JP3035357B2 - 超高速電気分離分析のための組成物、方法、および装置 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 発明の分野 本発明は、一般に、結合アッセイの分野に関し、そし
てより詳細には、電気泳動のような電気分離技術を使用
する結合アッセイを実施するための方法および組成物に
関する。

発明の背景 電気泳動は、混合物の分離および分析のための十分に
確立された技術である。電気泳動は、移動度の差異に基
づく、電場における分子の移動および分離を含む。電気
泳動の多くの異なる形態が開発され、異なるクラスの化
合物の分離が可能になった。これらの形態には、フリー
ゾーン電気泳動、ゲル電気泳動、等電点電気泳動、およ
び等速電気泳動が挙げられる。これらの技術は、マイク
ロメートルの断面寸法のチューブまたはチャンネルにお
いて実施され得、これは、キャピラリー電気泳動（CE）
と呼ばれる。キャピラリー電気泳動は、高電場強度が使
用され得、そしてこの技術が容易に自動化され得るた
め、アッセイ時間および電気泳動の解析に関して、より
大きなスケールのシステムを上回る利点を提供する。

CEは強力な分離技術であり、そして例えば、非結合形
態の抗原または抗体のいずれかから、抗原抗体複合体を
分離するために使用され得、その後、定量が可能にな
る。分析物と結合パートナー（例えば、抗体と抗原）と
の間の相互作用が高度に特異的である場合、この高度に
特異的な反応と、検出可能部分を結合パートナーに付着
させるための、結合（conjugation）技術との組み合わ
せにより、種々のアッセイ技術の使用が可能になり、体
液のような複雑な生物学的サンプル中の分析物を検出し
得るようになる。例えば、米国特許第4,486,530号は、
サンプル中のIgEの存在および／または濃度を決定する
ためのモノクローナル抗体および検出可能部分の使用を
開示している。一般に、CEアッセイは、有利な特性（例
えばより短いアッセイ時間、より少ないサンプル容量要
求性、より少ない試薬の使用、および潜在的に増強され
た感度）を有する。Reifら、Analytical Chemistry 66:
4027−4033（1994）を参照のこと。

従来のCEまたはイムノアッセイのための他の電気分離
技術を首尾よく使用するための重要な因子の１つは、抗
体の非結合形態と結合形態とを電気泳動的に分離する能
力である。しかし、電気分離技術の高分解力にも関わら
ず、これは、容易にまたは確実に達成できる要件ではな
い。このことの主な理由は、抗原、抗体、またはその両
方が、変異体、イソ型、グリコシル化の差異等の存在に
より、顕著な不均一を示し得るということである。この
ことは、抗体の非結合形態および複合体形態の両方が、
不均一に移動し、従って電気分離分析において、所望の
ような鋭い検出可能ピークよりもむしろ、広範な、境界
に乏しい分布が生じることを意味する。結果として、結
合種に対する非結合種の検出および／または定量は、困
難であり、そして／または信頼できないものである。従
って、特定の分析物、特に大きな生物分子については、
従来の電気分離法が臨床的に有用な診断的イムノアッセ
イ適用に対して顕著な利点を提供し得ない。

電気分離はまた、WO 93 20236、タイトル「プローブ
化合物および方法」に開示されるように、核酸分析物の
分析のために使用されている。そこで開示されるプロー
ブは、核酸分析物およびそれらに付着したポリヌクレオ
チド結合パートナーを含む。プローブのポリヌクレオチ
ド成分は、検出可能標識、ならびにサイズおよび／また
は荷電変更因子に付着され、このプローブからの放出の
際に各ポリヌクレオチド成分の電気泳動による画分化に
おいて補助する。核酸分析物の分析は、個々の放出され
たポリヌクレオチドの存在／非存在を、特定の核酸分析
物の存在／非存在と関連させることによって、間接的に
達成される。

いく人かの研究者らはまた、荷電した基を同一のの標
識した分子に付着させることによって、標識した抗体の
電気泳動移動度を調整している。ChenおよびEvangelist
a、Clinical Chemistry 40:1819−1822（1994）;Chenお
よびSternberg、Electrophoresis 15:13−21（1994）;C
hen,Journal of Chromatography 680:419−423（1994）
を参照のこと。一方で、この結果、標識された抗体の移
動度は、対応する標識されていない抗体の移動度と異な
る。しかし、他方で、標識された抗体の荷電特性を調整
することは理想的でない。なぜなら、アッセイの最終目
的は、上記の参考文献において開示される種類の代表的
な結合アッセイにおいて形成される２つの標識された種
（すなわち、標識された抗体−抗原複合体および結合し
ていない標識された抗体）を分離することであるからで
ある。上述の参考文献に示される方法論に従って、この
ような断片は両方とも荷電の調整により影響され、それ
によって、標識された種を区別する努力を無駄にする。
さらに、上述の参考文献は、２つの改変を有する（すな
わち検出可能部分およびそれらに付着した荷電部分の両
方を有する）単一の抗体を使用したいくつかの成功を示
しているが、競合的な形式で実施されたアッセイで、検
出された分析物は、小さく、低分子量の分析物（モルヒ
ネ、PCP、ジゴキシン）である。これらの分子は、代表
的には、より複雑な生物学的巨大分子よりも、CE分析に
対してより貢献する。Evangelistaら、American Clinic
al Laboratory 14（２）:27−28（1985）をまた参照の
こと。

発明の要旨 従って、本発明は先行技術における制限による１つ以
上の問題を実質的に回避する電気分離法に関する。これ
らの目的および他の目的は、本明細書中に開示される本
発明の利点および特性に沿って、後に続く説明、図面、
および請求の範囲から明らかである。

１つの局面において、本発明は以下を有する混合物を
チャンネルにおいて電気的に分離する工程を有する混合
物の電気分離分析のための方法を提供する：（１）サン
プル；（２）分析物上の第１の結合部位に結合する第１
の結合パートナー；（３）分析物の第２の結合部位に結
合する第２の結合パートナー、これにより、第１および
第２の結合パートナーは、サンプル中に存在する場合に
は、分析物に結合し、結合していない第１の結合パート
ナーから電気的に分離可能な三員複合体（three member
ed complex）を形成する。本発明の方法はさらに、検出
可能部分が第１の結合パートナーに結合し、そして電荷
改変部分が第２の結合パートナーに結合し、その結果、
電位への曝露において、三員複合体が、結合していない
第１の結合パートナーとは異なる電気泳動移動度を示す
ということを提供する。

別の実施態様において、サンプル中の分析物の非存
在、存在、または濃度を検出する本方法は、以下を含
む：分析物上の第１の結合部位に結合する第１の結合パ
ートナーおよび分析物中上の第２の結合部位に結合する
第２の結合パートナーとサンプルとを組み合わせて混合
物を生成し、その結果、存在する場合には、分析物が、
分析物、第１の結合パートナー、および第２の結合パー
トナーを含む三員複合体を形成する工程；電気伝導性の
媒体を含む電気分離チャンネル内に混合物を配置する工
程；電位をチャンネルに適用し、存在する場合には、三
員複合体を、結合していない第１の結合パートナーから
分離する工程；および、形成された複合体を検出する工
程。

本発明の１つの実施態様において、サンプル中の分析
物の非存在、存在、または濃度を検出する方法は、電気
分離チャンネル内で第１および第２の結合パートナーと
サンプルとを組み合わせる工程を含む。この実施態様に
おいて、できる限り複合体の形成を容易にし、そしてア
ッセイ時間を減少させるために、三員複合体はチャンネ
ル内では形成されることを意図する。別の実施態様にお
いて、本発明は、第１または第２の結合パートナーが電
気分離チャンネル内で固定される方法を提供する。この
例では、固定されたパートナーは、電位の適用の前に放
出される。

なお別の実施態様において、本発明の方法は、第１の
結合パートナーを含む第１のゾーンおよび第２の結合パ
ートナーを含む第２のゾーンにより特徴づけられる電気
分離チャネルを提供し、ここで、サンプルはチャンネル
内に配置され、そして両方のゾーンと接触し、それによ
って、サンプル中に存在する場合には、第１の結合パー
トナー、第２の結合パートナー、および分析物を含有す
る、三員複合体の形成を可能にする。三員複合体の電気
分離および検出は、本明細書中に記載されるように達成
される。

本発明は、サンプル中の分析物の種あたり少なくとも
１つの三員複合体の検出を意図し、そしてさらに単一の
サンプル中の多数の分析物の検出のための多数の分析物
の電気分離分析を意図する。ここで、三員複合体の形成
はサンプル中に特定の分析物が存在することの指標であ
る。

別の局面において、本発明は、以下からなる分析物の
検出のための組成物を特色とする；（１）分析物；
（２）その分析物上の第１の結合部位に結合し、そして
それに結合した検出可能部分を有する第１の結合パート
ナー；（３）分析物上の第２の結合部位に結合し、そし
てそれに結合した電荷改変部分を有する第２の結合パー
トナー。第２の結合部位が第１の結合部位と異なり、そ
の結果、第１および第２の結合パートナーが上記分析物
に結合されている三員複合体を形成し、そして、三員複
合体が結合していない第１の結合パートナーとは異なる
電気泳動移動度を示すことが意図される。

本発明は、上記分析物上の第１の結合部位が第１の結
合パートナー認識部位を含み、この部位に第１の結合パ
ートナーが結合し、そしてこの部位は第２の結合パート
ナーによっては認識されない組成物をさらに提供する。
さらに、本発明は、第１の結合パートナーが、第１の結
合パートナーおよび検出可能部分が結合される結合部位
とは異なる第１の分析物認識部位を含む組成物を提供す
る。同様に、本発明は、分析物上の第２の結合部位が、
第２の結合パートナーが結合しそして第１の結合パート
ナーによっては認識されない第２の結合パートナー認識
部位を含む組成物を提供する。本発明の組成物は、第２
の結合パートナーおよび電荷改変部分が結合する結合部
位とは異なる第２の分析物認識部位を有する第２の結合
パートナーをさらに特色とする。他の実施態様におい
て、本発明は、第１の結合パートナーおよび／または第
２の結合パートナーが１価の抗体またはＦ（ab′）ある
いはＦ（ab′）_２抗体フラグメント由来である組成物を
提供する。

別の局面において、本発明は以下によって特徴づけら
れる分析物の検出のための装置を特色とする：その中に
配置された電気伝導媒体を有する電気分離チャンネル；
注入ゾーン；注入ゾーン内に配置されたサンプル、分析
物を含むサンプル、分析物上の第１の結合部位に結合す
る第１の結合パートナーおよび分析物上の第２の結合部
位に結合する第２の結合パートナー；および、チャンネ
ルを横切る電位を印加する電圧の供給源。本発明は、検
出可能部分が第１の結合パートナーに付着され、そして
荷電改変部位が第２の結合パートナーに付着されている
ことを提供する。本発明は、第２の結合部位が第１の結
合部位と異なり、その結果、分析物、第１の結合パート
ナー、および第２の結合パートナーが三員複合体を形成
することをさらに提供する。

本発明はまた、上記三員複合体の電気泳動移動度が結
合していない上記の第１の結合パートナーの移動度と異
なる装置を特色とする。本発明の特定の実施態様におい
て、電位の活性化によって三員複合体と結合していない
第１の結合パートナーとが、本明細書中で開示される２
つの反対の移動ゾーンに分解される。

本発明の装置の特定の実施態様において、結合パート
ナー由来の分析物を含む複合体の電気分離は、電気泳動
によって達成される。本明細書中に開示されるように、
電気分離は、現在、好ましくはフリーゾーン電気泳動ま
たはフリーフロー電気泳動によって達成される。

本発明の１つの実施態様において、装置は、適切な基
板（substrate）内に刻み込まれるか、エッチングされ
るか、または配置された、電気分離チャンネルによって
特徴づけられる。電気分離チャンネルは、適切な深度、
幅、および長さの流通通路であることが意図される。特
定の実施態様において、電気分離チャンネルは、上記基
板を通過する直線経路である。特定の実施態様におい
て、電気分離チャンネルは分岐している。

本発明の装置は、チャンネルを規定するように、微細
構築された（microfabricated）本明細書中に開示され
るような固体の基板に由来する電気分離チャンネルを有
することがさらに意図される。別の実施態様において、
本発明は、上記基板内に配置される種々の微細構築され
たチャンネルを有する装置を提供する。いくつかの別の
実施態様において、この装置は単一のチャンネルを有す
る。なお別の実施態様において、本発明は電気分離チャ
ンネルがキャピラリー（好ましくは直径が約500μ未満
である）である、分析物の検出のための装置を提供す
る。キャピラリーは、本発明の組成物および方法を用い
た分析物の最適な検出のために、本明細書中で開示され
るように化学的に機能化され得る。

別の実施態様において、本発明は、サンプル中の分析
物を検出するための、上記分析物を検出するための検出
器手段を有する装置を提供する。本発明は、それによっ
て三員複合体がサンプル中の分析物の存在の指標となる
検出器手段を意図する。本発明は、サンプル中の分析物
の量を定量的に決定するための検出器手段をさらに意図
する。これらの実施態様の例において、本発明は、三員
複合体の形成の定量的決定が、サンプル中の分析物の濃
度の指標となるなることを意図する。本発明は、本明細
書中に開示されるような種々な検出器手段を意図する。

なお別の実施態様において、本発明は、サンプル中の
分析物を検出するための、以下を有する装置を特色とす
る：電気分離チャンネル；分析物含有サンプルの混合
物、分析物上の第１の結合部位に結合する第１の結合パ
ートナー、および分析物上の第２の結合部位に結合する
第２の結合パートナーの混合物、ならびに三員複合体
（ここで、複合体は、分析物、第１の結合パートナー、
および第２の結合パートナーを含有する）をチャンネル
内に配置するための手段；および上記チャンネルを横切
る電位を印加するための電圧の供給源。混合物を配置す
るための手段は、本明細書中で開示されるような機械的
送達手段ならびに自動化液体流動手段を含む。

別の局面において、本発明は、サンプル中の分析物の
電気分離分析のための、以下を含むキットを提供する：
チャンネルを含む電気分離装置；第１の結合部分に付着
させるための検出可能部分、ここで上記第１の結合部分
はサンプル中の分析物上の第１の結合部位に結合し得
る；および第２の結合部分に付着させるための電荷改変
部分、ここで上記第２の結合部分は、サンプル中の分析
物上の第２の結合部位に結合し得る。１つの実施態様に
おいて、キットは付着試薬さらに含み、それによって上
記検出可能部分および上記電荷改変部分が、それぞれ、
上記第１および第２の結合部分に付着され得、それそ
れ、第１の結合パートナーおよび第２の結合パートナー
を形成し、ここで上記第１の結合パートナーおよび上記
第２の結合パートナーは、サンプル中に存在する場合に
は、分析物に結合され得、それによって三員複合体を形
成する。これは電気分離分析の間、結合していない第１
の結合パートナーとは異なる電気泳動移動度を示す。特
定の実施態様において、本発明は、電気分離チャンネル
がキャピラリーであるキットを提供する。

なお別の実施態様において、本発明は、サンプル中の
分析物の電気分離分析のための、以下を含むキットを提
供する：分析物上の第１の結合部位に結合する第１の結
合パートナー、ここで上記第１の結合パートナーは検出
可能部分を含む；および上記分析物上の第２の結合部位
に結合する第２の結合パートナー、ここで上記第２の結
合パートナーは電荷改変部分を含む。本発明は、このよ
うなキットを利用する電気分離分析の結果、第１および
第２の結合パートナーが、存在する場合には、分析物と
三員複合体を形成し、それによって電気分離による複合
体化分析物の検出が可能になることをさらに提供する。

本発明の超高速電気分離分析のための組成物、方法、
および装置は、従来の電気泳動結合アッセイにおいて直
面する問題を解決する。例えば、本発明は、検出可能部
分で標識された結合していない形態の結合パートナーの
移動度に影響を与えることなく、分析物含有複合体の移
動度を特異的に調整する技術的ノウハウおよび手段を当
業者に提供する。このことはいくつかの利点を有する。
第１に、アッセイ開発が単純化される。複合体の移動度
が、今や、検出可能部分で標識された結合していない結
合パートナーの移動度とは顕著に異なるため、もはや、
結合していない結合パートナーと結合パートナーとの確
実な分離を達成するために分離条件を最適化する必要が
ない。本発明の組成物、方法、および／または装置を使
用して、分析物上の分離部位を認識する２つの結合パー
トナー（例えば抗体）が利用可能である任意の分析物
（例えば抗原）について、アッセイが迅速に開発され得
る。抗体の適合した対は、酵素結合免疫吸着アッセイ
（ELISA）および他のタイプのサンドイッチアッセイで
すでに使用されており、それゆえ、臨床的に有用な多く
の分析物について容易に商業的に入手可能である。さら
に、抗体結合パートナーおよび／または抗原分析物の不
均一性は、今や、結合した検出可能に標識された抗体と
結合していない検出可能に標識された抗体とを分離する
能力に最少の影響しか有さない。

本発明により実現された別の利点は、結合していない
成分と結合した成分の間の移動度の差異が増大するため
に分離時間が劇的に減少され得ることである。極端に
は、結合していない形態および複合体形態が逆方向の移
動度を有するアッセイ条件が達成され得る。このこと
は、注入ゾーンが結合していない分析物および複合体化
分析物を含む２つの反対の移動領域に分解したときに、
十分な分離が達成されることを意味する。

上記のように、本発明の方法は、検出機能および移動
度調整機能の両方を実施するための２つの異なる結合パ
ートナー（例えば、抗体）の使用を特色とする。特定の
実施態様では、凝集を最小にし、かつ感度を増強する１
価の抗体フラグメント（FabまたはFab′）形態の抗体結
合パートナーを利用する。上述のように、抗体は抗原上
の異なる部位を認識し、その結果、両方が抗原に非競合
的に結合する。特定の実施態様において、一方の抗体は
検出可能標識で標識され、そして他方は強度に荷電する
ように改変される。本明細書中に開示されるように、荷
電改変は、種々の化学的手段（例えば、十分に確立され
た化学を用いる、ポリヌクレオチド、あるいはポリリジ
ンまたはポリグルタミン酸のようなポリペプチドの抗体
への付着によって達成され得る。例えば、１つのアプロ
ーチは、Fab′フラグメントを生成し、続いて当該分野
で認識されているチオール反応化学を使用して、チオー
ル基で荷電付与基を付着させることである。

本発明に従って実施された例示的な結合アッセイにお
いて、両方の結合パートナー（例えば、抗体または抗体
フラグメント）はサンプルと組み合わされ、そしてイン
キュベートされて均衡を確立させられる。次いで、イン
キュベートされたサンプルはフリーゾーンキャピラリー
電気泳動電気分離チャンネルに注入され、そして電場が
適用されて、検出可能部分で標識された抗体の非結合形
態および結合形態を分離する。結合パートナーの１つ
（すなわち、荷電改変抗体）が、複合体結合抗体の移動
度にのみ寄与し、結合していない抗体には寄与しないた
め、これらの種の分離は迅速に生じる。極端な場合で
は、非結合種および結合種は反対方向に移動し、その結
果、遊離標識抗体ゾーンおよび結合標識抗体ゾーンの最
後部の縁が注入ゾーンをクリアーするとすぐに達成され
る。

簡単に述べれば、本明細書中に開示される超高速電気
分離分析による分析物の検出のための組成物、方法、お
よび装置は、高度に好ましく、そして以下の利点を実証
する。第１に、アッセイ開発時間が劇的に減少し得る。
本発明の実施から生じる検出可能な移動度の差異によ
り、分離条件を注意深く最適化する必要性の重要度が減
じる。第２に、識別可能な移動度の差異が本発明の実施
から生じるので、アッセイは顕著により短い時間で実施
され得る。第３に、検出可能酵素標識は、以前に可能で
あったよりもはるかに容易に使用され得る。イムノアッ
セイにおける検出可能シグナルを生じるに適切な多くの
酵素が、例えば、大容量のタンパク質であるため、抗体
−酵素結合体の非結合形態と結合形態との間で移動度の
十分な差異を得ることは困難であった。しかし、本発明
によれば、必要とされる移動度の差異は、電荷改変され
た第２の結合パートナーを使用して容易に達成される。
本発明は、今や、当業者が、CEおよび他の電気分離技術
と共に、感受性酵素増幅アッセイを開発しそして臨床的
に適用して、臨床的に重要な分析物の生理学的濃度を検
出することを可能にしている。

上述の一般的な説明および以下の詳細な説明は共に、
例示および解説であり、そして、請求される本発明のさ
らなる説明を提供することが意図されることが理解され
る。

図面の簡単な説明 添付の図面は、本発明のさらなる理解を提供し、そし
て本明細書の１部に組み込まれそしてこの１部を構成す
る。そして本発明のいくつかの実施態様を図解し、そし
て説明と共に本発明の原理を説明する。

図１は、本発明に従って実施される電気分離分析に適
切な固体基板から微細に組み立てられた、現在好ましい
装置の１つの実施態様の模式図である。

図２は、UV吸収を使用した、三員複合体の特徴付けお
よび検出を示すエレクトロフェログラム（electrophero
gram）である。

図３は、蛍光を使用した、三員複合体の特徴付けおよ
び検出を示すエレクトロフェログラムである。

図４は、未処置の溶解シリカキャピラリーを使用して
行われたエレクトロフェログラムである。

図５は、ポリ−Glu荷電改変第２の結合パートナーを
使用した、強度に負に荷電した三員複合体の移動ふるま
いを示すエレクトロフェログラムである。

図６は、三員複合体の移動における電荷改変された第
２の結合パートナーの役割を示すエレクトロフェログラ
ムである。

図７は、本発明に従って実施した電気分離における、
複数部位で電荷改変された第２の結合パートナーの使用
を示すエレクトロフェログラムである。

好ましい実施態様の詳細な説明 以下により詳細に記載されるように、本発明は、分析
物を検出するための組成物、方法、および装置に関す
る。詳細には、特定の実施態様では、本発明の組成物、
方法、および装置は、超高速電気分離分析によって分析
物を検出するための電気分離による混合物の成分の分離
に関する。

組成物は、サンプル、第１の結合パートナー、および
第２の結合パートナーを含み、ここで、第１の結合パー
トナーはそれに付着した検出可能部分を有し、そして第
２の結合パートナーはそれに付着した電荷改変部分を有
する。これらの組成物は、電気泳動移動度の差異によっ
て、結合分析物からの結合していない第１の結合パート
ナー（サンプル中に存在する場合）の分離を許容し、そ
れによって、複合体形成をその指標として用いて、サン
プル中の分析物の定性的および定量的な検出の両方を許
容する。

本発明の方法は、混合物中の成分の電気分離を可能に
し、さらに、上記の組成物を用いて、サンプル中の分析
物の非存在、存在、または濃度の検出を可能にする。詳
細には、この方法は、サンプルと組み合わせて上述のよ
うな第１および第２の結合パートナーを利用し、結合し
ていない第１の結合パートナーから分析物含有複合体を
電気的に分離する。本発明に従って実施される場合、本
方法は、結合していない第１の結合パートナーによる干
渉なく、分析物含有複合体の検出を提供する。

本発明の装置は、請求の範囲の組成物を利用する上述
の方法を実施するに適した電気分離チャンネルを含有す
る。好ましい実施態様では、電気分離チャンネルは、単
数のチャンネルまたは複数のチャンネルを規定するよう
に精巧に作製されたキャピラリーおよび／または固体基
板の形態である。

本発明の主題は、超高速電気分離分析によって分析物
を検出するための診断試薬およびキットに関する。

本明細書に用いられる用語「分析物」は、本発明を用
いる検出を許容し得る任意の物質を意味することを意図
される。当業者に理解されるように、使用に適した分析
物は、少なくとも２つの異なる結合パートナーと特異的
に相互作用し、そして結合し得る任意の部分を含む。す
なわち、少なくとも２つの異なる結合パートナーと非一
過性（すなわち、非媒介性）の検出可能な複合体を形成
する任意の分析物が適切である。好ましい分析物は、化
学的および生化学的な部分（例えば、タンパク質、ペプ
チド、核酸、ペプチドホルモン、非ペプチドホルモン、
乱用の薬物、環境の汚染物質、製薬、微生物の抗原、ウ
イルスの抗原、炭水化物、ポリクローナル抗体、モノク
ローナル抗体、抗イディオタイプ抗体、抗体フラグメン
ト、酵素基質、酵素インヒビター、ビオチン、およびレ
セプター）を含む。現在、好ましい分析物は、臨床的有
意性を有する分析物（例えば、ホルモン、タンパク質、
ペプチド、微生物の抗原、ウイルスの抗原、およびビタ
ミン）である。複合体形成を受け入れるようにされ得る
（すなわち、少なくとも２つの異なる結合パートナーと
結合するように操作または改変され得る）生化学的また
は化学的物質が、本発明における使用に適切であると考
えられることをさらに理解されるべきである。

本明細書中で用いられる用語「サンプル」は、目的の
分析物について分析されるべき任意の検体を意味するこ
とを意図される。現在、好ましいサンプルは、目的の分
析物を含有すると推測される任意の生物学的または環境
的な検体を含むが、それらに限定されない。本発明にお
ける使用に適切なサンプルは、以下を含む体液を含み得
るがそれらに限定されない：血液、血清、血漿、尿、脳
脊髄液、唾液、汗、精液、膣液、羊水、および腹水。さ
らに、サンプルは、以下を含む流体を含み得るがそれら
に限定されない：環境の汚染物質について分析され得
る、雨水、海水、地下水、土壌抽出物、および下水。

本明細書中で用いられる用語「結合パートナー」は、
結合活性を有し得る任意の部分（moiety）を意味するこ
とを意図される。用語、結合パートナーは、対応する分
析物と特異的に相互作用および結合する能力を有する任
意の生化学的または化学的部分を含むが、これらに限定
されない。本発明を実施するために、特定の結合パート
ナーの主体性が、検出されるべき特定の分析物の主体性
により支配されることは、当業者に明らかである。一般
的には、本発明における使用に適切な結合パートナー
は、以下の生化学的および化学的部分を含むが、これら
に限定されない：タンパク質、ペプチド、核酸、ペプチ
トホルモン、非ペプチドホルモン、環境性の汚染物質、
レクチン、微生物の抗原、ウイルスの抗原、炭水化物、
ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、抗イディオ
タイプ抗体、抗体フラグメント、生合成抗体結合部位、
酵素、アビジン、およびレセプター。さらに、対応する
分析物と複合体形成するようにされ得る（すなわち、特
定の分析物と結合するよう操作または改変され得る）生
化学的および化学的物質が、本発明における使用に適切
であると考えられる。現在、好ましい結合パートナー
は、臨床的に重要な分析物の検出に適切であるパートナ
ーである。

本明細書中で用いられる「第１の結合パートナー」
は、少なくとも１つの検出可能部分を含み、そして検出
されるべき分析物上の「第１の結合部位」に特異的に結
合する。第１の結合部位は、第１の結合パートナーが結
合し、そして「第２の結合パートナー」によって認識さ
れない第１の結合パートナー認識部位を含む。さらに、
第１の結合パートナーは、第１の結合パートナーおよび
「検出可能部分」が連結される連結部位とは異なる第１
の分析物認識部位をさらに含む。

同様に、「第２の結合パートナー」は、少なくとも１
つの「電荷改変部分」を含み、そして検出されるべき分
析物上の第２の結合部位に結合する。第２の結合パート
ナーは、さらに第２の結合パートナーおよび電荷改変部
分が連結される連結部位とは異なる第２の分析物認識部
位を含む。分析物上の第２の結合部位が、分析物上の第
１の結合部位とは異なることを理解されたい。

上述のように、第１および第２の結合パートナーは、
抗体型であり得る。現在、一価の抗体フラグメントが好
ましい。以下に詳細に記載されるように、天然に存在す
る抗体分子のFc部分が欠失したＦ（ab′）またはＦ（a
b′）_２フラグメントのような抗体フラグメントもまた
好ましい。必須の結合特異性を示し、そして減少された
凝集および立体障害のような特性（すなわち、一価の抗
体またはFc部分を欠失する抗体それぞれによって典型的
に示される特性）を示す任意の抗体フラグメントは、本
発明における使用に適切な結合パートナーである。他の
結合パートナーおよびその等価物の同定は、当業者の技
術内に十分にあり、そして日常的な実験を必要とするの
みである。

本明細書で用いられる、検出可能部分は、本発明にお
ける使用に適切な部分であり、以下を含むがそれらに限
定されない：酵素、発蛍光団、発色団、放射性同位体、
電気化学的部分、および化学的ルミネッセンス部分。現
在の好ましい検出可能部分は、蛍光部分（例えば、ロー
ダミン）である。本発明に従って実施される場合、検出
可能な酵素標識は、現在、以前に可能であったよりもは
るかに容易に用いられ得る。免疫アッセイにおいて検出
可能なシグナルを産生するのに適切な多くの酵素は、例
えば、大きなかさ高いタンパク質であるので、抗体−酵
素結合体の非結合形態と結合形態形態との間の移動度の
十分な差異を得ることが困難であった。しかし、本発明
によれば、必要な移動度の差異は、電荷改変された第２
の結合パートナーを用いて容易に達成される。本発明
は、現在、当業者が生理学的な濃度の臨床的に重要な分
析物を検出するCEおよび他の電気分離技術とともに敏感
な酵素増幅アッセイを開発し、そして臨床的に適用する
ことを可能にしている。他の現在好ましい検出可能部分
は以下を含む：フルオレセン、シアニン染料、クマリ
ン、フィコエリトリン、フィコビリプロテイン（phycob
iliprotein）、ダンシルクロリド、およびレキサスレッ
ド。

このような部分は、当該分野認識されている技術を用
いて、上述の第１の結合パートナーのいずれかとも容易
に結合され得る。このような部分の付着が、本発明にお
ける使用に適切な第１の結合パートナーを産生する任意
の手段を用いて達成され得ること（すなわち、第１の結
合パートナーが、結合の前に分析物と結合する能力を保
有すること）は当業者により理解される。現在好ましい
第１の結合パートナーは、以下に記載のようなローダミ
ンヨードアセトアミドを用いて、ローダミンと結合した
Ｆ（ab′）抗体フラグメントである。

さらに、本発明は、内因性の、検出可能部分（例え
ば、紫外線の吸収によってタンパク質の検出を可能にす
る、タンパク質上の官能基）を有する第１の結合パート
ナーを含む組成物を意図する。

本明細書中で用いられる「組成物」は、電気分離分析
によってサンプル中の分析物の非存在、存在、または濃
度を検出するのに適切な本明細書中で規定される、サン
プルと第１および第２の結合パートナーの両方との任意
の混合物または任意の組み合わせを意味することを意図
される。

あるいは、「組成物」は、「三員複合体（three−mem
bered complex）」を意味し、ここで、第１および第２
の結合パートナーは分析物に結合している。上述の第１
の結合パートナーに付着した検出可能部分によって、こ
のような複合体の存在が検出可能であり、それにより次
いで、分析物の存在が指示される。本発明の利点は、本
明細書中で規定される結合した第２の結合パートナー
が、分析物含有複合体の信頼し得る検出を可能にするの
に十分な、この三員複合体の結合していない第１の結合
パートナーからの分離を可能にするという発見に直接関
連する。第１の結合パートナーが、結合状態または非結
合状態のいずれであれ、検出可能部分を保有するので、
分析物の存在の指示物として複合体形成を使用するため
に、非結合形態を複合体化した結合形態から分離するこ
とは必要である。

従って、本明細書中でまた請求されるように、本発明
の第２の結合パートナーは、少なくとも１つの「電荷改
変部分」に連結される。電荷改変部分は、その分離が複
合体の検出を可能にするのに十分であるような、分析物
含有複合体を結合していない第１の結合パートナーから
電気分離する能力を結合した第２の結合パートナーに付
与する任意の部分である。任意のこのような電荷改変部
分は、本発明における使用に適切である。本発明におけ
る使用に適切な電荷改変部分は、負の電荷または正の電
荷を付与し得る。当業者は、日常的な実験によって適切
な部分の主体性を決定し得る。

本発明の全ての上述の実施態様に関して、三員複合体
の電気泳動移動度は、結合した第２の結合パートナーに
依存している。さらに、三員複合体は分析物の存在の指
標である。さらに、上記の三員複合体と第１の結合パー
トナーとの電気泳動移動度は区別し得る。特定の実施態
様において、複合体と第１の結合パートナーとの電気泳
動移動度は、所定のpHの条件下では相反する徴候を示
す。

第２の結合パートナーに付着された電荷改変部分は、
複合性部分をさらに含有し得る。すなわち、第２の結合
パートナーに電荷を実際に付与する部分は、媒介物を介
して第２の結合パートナーに付着され得る。例えば、本
発明の１つの実施態様では、核酸塩基は、アミノエチル
グリシンポリマーのようなポリアミドを介して第２の結
合パートナーに付着する。一方で、核酸塩基それ自身
は、媒介物を介して付着されたとしても、第２の結合パ
ートナーにおいて電荷改変を実際に付与し得る。他方
で、この特定の例では、第２の結合パートナーは、ペプ
チジル核酸（PNA）に効果的に結合されている。例え
ば、Nilsenら、Science 254:497（1991）;Egholmら、Na
ture 365:566（1993）を参照のこと、両方の参考文献は
参考として本明細書中に援用される。従って、この例示
的な実施態様における電荷改変部分は、実際に、本明細
書中に意図される複合性の部分である。本質的には、電
荷付与部分と直接的または間接的に結合される任意の分
析物認識部位は、本明細書中で用いられるような第２の
結合パートナーの定義内にあり、そして本明細書におけ
る使用に適する。第２の結合パートナーにおいて電荷改
変を付与するのに適切な等価な複合性部分は、当業者の
知識内にあり、そして日常的な実験によって同定され得
る。

特定の好ましい実施態様では、組成物は複合体を含
み、ここで、第２の結合パートナーは単一部位電荷改変
因子を含む。すなわち、第２の結合パートナーは、それ
自身が電荷改変されるように単一位置で誘導体化され
る。例えば、本発明における使用に適切な単一部位電荷
改変因子は以下の部分を含むが、それらに限定されな
い：オリゴヌクレオチド、ポリアスパラギン酸、ポリグ
ルタミン酸、カルボキシメチルセルロース、ポリマレイ
ン酸、ポリ乳酸、ポリスルホン酸、およびポリアクリル
酸。他の単一部位電荷改変因子は以下を含む：ポリリジ
ン、ポリエチレンイミン、ポリアルギニン、およびポリ
（ジアリルジメチルアンモニウム）塩。現在、負の電荷
改変因子が関係する限りは、ポリT₂₀のようなポリＴが
本発明において現在好ましい；ポリＡ、ポリＣ、または
ポリＧが等しく良好に用いられ得る。他の単一部位電荷
改変因子は、ポリサッカライドまたはポリジオールのよ
うな（−OH）基を含有するポリマーである。このような
基は、ホウ酸塩が分離媒体中に含まれている場合、ホウ
酸塩と複合体を形成し、そして負の電荷を付与する。さ
らに、250の負の電荷を有するポリグルタミン酸は、特
定の他の実施態様において現在好ましい。例えば、以下
に詳細に記載されるように、Ｆ（ab′）抗体フラグメン
トに結合したポリグルタミン酸は、本発明における第２
の結合パートナーとしての使用に適切である。一般的に
は、おおよそ、３〜500の負の電荷または３〜500の正の
電荷の範囲を有する任意の電荷改変部分が、本発明にお
ける使用に適切である。しかし、当業者は、日常的な実
験のみを用いて、彼／彼女の特定の適用に最も適切な電
荷を同定し得る。

他の現在好ましい実施態様では、第２の結合パートナ
ーは、複数部位分布電荷改変因子を含む。すなわち、第
２の結合パートナーの電荷密度を変化させる改変はま
た、本発明における使用に適切である。例えば、第２の
結合パートナー上の複数の部位で付着した電荷改変部分
の分布を生じる改変が使用に適する。誘導体化されたリ
ジン残基を介してタンパク質性結合パートナーに付着し
ている（Asp）_３（アスパラギン酸三量体）または（Gl
u）₁₀（グルタミン酸十量体）のようなペプチドが現在
好ましい。さらに、分析物含有複合体の結合していない
第１の結合パートナーからの電気分離が熟考した電荷改
変を伴うことなく達成され得るように、本質的に十分に
電荷改変されている第２の結合パートナーはまた、本発
明における第２の結合パートナーとしての使用に適切で
あることが当業者により理解される。

本発明によれば、本明細書中に規定される、分析物、
第１の結合パートナー、および第２の結合パートナーの
三員複合体を含む組成物は、結合していない第１の結合
パートナーとは異なる電気泳動移動度を示す。さらに、
組成物の上述の電気泳動移動度は、第２の結合パートナ
ーに依存する。好ましくは、三員複合体と第１の結合パ
ートナーとの電気泳動移動度は相反するの徴候を示す。

特定の実施態様では、本発明の組成物、非一過性、す
なわち、非媒介性の検出可能な三員複合体を含む。これ
は、フリーゾーン（free zone）およびフリーフロー（f
ree flow）キャピラリー電気泳動のような技術を用いる
電気分離を受け入れ得る。上記のように、複合体（個々
の成分部分ではない）の検出は、分析物の存在の指示物
である。本発明はさらに、一旦複合体形成が起これば、
複合体のさらなる操作（例えば、分画および／または成
分部分への解離）が、定量または定性のいずれであって
も、分析物測定に必要とされないことを意図する。現在
の好ましい実施態様では、核酸分析物を含む複合体は、
少なくとも１つの非核酸結合パートナーをさらに含む。
同様に、２つの核酸結合パートナーを含む複合体は、さ
らに好ましくは、非核酸分析物を含む。以前に考察され
たように、WO 93 20236に開示されている組成物は、核
酸分析物およびそれに一時的に付着したポリヌクレオチ
ドを含む。実際、そこに開示された方法のアニーリング
および／または連結の工程の後に形成される組成物は、
２つのメンバーによる複合体または４つのメンバーによ
る複合体として特徴付けられ得る。さらに、開示された
組成物それ自体は、核酸分析物の存在、非存在、または
濃度の指示物ではない。

検出可能部分または電荷改変部分は、上記の抗体フラ
グメントに付着され得る；ヒンジ領域での抗体フラグメ
ントの誘導体化は、例えば、チオール反応性基（例え
ば、マレイミド（maleiimide）またはハロアセトアミ
ド）を有する検出可能部分または電荷改変部分を用いる
ような既知の方法によって達成され得る。従って、抗体
フラグメントに導入された部分は、抗体認識部位から除
去され、そして抗体−抗原認識においていかなる副作用
も有さない。特に、大きな部分（例えば、酵素または電
荷キャリア）が抗体に付着されるべきである場合、この
ことは特に重要な考慮である。抗体中のチオール基は、
異なる経路（例えば、（ｉ）ペプシン消化、それに続く
ヒンジ領域［Ｆ（ab′）」でのジスルフィドの還元；
（ii）ヒンジ領域［Ｆ（ab′）］_２でのジスルフィドの
結合の切断による２つの半分への完全な抗体の還元；お
よび（iii）種々の当該分野で認識されている二官能性
試薬の使用を介する化学的導入）を通じて生成され得
る。

本発明の第１の結合パートナーに関係する限り、現在
好ましい検出可能部分は、蛍光部分、ローダミンであ
る。ローダミンは、例えば、上記のチオール化学作用お
よびローダミンヨードアセトアミドを用いて、Ｆ（a
b′）フラグメントと首尾よく結合され得る。このよう
な第１の結合パートナーの調製は、周知の技術および市
販の試薬を用いて、当業者の技術内にある。抗ローダミ
ンカートリッジの使用は、過剰のＦ（ab′）_２および非
標識Ｆ（ab′）からのローダミン標識したＦ（ab′）の
精製に適する。

適切な第２の結合パートナーは、単一部位または複数
部位の電荷改変アプローチを用いて調製され得る。単一
部位改変については、多数の電荷を有する電荷キャリア
（例えば、ポリグルタミン酸（ポリ−Glu）を使用する
ことが、いくつかの状況において適切である。ポルグル
タミン酸は、種々の重合度（d.p.）で、かつ比較的狭い
分子量分布でSigma［St.Louis,MO］から入手可能であ
る。例えば、240の平均d.p.を有するポリ−Glu（分子量
約36,000;241の負の電荷）は、市販の二官能性試薬を用
いてアミノ末端に結合され得る。次いで、活性化された
ポリ−Gluは、Ｆ（ab′）抗体フラグメントに付着さ
れ、本発明の第２の結合パートナーを形成し得る。ポリ
−Gluを誘導体化するためのＦ（ab′）_２の還元的切断
から生じる、Ｆ（ab′）ヒンジ領域におけるチオール基
の使用は２つの利点を有する。第１に、結合に利用可能
なこのような基が２つまたは３つしか存在せず、そして
第２に、それらは抗体認識部位から離れている。本明細
書中での使用に適切な別の単一部位電荷改変部分は、オ
リゴヌクレオチドポリT₂₀（分子量約6000;20の負の電
荷）である。

現在、より低い電荷密度を有する市販のポリアミノ酸
（例えば、約30,000の分子量を有するポリ（Glu:Ala）
（グルタミン酸：アラニン）のコポリマー、または約8,
900の分子量を有するポリアスパラギン酸（ポリ−As
p））が好ましい。ポリアスパラギン酸が好ましい。な
ぜなら、それはより低いpKaを有し、そしてそれの過剰
量は、ゲル濾過によってFab′との結合の後に容易に除
去され得るからである。

タンパク質−タンパク質架橋は、当該分野で公知の種
々の方法によって入手され得る。例えば、第１に、異種
の二官能架橋剤、Ｎ−サクシンイミジル−６−マレイミ
ドカプロエート（succinimidyl−６−maleimidocaproat
e）のＮ−サクシンイミジル基は、ポリ−Gluの末端のア
ミノ基と反応させられる。この反応は、中性のpHではア
ミノ基に対して選択的である。次いで、未反応の架橋剤
は、Sephadex G−25を用いる従来のゲル濾過によって除
去される。第２の反応では、Fab′のヒンジのチオール
基は、マレイミド基とpH6で選択的に反応させられる;pH
6では、チオール基は、アミノ基よりも1000倍速く反応
する。架橋剤は２つの結合部位の間に５つのCH₂基を有
するので、Fab′とポリ−Gluとの間の立体障害は最小に
なる。例えば、Yositakeら、J.Biochem.92:1413−1424
（1982）の参照のこと（これは参考として本明細書に援
用される）。

上記のように、第２の結合パートナーはまた、複数部
位電荷改変部分を含み得る。この型の誘導体化スキーム
は、例えば、抗体分子の全体にわたって負の電荷を分布
させ、電荷密度を低下させる。このことは、大きな電荷
改変部分が抗体分子上の単一部位に付着している場合に
時々観察される非特異的（イオン性）相互作用を回避し
得る。抗体サクシニル化（アシル化）は、この点に関し
て適切な方法である。室温で抗体分子全体を無水コハク
酸と反応させることによって、全てのεアミノ側鎖（リ
ジン残基中に存在する）は、カルボキシル酸の無水物に
変換され、各々のリジン残基に関して中性のpHで、１つ
の正の電荷の正味の損失および１つの負の電荷の正味の
獲得を生じる。このことは、結合活性において観察され
るいかなる損失をも伴うことなく、抗体の電気泳動移動
度において増大を生じる。さらに、リジンアミノ側鎖を
介する抗体への共有結合性の付着によって、短いポリア
ミノ酸、特にポリ−Glu（分子量約1000）およびアスパ
ラギン酸の三量体（分子量約363）は、リジン残基あた
りそれぞれ、11および４の負の電荷を導入し得る。従っ
て、単一部位よりもむしろ、抗体分子全体にわたる電荷
の分布が達成され得る。

上記の複数部位結合スキームは、市販のヘテロ二官能
性架橋剤2,3−ジブロモプロピオニル−Ｎ−ヒドロキシ
サクシンイミドエステル（SDBP）を用いる、連続的なア
ミン−アミンカップリングに基づく。この場合、架橋剤
のＮ−ヒドロキシサクシンイミド（NHS）末端は、抗体
分子と最初に反応する。なぜなら、この基は、より低温
であるほど不安定であるからである。抗体分子上の一級
アミンは、０〜５℃で架橋剤分子で改変され、NHSの放
出を生じる。抗体は、ここで、その表面にアルキルジブ
ロミド基を含有する。その後、この基は、室温でポリア
ミノ酸の一級アミン末端にカップリングされる。

本発明のタンパク質改変のために意図される別のヘテ
ロ二官能性試薬は、スルホサクシンイミジル［４−ヨー
ドアセチル］アミノベンゾエート（スルホ−S1AB）であ
る。（Asp）_３または（Glu）_７の一級アミノ基は、Ｎ−
ヒドロキシサクシンイミドエステルを介して、スルホ−
S1ABと最初に反応する。これは、Ｎ−ヒドロキシサクシ
ンイミドの放出を介してスルホ−S1ABとペプチドとの間
にアミド結合の形成をもたらす。これとは別に、スルフ
ヒドリル基は、pH＞7.0でεアミノ側鎖を反応するTraut
の試薬を用いて第２の結合パートナー中に導入される。
その後、スルフヒドリル基は、スルホ−S1AB改変（As
p）_３または（Glu）_７のヨードアセチル基と反応し、安
定なチオエーテル連結を生じる。

一般に、良好な感度を得るためには、任意の上記の調
製物から結合していないＦ（ab′）、Ｆ（ab′）_２、お
よび未消化の抗体を除去することが重要である。結合し
ていない抗体フラグメントおよび／または抗体は、抗体
に結合する場合、誘導体化された試薬と競合することに
よってアッセイ感度を減少させ得る。この目的に向かっ
て、ペプシン消化の過程は、至適条件を決定するために
経時的に電気泳動によりモニターされ得る。例えば、ペ
ポシン消化混合物のアリコートは、８時間の期間にわた
って採取され、それに続いて未変性および変性ゲル電気
泳動に供され得る。至的な状況下では、抗体の消化は１
時間後に完了し、そして生成されたＦ（ab′）_２は、ペ
プシンによるさらなる切断に対して耐性である。

活性化されたスルホン基およびカルボキシ基を有する
短いSPE（固相抽出）カラムが、ポリ−Glu結合体と結合
していないＦ（ab′）の除去に適切である。約5.0のpH
を使用することによって、結合していないＦ（ab′）
は、カラムに吸着し、一方、高度に荷電したＦ（ab′）
−ポリ−Glu結合体は、排出容量とともに溶出する。Sep
hadex G−150を用いる従来のクロマトグラフィー分画も
また有用である。

別の局面では、本発明は、超高速電気分離分析を用い
て、分析物の存在、非存在、または濃度を検出する方法
を提供する。本発明に従って実施される場合、この方法
は、サンプル中の分析物の存在、非存在、または濃度の
指示物として上記の組成物を利用する。１つの実施態様
では、第１の結合パートナーおよび第２の結合パートナ
ーは、サンプルと組み合わされ、混合物（ここで、分析
物が存在する場合、三員複合体が形成される）を生成す
る。本明細書中で用いられる用語「組み合わせ」は、引
き続く分子レベルでの相互作用のために、複数の成分が
一緒にされる任意のプロセスを意味することを意図され
る。組み合わせは、同時または連続的に起こり得る。同
時または連続的のいずれかで第１および第２の結合パー
トナーをサンプルに添加することによって、上記の三員
複合体が検出され得ることが意図される。代表的には、
この方法は、上記のように入手された非分画性混合物を
用いて行われるが、本発明の方法を用いる所定の分析物
の検出は、分画した混合物の使用を必要とし得る。

サンプルおよび結合パートナーを組み合わせることに
より、「混合物」が生じる。いくつかの場合（例えば、
分析物がサンプル中に存在する場合）、この混合物は三
員複合体を含み、一方、他の場合（例えば、第１および
第２の結合パートナーが分析物に結合しない場合）、こ
の混合物は複合体化していない結合パートナーを含む。
本発明の方法の特定の実施態様では、混合物中の成分が
相互作用しそして複合体を形成する、より長期にわたり
機会を与えられるように、組み合わせの後にインキュベ
ーションを行い得る。複合体形成が平衡状態に進行し得
るのに十分な時間のために、特定の分析物および／また
は結合パートナーの混合物をインキュベートすることが
必要である得る。当業者は、日常的な実験法を用いて、
いつインキュベートする工程を含ませることが適切およ
び／または必要であるかを決定し得る。

本明細書中に開示されるように、分析物、第１の結合
パートナー、および第２の結合パートナーを含む三員複
合体が、種々の異なる状況下で形成され得ることが意図
される。例えば、複合体形成は、全ての成分が溶液中に
ある場合（例えば、体液または生理学的緩衝液のサンプ
ルにおいて）に起こり得る。複合体形成は、１つ以上の
成分が電気分離チャンネル内に配置される（予め形成さ
れたゾーンに分散されるか、またはチャンネルの予め選
択された領域に可逆的に固定化されるかのいずれか）場
合に起こり得る。このような代替的な実施態様では、複
合体生成の必須条件は、分析物および結合パートナー
が、実際の電気分離分析の前に相互作用するのに十分な
機会を有することである。上記のように、本発明の方法
に従って利用される複合体は、好ましくは、電気分離分
析において結合していない第１の結合パートナーとは異
なる電気泳動移動度を示し、それによって、分析物含有
複合体の容易かつ信頼し得る検出が可能になる。

本明細書に開示される少なくとも１つの実施態様によ
れば、サンプルおよび結合パートナーの混合物が、電気
分離チャンネル内に配置され得る。チャンネルは、好ま
しくは、直径約500μのキャピラリーである。次いで、
電位がチャンネル内に含まれる電気伝導性の媒体に適用
され、混合物内の成分の移動を実施する。現在好ましい
電気伝導性の媒体は、双性イオンをさらに含み得る生物
学的緩衝液である。特に好ましい伝導性媒体は、0.1％
メチルセルロースを含むアミノカプロン酸−酢酸であ
る。現在好ましい双性イオン化合物は、広範なpH範囲に
わたって機能的な四級アミン−スルホン酸化合物である
AccuPure^TM（Waters Corp.,Milford,MA）、である。一
般に、双性イオン化合物は、キャピラリー壁へのタンパ
ク質の吸着を防止および／または最小化することによっ
て、非被覆キャピラリー電気分離チャンネルで有用であ
る。本発明の方法および装置における使用に適切な等価
物の同定は、当業者の技術内に十分あり、そして日常的
な実験より多くを必要としない。

電気分離の工程の後、本発明の方法は、複合体の検出
を提供する。検出は、以下を含むがそれらに限定されな
い方法論によって達成され得る：紫外線の吸収、可視光
線の吸収、蛍光、屈折率、ラマン、質量分析、電気化
学、および伝導率。蛍光による検出が好ましい。

本発明の方法は、サンプル中の２以上の異なる分析物
を検出するために用いられ得る。当業者は、２つ以上の
異なる分析物の存在、非存在、または濃度が、本明細書
に開示される方法および日常的な実験を用いて決定され
得るように、可能性のある結合パートナー、検出可能部
分、および電荷改変部分の中から選択し得る。

変化し得る本発明の方法の実験パラメーターは、以下
を含むがそれらに限定されない：電気浸透流動（electr
o−osmostic flow）、電気泳動移動度、電気泳動媒体の
化学作用、pH、温度、イオン強度、粘度、サンプル容
量、電位、キャピラリーの長さ、検出方法、および反応
種の濃度。これらのパラメータの１つ以上を変化させる
ことは、日常的な実験を使用する当業者が本発明を利用
することを可能にし、そして本発明に用途の多様さを付
与する。

電気浸透流動の制御は、再現性のある分析を可能にす
る。電気浸透流動は、その系に存在する各化学種の電気
泳動速度における固有の因子であり、そして試薬の接触
の接続時間、ならびに検出可能な複合体の移動に影響し
得る。一貫しかつ再現性のある電気浸透流動が、本発明
の定量分析に必須である。なぜなら、複合体の電気泳動
の移動速度は、結合していない第１の結合パートナーと
は異なるからである。電気浸透流動は、キャピラリーの
被覆の特性を変化させることによって、増大、減少、ま
たは逆転され得る。被覆は、キャピラリー壁における電
荷を変化させ得、それによってキャピリー溶液界面のゼ
ータ電位を変化させ得る。さらに、キャピラリー被覆
は、この壁の局所粘度に影響し得、それ故、このシステ
ムの分子における溶液薬剤を増大または減少させること
によって電気浸透流動に直接的に影響し得る。さらに、
電気泳動媒体のpHならびにそのイオン強度は、キャピラ
リー／溶液界面のゼータ電位を変化させ、それによって
溶液流動を変化させる。

化学成分の電気泳動の速度は、電場におけるその電気
泳動移動度および電気浸透流動によって決定される。そ
の成分の電気泳動移動度は、電気泳動媒体の特性（例え
ば、pH、イオン強度、および粘度）によって影響され得
る。電気泳動媒体（例えば、遊離溶液）は、このシステ
ムの所定の成分の電気泳動移動度を選択的に妨害する物
理特性に関して選択され得る。例えば、媒体にふるい分
けの薬剤（sieving agent）を添加することにより、こ
れらの種の分子薬剤は増大し得、それ故、電気泳動移動
度は減少し得る。さらに、このシステムの荷電した分子
のイオン化の程度は、種々のpHで媒体を緩衝化させるこ
とおよびイオン強度を変化させることによって選択的に
変化され得る。電気泳動移動度における差異は、電気泳
動媒体、pH、イオン強度、および粘度の選択によって増
幅され得る。このようなパラメーターは、日常的な実験
のみを用いて当業者により至適化され得る。

サンプルおよび結合パートナーの容量、ならびにそれ
らがシステムに導入される順番は、他の実験パラメータ
ー（例えば、分析物および結合パートナーの相対的に電
気泳動移動度、ゾーン内の分析物またはパートナーの濃
度、ならびに複合体形成それ自身の速度論）に照らし合
わせて選択される。一般に、より高い電気泳動の速度を
有する成分を含有するゾーンは、より遅く移動する成分
ゾーンよりも後にキャピラリーに導入されることが望ま
しい。その結果、成分の電気泳動の速度が同じ方向に向
けられている場合、より速い成分は、より遅い成分を追
い越し得る。

電気泳動の移動を付与するのに必要とされる電位は、
代表的には、一般にセンチメートル当たり数百ボルトか
らセンチメートル当たり数千ボルトの範囲の電場強度で
操作される高電圧供給源によってキャピラリーを横切っ
て適用される。本明細書中に参考して援用される、米国
特許第4,865,706号および同第4,865,707号を参照のこ
と。電位の適用は、手動操作、波形発生装置、またはコ
ンピューター制御のいずれかを介して制御され得る。

キャピラリー電気泳動における化学種の移動速度は、
電気泳動の効果および電気浸透の効果に起因して適用さ
れる電場に正比例する。電場の強度は、化学種の相対的
な移動速度に影響しないが、アッセイ時間、いくつかの
実施態様においてゾーンのエンゲージメント（エンenga
gement）が起こる時間、および十分に浸透する総時間に
影響し、それ故、複合体形成は、本発明の所定の実施態
様において適用される電位によって指示され得る。例え
ば、本発明の特定の実施態様では、一旦分析物およびパ
ートナーゾーンがエンゲージ（engage）されると、適用
された電位は、接触の特性を決定する：ゼロよりも大き
な電位では動的およびゼロ電位では静的。本明細書で用
いられる、低電位は約１〜100ボルト/cmをいう；高電位
は約100〜300ボルト/cmをいう。より低い電場強度は、
化学種のより遅い移動を生じ、それによって、２つのゾ
ーンの接触時間を増大させる。

より高い電位は、アッセイに関与する種の移動速度の
大きさ（相対値ではなく）が比較的に増大するので、速
度の利点を提供する。いくつかの実施態様では、高い電
位はまた、迅速にゾーンを混合する能力を提供し、そし
て十分な反応時間および感度が関与しない反応について
は、分析時間を最小化する能力を付与する。アッセイに
関する特定の化学的なシステムの必要となるものを認識
すれば、当業者は、日常的な実験によってアッセイに関
与する各段階を至適化するように電位を容易に選択し得
る。例えば、ゾーンの合併段階は、高電位で行われ、迅
速で均一な混合を誘導し得る；複合体形成相の確認は、
より低い電位で行われ、複合体が形成し、そして最大の
感度を提供するのに十分な時間を与える。次いで、電位
は、増大され、検出器を通過して検出可能な複合体を掃
引し、そして分析時間を最小化し得る。

以下にさらに考察されるように、適用される電位と組
み合わせて用いられるキャピラリーの長さは、電場の強
度を決定し、従って、各化学種の移動速度にもまた影響
する。キャピラリーの全体の長さに加えて、分離長、す
なわち、キャピラリーへの導入の点と複合体が検出器を
通過する点との間の長さは、アッセイに影響する別のパ
ラメーターである。分離長は、本明細書中に開示される
方法の特定の実施態様の混合および複合体化相を実施す
るのに利用可能な時間に影響する。連続した電位のため
に、より長い分離長がしばしば必要である。

速度論のパラメーターはまた、pH、イオン強度、粘
度、および温度のような因子の選択によって変化され得
る。例えば、複合体形成は、温度に高度に依存し得る。
いくつかの実施態様では、サーモスタットキャピラリー
電気泳動システムの使用は反応温度の選択を可能にす
る。さらに、電気泳動媒体のpHおよびイオン強度が変化
され得る。

電気泳動媒体は重要である。なぜなら、それは、求め
られる物理的な分離を実施するのに必要な電位泳動速度
における変化性を付与するために、試薬種の物理特性を
利用することを担うからである。

別の局面において、本発明は、電気分離分析によりサ
ンプル中の分析物の存在、非存在、または濃度を検出す
るための装置を提供する。本発明の方法および組成物に
従って利用される場合、この装置は、サンプル中の分析
物を定性的および定量的に検出し得る。本明細書中に開
示されるように、この装置は、代表的には電気伝導性媒
体；注入ゾーン；サンプルを含む混合物；第１の結合パ
ートナーおよび第２の結合パートナー；ならびに電圧の
供給源を含む電気分離チャンネルを含む。他の実施態様
は、チャンネル内にサンプル、結合パートナー、および
／または三員複合体を配置するさらなる手段を含む。

この装置の１つの実施態様における電位の活性化は、
２つの反対の移動ゾーンに分離する三員複合体および結
合していない第１の結合パートナーをもたらし、一方の
ゾーンは複合体を含み、そしてもう一方は結合していな
い第１の結合パートナーを含む。三員複合体の電気泳動
の移動度は、装置の電気浸透流動と反対の方向である他
の特定の実施態様において、この複合体は動電気的にチ
ャンネルに注入される。本明細書中で意図される全ての
実施態様において、三員複合体は、上記の理由により結
合していない第１の結合パートナーの速度と区別可能な
速度で電気泳動的に移動する。

本発明の装置において、電気分離は、好ましくは電気
泳動により達成される。現在、フリーゾーン電気泳動が
好ましい。詳細には、フリーゾーン電気泳動は、媒体の
流動に平衡に電場が適用される、電解質を含有する非ふ
るい（non−sieving）媒体中で行われる電気分離法であ
る。代表的には、フリーゾーン電気泳動は、高度に分離
および増強された感度を可能にするキャピラリー中でバ
ッチプロセスとして行われる。しかし、キャピラリー電
気泳動は、キャピラリーの小さな直径により、調製シス
テムとして本質的に制限される。キャピラリーの直径の
増大は、受容可能な解決ではない。なぜなら、分離およ
び感度が損なわれるからである。対照的に、フリーフロ
ー電気泳動は、調整的な適用に適切である。従って、別
の現在好ましい実施態様はフリーフロー電気泳動であ
る。詳細には、フリーフロー電気泳動は、キャリアバッ
クグラウンド電解質の水圧ポンプフローに垂直に電場が
適用される同じ組成物の電質を含む非ふるい媒体中でも
また行われる電気分離法である。電気分離チャンネル中
の荷電した種は、それぞれの電気泳動移動度に従って電
場による直流の直線方向と異なる角度で一方にそらされ
る。代表的には、連続的なフリーフロー電気分離は、フ
ロースルーチャンバーにおいて行われ、それによりこの
システムの調製能力の拡張が可能となる。

本発明の好ましい実施態様において、フリーゾーン電
気泳動がキャピラリーとして作製された電気分離チャン
ネルにおいて行われる。本明細書中で用いられる用語
「キャピラリー」は、例えば、溶解シリカにより作製さ
れた、直径が約500μ未満のチャンネルを含むことを意
図される。特定の実施態様において、未処理のシリカが
好ましい。例えば、高いpH（例えば、pH＞9.5）で操作
される場合、未処理のシリカが好ましいことが、当業者
に理解される。他の特定の実施態様において、処理した
シリカが好ましい。例えば、生理学的pHの範囲で操作す
る場合、または電気浸透流動の排除が所望される場合、
当業者は、処理されたシリカを使用する。本発明が関連
する限り、処理したキャピラリーは、エポキシポリマ
ー、ポリエチレンイミン、アミノプロピル−シアル酸付
加（sialyted）被覆、およびポリアクリルアミドとの反
応の結果である共有結合的改変を有する内壁を有するキ
ャピラリーを含むが、それらに限定されない。さらに、
キャピラリーの内壁は、動力学的に（例えば、アミノ誘
導体、陽イオンポリマー、および陽イオン蛍光界面活性
剤に曝されることにより）改変され得る。本発明のキャ
ピラリーを含む蛍光態様についてのさらなる考慮が、以
下に詳細に記載される。

代表的には、本発明の装置は、入口端および出口端を
有するキャピラリーを有する。キャピラリーは、引き伸
ばしたガラス、または溶解シリカチューブ、あるいは電
気泳動の微小サンプルについての任意の等価な手段であ
り得る。キャピラリーは、約500μ未満の直径、そして
より好ましくは約25〜100μの直径を有し得る。キャピ
ラリーの長さは、入口端〜出口端まで、約0.5〜5,000セ
ンチメートル、好ましくは約２〜100cmの範囲であり得
る。センチメートル当たり数百ボルトからセンチメート
ル当たり数千ボルト以上の電場で操作するキャピラリー
が好ましい。本明細書中で参考として援用される米国特
許第4,865,706号および同第4,865,707号を参照のこと。
さらに、本発明において使用されるキャピラリーは、代
表的には、シリカのもろい特性による破損を防ぐために
外表面を薬剤（例えば、ポリイミド）で被覆されたシリ
カから構築される。

本発明の方法において、キャピラリー被覆を使用する
ことはしばしば有利である。これらの被覆は、被覆され
ていないシリカの使用に対するいくつかの利点を提供す
る。シラノール基のイオン化は、負に荷電したシリカ表
面を生成する。正に荷電した分析物（例えば、タンパク
質）は、負に荷電した壁に吸着し、これによりシリカ／
溶液界面でのζ電位を変化させる。ζ電位の崩壊は、電
気浸透流動を変化させ、再現性を減少させ、そして生成
物の回収を低下させ得る。電気浸透流動の変化は、定量
分析において特に有害である。キャピラリー表面の改変
はまた、電気浸透流動を制御するために有用であり得
る。電気浸透流動を調節する能力は、本発明の特定の実
施態様を行うための効果的な道具として作用する。例え
ば、ゾーンの電気泳動混合のプロセスならびに検出可能
な生成物の移動は電気泳動速度に依存し、従ってこのシ
ステムの電気浸透流動に依存する。

キャピラリー電気泳動に使用されたこれらの被覆とし
ては、シリカ表面の共有結合的改変ならびにキャピラリ
ー壁を力学的に改変するための緩衝添加剤の使用が挙げ
られる。共有結合的改変技術の代表的な例としては、エ
ポキシポリマー（Townsら、1992,Journal of Chromatog
raphy 599:227）、ポリエチレンイミン（TownsおよびRe
gnier、1990,Journal of Chromatography,516:69）、ア
ミノプロピル−シアル酸化被覆物（Mselyら、1991,Ana
l.Chem.63:109）、ポリアクリルアミド（Cobbら、199
0）Anal.Chem.62:2478;Hjerten,1985,Journal of Chrom
atography 471:429）が挙げられる。力学的被覆物の使
用の代表的な例としては、アミン添加剤（LauerおよびM
cManigill,1986,Anal.Chem.58:166;Nielsenら、1989,An
al.Biochem.177:20）、カチオン性ポリマー（Wiktorowi
czおよびColbum,1990,Electrophoresis 11:769）、およ
びカチオン性蛍光界面活性剤（Emmerら、1991,Journal
of Chromatography 547:544）が挙げられる。吸着され
た力学的被覆物に結合した共有結合改変はまた、例え
ば、シラン誘導体化表面に吸着された非イオン性界面活
性剤の使用（TownsおよびRegnier,1991,Anal.Chem.63:1
126）において使用される。ポリアクリルアミド被覆物
の場合、このような被覆物は、シロキサン架橋処理（例
えば、Kergerらによる米国特許第5,322,608号に開示さ
れる処理）の後に沈着されることが現在好ましい。

なお別の実施態様において、本発明の装置は、例え
ば、彫刻、化学薬品、またはレーザーを用いた除去エッ
チングにより、電気分離チャンネルを規定するために微
細に組み立てられた（microfabricated）固形基板を含
む。電気分離チャンネルは、適切な深さ、幅、および長
さのフロースルー通路として微細に組み立てられる。現
在、好ましい実施態様は、約0.1μｍ〜1000μｍの間、
好ましくは約10μｍ〜1000μｍの間、より好ましくは約
５μｍ〜100μｍの間のチャンネルの深さおよび幅を含
む。幅、深さ、および長さを規定するための適切なパラ
メーターは、日常的な実験のみを用いて当業者により容
易に決定され得る。さらに、本発明によれば、装置は複
数のチャンネルを備え得る。以下により詳細に開示され
るように、装置の好ましい実施態様は、シリコン、シリ
カ、またはガラスを用いて微細に組み立てられ得る。連
続的なサンプル前処理のためのシリコンチップ上に組み
込まれた自由な流れの電気泳動デバイスは、Raymond
ら、Analytical Chemistry 68:2858−2865（1994）によ
り記載される。別の好ましい実施態様において、装置は
有機ポリマーを用いて微細に組み立てられる。装置にお
ける使用に適切な有機ポリマーは成形され得、透明であ
ってもよく、また好ましくは、特定の検出手段による検
出を許容するために必要な程度まで透明であり得る。例
示的な有機ポリマーとしては、ポリカーボネートおよび
ポリスチレンが挙げられるが、これらに限定されない。
等価物の同定は当業者の知識の範囲内であることが理解
される。

本発明は、流体サンプルにおいて特定の分析物を検出
するための、小さい大量生産可能な、必要に応じて使い
捨ての装置のファミリーを提供する。装置は、フロース
ルーチャンネルおよび任意のサンプル引入口を規定する
ために微細に組み立てられる、典型的に数mmの厚さおよ
び約0.2〜2.0cm²のオーダーの固形基板を備え得る。装
置は少なくとも１つのフロースルーチャンネルを含む。
フロースルーチャンネルはまた、そこに配置される結合
部分を含む少なくとも１つのゾーンを提供する。必要に
応じて、結合部分は、チャンネル内に固定され得る。本
明細書中に開示されるように、装置は、広範囲の迅速な
診断試験に使用され得る。あるいは、装置は、異なる分
析物に対する２つ以上の異なる結合部分を備える２つ以
上のチャンネルを伴って組み立てられ得、２つ以上のア
ッセイが同時に実施されることを可能にする。必要に応
じて、装置は、アッセイの終了時に使い捨ててもよい。

超高速電気分離分析のための本発明の装置は、固形基
板材料から大量に設計され、そして組み立てられ得る。
シリコン、シリカ、およびガラスは、正確かつ効率の良
い組立てを可能にする多数の（enormaous body）技術の
ために好ましいが、他の材料も使用され、ポリテトラフ
ルオロエチレンのようなポリマーが挙げられる。例え
ば、本発明の装置は、当業者に公知の任意の種々のミク
ロ機械加工法によるシリカ基板から大量に安価に組み立
てられ得る。利用可能なミクロ機械加工法としては、フ
ィルム沈着プロセス（例えば、スピン被覆および化学蒸
着）、レーザー組み立てまたは写真平板技術（例えば、
UVまたはＸ線プロセス）、あるいは湿式化学プロセスま
たはプラズマプロセスを含むエッチング法が挙げられる
（例えば、Manzら、Trends in Analytical Chemistry 1
0:144−149（1991）を参照のこと）。様々な幅および深
さのフローチャンネルは、0.1〜1,000μｍのオーダーの
断面寸法を用いて容易に組み立てられ得る。

さらに、微細に組み立てられたフロースルーチャンネ
ルを備える基板は、薄い陽極に結合したガラスカバーで
覆われ、そして密封され得る。他の透明または不透明の
基板が挟まれ得る。あるいは、シリコン基板が２つのガ
ラスカバー間に挟まれ得る。透明なカバーの使用は、チ
ャンネル内容物を力学的に見ることを容易にし、視覚ま
たは機械のいずれかにより検出するための光学試験（pr
obing）を可能にする。他の組み立て装置がまた使用さ
れ得る。

現在１つの好ましい実施態様において、図１に模式的
に示される装置10は、フロースルーチャンネル20と共に
微細に組み立てられる溶解シリカ基板12を備え得、これ
に必要に応じて、所定の分析物を結合し得る結合部分を
備え得る。緩衝溶液および試薬流体は、フロースルーチ
ャンネル20の両方の末端に組み立てられる穴16を介して
フロースルーチャンネル20に提供され得る。サンプルお
よび試薬を、穴24を介して添加し得る。穴26を、過剰な
サンプル溶液を受けるために使用し得、代表的なサンプ
ルがフロースルーチャンネル20に存在することを確実に
する。微細に組み立てられたシリカ基板12を、第２の溶
解シリカ基板30で覆い得る。分析の間、デバイス10を、
穴16、24、および26への流体接合部および電気接合部と
共に支持体構造に配置し得る。チャンネルの寸法は、約
10μｍ〜1,000μｍ幅および約５μｍ〜100μｍの深さの
範囲で変化し得る。図１に示される装置のスケールを、
見やすくするために拡大する。

本明細書において開示される装置の容量は、非常に小
さく、従って分析に必要とされるサンプル流体の量を減
少させる。例えば、1cm×1cmシリコン基板において、10
ミクロンの幅×10ミクロンの深さ×1cm（10⁴ミクロン）
の長さであるその表面上に500個の溝の配列を有する場
合、各溝の容量は、10^-3μＬであり、500個の溝の総容
量は0.5μＬである。本発明の低容量の装置は、本明細
書において意図される特定の実施態様のチャンネルにお
いて実施される結合アッセイの反応速度を増強させる。
例えば、固定された結合部分の表面被覆を含むチャンネ
ルにおいて、質量作用の法則により予測されるように、
チャンネルの容量が減少すると、このゾーンにおける結
合部分の容量に対する表面積の割合は増加し、これは分
析物と可逆的に移動した結合部分との間の分子間反応の
速度を増加させる。好ましくは、本発明の装置の完全な
チャンネルシステムは、10μＬ未満のオーダーの容量を
有する。特定の実施態様において、酵素増幅が使用さ
れ、この場合、検出ゾーンは、少なくとも１つの寸法に
おいて迅速な速度論を支持するのに十分小さい。本発明
の装置のフロースルーチャンネルは、マイクロリットル
容量、あるいはナノリットル容量またはそれより少ない
容量で微細に組み立てられ得、これはアッセイのために
必要とされるサンプルおよび／または試薬流体の量を有
利に制限する。

フロースルーチャンネルを備える上記の装置は、この
装置へ、およびこの装置から流体を送達し、そして受け
るための器具とさらに組み合わされ得る。この器具は、
このフローシステムを通してサンプルを押し出すための
ポンプのような手段を含み得る。特定の分析物を含有す
ることが推測される生物学的流体が引入口に適用された
後、ポンプはサンプルを装置およびフロースルーチャン
ネルに押し出すように動かされる。あるいは、サンプル
は、この器具により装置に注入され得るか、またはキャ
ピラリー作用により引入口を通してフロースルーチャン
ネルに侵入し得る。器具の他の実施態様は、別々に形成
された装置と共に使用するため組み立てられ得る。

上記のように、結合部分は、その製造の後に、例え
ば、フロースルーチャンネルの表面または固相反応物
（例えば、検出ゾーンにおいて沈着されるポリマービー
ズ）に対する物理的吸収または化学的結合によりチャン
ネルに導入され得るか、または可逆的にチャンネルに固
定化され得る。

キャピラリーを備える装置の場合、シリコン基板にお
ける電気分離チャンネルの表面はまた、化学的に活性化
され、そしてタンパク質、脂質、多糖、または他の高分
子と共に反応し、チャンネル中に被覆表面を形成する。
シリカ表面の化学的活性化の技術は、当該分野において
利用可能である。（例えば、Haller:Solid Phase Bioch
emistry,W.H.Scouten編、John Wiley,New York,535−59
7頁、（1983）；ならびにMandeniusら、Anal.Biochem.,
137:106−114（1984）および170:68−72（1988）ならび
にMandeniusら、Methods in Enzymology,137:388−394
を参照のこと）。シリコンに生体分子を結合させるため
の技術は当該分野において多数存在する。例えば、酵素
は、光架橋性ポリビニルアルコールにおける捕獲（entr
apment）を介してシリコンデバイス上に固定され得るか
（Howeら、IEEE Transsactions Electron Devices,ED3
3:499−506（1986））、または予め形成された膜を用い
て間接的に結合され得る（Nanazatoら、IEEE Transacti
ons Electron Devices,ED33:47−51（1986））。疎水性
二層グリセロールモノオレエート被覆は、シリコン基板
上で組み立てられ得る。Fromherzら、Biochim.Biophys.
Acta,1062:103−107（1991）。

当該分野において公知のタンパク質結合技術および固
定化技術はまた、活性化シリカ表面との使用に適応され
得る。Kennedyら、Clin.Chem.Acta,70:1−31（1976）;S
ankolliら、J.Imm.Methods,104:191−194（1987）;kric
kaら、Clin.Chem.,26:741−744（1980）；およびDeLuca
ら、Arch.Biochem.Biophys.,225:285−291（1983）。当
該分野において公知の化学作用が、生体分子の被覆され
た、または被覆されていないシリコンチャンネル表面へ
の結合における使用に適用され得る。結合部分（例え
ば、抗原結合タンパク質、ポリヌクレオチドプローブ、
またはリガンド／レセプター対のうちの１つ）は、シリ
コンチャンネル表面に結合され得る。表面被覆装置は、
当該分野において公知な広範囲の入手可能な結合アッセ
イ（例えば、イムノアッセイ、酵素アッセイ、リガンド
／結合アッセイ、ポリヌクレオチドハイブリダイゼーシ
ョンアッセイ、および細胞表面結合アッセイ）のいずれ
においても利用され得る。所定の分析物の検出は、チャ
ンネルの表面上に被覆された適切な結合部分を選択する
ことにより行われ得る。

当該分野において公知の多くの結合アッセイプロトコ
ル（例えば、酵素結合イムノアッセイのような免疫化学
アッセイ技術）は、本発明の電気分離チャンネル装置に
おいて利用され得る。（Boltonら、Handbook of Experi
mental Immunology,Weir,D.M.編、Blackwell Scientifi
c Publications,Oxford,1986,第１巻、第26章、イムノ
アッセイについての一般的な考察のために、を参照のこ
と）。

任意の従来の検出方法が、本発明の装置において使用
され得、より従来のキャピラリー電気泳動法において使
用される方法を含む。任意の適切に検出可能な物理特性
の種の検出を可能にする検出方法が選択される。これら
の検出方法としては、紫外線または可視光線の収光度、
蛍光、屈折率、ラマン、質量分析、電気化学、および伝
導率が挙げられるが、これらに限定されない。本発明の
電気泳動的に異なる複合体の検出は、キャピラリーの長
さに沿った別々の位置で、オフラインで、またはキャピ
ラリーの全長を画像化することにより起こり得る（Wu
ら、1992,Anal.Chem.54:219、本明細書中に参考として
援用される）。

なお別の局面において、本発明は、電気分離分析を用
いて分析物の存在、非存在、または濃度を検出するため
のキットを提供する。キットの好ましい実施態様は、生
物学的サンプル中の臨床的に関連する分析物を検出する
ために形成される。１つの実施態様において、本発明の
キットは、試薬および装置を含む。

上記のキット試薬は、第１の結合部分に対する結合の
ための検出可能な部分、第２の結合部分に対する結合の
ための電荷改変部分を含む。１つの実施態様において、
第１および第２の結合部分は、検出および電荷部分から
別々に利用可能である。代表的には、第１の結合部分
は、検出されるべき分析物上の第１の結合部位に結合可
能であり、そして第２の結合部分は、検出されるべき分
析物上の第２の結合部位に結合可能である。この場合、
キットは、この検出可能な部分および電荷改変部分が、
それぞれ、第１および第２の結合部分に結合され得る結
合試薬をさらに含む。結合の際に、第１および第２の結
合部分は、それぞれ、上記に記載される第１および第２
の結合パートナーとなる。従って、このキット試薬を用
いて作製された第１の結合パートナーおよび第２の結合
パートナーは、サンプル中に存在する場合、分析物に結
合可能であり、これにより電気分離分析の間、非結合の
第１の結合パートナーとは異なる電気泳動移動度を示す
３つの部分からなる複合体を形成する。

本発明のキットの特定の他の実施態様において、試薬
は、それに結合される検出可能な部分を有する第１の結
合パートナー、およびそれに結合される電荷改変部分を
有する第２の結合パートナーを含む。さらに、サンプル
中に存在する場合、第１および第２の結合パートナーを
含むキット試薬は、電気分離分析の際に、結合されてい
ない第１の結合パートナーとは異なって移動する分析物
と複合体を形成する。従って、本発明のキット試薬は、
サンプル中の分析物を検出するための手段を提供する。

特定の実施態様において、本発明のキットは、１つの
チャンネルまたは複数のチャンネルを備える電気分離装
置をさらに提供する。本発明に従って行われる診断キッ
トは、必要に応じて、多数の使い捨ての装置を提供する
ことが意図される。本発明のなお別の実施態様におい
て、キットは、本明細書中において規定される１つのキ
ャピラリーまたは複数のキャピラリーを備える電気分離
装置を提供する。

本発明の精神または範囲を逸脱することなく、本発明
の組成物、方法、装置、およびキットにおいてなされ得
る種々の改変および変更は、当業者には明らかである。
従って、本発明は、添付の請求の範囲およびその等価物
の範囲内にあるという条件で、本発明の改変および変更
を含むことが意図される。本発明の実施は、以下の実施
例からより十分に理解され、これは例示のみのために本
明細書で示され、そしていずれの方法でも本発明を限定
するものとして解釈されるべきではない。

実施例1:結合パートナーの調製および特徴付け （ａ）いくつかの実施態様において、還元剤として２−
メルカプトエチルアミンを用いて産生された半抗体（ha
lf−antibody）を含む結合パートナーが、本発明の使用
に適切であることが見出された。さらに、ローダミンヨ
ードアセトアミドを用いて、検出可能な部分ローダミン
をこのような抗体に結合することは、0.96の色素対タン
パク質の比率で成功した。ローダミンが結合された抗体
フラグメントは、その対応する分析物に対する結合親和
性を保持した。

（ｂ）他の実施態様において、抗体の適合対を用いて産
生されたＦ（ab′）_２またはＦ（ab′）フラグメントを
含む結合パートナーが、本発明の使用に適切であること
が見出された。１つの実施態様において、この方法は、
反応性スルフヒドリル基で検出可能な部分を用いて標識
された抗体のFab′フラグメントを、結合している結合
パートナーとして提供する工程；検出可能なFab′フラ
グメントと分析物を含み得るサンプルとを合わせる工
程；キャピラリー電気泳動を用いて未反応の標識された
検出可能な結合パートナーから、形成された検出可能な
複合体を分離する工程；および、複合体を検出する工
程、を包含する。現在好ましい実施態様において、Fa
b′フラグメントは、単一のスルフヒドリル基で結合さ
れ、Fab′フラグメントに結合された検出可能な部分
は、蛍光色素であり、そして混合物の要素は、等電点電
気泳動または等速電気泳動のような技術を用いて電場に
集められた。

本発明の他の現在好ましい実施態様において、反応性
スルフヒドリル基（検出可能な部分のその後の結合のた
め）を有する抗体のFab′フラグメントは、タンパク質
分解酵素ペプシンで抗体を切断することにより生成さ
れ、２つのジスルフィド結合Fabユニットおよびヒンジ
領域、およびFc部分の小ペプチドからなる１つのＦ（a
b′）_２フラグメントを得た。次いで、ジスルフィド結
合されたＦ（ab′）_２は還元され、２つのFab′フラグ
メントを得た。好ましくは、鎖内ジスルフィド結合は、
酸化により形成され、それぞれ単一の反応性スルフヒド
リル基を有する別々のFab′フラグメントを生成する。

代表的に、結合されたFab′フラグメントは：反応性
スルフヒドリル基を有するFab′フラグメントを提供す
る工程;Fab′フラグメントの反応性スルフヒドリル基と
反応する部位を有する検出可能な部分を提供する工程；
そしてFab′フラグメントの反応性スルフヒドリルが検
出可能な部分の反応部位と反応し、検出可能なFab′フ
ラグメントを形成するように、Fab′フラグメントと検
出可能な部分とを共に混合する工程により調製された。

当該分野において周知であるように、抗体は、抗体分
子上の異なる部位に関連する異なる活性を有る。例え
ば、分析物の結合活性は、Fabフラグメント上に位置す
る重鎖（V_H）の可変領域および軽鎖（V_L）ドメインの可
変領域に関連するが、補体固定および細胞膜レセプター
相互作用のようなエフェクター機能は、通常Fcフラグメ
ントに関連する。結合アッセイにおける抗体フラグメン
トの使用により、他のドメインからの干渉を伴わずに、
分子のある部分の活性を利用することが可能であること
が当業者により理解される。

本発明における使用のために、抗体は、種々の当該分
野で認識される切断技術を用いて、それぞれが異なる活
性を有するフラグメントに選択的に切断され得る。例え
ば、パパンインは、２つのFabフラグメントと鎖間ジス
ルフィド結合を含む１つのFcフラグメントとに抗体を切
断する。対照的に、ペプシンを用いた切断により、１つ
のＦ（ab′）_２フラグメントとFc部分の小ペプチドとが
生成される。得られたＦ（ab′）_２フラグメントは、２
つのジスルフィド結合Fabユニットおよびヒンジ領域か
らなる。ジスルフィド結合Ｆ（ab′）_２フラグメント
は、２つのFab′フラグメントを得るために還元され
得、それぞれが１つ以上の遊離のチオール基を有する。
このようなペプシンで生成されたFabユニットのこれら
の反応性チオール基は、外部部分（例えば、蛍光体、発
色団、または結合リガンド）を結合するために有用な部
位（１つ以上）を提供する。

１つの現在好ましい実施態様において、マウスモノク
ローナルIgG₁体（Pierce;Rockford,III）はペプシンを
用いて切断され、そして得られたＦ（ab′）_２フラグメ
ントが単離され、そして還元剤（例えば、ジチオスレイ
トール、ジチオエリトリトール、またはβ−メルカプト
エチルアミン）を用いて処理され、３つの結合ジスルフ
ィド結合を還元し、そしてFab′フラグメントを生成す
る。システイン残基間の鎖間ジスルフィド結合は、Fa
b′分子あたり単一の反応性チオール基のみを提供する
ために、酸化により形成される。次いで、各Fab′フラ
グメント上の遊離のスルフヒドリル基は、テトラメチル
ローダミンヨードアセトアミド（Molecular Prodes;Eug
ene,OR）、またはポリメチレン鎖により結合された２つ
の４級化ヘテロ芳香塩基からなる蛍光色素であるシアニ
ン（例えば、Ernstら、Cytometry 10:3−10（1989）を
参照のこと、これは本明細書中で参考として援用され
る）で結合された。このフラグメントは、例えば、Imob
ilineゲル電気泳動（等電点焦点調節）（Pharmacia）に
より使用前に精製された。

（ｃ）電荷改変部分およびその結合に関して、市販のポ
リ−Gluのポリマーは、最初にいくつかの条件下で電気
泳動移動度を決定することにより特徴づけられた。例え
ば、未処理の電気泳動カラムを用いて、ポリ−Glu（分
子量約36,000;241負電荷）は、30秒でpH5.2で、電気浸
透流動に対して移動することが観察された。より高いpH
（＞6.5）で、メチルセルロース（0.1％）のような緩衝
液添加剤の使用は、電気浸透流動に対してポリ−Gluの
溶出を引き起こすために必要であることが決定されてい
る。また、ポリ−Gluの調製物は、約30Kのサイズ排除を
有するSephadex G−50を用いて分画され、分子量分布を
減少させ、そして小さなポリ−Glu分子を取り除いた。

多数の電荷を有する電荷キャリアが、現在好ましい。
例えば、種々の程度の重合度（d.p.）で、かつ相対的に
狭い分子量分布を有するポルグルタミン酸は、Sigma（S
t.Louis,MO）から入手可能である。

いくつかの実施態様において、240の平均d.p.を有す
るポリ−Gluは、二官能性試薬のアミン末端で結合され
る。次いで、活性化ポリ−Gluは、Ｆ（ab′）フラグメ
ントに結合され、本発明の第２の結合パートナーを形成
する。

現在好ましい実施態様において、末端アミノ基を有す
るポリ−Gluは、Ｆ（ab′）_２の還元切断後のこのよう
な化学作用に利用可能なFab′のヒンジ領域におけるチ
オール基とともに結合された。ポリ−Gluの結合のため
にヒンジ領域中のチオール基を使用することは、２つの
利点を有する。第１に、結合に利用可能な２または３の
みのこのような基が存在し、そして第２に、抗体認識部
位から離れている。

本発明の特定の実施態様は、Yoshtakeら、J.Biochem.
92.1413−1424（1982）により以前に記載されている、
タンパク質−タンパク質架橋化学、およびその改変を用
いて行われた。例えば、異種の２官能性架橋剤Ｎ−スク
シンイミジル−６−マレイミドカプロエート（100×過
剰に存在する）のＮ−スクシンイミジル基を、最初にポ
リ−Gluの末端アミノ基と反応させた。この反応は、ア
ミノ基に選択的な中性pHで進行させた。未反応の架橋剤
は、続いてSephadex G−25により除去された。第２の反
応において、Fab′のヒンジのチオール基を、pH6でマレ
イミド基と選択的に反応させた。このpHにおいて、チオ
ール基は、アミノ基よりも1000倍早く反応した。架橋剤
は、その２つの結合側面間に５つのCH₂基を有し、Fab′
とポリ−Gluとの間の任意の立体障害を最小にする。本
明細書中の使用に適切な等価な化学は、当業者には明ら
かである。

ポリT₂₀（分子量約6000;20負電荷）のような選択され
たオリゴヌクレオチド、ならびに他のポリ−Gluポリマ
ー（分子量約36,000;241負電荷）はまた、本明細書中に
開示されるような第２の結合パートナーの電荷を改変す
るための適切な部分であることが見出された。

単一の部位の電荷改変に適切な他の部分としては、グ
ルタミン酸、アラニン、およびチロシンのランダムの当
モルのコポリマー（分子量約40,000;低い体積電荷密
度）が挙げられる。市販の低い体積荷電密度を有するさ
らに他のポリアミノ酸としては、分子量約30,000を有す
るポリ（Glu;Ala）（グルタミン酸：アラニン）および
分子量約8,900を有するポリ（アスパラギン酸）のコポ
リマーが挙げられる。ポリ（アスパラギン酸）は、低い
pKaを有し、そしてその過剰物は、Fab′と結合させた
後、ゲル濾過により容易に除去されたので、好ましい。
等価物の同定は、当業者の範囲内である。

上記の結合スキームの全ては、単一部位の改変に関す
る。しかし、上記のように、本発明はまた、複数部位の
改変を意図する。例示的な複数部位の改変スキームは以
下の通りである。

（ｄ）この特定の結合スキームは、第２の結合パートナ
ー（例えば、抗体分子）にわたり負電荷を分布させ、体
積電荷密度をより低くした。これは、大きな電荷部分が
単一の部位で結合した場合、時々観察される非特異的
（イオン性）相互作用が回避された。例えば、完全な抗
体を無水コハク酸と室温で反応させることにより、全て
のεアミノ側鎖（リジン残基に存在する）は、カルボン
酸の無水物に変換され、各リジン残基の中性pHでの１つ
の正電荷の正味の損失（net loss）および１つの負電荷
の正味の増加（net gain）をまたらした。これは、結合
活性の消失が何ら観察されることなく、およそ因子２
（factor of 2）により、抗体の電気泳動移動度の増加
をもたらした。現在好ましい実施態様において、抗体
は、リジンアミノ側鎖を介して、短いポリアミノ酸（特
に、それぞれリジン残基あたり８および４の負電荷を導
入するポリGlu（分子量約1,000）およびアスパラギン酸
の３量体（分子量約363））に共有結合された。これ
は、１つの部位でよりも抗体全体にわたる電荷の分布を
確実にした。

上記の複数部位の結合スキームは、ヘテロ２官能性架
橋剤である2,3−ジブロモプロピオニル−Ｎ−ヒドロキ
シスクシンイミドエステルを用いた連続的なアミン−ア
ミンカップリングに基づく。詳細には、第１に架橋剤の
Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド末端を、この基は低温で
不安定であるので、抗体と反応した。抗体上の第１アミ
ンを、０〜５℃で架橋分子を用いて改変し、NHSの放出
が生じた。次いで、抗体は、その表面上にアルキルジブ
ロミド基を含み、その後、この基を、室温でポリアミノ
酸の第１アミン末端に結合させた。

実施例2:本発明に従って実施された超速電気分離アッセ
イ （ａ）一旦形成すると、３つの部分からなる複合体の特
徴付けおよび検出を、UV吸収および被覆カラム（例え
ば、pH4.40）を用いて、達成した。図2aに示すように、
２つのピークが結合体混合物から得られ、一方は過剰な
ポリGluを含み、そして他方は結合Ｆ（ab′）−ポリ−G
luを含んだ。予期されたように、結合フラグメントは、
遊離のポリ−Gluよりも低い移動度を有した。これらの
特定の条件下で、負に荷電した種のみがこの極性に移動
したので、過剰な非結合Ｆ（ab′）は溶出しなかった。
第２の結合パートナーを含む反応混合物への分析物hCG
の添加の際に、結合性Ｆ（ab′）−ポリ−Gluにより、
より低い移動度にシフトし、そしてより広いピークを得
た（図2bを参照のこと）。第１の結合パートナー、すな
わち、蛍光標識される適合性Ｆ（ab′）の添加により、
より低い移動度へのさらなるシフトが生じ（図2c）、そ
して複合体形成を得た。この複合体は、pH4.40で負に荷
電した分子として約1.5分内で移動した。

（ｂ）蛍光検出を用いた別の実験において、複合体形成
を、pH4.40での電気浸透流動およびバックグラウンドの
電解質を有しない、被覆キャピラリーカラムを用いてさ
らに確認した（図３）。これらの条件下で、蛍光標識さ
れた抗体を含む複合体である、ポリ−Glu（分子量約36,
000）とヒンジ領域で結合した適合性Ｆ（ab′）フラグ
メントおよび分析物hCGは、１分以内に負に荷電した種
として移動した。実験パラメーターを、蛍光標識を有す
るpH4.40で負に荷電した種のみが検出されることにより
観察した。従って、蛍光シグナルは、複合体形成のみか
ら生じた。なぜなら、蛍光標識された非結合抗体は、こ
のpHで正に荷電されたからである。ピーク形状および移
動時間は再現可能であった。

（ｃ）本発明の特定の実施態様において、異なる電気泳
動条件（未処理の溶解シリカキャピラリーを含む）が使
用された。これらの条件は、２つの目的に役立つ；第１
に、溶質−壁相互作用が、極度のpHに頼ることなく減少
した；そして第２に、電気浸透流動が、複合体がこの流
動に対して非常に迅速に移動するように減少した。現在
好ましい媒体は、0.1％のメチルセルロースと組み合わ
せた高濃度の生物学的緩衝液（アミノカプロン酸／酢
酸、0.1M）である。この媒体は、良好な移動時間の再現
性を伴う良好なピーク形状をもたらした。

上記の実験条件を用いて、電気浸透流動に対して移動
する複合体を、注入の45秒以内に検出した（図4a）。特
に、このような条件は、上記の微細に組み立てられた電
気分離装置を用いた使用に適切であった。

さらに、複合体形成を確認するために、hCGの非存在
下で実験を行った。このタイプの実験において、標識抗
体およびＦ（ab′）−ポリ−Gluを、hCGの非存在下で、
それ以外は図4aに記載のものと同一の条件下で、インキ
ュベートした、予期されたように、複合体含有ピーク
は、分析物の非存在下で検出されなかった（図4bを参照
のこと）。

同じ実験条件（すなわち未処理キャピラリー）下の正
面（frontal）電気泳動を用いた実験もまた行った。こ
の場合、底の端の緩衝液リザーバーを分析物で置換し、
そしてサンプル注入なしで電気泳動を進めた。複合体は
移動するのに十分な電気泳動移動度を有する唯一の分子
であるので、最終的にプラトー（plateau）を確立し
た。

（ｄ）上記のように、本発明の特定の実施態様を用いて
行った電気分離は、３つの部分からなる複合体および反
対方向に移動する結合していない第１の結合パートナー
を生じた。このような極端な環境において、これらの種
の分離は、実質的に完全に達成される。

これを図５に示す：パネルＡは、ローダミン標識抗hC
G抗体（黒矢印）のエレクトロフェログラム（electroph
erogram）である；パネルＡに示す小さな種（白矢印）
は、内部標準ローダミンである。（不純物もまた、白矢
印により示されるものと同様に移動する。）使用された
媒体は、1M AccuPure^TM（Waters Corp.,Milford,MA）を
含む25mMリン酸緩衝液（pH6.75）であった。パネルＢ
は、ローダミン標識抗hCG抗体調製物への分析物hCGの添
加を示す。パネルＢにおいて、斜線の矢印は、標識抗体
単独（黒矢印）からある程度区別可能である抗原−抗体
二重体（duplex）を示す。パネルＣは、結合していない
標識抗体または抗原−抗体二重体のいずれかの移動を著
しく影響せず、結合していないポリ−Glu（５×10^-6M、
36,000分子量）の添加を示す。

対照的に、パネルＤにはっきりと示されるように、上
記のポリ−Gluと結合し、それにより電荷が改変された
第２の抗体の添加により、抗原−抗体二重体の実質上の
消失が生じる（斜線の矢印、パネルＤを参照のこと）。

ローダミン標識抗hCG抗体に結合したhGCを示す二重体
のピーク（パネルＢ）は、ポリ−Gluが結合している第
２の抗体の添加により、３つの部分からなる複合体に変
換された。次いで、この３つの部分からなる複合体は、
第２の抗体から十分な負電荷を獲得し、その結果これら
の実験条件下で溶出しなかった。すなわち、これらの条
件下で、他の種は、強力な電気浸透流動により負電極に
向かって流れ出すが、高度に負に帯電した複合体は、非
常にゆっくり移動するので、電気分離キャピラリー中の
他の標識種の検出に比較可能な時間枠内で検出されなか
った。他の類似の実験において、複合体は、電気浸透流
動と反対方向に移動し、そして検出される唯一の種であ
った。いずれの例においても、結合していない標識結合
パートナーからの３つの部分からなる複合体の実質的に
完全な分離が達成された。

これらの観察は、分離条件を、任意の所望の程度の分
離が達成され得るように、当業者により操作され得るこ
とを示す。抗原が有意に不均一である場合、迅速な分離
が必要である場合、または、酵素の適用が使用され、そ
れゆえ遊離の標識結果パートナーにより形成されたもの
からの複合体により形成される産物の良好な分離が必要
である場合、一般に、図５、パネルＤに示すような分離
の程度は、望ましくあり得る。他の適用のために、より
少ない分離がより所望され得る。

図５に示す実験のために使用される電気分離条件はま
た、自由流（free−flow）電気泳動を用いる分析のため
に十分に適合される。自由流電気泳動において、サンプ
ル流体の流れが運搬される分離媒体の水圧でくみ出され
た流れを、流れの方向に直交する電場に供す。電場によ
り、運搬されるサンプルの流れは、電気泳動移動度に基
づいてサンプル成分の別々の流れに分配される。これら
の流れを検出し得、そして分析のために回収し得る。代
表的に、この分離は、非常に高い分解度を有しないが、
この方法は、一般にキャピラリー電気泳動において使用
され得るよりも多い容量を処理し得る。図５、パネルＤ
に示す結果は、複合体および標識抗体が電場において非
常に異なる移動挙動を有する状況を示す。自由流の電気
泳動において、同じ試薬および分離媒体を用いると、複
合体および標識抗体は、複合体の検出を簡単にする別々
の流れに容易に分かれる。

（ｅ）図６は、複数部位に電荷改変した第２の結合パー
トナーを用いて得られたエレクトロフェログラムであ
る。電気分離を、未処理の溶解シリカキャピラリーおよ
び1M AccuPure^TM（Waters Corp.,Milford,MA）を含む25
mMリン酸（pH6.75）を用いて行った。パネルＢは、hC
G、ローダミン標識第１抗体、およびスクシニル化した
電荷改変第２抗体を含む３つの部分からなる複合体（斜
線の矢印）の移動を示す。複合体は、結合していないロ
ーダミン標識抗体（黒矢印）とは明らかにおよび明確に
分離される。パネルＢとパネルＡを比較すると、この分
離の電荷改変第２抗体に対する依存性が明らかになる。
パネルＡにおいて、斜線の矢印はまた、３つの部分から
なる複合体を示すが、この特定の複合体は、hCG、標識
第１抗体、および改変されていない、非電荷第２抗体を
含む。従って、第２の結合パートナーに対する電荷改変
が、キャラリーのより負の領域に対するシフトを引き起
こすことにより、種の分離を達成するという事実が、図
６のパネルＡおよびＢにおいて明らかに示される。

図７はまた、複数部位で電荷改変した第２の結合パー
トナーを用いて得られたエレクトロフェログラムであ
る。実験条件は、図６に記載のようである。パネルＡ
は、ローダミン標識抗ｈ−CG抗体（黒矢印）およびロー
ダミン標識抗体とｈ−CGとの二重体（斜線の矢印）の移
動を示す。内部標準ローダミンを、白矢印で示す。パネ
ルＢは、スクシニル化した電荷改変抗hCG第２抗体の添
加を示す。ここで、斜線の矢印は、３つの部分からなる
複合体を示し、そしてパネルＡに対してより高い負の移
動度への明らかなシフトを示す。ここで、標識種の分離
を増強し、そして標識抗体単独（黒矢印）による干渉が
非常に減少した。

（ｆ）一般的に、本発明の分析物の存在または非存在を
定量的に検出することは、以下のことを必要とする：適
合性結合パートナー（例えば、特定の分析物に対する抗
体）を同定すること；および、その後、第１抗体と検出
可能な部分とを結合させたままで、改変して高い電荷を
有するように第２抗体を結合させること。分析物とのイ
ンキュベーションの際に形成される３つの部分からなる
複合体は、蛍光部分と電荷部分の両方を有し、従って、
過剰な蛍光抗体から容易に分離される。

単一部分の電荷改変を用いる例示的な実験において、
適合性抗ｈ−CG抗体を、最初にペプシンで切断し、続い
て２−メルカプトエチルアミンを用いてヒンジ領域を還
元して切断した。この処理により、ヒンジ領域で遊離の
チオール基を有するFab′フラグメントが生じた。１つ
のFab′を、中性pHで遊離チオールとのみ反応するトリ
メチルローダミン−５−ヨードアセトアミドで標識し
た。他のFab′を以下のように処理した：最初に、異種
の二官能性架橋剤であるＮ−スクシンイミジル−６−マ
レイミドカプロエートを、ポリ−Glu（分子量約36,000;
平均d.p.240）の末端アミノ基と、100倍過剰に反応させ
た。過剰な試薬を、Sephadex G−25ゲル濾過カラムを用
いて除去した。次いで、活性化ポリ−Gluのマレイミド
基を、pH6.0でFab′のチオール基と選択的に反応させ
た。

（ａ）上記の第１の結合パートナー（すなわち、蛍光
標識したFab′）、（ｂ）第２の結合パートナー（すな
わち、ポリ−Glu結合したFab′）、および（ｃ）分析物
hCGを結合する際に、複合体を、UV吸収および蛍光検出
の両方を用いて定量的に検出した。電気浸透流動を有し
ない被覆キャピラリーを用いて、複合体をpH4.4で負に
荷電した種として検出した。未処理溶解シリカキャピラ
リーを用いる限りでは、0.1％メチルセルロースと組み
合わせた高濃度の生物学的緩衝液（アミノカプロン酸／
酢酸、0.1M）は、良好な移動時間再現性を伴って適切な
ピーク形状を示した。定量的に、電気浸透流動に対して
移動する複合体を注入の45秒以内に検出した。

（ｇ）尿のような生物学的サンプル中の分析物hCGの定
量を、hCG、第１の結合パートナー、および第２の結合
パートナーの複合体の形成を測定することにより行い
得、上記の電気分離分析において検出し得る。例えば、
アッセイを、10μＬの尿サンプル、10μＬの３×10^-6M
ローダミ標識Fab′および10μＬの３×10^-6MポリGlu結
合Fab′を合わせることにより行い得る。この混合物
を、37℃で５分インキュベートする。インキュベーショ
ンの後、10nlのサンプル混合物を、0.1Mε−アミノカプ
ロン酸および0.1％メチルセルロースを含むポリアクリ
ルアミド被覆キャピラリーに注入し、酢酸でpH4.4に調
整する。分離を、30kV適用電位で行い、そして複合体ピ
ークを、励起用の514nmアルゴンイオンレーザーを用い
て、そして20nmバンドパスを有するバンドパスフィルタ
ーを用いた590nm周囲の放出波長を選択するレーザー蛍
光検出により検出する。このピークを、当該分野におい
て周知のピーク面積の検出により定量する。尿サンプル
中に存在するhCGの量は、複合体のピーク面積と、hCGの
ない尿中に調製されたhCGの既知のスタンダードを処理
するにより既に得られた検定曲線とを比較することによ
り決定される。本明細書中で開示された電気分離物質お
よび方法を用いる定量分析は、少なくとも約10^-10Mまた
は約49mIU/mlの感受性レベルで、hCGの検出を可能にす
ることが期待される。

上記のように、酵素は、本発明の物質および方法を用
いる使用に適切な検出部分である。当該分野で認識され
ている技術を用いて第１の結合パートナーに結合した酵
素、アルカリホスファターゼを用いる定量電気分離アッ
セイは、例えば、少なくとも約10^-12Mまたは約0.49mIU/
mlの感受性でhCGの測定を可能にする。シグナル増強の
ために酵素増幅を用いる酵素アッセイは、特定の分析物
（例えば、甲状腺刺激ホルモン）に対して好ましいとし
て、当業者により認識される。酵素結合技術および酵素
増幅プロトコルは、当該分野で周知であり、そして本発
明における使用に適切な酵素基質試薬の選択は、日常的
な実験法を用いる当業者の十分な範囲内である。

等価物 本発明は、本発明の精神または必須の特性を逸脱する
ことなく、他の特定の形態に包含され得る。従って、前
述の実施態様は、全ての局面において、本明細書中に記
載される本発明を限定的するのではなく、例示であるこ
とが考慮されるべきである。従って、本発明の範囲は、
前述の記載により示されるのではなく、添付の請求の範
囲により示される。従って、請求の範囲の等価物の意義
および範囲内にある全ての改変は本明細書中に包含され
るべきであることが意図される。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ Ｇ０１Ｎ 27/26 ３１５Ｈ (72)発明者 ナシャベー，ワシム エス. アメリカ合衆国 マサチューセッツ 02167，チェストナット ヒル，ウエス トゲイト ロード ナンバー４ 39 (72)発明者 シュマルジング，ディエター アール. アメリカ合衆国 マサチューセッツ 02118，ボストン，トレモント ストリ ート ナンバー４ 750 (56)参考文献 特開 昭63−279170（ＪＰ，Ａ) 生物物理化学、ＶＯＬ．39，ＮＯ．６ （1995）Ｐ．349−353 Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒ ｙ，ｖｏｌ．41，ｎｏ．９（1995）ｐ. 1403−1406 (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) G01N 33/561 G01N 27/447 G01N 33/533 G01N 33/563 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＪＩＣＳＴファイル（ＪＯＩＳ)

Claims (89)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】分析物を検出するための組成物であって； （ａ）分析物； （ｂ）該分析物上の第１の結合部位に結合する第１の結
   合パートナーであって、ここで該第１の結合パートナー
   は検出可能部分を含む；および （ｃ）該分析物上の第２の結合部位に結合する第２の結
   合パートナーであって、ここで該第２の結合パートナー
   は電荷改変部分を含み、それによって、サンプル中に分
   析物が存在する場合、該第１の結合パートナーおよび該
   第２の結合パートナーが、該分析物に結合して、結合し
   ていない第１の結合パートナーから電気的に分離可能な
   三員複合体を形成する、 組成物。
2. 【請求項２】前記第２の結合部位が前記第１の結合部位
   と異なる、請求項１に記載の組成物。
3. 【請求項３】前記第１および第２の結合パートナーが前
   記分析物に結合されている、三員複合体をさらに含む、
   請求項１に記載の組成物。
4. 【請求項４】前記三員複合体が、結合していない第１の
   結合パートナーと異なる電気泳動移動度を示す、請求項
   ３に記載の組成物。
5. 【請求項５】前記分析物が、少なくとも２つの異なる結
   合パートナーに対する特異的親和性を有する化学的また
   は生物学的部分である、請求項１に記載の組成物。
6. 【請求項６】前記分析物が、タンパク質、ペプチド、核
   酸、ペプチドホルモン、非ペポチドホルモン、誤用の薬
   物、環境汚染物、医薬、微生物の抗原、ウイルスの抗
   原、炭水化物、ビタミン、ポリクローナル抗体、モノク
   ローナル抗体、抗イディオタイプ抗体、抗フラグメン
   ト、酵素基質、酵素インヒビター、ビオチン、およびレ
   セプターからなる群より選択される、請求項１に記載の
   組成物。
7. 【請求項７】前記分析物が、タンパク質、ペプチド、ペ
   プチドホルモン、非ペプチドホルモン、誤用の薬物、環
   境汚染物、医薬、微生物の抗原、ウイルスの抗原、炭水
   化物、ビタミン、ポリクローナル抗体、モノクローナル
   抗体、抗イディオタイプ抗体、抗体フラグメント、酵素
   基質、酵素インヒビター、ビオチン、およびレセプター
   からなる群より選択される、請求項１に記載の組成物。
8. 【請求項８】前記分析物が、血液、血清、血漿、尿、脳
   脊髄液、唾液、汗、精液、膣液、羊水、腹水からなる群
   より選択される体液中に存在する、請求項１に記載の組
   成物。
9. 【請求項９】前記第１および第２の結合パートナーが、
   対応する分析物に対する特異的親和性および明確な結合
   親和性を有する、化学的または生物学的部分である、請
   求項１に記載の組成物。
10. 【請求項１０】前記第１および第２の結合パートナー
    が、タンパク質、ペプチド、核酸、ペプチドホルモン、
    非ペプチドホルモン、微生物の抗原、ウイルスの抗原、
    環境汚染物、レクチン、ポリクローナル抗体、モノクロ
    ーナル抗体、抗イディオタイプ抗体、抗体フラグメン
    ト、生合成抗体結合部位、酵素、アビジン、およびレセ
    プターからなる群より選択される、請求項１に記載の組
    成物。
11. 【請求項１１】前記第１および第２の結合パートナー
    が、タンパク質、ペプチド、ペプチドホルモン、非ペプ
    チドホルモン、微生物の抗原、ウイルスの抗原、環境汚
    染物、レクチン、ポリクローナル抗体、モノクローナル
    抗体、抗イディオタイプ抗体、抗体フラグメント、生合
    成抗体結合部位、酵素、アビジン、およびレセプターか
    らなる群より選択される、請求項１に記載の組成物。
12. 【請求項１２】前記第１の結合パートナーが、１価の抗
    体フラグメントを含む、請求項１に記載の組成物。
13. 【請求項１３】前記第１の結合パートナーが、Ｆ（a
    b′）またはＦ（ab′）_２抗体を含む、請求項１に記載
    の組成物。
14. 【請求項１４】前記分析物上の前記第１の結合部位が、
    前記第１の結合パートナーが結合しかつ前記第２の結合
    パートナーによっては認識されない第１の結合パートナ
    ー認識部位を含む、請求項２に記載の組成物。
15. 【請求項１５】前記第１の結合パートナーが、該第１の
    結合パートナーおよび検出可能部分が結合される結合部
    位とは異なる第１の分析物認識部位を含む、請求項１に
    記載の組成物。
16. 【請求項１６】前記検出可能部分が、酵素、蛍光団、発
    色団、放射性同位元素、および電気化学、化学発光部分
    からなる群より選択される、請求項１に記載の組成物。
17. 【請求項１７】前記検出可能部分が、蛍光部分を含む、
    請求項１に記載の組成物。
18. 【請求項１８】前記検出可能部分が、ローダミン、フル
    オレセイン、シアニン色素、クマリン、フィコエリスリ
    ン、フィコビリタンパク質、ダンシルクロリド、テキサ
    スレッドからなる蛍光部分の群より選択される、請求項
    17に記載の組成物。
19. 【請求項１９】前記第２の結合パートナーが、１価の抗
    体フラグメントを含む、請求項１に記載の組成物。
20. 【請求項２０】前記第２の結合パートナーが、Ｆ（a
    b′）またはＦ（ab′）_２抗体を含む、請求項１に記載
    の組成物。
21. 【請求項２１】前記分析物上の前記第２の結合部位が、
    前記第２の結合パートナーが結合しかつ前記第１の結合
    パートナーによっては認識されない第２の結合パートナ
    ー認識部位を含む、請求項２に記載の組成物。
22. 【請求項２２】前記第２の結合パートナーが、該第２の
    結合パートナーおよび電荷改変部分が結合される結合部
    位とは異なる第２の分析物認識部位を含む、請求項１に
    記載の組成物。
23. 【請求項２３】前記電荷改変部分が、単一部位荷電変更
    因子を含む、請求項１に記載の組成物。
24. 【請求項２４】前記電荷改変部分が、多数部位分布荷電
    変更因子を含む、請求項１に記載の組成物。
25. 【請求項２５】前記電荷改変部分が、オリゴヌクレオチ
    ド、ポリアミノ酸、ポリアスパラギン酸、ポリグルタミ
    ン酸、ポリアクリル酸、ポリスルホン酸、カルボキシメ
    チルセルロース、ポリ酪酸、およびポリマレイン酸から
    なる群より選択される負の電荷キャリアである、請求項
    １に記載の組成物。
26. 【請求項２６】前記電荷改変部分が、ポリグルタミン
    酸、ポリアスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン
    酸ヘテロポリマー、グルタミン酸含有ヘテロポリマー、
    およびアスパラギン酸含有ヘテロポリマーからなる群よ
    り選択される、請求項１に記載の組成物。
27. 【請求項２７】前記電荷改変部分が、ホウ素と複合体化
    して負に荷電した基を形成する−OH基を有するポリマー
    である、請求項１に記載の組成物。
28. 【請求項２８】前記電荷改変部分が、ポリＴオリゴヌク
    レオチドである、請求項１に記載の組成物。
29. 【請求項２９】前記電荷改変部分が、ポリリジン、ポリ
    アルギニン、ポリ（ジアリルジメチルアンモニウム）
    塩、およびポリエチレンイミンからなる群より選択され
    る、正の電荷キャリアである、請求項１に記載の組成
    物。
30. 【請求項３０】前記三員複合体および前記第１の結合パ
    ートナーの電気泳動移動度が、反対の徴候である、請求
    項４に記載の組成物。
31. 【請求項３１】前記三員複合体の電気泳動移動度が、結
    合した第２の結合パートナーに依存する、請求項４に記
    載の組成物。
32. 【請求項３２】サンプル中の分析物を検出するための組
    成物であって： （ａ）該分析物を含むと推測されるサンプルであって、
    ここで該分析物は第１の結合パートナーおよび第２の結
    合パートナーに結合し得る、サンプル； （ｂ）検出されるべき該分析物上の第１の結合部位に結
    合する該第１の結合パートナー、ここで該第１の結合パ
    ートナーは検出可能部分を含む；および （ｃ）該分析物上の第２の結合部位に結合する該第２の
    結合パートナー、ここで該第２の結合パートナーは電荷
    改変部分を含み、それによって、サンプル中に分析物が
    存在する場合、該第１の結合パートナーおよび該第２の
    結合パートナーが、該分析物に結合して、結合していな
    い第１の結合パートナーから電気的に分離可能な三員複
    合体を形成する、 を含む、組成物。
33. 【請求項３３】前記第２の結合部位が前記第１の結合部
    位とは異なる、請求項32に記載の組成物。
34. 【請求項３４】前記第１および第２の結合パートナーが
    前記分析物に結合されている三員複合体をさらに含む、
    請求項32に記載の組成物。
35. 【請求項３５】前記三員複合体が、結合していない第１
    の結合パートナーとは異なる電気泳動移動度を示す、請
    求項34に記載の組成物。
36. 【請求項３６】前記三員複合体が分析物の存在の指標物
    である、請求項３または34に記載の組成物。
37. 【請求項３７】サンプル中の分析物の非存在、存在、ま
    たは濃度を検出するための方法であって、該方法は： （ａ）（ｉ）検出されるべき分析物上の第１の結合部位
    に結合する第１の結合パートナー、ここで該第１の結合
    パートナーは検出可能部分を含む；および （ii）該分析物上の第２の結合部位に結合する第２の結
    合パートナー、ここで該第２の結合パートナーは電荷改
    変部分を含む、 をサンプルと組み合わせて、存在する場合には、該分析
    物が分析物、第１の結合パートナー、および第２の結合
    パートナーを含む三員複合体を形成するように混合物を
    生成する、工程； （ｂ）電気伝導媒体を含む電気分離チャンネル内に該混
    合物を配置する工程； （ｃ）該チャネルに電位を適用し、それによって、存在
    する場合には、三員複合体を、結合していない第１の結
    合パートナーから分離する工程；および、 （ｄ）該複合体を検出する工程、 を包含する、方法。
38. 【請求項３８】前記三員複合体が、工程（ｃ）において
    前記電位を適用した際に結合していない第１の結合パー
    トナーとは異なる電気泳動移動度を示す、請求項37に記
    載の方法。
39. 【請求項３９】工程（ａ）において生成される前記混合
    物が、前記第１および第２の結合パートナーを前記サン
    プルに、同時または連続的に添加することによって生成
    される、請求項37に記載の方法。
40. 【請求項４０】工程（ａ）において生成される混合物
    を、複合体形成が平衡状態に進行するのに十分な時間の
    間インキュベートする工程をさらに包含する、請求項37
    に記載の方法。
41. 【請求項４１】工程（ｂ）が、工程（ａ）の完了におい
    て得られる非画分性混合物を使用して実施される、請求
    項37に記載の方法。
42. 【請求項４２】工程（ｂ）の前記電気分離チャンネルが
    約500μ未満の直径を有するキャピラリーを含む、請求
    項37に記載の方法。
43. 【請求項４３】工程（ｄ）における前記複合体を検出す
    る工程が、紫外線の吸収、可視光線の吸収、蛍光、屈折
    率、ラマン、質量分析、電気化学、および伝導率からな
    る群より選択される方法によって達成される、請求項37
    に記載の方法。
44. 【請求項４４】工程（ａ）の前記サンプルが前記電気分
    離チャンネル内にある、請求項37に記載の方法。
45. 【請求項４５】工程（ａ）の前記第１および第２の結合
    パートナーが、前記電気分離チャンネル内に固定されて
    いる、請求項37に記載の方法。
46. 【請求項４６】前記固定された結合パートナーが、工程
    （ｃ）の電位を適用する工程の前に放出される、請求項
    45に記載の方法。
47. 【請求項４７】サンプル中の分析物の非存在、存在、ま
    たは濃度を検出するための方法であって、該方法は： （ａ）（ｉ）第１のゾーン、ここで該第１のゾーンは検
    出されるべき分析物上の第１の結合部位に結合する第１
    の結合パートナーを含み、ここで該第１の結合パートナ
    ーは検出可能部分を含む、および （ii）第２のゾーン、ここで該第２のゾーンは該分析物
    上の第２の結合部位に結合する第２の結合パートナーを
    含み、ここで該第２の結合パートナーは、電荷改変部分
    を含む、 を含む電気分離チャンネルを提供する工程； （ｂ）該電気分離チャンネル内にサンプルを配置する工
    程； （ｃ）該サンプル中に存在する場合には、該分析物が、
    分析物、第１の結合パートナー、および第２の結合パー
    トナーを含む三員複合体を形成するように該サンプルを
    該第１および第２のゾーンに接触させる、工程； （ｄ）存在する場合には、三員複合体を結合していない
    第１の結合パートナーから分離する工程；および （ｅ）該複合体を検出する工程、 を含む方法。
48. 【請求項４８】前記サンプルが２つ以上の異なる分析物
    を含有する、請求項37または47に記載の方法。
49. 【請求項４９】２つ以上の異なる三員複合体を形成させ
    る工程を含む、請求項48に記載の方法。
50. 【請求項５０】混合物の電気分離分析のための方法であ
    って、該方法は： チャンネルにおいて： （ａ）サンプル； （ｂ）分析物上の第１の結合部位に結合する第１の結合
    パートナー、ここで該第１の結合パートナーは検出可能
    部分を含む；および （ｃ）該分析物上の第２の結合部位に結合する第２の結
    合パートナー、ここで該第２の結合パートナーは電荷改
    変部分を含む、 を含有する混合物を電気的に分離する工程、 を包含し、 ここで、該分析物は、該サンプル中に存在する場合に
    は、該第１の結合パートナーおよび該第２の結合パート
    ナーとともに三員複合体を形成し、それによって結合し
    ていない第１の結合パートナーから電気的に分離可能と
    なる、 方法。
51. 【請求項５１】前記三員複合体が、電気分離分析におい
    て結合していない第１の結合パートナーとは異なる電気
    泳動移動度を示す、請求項50に記載の方法。
52. 【請求項５２】前記三員複合体の形成が、前記サンプル
    中の分析物の存在の指標である、請求項37、47、または
    50に記載の方法。
53. 【請求項５３】分析物を検出するための電気分離装置で
    あって： （ａ）（ｉ）電気伝導媒体 （ii）注入ゾーン；および （iii）該注入ゾーン内に配置された第１の結合パート
    ナーおよび第２の結合パートナーに結合し得る分析物を
    含むと推測されるサンプルを含む電気分離チャンネル、
    ここで該サンプルは： （１）該分析物； （２）該分析物上の第１の結合部位に結合する該第１の
    結合パートナー、ここで該第１の結合パートナーは検出
    可能部分をさらに含む；および （３）該分析物上の第２の結合部位に結合する該第２の
    結合パートナー、ここで該第２の結合パートナーは電荷
    改変部分をさらに含む、 を含有し、 ここで、該分析物、該第１の結合パートナー、および該
    第２の結合パートナーが三員複合体を形成するように該
    第２の結合部位は該第１の結合部位と異なり、それによ
    って結合していない第１の結合パートナーから電気的に
    分離可能になる； および （ｂ）該チャンネルを横切る電位を印加する電圧の供給
    源、 を含む、電離分離装置。
54. 【請求項５４】前記電位の活性化の結果、前記三員複合
    体および結合していない第１の結合パートナーが２つの
    反対の移動ゾーンに分かれ、一方のゾーンは該三員複合
    体を含み、他方のゾーンは該結合していない第１の結合
    パートナーを含み、その結果、前記分析物の検出を可能
    にするのに十分な程度に、該三員複合体を該結合してい
    ない第１の結合パートナーから分離する、請求項53に記
    載の装置。
55. 【請求項５５】電気分離が電気泳動によって達成され
    る、請求項53に記載の装置。
56. 【請求項５６】電気分離がフリーゾーン電気泳動をさら
    に含む、請求項55に記載の装置。
57. 【請求項５７】前記電気分離チャンネルが、適切な基質
    内に刻み込まれているか、エッチングされているか、ま
    たは配置されているチャンネルを含む、請求項53に記載
    の装置。
58. 【請求項５８】前記電気分離チャンネルが、適切な深
    さ、幅、および長さの流通通路を含む、請求項53に記載
    の装置。
59. 【請求項５９】前記電気分離チャンネルが、チャンネル
    を規定するために微細構築された固体基質を含む、請求
    項53に記載の装置。
60. 【請求項６０】前記微細構築された固体基質が、シリコ
    ン、シリカ、およびガラスからなる群より選択される、
    請求項59に記載の装置。
61. 【請求項６１】前記電気分離チャンネルが、前記基質を
    通る直線通路を含む、請求項59に記載の装置。
62. 【請求項６２】前記固体基質が有機ポリマーを含む、請
    求項59に記載の装置。
63. 【請求項６３】前記装置が、前記固体基質内に配置され
    た多数の微細構築されたチャンネルを含む、請求項59に
    記載の装置。
64. 【請求項６４】前記チャンネルの少なくとも一部内にお
    いて、チャンネル幅およびチャンネル深度が、約0.1μ
    ｍと1000μｍとの間にある、請求項59に記載の装置。
65. 【請求項６５】前記チャンネル幅が、約10μｍ〜約1000
    μｍである、請求項64に記載の装置。
66. 【請求項６６】前記チャンネル深度が、約５μｍ〜約10
    0μｍである、請求項64に記載の装置。
67. 【請求項６７】前記電気分離チャンネルがキャピラリー
    を含む、請求項53に記載の装置。
68. 【請求項６８】前記キャピラリーが、直径約500μ未満
    である、請求項67に記載の装置。
69. 【請求項６９】前記キャピラリーが、未処理または処理
    された溶解シリカをさらに含む、請求項67に記載の装
    置。
70. 【請求項７０】前記処置されたキャピラリーが、電荷を
    有する内壁をさらに含む、請求項69に記載の装置。
71. 【請求項７１】前記処置されたキャピラリーが、共有結
    合性の改変を有する内壁をさらに含む、請求項69に記載
    の装置。
72. 【請求項７２】前記共有結合性の改変が、エポキシポリ
    マー、ポリエチレンイミン、アミノプロピルシアル化コ
    ーティング、およびポリアクリルアミドからなる群より
    選択される物質の使用に関する、請求項71に記載の装
    置。
73. 【請求項７３】前記処置されたキャピラリーが、緩衝液
    添加物の導入によって力学的に改変された内壁をさらに
    含む、請求項69に記載の装置。
74. 【請求項７４】前記キャピラリーの前記内壁が、アミノ
    誘導体、カチオン性ポリマー、およびカチオン性蛍光界
    面活性剤からなる群より選択される物質によって、力学
    的に改変されている、請求項73に記載の装置。
75. 【請求項７５】前記三員複合体の電気泳動移動度が、逆
    方向の電気浸透性の流れであり、それによって、該複合
    体が電気動力学的に注入される、請求項53に記載の装
    置。
76. 【請求項７６】前記三員複合体の電気泳動移動度が、結
    合していない第１の結合パートナーの移動度と異なる、
    請求項53に記載の装置。
77. 【請求項７７】電気分離がキャピラリー電気泳動によっ
    て達成される、請求項53に記載の装置。
78. 【請求項７８】前記分析物を検出するための手段をさら
    に含む、請求項53に記載の装置。
79. 【請求項７９】前記分析物を検出するための前記手段
    が、サンプル中の分析物の存在の指標である前記三員複
    合体を検出するための手段をさらに含む、請求項78に記
    載の装置。
80. 【請求項８０】前記サンプル中の前記分析物の量を定量
    的に決定するための手段をさらに含む、請求項53に記載
    の装置。
81. 【請求項８１】前記分析物の量を決定するための手段
    が、前記サンプル中の分析物の濃度の指標である前記三
    員複合体の形成を定量的に決定するための手段をさらに
    含む、請求項80に記載の装置。
82. 【請求項８２】前記検出手段が、紫外線の吸収、可視光
    線の吸収、蛍光、屈折率、ラマン、質量分析、電気化
    学、および伝導率からなる群より選択される、請求項78
    に記載の装置。
83. 【請求項８３】サンプル中の分析物を検出するための電
    気分離装置であって： （ａ）電気分離チャンネル； （ｂ）（ｉ）サンプル、ここで該サンプルは分析物を含
    む； （ii）該分析物上の第１の結合部位に結合する第１の結
    合パートナー、ここで該第１の結合パートナーは検出可
    能部分を含む； （iii）該分析物上の第２の結合部位に結合する第２の
    結合パートナー、該第２の結合パートナーは電荷改変部
    分を含み、それによって結合していない第１の結合パー
    トナーから電気的に分離可能となる；および （iv）三員複合体、ここで該三員複合体は、該分析物、
    該第１の結合パートナー、および該第２の結合パートナ
    ーを含む；および （ｃ）該チャンネルを横切る電位を印加するための電圧
    の供給源、 を含む、装置。
84. 【請求項８４】電気分離が電気泳動によって達成され
    る、請求項83に記載の装置。
85. 【請求項８５】電気分離が、フリーゾーン電気泳動また
    はフリーフロー電気泳動をさらに含む、請求項84に記載
    の装置。
86. 【請求項８６】サンプル中の分析物の電気分離分析のた
    めのキットであって： （ａ）チャンネルを含む電気分離装置； （ｂ）第１の結合部分に付着させるための検出可能部
    分、ここで該第１の結合部分はサンプル中の分析物上の
    第１の結合部位に結合可能である；および （ｃ）第２の結合部分に付着させるための電荷改変部
    分、該第２の結合部分は該サンプル中の分析物上の第２
    の結合部位に結合可能である、 を含む、キット。
87. 【請求項８７】前記検出可能部分および前記電荷改変部
    分が前記第１および第２の結合部分それぞれに付着して
    第１の結合パートナーおよび第２の結合パートナーをそ
    れぞれ形成し得る付着試薬をさらに含有する請求項86に
    記載のキットであって、ここで、該第１の結合パートナ
    ーおよび該第２の結合パートナーが、前記サンプル中に
    存在する場合には、前記分析物に結合し得、それによっ
    て、電気分離分析の間、結合していない第１の結合パー
    トナーとは異なる電気泳動移動度を示す三員複合体を形
    成する。
88. 【請求項８８】前記チャンネルが、約500μ未満の直径
    を有するキャピラリーを含む、請求項86に記載のキッ
    ト。
89. 【請求項８９】サンプル中の分析物の電気分離分析のた
    めキットであって： （ａ）分析物上の第１の結合部位に結合する第１の結合
    パートナー、ここで該第１の結合パートナーは検出可能
    部分を含む；および （ｂ）該分析物上の第２の結合部位に結合する第２の結
    合パートナー、ここで該第２の結合パートナーは電荷改
    変部分を含む、 を含み、その結果、該第１および第２の結合パートナー
    が、存在する場合には、該分析物と三員複合体を形成
    し、それによって、結合していない第１の結合パートナ
    ーから電気的に分離可能となり、そして電気分離による
    複合体化された分析物の検出が可能になる、キット。