JP2997056B2 - 魚におけるフルンケル症予防用ワクチン - Google Patents
魚におけるフルンケル症予防用ワクチンInfo
- Publication number
- JP2997056B2 JP2997056B2 JP3506773A JP50677391A JP2997056B2 JP 2997056 B2 JP2997056 B2 JP 2997056B2 JP 3506773 A JP3506773 A JP 3506773A JP 50677391 A JP50677391 A JP 50677391A JP 2997056 B2 JP2997056 B2 JP 2997056B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- strain
- aeromonas
- attenuated
- gene
- mutation
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/02—Bacterial antigens
- A61K39/0208—Specific bacteria not otherwise provided for
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/04—Antibacterial agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/28—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Vibrionaceae (F)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/55—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the host/recipient, e.g. newborn with maternal antibodies
- A61K2039/552—Veterinary vaccine
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Public Health (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Oncology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】 本発明は、Aeromonas（アエロモナス）の弱毒化され
た菌株、及び魚におけるフルンケル症予防用ワクチンと
してのこのような菌株の利用に関する。特に、本発明
は、芳香環生合成経路内での突然変異を有するAeromona
s弱毒菌株に関する。
た菌株、及び魚におけるフルンケル症予防用ワクチンと
してのこのような菌株の利用に関する。特に、本発明
は、芳香環生合成経路内での突然変異を有するAeromona
s弱毒菌株に関する。
Aeromonas salmonicida（アエロモナス・サルモニシ
ダ）は、種々の硬骨魚を冒しうる病気であるフルンケル
症の病因であり、サケ及びマスの養殖において非常に重
要なものである。この病気は、一般にサケ・マスにおい
て致命的なものであり、環境面の重大な影響をもたらし
うる、魚の養殖業界における高濃度の抗生物質の使用を
導く。
ダ）は、種々の硬骨魚を冒しうる病気であるフルンケル
症の病因であり、サケ及びマスの養殖において非常に重
要なものである。この病気は、一般にサケ・マスにおい
て致命的なものであり、環境面の重大な影響をもたらし
うる、魚の養殖業界における高濃度の抗生物質の使用を
導く。
フルンケル症に対する効果的なワクチンの産生に、多
大な努力が払われてきた。これまでのワクチンの大部分
は、バクテリン（bacterins）又はトキソイド化亜細胞
成分又はその両方の組合せであった（Austin and Austi
nにより総説、1987年）。以前毒性であったA.salmonici
da菌株の弱毒化された突然変異株は、実験室内の継代培
養により容易に誘導できる。（McCarthy and Rberts、1
980年;Munn and Trust、1984年）。この弱毒化には、通
常、外表面タンパク質Ａ層（Ａ−layer）の喪失が伴っ
ている。A-菌株は、毒性A+菌株に伴う表面抗原決定基が
欠如し（McCarthy他、1983年;Olivier他、1985年）、し
かも魚に投与した場合の持続性が弱いことから（Munn a
nd Trust、1985年）、弱毒化生ワクチンとしては不適当
である。しかしながら、このような菌株の１つはタイセ
イヨウサケにおいて防御免疫を引き出すものとして報告
されたが（Cipriano and Starliper、1982年）、商業的
ワクチンの形で開発されてはいない。
大な努力が払われてきた。これまでのワクチンの大部分
は、バクテリン（bacterins）又はトキソイド化亜細胞
成分又はその両方の組合せであった（Austin and Austi
nにより総説、1987年）。以前毒性であったA.salmonici
da菌株の弱毒化された突然変異株は、実験室内の継代培
養により容易に誘導できる。（McCarthy and Rberts、1
980年;Munn and Trust、1984年）。この弱毒化には、通
常、外表面タンパク質Ａ層（Ａ−layer）の喪失が伴っ
ている。A-菌株は、毒性A+菌株に伴う表面抗原決定基が
欠如し（McCarthy他、1983年;Olivier他、1985年）、し
かも魚に投与した場合の持続性が弱いことから（Munn a
nd Trust、1985年）、弱毒化生ワクチンとしては不適当
である。しかしながら、このような菌株の１つはタイセ
イヨウサケにおいて防御免疫を引き出すものとして報告
されたが（Cipriano and Starliper、1982年）、商業的
ワクチンの形で開発されてはいない。
Ａ層を保持する弱毒菌株についての記述もなされてい
る（Hackett他、1984年;Sakai、1985年）が、弱毒化の
正確な性質はわかっていなかった。点突然変異が関与し
ていた場合、この突然変異株は、魚への投与後、毒性に
復帰することがある得る。化学的に突然変異誘発の後に
分離されたプロテアーゼ欠損突然変異体は防御免疫を引
き出さなかった（Sakai、1985年）。従って、これまで
の弱毒化生菌株はフルンケル症に対する予防接種には不
適当であった（Michel、1982年）。
る（Hackett他、1984年;Sakai、1985年）が、弱毒化の
正確な性質はわかっていなかった。点突然変異が関与し
ていた場合、この突然変異株は、魚への投与後、毒性に
復帰することがある得る。化学的に突然変異誘発の後に
分離されたプロテアーゼ欠損突然変異体は防御免疫を引
き出さなかった（Sakai、1985年）。従って、これまで
の弱毒化生菌株はフルンケル症に対する予防接種には不
適当であった（Michel、1982年）。
本発明によれば、芳香環生合成経路の遺伝子に突然変
異を有するAeromonas弱毒菌株が提供されている。
異を有するAeromonas弱毒菌株が提供されている。
好ましくは、この突然変異は単一の工程で修復され得
ないような、非復帰性のものである。この突然変異は、
逆位、置換又は欠失変異であってよい。
ないような、非復帰性のものである。この突然変異は、
逆位、置換又は欠失変異であってよい。
特に、この突然変異は、aroA遺伝子（すなわち、５−
エノールピルビルシキメート−３−ホスフェート（EPS
P）シンターゼをコードする遺伝子）におけるものであ
ってよい。
エノールピルビルシキメート−３−ホスフェート（EPS
P）シンターゼをコードする遺伝子）におけるものであ
ってよい。
本発明はまた、1990年２月26日付で登録番号40261号
としてスコットランドのNational Collection of Indus
trial and Marine Bacteria,23,St.Machar Drive,Aberd
een AB2 1RYに寄託されたAeromonas salmonicida菌株DU
5847、又はカナマイシン薬剤感受性マーカーが切除され
た状態の菌株、又は1991年３月11日付で登録番号NCIMB4
038としてスコットランドのNational Collection of In
dustrial and Marine Bacteria,23,St.Machar Drive,Ab
erdeen AB2 1RYに寄託された菌株DU5860、又は芳香環生
合成経路の突然変異遺伝子をコードするDNA領域内で寄
託菌株に実質的に類似したAeromonas菌株にも関する。
なお、ここで、この菌株は弱毒化されたものである。
としてスコットランドのNational Collection of Indus
trial and Marine Bacteria,23,St.Machar Drive,Aberd
een AB2 1RYに寄託されたAeromonas salmonicida菌株DU
5847、又はカナマイシン薬剤感受性マーカーが切除され
た状態の菌株、又は1991年３月11日付で登録番号NCIMB4
038としてスコットランドのNational Collection of In
dustrial and Marine Bacteria,23,St.Machar Drive,Ab
erdeen AB2 1RYに寄託された菌株DU5860、又は芳香環生
合成経路の突然変異遺伝子をコードするDNA領域内で寄
託菌株に実質的に類似したAeromonas菌株にも関する。
なお、ここで、この菌株は弱毒化されたものである。
本発明の芳香族依存性突然変異体は、次のような理由
から、これまでの弱毒化生ワクチンに比べ多大な改良を
提供する： （ｉ）弱毒化の原因が正確に規定されている。
から、これまでの弱毒化生ワクチンに比べ多大な改良を
提供する： （ｉ）弱毒化の原因が正確に規定されている。
（ii）弱毒化された細菌は、毒性生物体上に存在する表
面抗原を保持し、かくして優れた免疫原である。
面抗原を保持し、かくして優れた免疫原である。
（iii）弱毒化された生物体は完全に無毒性である。
（iv）Aro-表現型は復帰できない。
本発明はまた、フルンケル症予防用ワクチンの調製に
おける、芳香環生合成経路の遺伝子に突然変異を有する
Aeromonas弱毒菌株の利用にも関する。
おける、芳香環生合成経路の遺伝子に突然変異を有する
Aeromonas弱毒菌株の利用にも関する。
さらにもう１つの態様においては、本発明は、芳香環
生合成経路の遺伝子に突然変異を有するAeromonas弱毒
菌株を含む、フルンケル症に対するワクチンを提供す
る。
生合成経路の遺伝子に突然変異を有するAeromonas弱毒
菌株を含む、フルンケル症に対するワクチンを提供す
る。
本発明はさらに、芳香環生合成経路の遺伝子に突然変
異を有するAeromonas弱毒菌株を、免疫応答を引き出す
のに充分な量で用いて魚を免疫することを含む、魚にお
けるフルンケル症予防方法を提供する。好ましくは、こ
の方法は、第１の免疫量とそれに続く第２の追加免疫
（ブースター;booster）量の前記Aeromonas弱毒菌株の
投与を含む。
異を有するAeromonas弱毒菌株を、免疫応答を引き出す
のに充分な量で用いて魚を免疫することを含む、魚にお
けるフルンケル症予防方法を提供する。好ましくは、こ
の方法は、第１の免疫量とそれに続く第２の追加免疫
（ブースター;booster）量の前記Aeromonas弱毒菌株の
投与を含む。
芳香族化合物のための生合成経路は、まずエリトロー
ス−４−ホスフェートとホスホエノールピルベートの反
応から最終的なコリスミン酸の合成へと導く。次にこの
経路は分岐して芳香族アミン酸とｐ−アミノ安息香酸
（PABA）を形成する。このｐ−アミノ安息香酸の方は、
DNAとタンパク質の生合成においてきわめて重大な役割
をもつ補助因子である葉酸に変換される（図１）。細菌
とは対照的に、高等動物は葉酸又はPABAを合成しない。
PABA合成の欠損している細菌は、代謝阻止がバイパスさ
れうるほど充分高いレベル外因性PABAが存在せず、さら
に細菌が外因性葉酸をとり込むことができないことか
ら、感染した動物内で生育できない。
ス−４−ホスフェートとホスホエノールピルベートの反
応から最終的なコリスミン酸の合成へと導く。次にこの
経路は分岐して芳香族アミン酸とｐ−アミノ安息香酸
（PABA）を形成する。このｐ−アミノ安息香酸の方は、
DNAとタンパク質の生合成においてきわめて重大な役割
をもつ補助因子である葉酸に変換される（図１）。細菌
とは対照的に、高等動物は葉酸又はPABAを合成しない。
PABA合成の欠損している細菌は、代謝阻止がバイパスさ
れうるほど充分高いレベル外因性PABAが存在せず、さら
に細菌が外因性葉酸をとり込むことができないことか
ら、感染した動物内で生育できない。
細菌のその他の種の芳香環生合成経路突然変異体も知
られているが、このようなAeromonasの突然変異体が、
感染した魚において疾病の症候をひきおこさないほど充
分に弱毒化され、また同時に免疫応答を誘発するのに充
分なほど長い間魚の体内で持続するだろうということを
これまでに予測することはできていなかった。例えば、
S.typhimurium aroA突然変異体は、マウスにおいて、マ
ウスサルモネラ症に対する有効な生ワクチンであること
がわかっており（Hosieth ＆ Stoker、1981年）、また
２つ芳香環生合成遺伝子の各々に突然変異を宿したS.ty
phimurium菌株がマウスサルモネラ症に対するワクチン
菌株として有効であることもわかっている（Wellcome F
oundation Ltd.のPCT刊行物No.PCT/GB88/01143）。しか
しなが、３つの無毒性Salmonellatyphimurium芳香族依
存性突然変異体のうち２つは、子牛において生−生物体
ワクチンとして効果がないことがわかっている（Smith
他、1984年）。さらに、Yersinia enterocoliticaのaro
A突然変異体は、ラットの実験的感染に対して低い防御
性しか与えず（Bowe他、1989年）、Salmonella Cholera
esuisのaroA突然変異体は、マウスにおいて生ワクチン
として効果がなかった（Nnalue ＆ Stocker、1987
年）。しかしながら、驚くべきことに、Aeromonas salm
onicidaの芳香族依存性突然変異体が無毒性であり、感
染した魚の体内で最高約２週間生きのび、しかも強い防
御免疫を刺激することが発見された。従って、これら
は、フルンケル症に対する弱毒化生ワクチンとして使用
するのに適している。このようなワクチンはまた、細菌
が宿主の免疫系に効果的な形で提示されるという利点も
有している。
られているが、このようなAeromonasの突然変異体が、
感染した魚において疾病の症候をひきおこさないほど充
分に弱毒化され、また同時に免疫応答を誘発するのに充
分なほど長い間魚の体内で持続するだろうということを
これまでに予測することはできていなかった。例えば、
S.typhimurium aroA突然変異体は、マウスにおいて、マ
ウスサルモネラ症に対する有効な生ワクチンであること
がわかっており（Hosieth ＆ Stoker、1981年）、また
２つ芳香環生合成遺伝子の各々に突然変異を宿したS.ty
phimurium菌株がマウスサルモネラ症に対するワクチン
菌株として有効であることもわかっている（Wellcome F
oundation Ltd.のPCT刊行物No.PCT/GB88/01143）。しか
しなが、３つの無毒性Salmonellatyphimurium芳香族依
存性突然変異体のうち２つは、子牛において生−生物体
ワクチンとして効果がないことがわかっている（Smith
他、1984年）。さらに、Yersinia enterocoliticaのaro
A突然変異体は、ラットの実験的感染に対して低い防御
性しか与えず（Bowe他、1989年）、Salmonella Cholera
esuisのaroA突然変異体は、マウスにおいて生ワクチン
として効果がなかった（Nnalue ＆ Stocker、1987
年）。しかしながら、驚くべきことに、Aeromonas salm
onicidaの芳香族依存性突然変異体が無毒性であり、感
染した魚の体内で最高約２週間生きのび、しかも強い防
御免疫を刺激することが発見された。従って、これら
は、フルンケル症に対する弱毒化生ワクチンとして使用
するのに適している。このようなワクチンはまた、細菌
が宿主の免疫系に効果的な形で提示されるという利点も
有している。
ここで本発明について、添付図面を参照しながらさら
に詳細に説明する。なお、図中： 図１は、芳香族化合物の生合成のための生合成経路の
要約である。
に詳細に説明する。なお、図中： 図１は、芳香族化合物の生合成のための生合成経路の
要約である。
図２。A.salmonicidaのaroA領域の地図及び突然変異
体の構造。図の上部は、aroAと担う4.3kbのPst1断片の
制限地図を示す。拡大した2.0kbのEcoR I断片のさらに
詳細な地図が与えられている。水平方向の矢印は、DNA
配列決定から誘導されたaroA遺伝子の転写方向における
範囲を示す。三角形は、aroA::KarにおけるKar断片によ
るaroA内への挿入の位置を示している。同様に２つの欠
失ΔaroA1及びΔaroA2も示されている。制限部位は以下
のように省略して表わされている:P＝Pst I;E＝EcoR I;
Hc＝Hinc II;X＝Xho I;R V＝EcoR V;Sa＝Sal I;Bs＝Bst
E II;B＝BamH I;H＝Hind III。
体の構造。図の上部は、aroAと担う4.3kbのPst1断片の
制限地図を示す。拡大した2.0kbのEcoR I断片のさらに
詳細な地図が与えられている。水平方向の矢印は、DNA
配列決定から誘導されたaroA遺伝子の転写方向における
範囲を示す。三角形は、aroA::KarにおけるKar断片によ
るaroA内への挿入の位置を示している。同様に２つの欠
失ΔaroA1及びΔaroA2も示されている。制限部位は以下
のように省略して表わされている:P＝Pst I;E＝EcoR I;
Hc＝Hinc II;X＝Xho I;R V＝EcoR V;Sa＝Sal I;Bs＝Bst
E II;B＝BamH I;H＝Hind III。
図３。A.salmonicida aroA::Karの分離 このダイヤグラムは、A.salmonicida644Rbにおける置
換突然変異aroA::Karの分離の工程を描いている。円
は、aroA::Kar突然変異を有する自殺プラスミドpSUP202
を表わしている（詳細は図２）。箱形は、aroA遺伝子で
あり、三角形はSal I部位へのKarの挿入である。プラス
ミドが染色体内に組込まれうるように、aroA領域内の相
同配列の間で単一のキャンベル型の交差が、起こってい
る。細胞は、カナマイシン、テトラサイクリン及びクロ
ラムフェニコールに対して耐性となり、Aro+のままとど
まる。薬剤を含まないブロス中での生育は、プラスミド
の切除を可能にする。この第２の交差がKar挿入の反対
側に起こる場合、いくつかの切除体はKarのままとどま
る。突然変異体はそのAro-Ka+表現型によって検出され
る。
換突然変異aroA::Karの分離の工程を描いている。円
は、aroA::Kar突然変異を有する自殺プラスミドpSUP202
を表わしている（詳細は図２）。箱形は、aroA遺伝子で
あり、三角形はSal I部位へのKarの挿入である。プラス
ミドが染色体内に組込まれうるように、aroA領域内の相
同配列の間で単一のキャンベル型の交差が、起こってい
る。細胞は、カナマイシン、テトラサイクリン及びクロ
ラムフェニコールに対して耐性となり、Aro+のままとど
まる。薬剤を含まないブロス中での生育は、プラスミド
の切除を可能にする。この第２の交差がKar挿入の反対
側に起こる場合、いくつかの切除体はKarのままとどま
る。突然変異体はそのAro-Ka+表現型によって検出され
る。
図４。A.salmonicida ΔaroAの分離 このダイヤグラムは、対立遺伝子の置換によるA.salm
onicidaのaroA遺伝子の欠失突然変異の分離に関与する
工程を示している。円は、点線で輪郭が表わされた短い
箱形によって示される欠失aroA遺伝子をもつpSUP202を
表わしている。プラスミドは、相同aroA座（より長い箱
形）での単一のキャンベル型組換え事象により染色体内
に組込まれる。細胞はAro-、Tcr、Cmrである。薬剤を含
まないブロス中で生育後、プラスミド切除が起こり、結
果として薬剤感受性細胞が得られる。切除事象が挿入事
象に対し欠失の反対側で起こる場合、細胞はAro-とな
る。
onicidaのaroA遺伝子の欠失突然変異の分離に関与する
工程を示している。円は、点線で輪郭が表わされた短い
箱形によって示される欠失aroA遺伝子をもつpSUP202を
表わしている。プラスミドは、相同aroA座（より長い箱
形）での単一のキャンベル型組換え事象により染色体内
に組込まれる。細胞はAro-、Tcr、Cmrである。薬剤を含
まないブロス中で生育後、プラスミド切除が起こり、結
果として薬剤感受性細胞が得られる。切除事象が挿入事
象に対し欠失の反対側で起こる場合、細胞はAro-とな
る。
図５。A.salmonicidaのaroA遺伝子のヌクレオチド配
列及び推定アミノ酸配列。
列及び推定アミノ酸配列。
図６。A.salmonicida及びE.coliのEPSPシンターゼの
アミノ酸配列のWilburアラインメント。
アミノ酸配列のWilburアラインメント。
なお、：は同一のアミノ酸残基であり、・は保存的な
アミノ酸置換である。
アミノ酸置換である。
Aeromonas salmonicidaの芳香族依存性突然変異体の
構築 例１−抗生物質耐性を伴ったaro突然変異 aroA突然変異の相補性について選択するE.coli AB132
1内のプラスミドベクター上に、A.salmonicidaのaroA遺
伝子をクローニングした。（Ｏ′Reilly他、1988年）。
遺伝子を、2kbのEcoR I断片までマッピングした（図
２）。中央にあるSal I部位（図２、３）の中にカナマ
イシン耐性を発現させるDNAの断片を挿入することによ
り、クローニングされたaroA遺伝子を不活性化した。ar
oA::Kar構築物を有するこのプラスミドはもはや、E.col
i AB1321を相補することができなかった。
構築 例１−抗生物質耐性を伴ったaro突然変異 aroA突然変異の相補性について選択するE.coli AB132
1内のプラスミドベクター上に、A.salmonicidaのaroA遺
伝子をクローニングした。（Ｏ′Reilly他、1988年）。
遺伝子を、2kbのEcoR I断片までマッピングした（図
２）。中央にあるSal I部位（図２、３）の中にカナマ
イシン耐性を発現させるDNAの断片を挿入することによ
り、クローニングされたaroA遺伝子を不活性化した。ar
oA::Kar構築物を有するこのプラスミドはもはや、E.col
i AB1321を相補することができなかった。
A.salmonicida染色体内のaroA座との高頻度の相同組
換えを容易にするため、aroA::Kar突然変異を比較的長
い隣接配列を伴って構築した（図２）。
換えを容易にするため、aroA::Kar突然変異を比較的長
い隣接配列を伴って構築した（図２）。
このプロセスは、以下のようにさらに詳細に記述する
ことができる： 標準的な手順を用いて、バクテリオファージλベクタ
ー中及びプラスミドベクター中にaroA遺伝子をA.salmon
icidaのゲノムDNAからクローニングした（Sambrook他、
1989年）。
ことができる： 標準的な手順を用いて、バクテリオファージλベクタ
ー中及びプラスミドベクター中にaroA遺伝子をA.salmon
icidaのゲノムDNAからクローニングした（Sambrook他、
1989年）。
A.salmonicidaの高分子量のゲノムDNAをSau3Alで部分
的に切断した。ショ糖密度勾配遠心分離法により15〜20
kbの断片を分離した。約１μｇ、BamH1で切断したλ置
換ベクターλ2001（Karn他、1984年）１μｇ連結した。
DNAを生体外（インビドロ）でパッケージングし（Hoh
n、1979年）、再構成されたファージ粒子を、芳香族添
加物が欠如した最小培地中のEscherichia coli AB1321
aroAのローンにプレーティングした。A.salmonicidaのa
roA遺伝子を有するファージは、ローンの強化生育ゾー
ンでとり囲まれたプラークを形成するその能力によって
認知した（Ｏ′Reilly他、1988年）。
的に切断した。ショ糖密度勾配遠心分離法により15〜20
kbの断片を分離した。約１μｇ、BamH1で切断したλ置
換ベクターλ2001（Karn他、1984年）１μｇ連結した。
DNAを生体外（インビドロ）でパッケージングし（Hoh
n、1979年）、再構成されたファージ粒子を、芳香族添
加物が欠如した最小培地中のEscherichia coli AB1321
aroAのローンにプレーティングした。A.salmonicidaのa
roA遺伝子を有するファージは、ローンの強化生育ゾー
ンでとり囲まれたプラークを形成するその能力によって
認知した（Ｏ′Reilly他、1988年）。
aroAのPst I及びEcoR I断片をプラスミドpUC18（Yani
sh−Perron他、1985年）及びpBR322（Bolivar他、1977
年）にクローニングし、Tcr又はAprコロニーを適当とし
て選択するAB1321を形質転換させ、次にレプリカ平板を
行なって相補性を検出することによってAro+誘導体を分
離した。制限地図作成（図２）により、EcoR1断片を相
補する2kbが4.3kbのPst I断片内に含まれていることが
明らかになった。
sh−Perron他、1985年）及びpBR322（Bolivar他、1977
年）にクローニングし、Tcr又はAprコロニーを適当とし
て選択するAB1321を形質転換させ、次にレプリカ平板を
行なって相補性を検出することによってAro+誘導体を分
離した。制限地図作成（図２）により、EcoR1断片を相
補する2kbが4.3kbのPst I断片内に含まれていることが
明らかになった。
遺伝子をトランスポゾンTn5からのカナマイシン耐性
遺伝子を担う2.2kbのSal I−Xho I断片（Putnoky他、19
83年）を中央にあるSal I部位（図２）の中に挿入する
ことにより、Pst I断片に担われたクローニングされたa
roA不活性化した。このプラスミはもはやAB1321を相補
することができなかった。
遺伝子を担う2.2kbのSal I−Xho I断片（Putnoky他、19
83年）を中央にあるSal I部位（図２）の中に挿入する
ことにより、Pst I断片に担われたクローニングされたa
roA不活性化した。このプラスミはもはやAB1321を相補
することができなかった。
宿主範囲の広い自殺プラスミドpSUP202（Simon他、19
83年）の中のPst I部位に、aroA::Karカセットをクロー
ニングした。キメラpSUP202aroA::Karプラスミドで、動
員E.coli供与菌株S17−１（Simon他、1983年）を形質転
換した。E.coli S17−１ pSUP202 aroA::Karの一晩
のブラス培養（37℃でＬブロス中で生育）から得た細胞
を、トリプチカーゼ大豆ブロス（TSB）中で22℃で生育
させた（ナリジキシン酸耐性をもつ）継代接種されたば
かりの（以下の例３参照）A.salmonicida 644Rbの48時
間培養と混合した。30℃で４時間インキュベートされた
トリプチカーゼ大豆寒天（TSA）の表面上の0.45ミクロ
ンのニトロセルロースフィルター上で、A.salmonicida
培養0.1mlとE.coli供与菌培養0.02mlを混合した。細胞
を収集し、生理食塩水中に再懸濁し、選択平板（それぞ
れ40μg/ml及び30μg/mlで、カナマイシン及びナリジキ
シン酸を含むTSA）上へプレーティングした。
83年）の中のPst I部位に、aroA::Karカセットをクロー
ニングした。キメラpSUP202aroA::Karプラスミドで、動
員E.coli供与菌株S17−１（Simon他、1983年）を形質転
換した。E.coli S17−１ pSUP202 aroA::Karの一晩
のブラス培養（37℃でＬブロス中で生育）から得た細胞
を、トリプチカーゼ大豆ブロス（TSB）中で22℃で生育
させた（ナリジキシン酸耐性をもつ）継代接種されたば
かりの（以下の例３参照）A.salmonicida 644Rbの48時
間培養と混合した。30℃で４時間インキュベートされた
トリプチカーゼ大豆寒天（TSA）の表面上の0.45ミクロ
ンのニトロセルロースフィルター上で、A.salmonicida
培養0.1mlとE.coli供与菌培養0.02mlを混合した。細胞
を収集し、生理食塩水中に再懸濁し、選択平板（それぞ
れ40μg/ml及び30μg/mlで、カナマイシン及びナリジキ
シン酸を含むTSA）上へプレーティングした。
１受容菌あたり10-2の頻度で接合体を回収した。Kar
は、aroA座での染色体との組換えに続くA.salmonicida
によってのみ遺伝されうる。最も頻繁に起こる事象は、
単一のキャンベル型交差（図３）である。それより稀で
あるが（１受容菌あたり10-4）２重組換え体が得られた
（図３）。組換え体は、その表現型によって認識された
（図３にまとめられている）。組換え体の構造は、クロ
ーニングされたA.salmonicidaのaroA遺伝子をプローブ
として用いて、DNAハイブリダイゼーション（Souther
n、1975年）によって確認した。
は、aroA座での染色体との組換えに続くA.salmonicida
によってのみ遺伝されうる。最も頻繁に起こる事象は、
単一のキャンベル型交差（図３）である。それより稀で
あるが（１受容菌あたり10-4）２重組換え体が得られた
（図３）。組換え体は、その表現型によって認識された
（図３にまとめられている）。組換え体の構造は、クロ
ーニングされたA.salmonicidaのaroA遺伝子をプローブ
として用いて、DNAハイブリダイゼーション（Souther
n、1975年）によって確認した。
これらの組換え体の１つ、A.salmonicida菌株DU5847
を、登録番号40261号として1990年２月26日付でスコッ
トランドのNational Collection of Industrial and Ma
rine Bacteria,23 St.Machar Drive,Aberdeen AB2 IRY
寄託した。
を、登録番号40261号として1990年２月26日付でスコッ
トランドのNational Collection of Industrial and Ma
rine Bacteria,23 St.Machar Drive,Aberdeen AB2 IRY
寄託した。
例２−aroA欠失突然変異 A.salmonicidaのaroA遺伝子を配列決定して、aroAを
完全に不活性化し、かつ復帰不可能なものである、コー
ド配列内の欠失の構築を容易にした。プラスミド上に、
２つの欠失突然変異体を構築した。ΔaroA1は、EcoR1部
位の間にある全てのコード配列を除去する大きな欠失で
ある。ΔaroA2は、aroAコード配列（図２）内により小
さい２つの欠失を受けている。これら２つの突然変異体
は、あらゆるAeromonas菌株のaroA突然変異体を構築す
るのに用いることができる。
完全に不活性化し、かつ復帰不可能なものである、コー
ド配列内の欠失の構築を容易にした。プラスミド上に、
２つの欠失突然変異体を構築した。ΔaroA1は、EcoR1部
位の間にある全てのコード配列を除去する大きな欠失で
ある。ΔaroA2は、aroAコード配列（図２）内により小
さい２つの欠失を受けている。これら２つの突然変異体
は、あらゆるAeromonas菌株のaroA突然変異体を構築す
るのに用いることができる。
A.salmonicida aroA遺伝子の配列は図５に示されてい
る。推定上のEPSPシンターゼのアミノ酸配列は、DNA配
列（図５）から推定した。これは、広範に特徴づけられ
たE.coliE.coli EPSPシンターゼ（図６）ときわめて類
似している。
る。推定上のEPSPシンターゼのアミノ酸配列は、DNA配
列（図５）から推定した。これは、広範に特徴づけられ
たE.coliE.coli EPSPシンターゼ（図６）ときわめて類
似している。
A.salmonicidaのΔaroA突然変異は、pSUP202自殺ベク
ターを用いて構築できる。これらを、野生型aroA遺伝子
を置換するために、A.salmonicidaの染色体内に導入す
ることが可能である（図４）。望まれる組換え体は、表
現型の変化（Aro+からAro-への）によって検出でき、DN
Aハイブリダイゼーションによって確認できる。この技
法は、薬剤耐性マーカーを持たず商業用ワクチンとして
の使用に適した菌株を産生するため、寄託されたA.salm
onicida菌株のDU5847からKarマーカーを除去するのに使
用可能である。
ターを用いて構築できる。これらを、野生型aroA遺伝子
を置換するために、A.salmonicidaの染色体内に導入す
ることが可能である（図４）。望まれる組換え体は、表
現型の変化（Aro+からAro-への）によって検出でき、DN
Aハイブリダイゼーションによって確認できる。この技
法は、薬剤耐性マーカーを持たず商業用ワクチンとして
の使用に適した菌株を産生するため、寄託されたA.salm
onicida菌株のDU5847からKarマーカーを除去するのに使
用可能である。
ΔaroA1の欠失は、より大きいPst I断片を担うプラス
ミドから2kbのEcoR I断片を除去することにより構築し
た（図２）。次に、ΔaroA1を有するPst I断片を、動員
可能な自殺プラスミドpSUP202（Simon他、1983年）のPs
t I部位にクローニングした。
ミドから2kbのEcoR I断片を除去することにより構築し
た（図２）。次に、ΔaroA1を有するPst I断片を、動員
可能な自殺プラスミドpSUP202（Simon他、1983年）のPs
t I部位にクローニングした。
前述の平板交配（plate−mating）手順を用いて、プ
ラスミドをA.salmonicidaAro+へ伝達した。テトラサイ
クリン上での生育によって、単一の交差により（図４）
プラスミドが染色体上に組込まれた組換え体を選択し
た。これらの組換え体は、テトラサイクリン及びクロラ
ムフェニコールに対して耐性であり、Aro+であった。非
選択的ブロス中での生育によって、Tc-Cm-Aro-である誘
導体の識別が可能になった。A.salmonicida ΔaroA1のa
ro座の構造は、aroA遺伝子をプローブとして用いて、サ
ザンハイブリダイゼーション（Southern、1975年）によ
って確認した。この菌株はAro+に復帰せず、薬剤耐性マ
ーカーをもっていない。これは、商業用ワクチンとして
の使用に適している。
ラスミドをA.salmonicidaAro+へ伝達した。テトラサイ
クリン上での生育によって、単一の交差により（図４）
プラスミドが染色体上に組込まれた組換え体を選択し
た。これらの組換え体は、テトラサイクリン及びクロラ
ムフェニコールに対して耐性であり、Aro+であった。非
選択的ブロス中での生育によって、Tc-Cm-Aro-である誘
導体の識別が可能になった。A.salmonicida ΔaroA1のa
ro座の構造は、aroA遺伝子をプローブとして用いて、サ
ザンハイブリダイゼーション（Southern、1975年）によ
って確認した。この菌株はAro+に復帰せず、薬剤耐性マ
ーカーをもっていない。これは、商業用ワクチンとして
の使用に適している。
ΔaroA1突然変異を有するこのA.salmonicida菌株DU58
60を、登録番号NCIMB40381として、1991年３月11日付で
のスコットランドのNational Collection of Industria
land Marine Bacteria,23 St.Machar Drive,Aberdeen A
B2 IRY寄託した。
60を、登録番号NCIMB40381として、1991年３月11日付で
のスコットランドのNational Collection of Industria
land Marine Bacteria,23 St.Machar Drive,Aberdeen A
B2 IRY寄託した。
当業者であれば、Δaroa2突然変異を有するA.salmoni
cida菌株ならびにaroA遺伝子以外の芳香環合成経路の遺
伝子における突然変異体を産生するためにもまた、これ
らの技術を使用し得ることが理解できるだろう。
cida菌株ならびにaroA遺伝子以外の芳香環合成経路の遺
伝子における突然変異体を産生するためにもまた、これ
らの技術を使用し得ることが理解できるだろう。
例３−ワクチン能（ポテンシャル）の評価 毒性 長時間にわたる実験室内の継代培養で、A.salmonicid
aがその毒性を失うことは周知である（McCarthy and Ro
berts、1980年）。したがって、生体内（in vivo）で継
代接種されたばかりの、既知の毒性菌株644Rbの中に、a
roA::Kar突然変異を導入した。これは、ブラウントラウ
トに細菌を筋肉（im）注射し、その後続けて４回にわた
り死後の腎臓からこの微生物を回収することによって達
成した。この菌株は、102細胞未満のLD50を有してい
た。
aがその毒性を失うことは周知である（McCarthy and Ro
berts、1980年）。したがって、生体内（in vivo）で継
代接種されたばかりの、既知の毒性菌株644Rbの中に、a
roA::Kar突然変異を導入した。これは、ブラウントラウ
トに細菌を筋肉（im）注射し、その後続けて４回にわた
り死後の腎臓からこの微生物を回収することによって達
成した。この菌株は、102細胞未満のLD50を有してい
た。
次に、以下のように、防御抗原を保存するため、最低
数の実験室内継代培養でこの毒性菌株に突然変異体を導
入した： （ｉ）感染した魚からの腎臓の中味をTSA平板上に画線
接種することにより、毒性菌株を得た。
数の実験室内継代培養でこの毒性菌株に突然変異体を導
入した： （ｉ）感染した魚からの腎臓の中味をTSA平板上に画線
接種することにより、毒性菌株を得た。
（ii）TSB中に単一コロニーを接種した。自殺プラスミ
ドを有するE.coliとの交配に、この培養を直接使用し
た。
ドを有するE.coliとの交配に、この培養を直接使用し
た。
（iii）選択的抗生物質を含むTSA平板上に交配混合物の
希釈溶液をプレーティングした。
希釈溶液をプレーティングした。
（iv）密度の高い掃引として一回、単一の接合体コロニ
ーを再度プレーティングした（交差画線接種により表現
型をチェックし、突然変異体を同定した）。
ーを再度プレーティングした（交差画線接種により表現
型をチェックし、突然変異体を同定した）。
（ｖ）単一コロニーを求めて、掃引増殖を画線接種し
た。
た。
（vi）TSB中に１つの単一コロニーを接種した。この培
養をアリコートにし、液体窒素中でのスナップ凍結の
後、−80℃で保管した。
養をアリコートにし、液体窒素中でのスナップ凍結の
後、−80℃で保管した。
（vii）毒性研究のため及び免疫原の調製のため、単一
コロニーを求めて凍結培養の頂部からの氷をTSA平板上
に画線接種した。
コロニーを求めて凍結培養の頂部からの氷をTSA平板上
に画線接種した。
（viii）TSB中に１つのコロニーを接種した。この培養
は、毒性研究及び予防接種のための接種物を提供した。
は、毒性研究及び予防接種のための接種物を提供した。
宿主範囲の広いプラスミドpGSS33（Sharpe、1984年）
の突然変異体に野生型aroA遺伝子を伝達することによ
り、A.salmonicida 644RbのAro-突然変異体の毒性因子
の保持を立証した。107の細胞をim（筋肉）注射した結
果、75％のフルンケル症による死亡率が得られた。
の突然変異体に野生型aroA遺伝子を伝達することによ
り、A.salmonicida 644RbのAro-突然変異体の毒性因子
の保持を立証した。107の細胞をim（筋肉）注射した結
果、75％のフルンケル症による死亡率が得られた。
持続性 生体内（in vivo）での持続性を評価するため、40匹
のブラウントラウトに107のAro-細菌を接種し、１日の
間隔で試料を採取した。腎臓（毒性生物体で感染した魚
において、細菌が多数発見された部位）の中には、感染
後最高10日までは約103のcfu（腎臓１つあたりのコロニ
ー形成単位）の割合で細菌が発見されたが、14日以降は
全く分離されなかった。明らかに細菌は、症候をひき起
こすことなく宿主内で持続できる。このことは、防御免
疫を刺激するためにおそらく必要である。
のブラウントラウトに107のAro-細菌を接種し、１日の
間隔で試料を採取した。腎臓（毒性生物体で感染した魚
において、細菌が多数発見された部位）の中には、感染
後最高10日までは約103のcfu（腎臓１つあたりのコロニ
ー形成単位）の割合で細菌が発見されたが、14日以降は
全く分離されなかった。明らかに細菌は、症候をひき起
こすことなく宿主内で持続できる。このことは、防御免
疫を刺激するためにおそらく必要である。
免疫応答 Aro-細菌のIP（腹腔内）注射を受けた魚における血清
抗体レベルを、凝集滴定によって測定した。６週間後、
抗体の力価は２未満から128まで上昇した。このこと
は、Aro-細菌の注射が免疫応答を刺激することを示して
いる。
抗体レベルを、凝集滴定によって測定した。６週間後、
抗体の力価は２未満から128まで上昇した。このこと
は、Aro-細菌の注射が免疫応答を刺激することを示して
いる。
防御 免疫を刺激するため、ブラウントラウトに107のAro-
細菌を腹腔内注射した。最初の予防接種から６週間後、
20匹の魚に同数の無毒性細菌を追加免疫（ブースター）
注射した。４匹の予防接種を受けた魚と受けない魚のグ
ループに、次に101〜107cfuの毒性生物体で攻撃した。
攻撃を受けた魚の死亡数及び死亡時期を記録し、LD50を
計算した。
細菌を腹腔内注射した。最初の予防接種から６週間後、
20匹の魚に同数の無毒性細菌を追加免疫（ブースター）
注射した。４匹の予防接種を受けた魚と受けない魚のグ
ループに、次に101〜107cfuの毒性生物体で攻撃した。
攻撃を受けた魚の死亡数及び死亡時期を記録し、LD50を
計算した。
このデータは、Aro-Aeromonas salmonicidaにはサケ
・マスに対する毒性が欠如していること、そして該細菌
を腹腔内注射した結果、著しい防御免疫が得られること
を明らかに立証している。
・マスに対する毒性が欠如していること、そして該細菌
を腹腔内注射した結果、著しい防御免疫が得られること
を明らかに立証している。
例４−安定性研究 何ヵ月にもわたり、多数の常用の安定化培地中で、A.
salmonicida 644RbのAro-突然変異体菌株の長期安定性
を評価した。A.salmonicidaの一晩の培養を遠心分離
し、洗浄し、３つの安定化培地のうちの１つ又は栄養ブ
ロス中に細胞を再懸濁した。次に、懸濁液を凍結乾燥
し、室温で保存した。凍結乾燥後のさまざまな時点で、
細胞を水中に再懸濁し、計数した。安定化培地には、
（Ａ）7.5％ショ糖、２％グルタミン酸ナトリウム、4.5
％デキストラン、（Ｂ）10％ショ糖、１％グルタミン酸
ナトリウム、５％デキストラン、（Ｃ）10％ショ糖、１
％グルタミン酸ナトリウム（全て水中での重量対体積百
分率）、及び（Ｄ）ブロス対照が含まれている。生存度
テストの結果は、表Ｉに示され、テスト期間全体にわた
りこの菌株が適切な安定性を示したことを表わしてい
る。
salmonicida 644RbのAro-突然変異体菌株の長期安定性
を評価した。A.salmonicidaの一晩の培養を遠心分離
し、洗浄し、３つの安定化培地のうちの１つ又は栄養ブ
ロス中に細胞を再懸濁した。次に、懸濁液を凍結乾燥
し、室温で保存した。凍結乾燥後のさまざまな時点で、
細胞を水中に再懸濁し、計数した。安定化培地には、
（Ａ）7.5％ショ糖、２％グルタミン酸ナトリウム、4.5
％デキストラン、（Ｂ）10％ショ糖、１％グルタミン酸
ナトリウム、５％デキストラン、（Ｃ）10％ショ糖、１
％グルタミン酸ナトリウム（全て水中での重量対体積百
分率）、及び（Ｄ）ブロス対照が含まれている。生存度
テストの結果は、表Ｉに示され、テスト期間全体にわた
りこの菌株が適切な安定性を示したことを表わしてい
る。
本明細書中、「実質的に類似の」という語は、寄託済
みの菌株に対し、芳香環生合成経路の突然変異遺伝子の
領域においてそれとハイブリダイズし、PABA合成が欠損
し、及び弱毒化するに充分な配列同一性又は相同性をも
つA.salmonicidaの菌株を意味し、また、芳香環生合成
経路の関連遺伝子全体の欠失を有し、PABA合成が欠損
し、弱毒化された菌株をも含んでいる。
みの菌株に対し、芳香環生合成経路の突然変異遺伝子の
領域においてそれとハイブリダイズし、PABA合成が欠損
し、及び弱毒化するに充分な配列同一性又は相同性をも
つA.salmonicidaの菌株を意味し、また、芳香環生合成
経路の関連遺伝子全体の欠失を有し、PABA合成が欠損
し、弱毒化された菌株をも含んでいる。
参考文献 −Austin,B.及びAustin,D.A.共著（1987年）、第９章、
「アエロモナス」、「細菌性魚類病原体−養殖及び野生
魚における疾病」、Ellis Horwood,Chichester中、111
〜195頁。
「アエロモナス」、「細菌性魚類病原体−養殖及び野生
魚における疾病」、Ellis Horwood,Chichester中、111
〜195頁。
−Bolivar,F.,Rodriquez,R.L.,Greene,P.J.,Betlach,M.
C.,Heyneker,H.L.,Boyerm H.W.,Crosa,J.H.及びFalkow,
S.共著（1977年）。「新しいクローニグ媒体の構築と特
徴づけIII.多目的クローニングシステム」Gene 2:95−1
13。
C.,Heyneker,H.L.,Boyerm H.W.,Crosa,J.H.及びFalkow,
S.共著（1977年）。「新しいクローニグ媒体の構築と特
徴づけIII.多目的クローニングシステム」Gene 2:95−1
13。
−Bowe,F.,O'Gara,P.,Maskell,D.,Cafferkey,M.及びDou
gan,G.共著（1989年）。「Yersinia enterocolitica 0:
8 aroA突然変異体の毒性、持続性及び免疫原性」、Infe
ction and Immunity 57:3234−3236。
gan,G.共著（1989年）。「Yersinia enterocolitica 0:
8 aroA突然変異体の毒性、持続性及び免疫原性」、Infe
ction and Immunity 57:3234−3236。
−Cipriano,R.C及びStarliper,C.E.共著（1982年）。
「Aeromonas salmonicidaの無毒性菌株を用いたフルン
ケル症に対するサルモニド（salmonids）の液浸及び注
射予防接種」。Progressive Fish Culturist 44::167−
169。
「Aeromonas salmonicidaの無毒性菌株を用いたフルン
ケル症に対するサルモニド（salmonids）の液浸及び注
射予防接種」。Progressive Fish Culturist 44::167−
169。
−Hackett,J.L.,Lynch,W.H.,Paterson,W.D.及びCombs,
D.H.共著（1984年）。「Aeromonas salmonicidaの細胞
外プロテアーゼ、細胞外溶血素及び毒性」。Can.J.Fis
h.Aquat.Sci.41:1354−1360。
D.H.共著（1984年）。「Aeromonas salmonicidaの細胞
外プロテアーゼ、細胞外溶血素及び毒性」。Can.J.Fis
h.Aquat.Sci.41:1354−1360。
−Hohn,B.著（1979年）。「ラムダ及びコスミドDNAの生
体外（in vitro）パッケージング」。Methods in Enzym
ology 68:299−309。
体外（in vitro）パッケージング」。Methods in Enzym
ology 68:299−309。
−Karn,J.,Matthes,H.W.D.,Gait,M.J.及びBrenner,S.
（1984年）。「Xba I、BamH I、Hind III、Sst I及びXh
o Iのための部位を有する新しい選択性ファージクロー
ニングベクター2001」Gene 32:217−224。
（1984年）。「Xba I、BamH I、Hind III、Sst I及びXh
o Iのための部位を有する新しい選択性ファージクロー
ニングベクター2001」Gene 32:217−224。
−McCarthy,D.H.及びRoberts,R.J.共著（1980年）。
「魚のフルンケル症−知識の現状」。Droop,M.A.及びJa
nnasch,H.W.編、「水生微生物学の進歩」、London,Acad
emic Press中、293〜341頁。
「魚のフルンケル症−知識の現状」。Droop,M.A.及びJa
nnasch,H.W.編、「水生微生物学の進歩」、London,Acad
emic Press中、293〜341頁。
−McCarthy,D.H.,Amend,D.F.,Johnson,K.A.及びBloom,
J.V.共著（1983年）。「Aeromonas salmonicida:防御免
疫を有する抗原の決定及び実験的バクテリンの評価」。
Journal of Fish Diseases 6:155−174。
J.V.共著（1983年）。「Aeromonas salmonicida:防御免
疫を有する抗原の決定及び実験的バクテリンの評価」。
Journal of Fish Diseases 6:155−174。
−Michel,C.著（1982年）。「フルンケル症予防接種へ
の進歩Roberts,R.J.編、「魚の微生物疾患」、Academic
Press,London,NewYork中、151〜169頁。
の進歩Roberts,R.J.編、「魚の微生物疾患」、Academic
Press,London,NewYork中、151〜169頁。
−Munn,C.B.及びTrust,T.J.共著（1984年）。「Aeromon
as salmonicidaの毒性における付加的タンパク質の役
割」。Acuigrup編、「魚類の疾病、第４回COPRAQ会
議」、Editora ATP,Madrid,Spain中、69〜75頁。
as salmonicidaの毒性における付加的タンパク質の役
割」。Acuigrup編、「魚類の疾病、第４回COPRAQ会
議」、Editora ATP,Madrid,Spain中、69〜75頁。
−Nnalue,N.A.及びB.A.D.Stocker共著（1987年）。「Sa
lmonella choleraesuisの栄養要求性及びgalE誘導体の
毒性及び生ワクチン効力の試験」。Infection and Immu
nity,55,955−962。
lmonella choleraesuisの栄養要求性及びgalE誘導体の
毒性及び生ワクチン効力の試験」。Infection and Immu
nity,55,955−962。
−Olivier,G.,Evelyn,T.P.T及びLallier,R.共著（1985
年）。「Aeromonas salmonicidaの毒性及び無毒性菌株
からのワクチンの免疫原性」。Journal of Fish Diseas
es 8:43−55。
年）。「Aeromonas salmonicidaの毒性及び無毒性菌株
からのワクチンの免疫原性」。Journal of Fish Diseas
es 8:43−55。
−O'Reilly,Y.,O'Toole,P.W.及びFoster,T.J.共著（198
8年）。「ラムダライブラリーのスクリーニングと組換
え体の検出」。Owen,P.及びFoster,T.J.編、「細菌性病
原体の免疫化学的及び分子遺伝学的分析」、Amsterdam,
Elsevier中、187〜197頁。
8年）。「ラムダライブラリーのスクリーニングと組換
え体の検出」。Owen,P.及びFoster,T.J.編、「細菌性病
原体の免疫化学的及び分子遺伝学的分析」、Amsterdam,
Elsevier中、187〜197頁。
−Putnoky,P.,Kiss,G.B.,Ott,I.及びKonorosi,A.共著
（1983年）。「Tn5はカナマイシン耐性遺伝子から下流
のストレプトマイシン耐性決定基を運ぶ」。Mol.Gen.Ge
net.,191:288−294. −Sakai,D.K.著（1985年）。「凝集性Aeromonas salmon
icida菌株に対する特異的抗体の感染性に対する効力及
び不活性化されたプロテアーゼでの予防接種」。Journa
l of Fish Diseases 8:397−405。
（1983年）。「Tn5はカナマイシン耐性遺伝子から下流
のストレプトマイシン耐性決定基を運ぶ」。Mol.Gen.Ge
net.,191:288−294. −Sakai,D.K.著（1985年）。「凝集性Aeromonas salmon
icida菌株に対する特異的抗体の感染性に対する効力及
び不活性化されたプロテアーゼでの予防接種」。Journa
l of Fish Diseases 8:397−405。
−Sambrook,J.,Fritsch,E.F.及びManiatis,T.（1989
年）。「分子クローニング、実験室マニュアル」第２
版。Cold Spring Harbour Laboratory Press,Cold Spri
ng Harbour,New York。
年）。「分子クローニング、実験室マニュアル」第２
版。Cold Spring Harbour Laboratory Press,Cold Spri
ng Harbour,New York。
−Sharpe,G.S.著（1984年）。「グラム陰性菌のための
宿主範囲の広いクローニングベクター」。Gene 29:93−
102。
宿主範囲の広いクローニングベクター」。Gene 29:93−
102。
−Simon,R.,Priefer,U.及びPuhler,A共著（1983年）。
「生体内（in vivo）遺伝子工学のための宿主範囲の広
い動員系：グラム陰性菌におけるトランスポゾン突然変
異誘発」。Bio/Technology 1:784−791。
「生体内（in vivo）遺伝子工学のための宿主範囲の広
い動員系：グラム陰性菌におけるトランスポゾン突然変
異誘発」。Bio/Technology 1:784−791。
−Smith,B.P.,M.Reina−Guerra,S.K.Hoiseth,B.A.D.Sto
cker,F.Habasha,E.Johnson及びF.Merritt共著。「子牛
の変型生ワクチンとしての芳香族依存性Salmonellatyph
imurium」。Am.J.Vet.Res.45,59−66,1984年。
cker,F.Habasha,E.Johnson及びF.Merritt共著。「子牛
の変型生ワクチンとしての芳香族依存性Salmonellatyph
imurium」。Am.J.Vet.Res.45,59−66,1984年。
−Southern,E.M.著（1975年）。「ゲル電気泳動により
分離されたDNA断片中の特異配列の検出」。J.Mol.Biol.
98:503−517。
分離されたDNA断片中の特異配列の検出」。J.Mol.Biol.
98:503−517。
−Yanisch−Perron,C.,Vieira,J.C.及びMessing.J.（19
85年）。「改良型M13ファージクローニングベクター及
び宿主菌株:M13mp18及びpUC19ベクターのヌクレオチド
配列」。Gene 33:103−119。
85年）。「改良型M13ファージクローニングベクター及
び宿主菌株:M13mp18及びpUC19ベクターのヌクレオチド
配列」。Gene 33:103−119。
フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｒ 1:01） (72)発明者 フォスター，ティモシー・ジェームズ アイルランド共和国、ダブリン 16、テ ンプルオギュー、クーランバー・パーク 70 (72)発明者 ホーガン，ローレンス・マイケル アイルランド共和国、ダブリン ９、ド ラムコンドラ、セント・クレメンツ・ロ ード 27 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12N 1/00 - 1/38 C12N 15/00 - 15/90 A61K 31/00 - 48/00 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＧｅｎＢａｈｋ／ＤＤＢＪ／ＥＭＢＬ
Claims (7)
- 【請求項１】PABA合成が欠損しており、かつ芳香環生合
成経路の遺伝子に突然変異を有する弱毒化されたAeromo
nas菌株。 - 【請求項２】突然変異が非復帰性のものである、請求の
範囲第１項に記載の弱毒Aeromonas菌株。 - 【請求項３】突然変異がaroA遺伝子内にある、請求の範
囲第２項に記載の弱毒Aeromonas菌株。 - 【請求項４】1990年２月26日付で、登録番号40261号と
してスコットランドのNational Collection of Industr
ial and MarineBacteriaに寄託された、Aermonas salmo
nicida菌株DU5847、又は同様に弱毒化され、芳香環生合
成経路の変異体遺伝子をコードするDNA領域において前
記菌株に実質的に類似したAeromonas菌株。 - 【請求項５】カナマイシン薬剤感受性マーカーが切除さ
れた状態の、1990年２月26日付で、登録番号40261号と
してスコットランドのNational Collection of Industr
ial and Marine Bacteriaに寄託された、Aeromonas sal
monicida菌株DU5847。 - 【請求項６】1991年３月11日付で、登録番号NCIMB40381
号としてスコットランドのNational Collection of Ind
ustrial and Marine Bacteriaに寄託された、Aeromonas
salmonicida菌株、又は、同様に弱毒化され、芳香環生
合成経路の変異体遺伝子をコードするDNA領域において
前記菌株に実質的に類似したAeromonas菌株。 - 【請求項７】請求の範囲第１〜６項のいずれか１項に記
載の弱毒Aeromonas菌株を含む、フルンケル症に対する
ワクチン。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| IE887/90 | 1990-03-13 | ||
| IE88790A IE61635B1 (en) | 1990-03-13 | 1990-03-13 | Improvements in vaccines |
| PCT/EP1991/000490 WO1991013978A1 (en) | 1990-03-13 | 1991-03-12 | Vaccines for preventing furunculosis in fish |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH06503946A JPH06503946A (ja) | 1994-05-12 |
| JP2997056B2 true JP2997056B2 (ja) | 2000-01-11 |
Family
ID=11019383
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3506773A Expired - Lifetime JP2997056B2 (ja) | 1990-03-13 | 1991-03-12 | 魚におけるフルンケル症予防用ワクチン |
Country Status (8)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0520011B1 (ja) |
| JP (1) | JP2997056B2 (ja) |
| CA (1) | CA2078128A1 (ja) |
| DK (1) | DK0520011T3 (ja) |
| IE (1) | IE61635B1 (ja) |
| NO (1) | NO306735B1 (ja) |
| NZ (1) | NZ237421A (ja) |
| WO (1) | WO1991013978A1 (ja) |
Families Citing this family (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5498414A (en) * | 1992-10-05 | 1996-03-12 | University Of Victoria | Attenuated strains of Aeromonas salmonicida useful as fish vaccines |
| IL132327A0 (en) * | 1997-04-11 | 2001-03-19 | Univ Louisiana State | Attenuated invasive vaccines against fish pathogens |
| US6010705A (en) * | 1997-04-11 | 2000-01-04 | Board Of Supervisors Of Louisiana State University And Agricultural And Mechanical College | Attenuated, invasive vaccines against fish pathogens |
| JP4905649B2 (ja) * | 2006-03-08 | 2012-03-28 | 国立大学法人 長崎大学 | 魚用ワクチン、その製造方法、および魚類感染症の予防方法 |
| JP4892296B2 (ja) | 2006-08-24 | 2012-03-07 | 川崎製薬株式会社 | 魚類のエドワジェラ症及び連鎖球菌症用ワクチン |
| CN115152665B (zh) * | 2022-07-26 | 2023-10-20 | 郝雅 | 一种水生生态系统捕食信息素生态效应研究装置 |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4735801A (en) * | 1982-09-07 | 1988-04-05 | Board Of Trustees Of Leland Stanford Jr. University | Novel non-reverting salmonella live vaccines |
| US5077044A (en) * | 1980-05-19 | 1991-12-31 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Jr. University | Novel non-reverting shigella live vaccines |
| GB8730037D0 (en) * | 1987-12-23 | 1988-02-03 | Wellcome Found | Vaccines |
| DK189788D0 (da) * | 1988-04-07 | 1988-04-07 | Wolf Watz Hans | Vaccine |
-
1990
- 1990-03-13 IE IE88790A patent/IE61635B1/en not_active IP Right Cessation
-
1991
- 1991-03-12 CA CA002078128A patent/CA2078128A1/en not_active Abandoned
- 1991-03-12 EP EP91906645A patent/EP0520011B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1991-03-12 JP JP3506773A patent/JP2997056B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1991-03-12 WO PCT/EP1991/000490 patent/WO1991013978A1/en active IP Right Grant
- 1991-03-12 DK DK91906645.6T patent/DK0520011T3/da active
- 1991-03-13 NZ NZ237421A patent/NZ237421A/en unknown
-
1992
- 1992-09-11 NO NO923550A patent/NO306735B1/no unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| IE61635B1 (en) | 1994-11-16 |
| WO1991013978A1 (en) | 1991-09-19 |
| IE900887A1 (en) | 1991-09-25 |
| NO306735B1 (no) | 1999-12-13 |
| EP0520011A1 (en) | 1992-12-30 |
| DK0520011T3 (da) | 1995-07-10 |
| NO923550L (no) | 1992-11-09 |
| NZ237421A (en) | 1992-07-28 |
| JPH06503946A (ja) | 1994-05-12 |
| NO923550D0 (no) | 1992-09-11 |
| CA2078128A1 (en) | 1991-09-14 |
| EP0520011B1 (en) | 1995-03-01 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP3054440B2 (ja) | 生ワクチン | |
| DE69935927T2 (de) | Plasmidstabilisierungssystem für die verabreichung von antigenen | |
| Chatfield et al. | Construction of a genetically defined Salmonella typhi Ty2 aroA, aroC mutant for the engineering of a candidate oral typhoid-tetanus vaccine | |
| US9050285B2 (en) | Recombinant bacterium capable of eliciting an immune response against Streptococcus pneumoniae | |
| KR0139950B1 (ko) | 무병원성 미생물 및 이의 용도 | |
| US5855879A (en) | Avirulent microbes and uses therefor | |
| US8889121B2 (en) | Bacterium comprising a regulated rfaH nucleic acid | |
| DE69027313T2 (de) | Impfstoffe enthaltende avirulente phop-type mikroorganismen | |
| US5656488A (en) | Recombinant avirulent salmonella antifertility vaccines | |
| DE60112413T2 (de) | Ssa inaktivierte salmonella impfstoffe | |
| US5855880A (en) | Avirulent microbes and uses therefor | |
| JP2000504726A (ja) | ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）のワクチン | |
| JP2002511752A (ja) | 生弱毒ワクチン | |
| JPH11504662A (ja) | アクチノバチラス・プレウロニューモニエに対するワクチンとしてのリボフラビン変異体 | |
| JP2003509008A (ja) | 感染症の治療のための弱毒化微生物 | |
| RU2351360C2 (ru) | СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИММУНОГЕННОЙ НЕГЕМОЛИТИЧЕСКОЙ БАКТЕРИИ ВИДА Actinobacillus pleuropneumoniae, БАКТЕРИЯ ВИДА Actinobacillus pleuropneumoniae, ВАКЦИНА ПРОТИВ СВИНОЙ ПЛЕВРОПНЕВМОНИИ (ВАРИАНТЫ), ИММУНОГЕННЫЙ И НЕГЕМОЛИТИЧЕСКИЙ ШТАММ Actinobacillus pleuropneumoniae (ВАРИАНТЫ) | |
| AU666108B2 (en) | CDT mutants of salmonella typhi | |
| CZ301520B6 (cs) | Bakterie zeslabená nevratnou mutací, vakcína, která ji obsahuje a její použití | |
| EP0465561A1 (en) | Avirulent microbes and uses therefor | |
| JP2997056B2 (ja) | 魚におけるフルンケル症予防用ワクチン | |
| DE60107707T2 (de) | Mikroben mit einer transkriptionsabbrecher enthaltender dämpfender mutation | |
| EP3640323A2 (en) | Production of rough-type salmonella enteritidis and the genetic modifications thereof for use as an avian vaccine | |
| US7592171B2 (en) | Vibrio cholerae with improved biological safety features in freeze dried form | |
| Cryz Jr et al. | Construction and characterization of a Vi-positive variant of the Salmonella typhi live oral vaccine strain Ty21a | |
| EP0202260A1 (en) | IMPROVED PREPARATION OF ANTIGENS. |