの３４０nmでの分子吸光係数

【００７０】ホスホグルコイソメラーゼ（ＰＧＩ）の活
性測定：ＰＧＩの活性測定を、表８に示す反応組成を用
いて行なった。

【００７１】

【表８】

【００７２】測定方法 １．基準キュヴエットはＦ６Ｐの代わりに蒸留水を加え
た。 ２．Ｆ６Ｐを加えて反応を開始。ＮＡＤＰＨの増加を３
４０nmでブラックセルを用いて測定した。 ３．吸光度の増加が直線的になっている部分を確認し、
その傾き（ΔＡ３４０nm／min ）より以下に示す計算方
法により活性を求めた。

【００７３】活性決定 活性（Ｕ／ml）＝（Ａ／６．２２）×（１／Ｂ）×Ｃ×
Ｄ Ａ：ΔＡ３４０nm／min Ｂ：反応に使用した酵素体積 Ｃ：使用酵素（Enzyme) 希釈率 Ｄ：反応液体積 ６．２２：ＮＡＤＰＨの３４０nmでの分子吸光係数

【００７４】

【実施例２】実施例１における表１の反応混合物に代え
て表９の反応混合物を用いる以外、実施例１と同様の実
験を行なった結果、Ｃ−１位が¹³Ｃで特異的に標識され
た¹³Ｃ標識グルコース−６−リン酸が３１mM得られ、対
Ｈ¹³ＣＨＯ収率６２％であり、Ｃ−１位が¹³Ｃで特異的
に標識された¹³Ｃ標識フルクトース−６−リン酸が８mM
得られ、対Ｈ¹³ＣＨＯ収率は１６％であった。表９にお
いて、¹³Ｃ標識ホルムアルデヒドとしては、９９％¹³Ｃ
ホルムアルデヒド（ＭＳＤアイソトープ社製）の２０％
水溶液であるホルマリン−¹³Ｃをホルムアルデヒド量に
換算してそのまま使用した。

【００７５】

【実施例３】実施例１における表１の反応混合物に代え
て表１０の反応混合物を用いる以外、実施例１と同様の
実験を行なった結果、Ｃ−１位が¹³Ｃで特異的に標識さ
れた¹³Ｃ標識フルクトース−６−リン酸が７５mM得ら
れ、対¹³Ｃ標識ホルムアルデヒド（Ｈ¹³ＣＨＯ）収率７
５％であった。

【００７６】

【実施例４】実施例１における表１の反応混合物に代え
て表１１の反応混合物を用いる以外、実施例１と同様の
実験を行なった結果、Ｃ−１位が¹³Ｃで特異的に標識さ
れた¹³Ｃ標識グルコース−６−リン酸が３５mM得られ、
対¹³Ｃメタノール収率７０％であり、Ｃ−１位が¹³Ｃで
特異的に標識された¹³Ｃ標識フルクトース−６−リン酸
が９mM得られ、対¹³Ｃメタノール収率１３％であった。
カタラーゼおよび過酸化水素は前記シグマ社製製品を使
用した。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明に使用する酵素の精製を説明するための
グラフである。

【図２】本発明における¹³Ｃ標識Ｆ６Ｐの¹³Ｃ−ＮＭＲ
分析結果を示すチャート図である。

【図３】本発明における¹³Ｃ標識Ｆ６Ｐの単離方法を説
明するフローチャートである。

【図４】本発明の¹³Ｃ標識Ｆ６Ｐの単離精製におけるカ
ラムクロマトグラフィーの溶出パターンを示すグラフで
ある。

【表９】

【表１０】

【表１１】

Claims (8)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 アルコールオキシダーゼと、ホスホリボ
   イソメラーゼ、ヘキシュロースリン酸シンターゼおよび
   ホスホヘキシュロイソメラーゼよりなるメタノール資化
   性細菌のホルムアルデヒド固定酵素系との存在下、^１３
   Ｃ標識メタノールおよびリボース−５−リン酸を反応さ
   せてＣ−１位が特異的に^１３Ｃで標識されたフルクトー
   ス−６−リン酸を得ることを特徴とする^１３Ｃ標識化合
   物の製造方法。
2. 【請求項２】 リボース−５−リン酸をホスホリボイソ
   メラーゼにより異性化してリブロース−５−リン酸と
   し、次いでヘキシュロースリン酸シンターゼと^１３Ｃ標
   識メタノールをアルコールオキシダーゼの存在下に反応
   させて得られる^１３Ｃ標識ホルムアルデヒドとを添加・
   反応させてＣ−１位が特異的に^１３Ｃで標識された^１３
   Ｃ標識ヘキシュロース−６−リン酸を生成させ、次いで
   ホスホヘキシュロイソメラーゼにより異性化してＣ−１
   位が特異的に^１３Ｃで標識されたフルクトース−６−リ
   ン酸を得ることを特徴とする^１３Ｃ標識化合物の製造方
   法。
3. 【請求項３】 アルコールオキシダーゼと、ホスホリボ
   イソメラーゼ、ヘキシュロースリン酸シンターゼ、ホス
   ホヘキシュロイソメラーゼおよびホスホグルコイソメラ
   ーゼよりなるメタノール資化性細菌のホルムアルデヒド
   固定酵素系との存在下、^１３Ｃ標識メタノールおよびリ
   ボース−５−リン酸を反応させてＣ−１位が特異的に
   ^１３Ｃで標識されたグルコース−６−リン酸を得ること
   を特徴とする^１３Ｃ標識化合物の製造方法。
4. 【請求項４】 リボース−５−リン酸をホスホリボイソ
   メラーゼにより異性化してリブロース−５−リン酸と
   し、次いでヘキシュロースリン酸シンターゼと^１３Ｃ標
   識メタノールをアルコールオキシダーゼの存在下に反応
   させて得られる^１３Ｃ標識ホルムアルデヒドとを添加・
   反応させてＣ−１位が特異的に^１３Ｃで標識された^１３
   Ｃ標識ヘキシュロース−６−リン酸を生成させ、次いで
   ホスホヘキシュロイソメラーゼにより異性化してＣ−１
   位が特異的に^１３Ｃで標識されたフルクトース−６−リ
   ン酸を生成させ、次いでホスホグルコイソメラーゼによ
   り異性化してＣ−１位が特異的に^１３Ｃで標識されたグ
   ルコース−６−リン酸を得ることを特徴とする^１３Ｃ標
   識化合物の製造方法。
5. 【請求項５】 該アルコールオキシダーゼに、カタラー
   ゼおよび過酸化水素を共存させる請求項１ないし４記載
   の製造方法。
6. 【請求項６】 ホスホリボイソメラーゼ、ヘキシュロー
   スリン酸シンターゼ、ホスホヘキシュロイソメラーゼお
   よびホスホグルコイソメラーゼよりなるメタノール資化
   性細菌のホルムアルデヒド固定酵素系、^１３Ｃ標識ホル
   ムアルデヒドおよびリボース−５−リン酸を反応させて
   Ｃ−１位が特異的に^１３Ｃで標識されたグルコース−６
   −リン酸を得ることを特徴とする^１３Ｃ標識化合物の製
   造方法。
7. 【請求項７】 リボース−５−リン酸をホスホリボイソ
   メラーゼにより異性化してリブロース−５−リン酸と
   し、次いでヘキシュロースリン酸シンターゼおよび^１３
   Ｃ標識ホルムアルデヒドを添加・反応させてＣ−１位が
   特異的に^１３Ｃで標識された^１３Ｃ標識ヘキシュロース
   −６−リン酸を生成させ、次いでホスホヘキシュロイソ
   メラーゼにより異性化してＣ−１位が特異的に^１３Ｃで
   標識されたフルクトース−６−リン酸を生成させ、次い
   でホスホグルコイソメラーゼにより異性化してＣ−１位
   が特異的に^１３Ｃで標識されたグルコース−６−リン酸
   を得ることを特徴とする^１３Ｃ標識化合物の製造方法。
8. 【請求項８】 該ヘキシュロースリン酸シンターゼおよ
   び該ホスホヘキシュロイソメラーゼが、メタノールを単
   一炭素源とする液体培地にＭｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ
   ａｍｉｎｏｆａｃｉｅｎｓ ７７ａ菌株を植菌・培養し
   て得られるＭｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ ａｍｉｎｏｆａ
   ｃｉｅｎｓ ７７ａの菌株の無細胞抽出液を精製して得
   られる請求項１〜４および６〜７の何れかに記載の製造
   方法。