JP2960265B2 - Biosensor and measurement method using the same - Google Patents
Biosensor and measurement method using the sameInfo
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Description
【０００１】[0001]
【産業上の利用分野】本発明は、試料中の特定成分につ
いて、迅速かつ高精度な定量を簡便に実施することので
きるバイオセンサおよびそれを用いた基質濃度の測定方
法に関する。BACKGROUND OF THE INVENTION 1. Field of the Invention The present invention relates to a biosensor capable of quickly and accurately quantifying a specific component in a sample and a method for measuring a substrate concentration using the biosensor.
【０００２】[0002]
【従来の技術】試料中の特定成分について、試料液の希
釈や撹拌などを行なう事なく簡易に定量しうる方式とし
て、以下のようなバイオセンサが提案されている（特開
平３−２０２７６４号）。2. Description of the Related Art The following biosensor has been proposed as a method for simply quantifying a specific component in a sample without diluting or stirring the sample solution (Japanese Patent Laid-Open No. Hei 3-202768). .
【０００３】このバイオセンサは、絶縁性の基板上に形
成した電極系の表面に親水性高分子と酸化還元酵素およ
び電子受容体の混合物からなる酵素反応層を形成し、前
記酸化還元酵素と電子受容体と試料液との反応に際して
の物質濃度変化を電気化学的に前記電極系で検知し、前
記基質濃度を測定するものである。In this biosensor, an enzyme reaction layer composed of a mixture of a hydrophilic polymer, a oxidoreductase and an electron acceptor is formed on the surface of an electrode system formed on an insulating substrate, and the oxidoreductase and the electron A substance concentration change upon the reaction between the receptor and the sample solution is electrochemically detected by the electrode system, and the substrate concentration is measured.
【０００４】以下、このバイオセンサの動作を、グルコ
ースセンサを例にして説明する。グルコースを含む試料
液をグルコースセンサへ供給すると、酵素反応層が試料
液に溶解する。酵素反応層中の酸化還元酵素であるグル
コースオキシダーゼによってグルコースは酸化される。
この時、酵素反応層中の電子受容体が還元される。試料
液中のグルコースが全て反応した段階で、電極系を構成
する測定極と対極間に適当な一定電圧を印加すると、電
子受容体の還元体が酸化される。この酸化電流値を測定
することにより、試料液中のグルコース濃度を定量する
ことができる。[0004] The operation of this biosensor will be described below using a glucose sensor as an example. When a sample solution containing glucose is supplied to the glucose sensor, the enzyme reaction layer dissolves in the sample solution. Glucose is oxidized by glucose oxidase, which is an oxidoreductase in the enzyme reaction layer.
At this time, the electron acceptor in the enzyme reaction layer is reduced. When an appropriate constant voltage is applied between the measurement electrode and the counter electrode constituting the electrode system at the stage when all the glucose in the sample solution has reacted, the reduced form of the electron acceptor is oxidized. By measuring the oxidation current value, the glucose concentration in the sample solution can be determined.
【０００５】一方、試料液中に測定を妨害する物質が含
まれる場合においては次のようなバイオセンサが提案さ
れている（特開平２−３１０４５７号）。On the other hand, when a sample solution contains a substance that interferes with measurement, the following biosensor has been proposed (JP-A-2-310457).
【０００６】このバイオセンサは、絶縁性の基板上に形
成した電極系上に親水性高分子と酵素および電子受容体
からなる酵素反応層を形成し、さらに妨害物質除去用の
電極部を付加したものである。In this biosensor, an enzyme reaction layer comprising a hydrophilic polymer, an enzyme and an electron acceptor is formed on an electrode system formed on an insulating substrate, and an electrode portion for removing an interfering substance is added. Things.
【０００７】試料液を上記バイオセンサへ供給すると妨
害物質除去用の電極部で試料液中に存在する還元性の物
質は電解酸化される。この後に酵素反応層が溶解し、試
料液中の基質との間で酵素反応が進行し、電子受容体が
還元される。試料液中の還元性の物質は予め妨害物質除
去用の電極部で除去されるために安定したセンサ応答を
得ることを可能ならしめたものである。When the sample liquid is supplied to the biosensor, the reducing substance present in the sample liquid is electrolytically oxidized at the electrode for removing interfering substances. Thereafter, the enzyme reaction layer dissolves, the enzyme reaction proceeds with the substrate in the sample solution, and the electron acceptor is reduced. Since the reducing substance in the sample liquid is removed in advance by the interfering substance removing electrode section, a stable sensor response can be obtained.
【０００８】[0008]
【発明が解決しようとする課題】上記のような従来のバ
イオセンサにおいては、試料液として全血を用いた場合
に次のような課題を有していた。全血のヘマトクリット
（血液中の赤血球容積比）は検体により差がみられ、そ
の差が２０％から３０％となる場合もある。従来のグル
コースセンサを用いてヘマトクリットの異なる全血試料
中のグルコースを定量する際には、ヘマトクリットによ
ってセンサ応答が影響を受ける。具体的には、ヘマトク
リットの高い全血試料ほどセンサ応答が低くなる傾向が
あった。The above-mentioned conventional biosensor has the following problems when whole blood is used as a sample solution. The hematocrit (volume ratio of red blood cells in blood) of whole blood varies depending on the sample, and the difference may be 20% to 30%. When quantifying glucose in a whole blood sample with a different hematocrit using a conventional glucose sensor, the hematocrit affects the sensor response. Specifically, the sensor response tended to be lower for a whole blood sample having a higher hematocrit.
【０００９】さらに、従来の妨害物質除去用の電極を有
するバイオセンサを用いて、還元性の物質を多量に含有
する試料液中の特定基質を定量する場合には、次のよう
な課題を有していた。Further, when a specific substrate in a sample solution containing a large amount of a reducing substance is quantified by using a conventional biosensor having an electrode for removing an interfering substance, there are the following problems. Was.
【００１０】試料液中の還元性の物質濃度が高い場合に
は、前記還元性の物質が妨害物質除去用の電極部におい
て全て電解酸化される前に試料液が酵素反応層に到達
し、電極反応に影響を与える。その結果、センサ応答に
誤差が生じ、測定精度が低下するといった問題があっ
た。When the concentration of the reducing substance in the sample solution is high, the sample solution reaches the enzyme reaction layer before all the reducing substance is electrolytically oxidized at the electrode portion for removing the interfering substance, and Affects reaction. As a result, there has been a problem that an error occurs in the sensor response and the measurement accuracy is reduced.
【００１１】さらに、試料液の物性として例えば試料液
の粘度は、前記溶液中の種々の反応および主電極系によ
る定量に際して影響を与える。それによって、基質濃度
が正確に測定できないこともあった。Furthermore, the physical properties of the sample liquid, such as the viscosity of the sample liquid, affect various reactions in the solution and quantitative determination by the main electrode system. As a result, sometimes the substrate concentration could not be measured accurately.
【００１２】[0012]
【課題を解決するための手段】上記の課題を解決するた
めに本発明は、絶縁性の基板上に主電極系と副電極系と
を設たものである。さらに前記主電極系と副電極系間の
電気特性変化から電極上の試料液の有無を判定するもの
である。さらに前記主電極系と副電極系において各電極
系における電気特性変化を検知し、その際の時間的差異
をもとに試料液の物性を判定する基質濃度の測定方法で
ある。In order to solve the above-mentioned problems, the present invention provides a main electrode system and a sub-electrode system on an insulating substrate. Further, the presence or absence of the sample liquid on the electrode is determined from the change in the electrical characteristics between the main electrode system and the sub-electrode system. Further, there is provided a method of measuring a substrate concentration in which a change in electrical characteristics of each electrode system is detected between the main electrode system and the sub-electrode system, and physical properties of a sample liquid are determined based on a time difference at that time.
【００１３】[0013]
【作用】本発明は上記した構成により、還元性の物質を
含む試料液をバイオセンサに供給すると、副電極系にお
いて試料液中の還元性の物質を定量することができる。
一方、主電極系においては、試料液に溶解した反応層中
の酵素と測定対象となる基質との間で酵素反応が進行
し、電子受容体が還元される。前記電子受容体は、同時
に試料液中の還元性の物質によっても還元される。従っ
て、主電極系上における電子受容体の還元体の生成量
は、測定対象となる基質濃度と還元性の物質との和に依
存する。According to the present invention, when a sample liquid containing a reducing substance is supplied to a biosensor, the reducing substance in the sample liquid can be quantified in the sub-electrode system.
On the other hand, in the main electrode system, an enzymatic reaction proceeds between the enzyme in the reaction layer dissolved in the sample solution and the substrate to be measured, and the electron acceptor is reduced. The electron acceptor is simultaneously reduced by a reducing substance in the sample solution. Accordingly, the amount of the reduced form of the electron acceptor on the main electrode system depends on the sum of the concentration of the substrate to be measured and the reducing substance.
【００１４】本発明によると副電極系により還元性の物
質定量が可能であり、それゆえ、主、副両電極系の出力
より測定対象となる基質濃度を高精度に定量することが
可能なバイオセンサが実現できる。According to the present invention, it is possible to quantitatively determine a reducing substance by the sub-electrode system, and therefore, it is possible to precisely determine the concentration of the substrate to be measured from the outputs of the main and sub-electrode systems. A sensor can be realized.
【００１５】さらに、電極上への試料液の導入を主電極
系と副電極系間の電気特性変化から検知することによっ
て、試料液がバイオセンサに十分供給されることを検知
することができ、バイオセンサへの試料液供給が不十分
な時点で測定を開始するなどといった誤作動を避け、よ
り高精度な測定が可能となる。Further, by detecting the introduction of the sample liquid onto the electrode from a change in the electrical characteristics between the main electrode system and the sub-electrode system, it is possible to detect that the sample liquid is sufficiently supplied to the biosensor. avoiding malfunction of the sample fluid supply is said that such measurement starts with insufficient time to the biosensor, thereby enabling more accurate measurement.
【００１６】また、本発明の反応層は使用前は乾燥状態
にあり、試料液が副電極系に達すると、副電極系を構成
する測定極と対極間のインピーダンスが低下する。その
電気特性変化から試料液が副電極系に達したことを検知
する。つぎに、試料液は主電極系に達すると、副電極系
の場合と同様にして、その電気特性変化から試料液が主
電極系に達したことを検知する。副電極系と主電極系に
おける電気特性変化の検知の時間的差異は、試料液の粘
度等に依存する。したがって、前記時間的差異によって
試料液の粘度等を検知し、それに基づいて基質濃度を試
料液の物性を予め定性定量することなく正確に定量する
ことが可能となる。Further, the reaction layer of the present invention is in a dry state before use, and when the sample liquid reaches the sub-electrode system, the impedance between the measurement electrode and the counter electrode constituting the sub-electrode system decreases. It is detected from the change in the electrical characteristics that the sample liquid has reached the sub-electrode system. Next, when the sample liquid reaches the main electrode system, the fact that the sample liquid has reached the main electrode system is detected from the change in the electrical characteristics in the same manner as in the sub-electrode system. The time difference in detecting the change in the electrical characteristics between the sub-electrode system and the main electrode system depends on the viscosity of the sample liquid and the like. Therefore, it is possible to detect the viscosity or the like of the sample liquid based on the time difference, and to accurately determine the substrate concentration based on the detected time without qualitatively determining the physical properties of the sample liquid in advance.
【００１７】[0017]
【実施例】以下、本発明の実施例について図を参照しな
がら説明する。DESCRIPTION OF THE PREFERRED EMBODIMENTS Embodiments of the present invention will be described below with reference to the drawings.
【００１８】（実施例１）バイオセンサの一例として、
グルコースセンサについて説明する。(Embodiment 1) As an example of a biosensor,
The glucose sensor will be described.
【００１９】図１は本発明のバイオセンサの一実施例と
して作製したグルコースセンサのベース平面図、図２は
同グルコースセンサのうち反応層を除いた分解斜視図で
ある。FIG. 1 is a plan view of a base of a glucose sensor manufactured as an embodiment of the biosensor of the present invention, and FIG. 2 is an exploded perspective view of the glucose sensor excluding a reaction layer.
【００２０】ポリエチレンテレフタレートからなる絶縁
性の基板１に、スクリーン印刷により銀ペ−ストを印刷
し、リ−ド２、３、４、５を形成した。つぎに樹脂バイ
ンダーを含む導電性カーボンペーストを印刷して主電極
系の測定極６と副電極系（測定極８、対極９）を形成し
た。測定極６はリード２と、測定極８はリード４と、対
極９はリード５とそれぞれ接触している。Silver paste was printed by screen printing on an insulating substrate 1 made of polyethylene terephthalate to form leads 2, 3, 4, and 5. Next, a conductive carbon paste containing a resin binder was printed to form a main electrode system measurement electrode 6 and a sub electrode system (measurement electrode 8, counter electrode 9). The measuring electrode 6 is in contact with the lead 2, the measuring electrode 8 is in contact with the lead 4, and the counter electrode 9 is in contact with the lead 5, respectively.
【００２１】つぎに絶縁性ペーストを印刷して絶縁層１
０を形成した。絶縁層１０は、測定極６の外周部を覆っ
ており、これによって測定極６の露出部分の面積を一定
に保っている。さらに、絶縁層６は、リード２、３、
４、５を部分的に覆っている。副電極系（測定極８、対
極９）は絶縁層１０によって完全には覆われていない。Next, an insulating paste is printed to form the insulating layer 1.
0 was formed. The insulating layer 10 covers the outer peripheral portion of the measurement electrode 6, thereby keeping the area of the exposed portion of the measurement electrode 6 constant. Further, the insulating layer 6 includes the leads 2, 3,.
4 and 5 are partially covered. The sub-electrode system (the measurement electrode 8 and the counter electrode 9) is not completely covered by the insulating layer 10.
【００２２】つぎに、樹脂バインダーを含む導電性カー
ボンペーストをリード３と接触するように印刷して主電
極系の対極７を形成した。以上により図１に示すベース
１１を作製した。Next, a conductive carbon paste containing a resin binder was printed so as to be in contact with the leads 3 to form the counter electrode 7 of the main electrode system. Thus, the base 11 shown in FIG. 1 was manufactured.
【００２３】次に、上記主電極系上に酵素としてグルコ
ースオキシダーゼ（ＥＣ１．１．３．４；以下ＧＯＤと
略す）および電子受容体としてフェリシアン化カリウム
を親水性高分子としてカルボキシメチルセルロ−ス（以
下ＣＭＣと略す）の０．５wt％水溶液に溶解させた混合
水溶液を滴下し、５０℃の温風乾燥器中で１０分間乾燥
させて反応層を形成した。Next, glucose oxidase (EC 1.1.3.4; hereinafter abbreviated as GOD) as an enzyme, potassium ferricyanide as an electron acceptor, and carboxymethyl cellulose (hereinafter referred to as a hydrophilic polymer) on the main electrode system. A mixed aqueous solution dissolved in a 0.5 wt% aqueous solution of CMC (abbreviated as CMC) was added dropwise and dried in a 50 ° C. hot air drier for 10 minutes to form a reaction layer.
【００２４】このように親水性高分子、酵素および電子
受容体の混合溶液を一度に滴下、乾燥させることによっ
て製造工程を簡略化させることができる。As described above, the manufacturing process can be simplified by dropping and drying the mixed solution of the hydrophilic polymer, the enzyme and the electron acceptor at a time.
【００２５】上記のようにして反応層を形成した後、カ
バー２２およびスペーサー２１を図２中、一点鎖線で示
すような位置関係をもって接着した。カバーおよびスペ
ーサーに高分子などの透明な材料を用いると、反応層の
状態や試料液の導入状況を外部から極めて容易に確認す
ることが可能である。After the formation of the reaction layer as described above, the cover 22 and the spacer 21 were adhered in a positional relationship as shown by a dashed line in FIG. When a transparent material such as a polymer is used for the cover and the spacer, the state of the reaction layer and the state of introduction of the sample solution can be extremely easily checked from the outside.
【００２６】また、カバーを装着するとカバーとスペー
サーによって出来る空間部の毛細管現象によって、試料
液はセンサ先端の試料供給孔２３に接触させるだけの簡
易操作で容易に反応層部分および副電極系部分へ導入さ
れる。Further, when the cover is mounted, the sample liquid is easily brought into the reaction layer portion and the sub-electrode system portion by a simple operation merely by contacting the sample supply hole 23 at the tip of the sensor due to the capillary action in the space formed by the cover and the spacer. be introduced.
【００２７】なお、試料液の供給をより一層円滑にする
ためには、さらにレシチンの有機溶媒溶液を試料供給部
（センサ先端部）から反応層にわたる部位に展開し、乾
燥させることでレシチン層を形成するとよい。In order to further smoothly supply the sample solution, an organic solvent solution of lecithin is further developed from the sample supply section (sensor tip) to a portion extending from the reaction layer, and dried to form a lecithin layer. It is good to form.
【００２８】前記レシチン層を設けた場合には、絶縁性
の基板１とカバー２２とスペーサー２１によって生じる
空間部が毛細管現象を発現し得ない程度の大きさとなる
場合においても、試料液の供給が可能となる。When the above-mentioned lecithin layer is provided, even if the space formed by the insulating substrate 1, the cover 22 and the spacer 21 has such a size that the capillary phenomenon cannot be exhibited, the supply of the sample liquid is not required. It becomes possible.
【００２９】上記のように作製したグルコースセンサに
試料液としてグルコースとアスコルビン酸の混合水溶液
３μｌを試料供給孔２３より供給した。試料液供給前
は、反応層を含めてバイオセンサ全体が乾燥状態であ
る。そこで、試料液が空気孔２４部分まで達し、主電極
系上の反応層が溶解すると、主電極系の測定極と副電極
系の測定極間のインピーダンスが変化する。3 μl of a mixed aqueous solution of glucose and ascorbic acid was supplied from the sample supply hole 23 as a sample solution to the glucose sensor prepared as described above. Before the supply of the sample liquid, the entire biosensor including the reaction layer is in a dry state. Then, when the sample liquid reaches the air hole 24 and the reaction layer on the main electrode system is dissolved, the impedance between the measurement electrode of the main electrode system and the measurement electrode of the sub-electrode system changes.
【００３０】前記インピーダンスの変化により、試料液
がバイオセンサに十分に供給されたことを検知し、次に
副電極系の対極を基準にして測定極に＋１Ｖを印加し、
５秒後の電流値を測定したところ、試料液中のアスコル
ビン酸濃度に比例した。したがって、副電極系を用いて
アスコルビン酸の定量が可能である。Based on the change in impedance, it is detected that the sample liquid has been sufficiently supplied to the biosensor, and then +1 V is applied to the measurement electrode with reference to the counter electrode of the sub-electrode system.
When the current value after 5 seconds was measured, it was proportional to the ascorbic acid concentration in the sample solution. Therefore, ascorbic acid can be quantified using the auxiliary electrode system.
【００３１】反応層中のＧＯＤおよびフェリシアン化カ
リウムは特に主電極系上に固定化されたものではない
が、反応層が試料液に溶解すると親水性高分子を含むた
めに試料液の粘度が高まり物質の拡散は抑制される。し
たがって、短時間では反応層構成物質は副電極系上へ移
動しない。しかしながら、より信頼性の高い測定を実施
するためには酵素およびフェリシアン化カリウムを固定
化することも有効である。GOD and potassium ferricyanide in the reaction layer are not particularly fixed on the main electrode system. However, when the reaction layer is dissolved in the sample solution, the viscosity of the sample solution increases because the sample contains a hydrophilic polymer, and the viscosity of the sample solution increases. Is suppressed. Therefore, the reaction layer constituent material does not move onto the sub-electrode system in a short time. However, it is also effective to immobilize the enzyme and potassium ferricyanide in order to perform a more reliable measurement.
【００３２】さらに、試料液を供給し、インピーダンス
変化を検知してから１分後に主電極系の対極を基準にし
て主電極系の測定極に＋０．５Ｖを印加し、５秒後の電
流値Ｉを測定した。Ｉはアスコルビン酸によって還元さ
れて生成したフェロシアン化カリウムの酸化電流と、グ
ルコースがＧＯＤによって酸化された際に還元されて生
成したフェロシアン化カリウムの酸化電流の和である。Further, one minute after supplying the sample liquid and detecting a change in impedance, +0.5 V was applied to the measurement electrode of the main electrode system with reference to the counter electrode of the main electrode system, and the current value was measured 5 seconds later. I was measured. I is the sum of the oxidation current of potassium ferrocyanide generated by reduction by ascorbic acid and the oxidation current of potassium ferrocyanide generated by reduction when glucose is oxidized by GOD.
【００３３】副電極系によりアスコルビン酸濃度が既知
であるため、主電極系において得られた酸化電流値よ
り、試料液中のグルコース濃度を算出することができ
た。Since the concentration of ascorbic acid was known by the sub-electrode system, the glucose concentration in the sample solution could be calculated from the oxidation current value obtained in the main electrode system.
【００３４】つぎに、試料液供給後、主電極系と副電極
系間の電気特性変化によって試料液が十分に供給された
ことを検知したのちに上記の手順によって得たグルコー
ス濃度と、前記電気特性変化の代わりに目視によってセ
ンサに試料液が十分供給されたことを確認して、上記の
手順と同様にして得たグルコース濃度のばらつきをそれ
ぞれ３０個のグルコースセンサを用いて比較した。Next, after supplying the sample liquid, it is detected that the sample liquid has been sufficiently supplied by the change in the electric characteristics between the main electrode system and the sub-electrode system, and then the glucose concentration obtained by the above procedure and Instead of the characteristic change, it was confirmed that the sample liquid was sufficiently supplied to the sensor, and the dispersion of the glucose concentration obtained in the same manner as in the above procedure was compared using each of 30 glucose sensors.
【００３５】その結果、応答のばらつきを表わす変動係
数（ＣＶ値）は、それぞれ２％と５％であった。本発明
の複数の電極系間の電気特性変化によって試料液の供給
を検知した方が目視による場合よりばらつきの少ない結
果が得られたのは、副電極系および主電極系において応
答電流を得る際の時間的なばらつきをより少なくするこ
とができたことによる。As a result, the coefficient of variation (CV value) representing the variation in response was 2% and 5%, respectively. Detecting the supply of the sample liquid based on the change in the electrical characteristics between the plurality of electrode systems of the present invention resulted in less variation than in the case of visual observation because the response current was obtained in the sub-electrode system and the main electrode system. This is because the time variation of the time was reduced.
【００３６】（実施例２）図３は本発明のバイオセンサ
の別の一実施例として作製したグルコースセンサのベー
ス平面図である。Embodiment 2 FIG. 3 is a plan view of a base of a glucose sensor manufactured as another embodiment of the biosensor of the present invention.
【００３７】ポリエチレンテレフタレートからなる絶縁
性基板１上に、実施例１と同様にしてスクリーン印刷に
より図３に示したベース１１を形成した。この主電極系
（測定極６、対極７）上に実施例１と同様にして、ＧＯ
Ｄとフェリシアン化カリウムとＣＭＣの混合水溶液を滴
下した。A base 11 shown in FIG. 3 was formed on an insulating substrate 1 made of polyethylene terephthalate by screen printing in the same manner as in Example 1. On this main electrode system (measuring electrode 6, counter electrode 7), GO
A mixed aqueous solution of D, potassium ferricyanide and CMC was added dropwise.
【００３８】つぎに、副電極系（測定極８、対極９）上
にフェリシアン化カリウムとＣＭＣの混合水溶液を滴下
して５０℃の温風乾燥器中で１０分間乾燥させて主電極
系上に反応層を、副電極系上にフェリシアン化カリウム
−ＣＭＣ層をそれぞれ形成した。Next, a mixed aqueous solution of potassium ferricyanide and CMC was dropped on the sub-electrode system (measurement electrode 8, counter electrode 9) and dried in a 50 ° C. hot air drier for 10 minutes to react on the main electrode system. The layers were each formed with a potassium ferricyanide-CMC layer on the auxiliary electrode system.
【００３９】さらに実施例１と同様にして、カバーおよ
びスペーサーと共に一体化してグルコースセンサを作製
した。Further, in the same manner as in Example 1, the glucose sensor was integrated with the cover and the spacer to produce a glucose sensor.
【００４０】上記のように作製したグルコースセンサに
試料液としてグルコースとアスコルビン酸の混合水溶液
３μｌを試料供給孔２３より供給すると、副電極系上の
フェリシアン化カリウム−ＣＭＣ層と、主電極系上の反
応層がそれぞれ溶解した。When 3 μl of a mixed aqueous solution of glucose and ascorbic acid is supplied from the sample supply hole 23 as a sample solution to the glucose sensor prepared as described above, the potassium ferricyanide-CMC layer on the sub-electrode system reacts with the reaction on the main electrode system. The layers each dissolved.
【００４１】実施例１と同様に、主電極系の作用極と副
電極系の作用極間のインピーダンス変化により試料液が
センサに十分供給されたことを検知し、次に副電極系の
対極を基準にして作用極に＋０．５Ｖを印加し、５秒後
の酸化電流値をＩ0とした。As in the first embodiment, it is detected that the sample liquid has been sufficiently supplied to the sensor by the impedance change between the working electrode of the main electrode system and the working electrode of the sub-electrode system. A reference voltage of +0.5 V was applied to the working electrode, and the oxidation current value after 5 seconds was defined as I 0 .
【００４２】副電極系上のフェリシアン化カリウムはア
スコルビン酸によって還元され、フェロシアン化カリウ
ムが生成する。前記＋０．５Ｖの印加によって得られる
酸化電流Ｉ0はこのフェロシアン化カリウムの酸化によ
るものである。従って、試料液中のアスコルビン酸に比
例する。The potassium ferricyanide on the sub-electrode system is reduced by ascorbic acid to form potassium ferrocyanide. The oxidation current I 0 obtained by the application of +0.5 V is due to the oxidation of the potassium ferrocyanide. Therefore, it is proportional to ascorbic acid in the sample solution.
【００４３】上記反応層中のＧＯＤは特に主電極系上に
固定化されたものではないが、反応層が試料液に溶解す
ると親水性高分子を含むために試料液の粘度が高まり物
質の拡散は抑制される。よって、短時間では反応層構成
物質は副電極系上へ移動しない。しかしながら、より信
頼性の高い測定を実施するためには酵素を固定化するこ
とも有効である。The GOD in the reaction layer is not particularly fixed on the main electrode system. However, when the reaction layer is dissolved in the sample solution, the viscosity of the sample solution increases because the sample contains a hydrophilic polymer, and the diffusion of the substance increases. Is suppressed. Therefore, the reaction layer constituent material does not move onto the sub-electrode system in a short time. However, it is also effective to immobilize the enzyme to perform a more reliable measurement.
【００４４】さらに、試料液を供給し、前記インピーダ
ンス変化を検知してから１分後に主電極系の対極を基準
にして主電極系の作用極に＋０．５Ｖを印加し、５秒後
の電流値Ｉ1を測定した。Further, one minute after the sample liquid was supplied and the impedance change was detected, +0.5 V was applied to the working electrode of the main electrode system with reference to the counter electrode of the main electrode system, and the current after 5 seconds. the value I 1 was measured.
【００４５】Ｉ1はアスコルビン酸による還元で生成し
たフェロシアン化カリウムの酸化電流と、グルコースが
ＧＯＤによって酸化された際の還元で生成したフェロシ
アン化カリウムの和の酸化電流である。両電極系におけ
る応答性の差を補正する係数をｋとすると、Ｉ1−ｋＩ0
で得られる電流値は試料液中のグルコース濃度と極めて
良く対応した。I 1 is the sum of the oxidation current of potassium ferrocyanide generated by reduction with ascorbic acid and the sum of potassium ferrocyanide generated by reduction when glucose is oxidized by GOD. Assuming that a coefficient for correcting the difference in responsiveness between the two electrode systems is k, I 1 -kI 0
The current value obtained in Step 2 corresponded very well with the glucose concentration in the sample solution.
【００４６】（実施例３）ポリエチレンテレフタレート
からなる絶縁性基板上１に、実施例１と同様にしてスク
リーン印刷により図３に示したベースを形成した。この
主電極系（作用極６、対極７）上に実施例１と同様にし
て、ＧＯＤとフェリシアン化カリウムとＣＭＣの混合水
溶液を滴下した。Example 3 A base shown in FIG. 3 was formed on an insulating substrate 1 made of polyethylene terephthalate by screen printing in the same manner as in Example 1. A mixed aqueous solution of GOD, potassium ferricyanide, and CMC was dropped on this main electrode system (working electrode 6, counter electrode 7) in the same manner as in Example 1.
【００４７】つぎに、副電極系（作用極８、対極９）上
に牛血清アルブミン（以後ＢＳＡと略す）とフェリシア
ン化カリウムとＣＭＣの混合水溶液を滴下した。主電極
系上にはＧＯＤとフェリシアン化カリウムとＣＭＣの混
合水溶液が、副電極系上にはＢＳＡとフェリシアン化カ
リウムとＣＭＣの混合水溶液がそれぞれ存在する。次
に、５０℃の温風乾燥器中で１０分間乾燥させて主電極
系上に反応層を、副電極系上にＢＳＡ−フェリシアン化
カリウム−ＣＭＣ層をそれぞれ形成した。さらに実施例
１と同様にして、カバーおよびスペーサーと共に一体化
してグルコースセンサを作製した。Next, a mixed aqueous solution of bovine serum albumin (hereinafter abbreviated as BSA), potassium ferricyanide and CMC was dropped on the sub-electrode system (working electrode 8 and counter electrode 9) . Main electrode
The system contains a mixture of GOD, potassium ferricyanide and CMC.
The mixed aqueous solution contains BSA and ferricyanide on the sub-electrode system.
There is a mixed aqueous solution of Li and CMC respectively. Next
Then, the mixture was dried for 10 minutes in a 50 ° C. hot air drier to form a reaction layer on the main electrode system and a BSA-potassium ferricyanide-CMC layer on the sub-electrode system. Further, in the same manner as in Example 1, the glucose sensor was integrated with the cover and the spacer to produce a glucose sensor.
【００４８】副電極系上にＢＳＡ−フェリシアン化カリ
ウム−ＣＭＣ層を形成することにより、還元性の物質
（例えばアスコルビン酸など）の副電極系上における拡
散などの条件が主電極系上と類似したものにできる。By forming the BSA-potassium ferricyanide-CMC layer on the sub-electrode system, conditions such as diffusion of a reducing substance (for example, ascorbic acid) on the sub-electrode system are similar to those on the main electrode system. Can be.
【００４９】また、ＧＯＤやＢＳＡのようなタンパク質
が電極系上に存在する場合には、タンパク質の吸着など
によって電極活性が一部低下する場合も有り得るが、上
記のように主電極系と副電極系の両者の電極系上にタン
パク質を配置することによって、各電極系において検出
される酸化電流値の差を小さくすることができる。その
結果、主、副両電極系における酸化電流間の補正を簡略
化することができる。本効果はカーボンを主体とする電
極材料を用いた際に特に有効である。When a protein such as GOD or BSA exists on the electrode system, the electrode activity may partially decrease due to protein adsorption or the like. By arranging the protein on both electrode systems of the system, the difference between the oxidation current values detected at each electrode system can be reduced. As a result, it is possible to simplify the correction between the oxidation currents in the main and sub electrode systems. This effect is particularly effective when an electrode material mainly composed of carbon is used.
【００５０】また、各電極系の位置関係としてはセンサ
先端の試料供給孔２３から試料液を供給する際には、図
３のように副電極系を試料供給孔に近い位置に配置する
ことが有効である。すなわち、試料液は試料供給孔から
空気孔の方向へと進行するため、ＧＯＤを含む反応層は
試料液の流れの上流よりも下流に配置する方が副電極系
上へのフェリシアン化カリウムの移動確率を減少させる
ことができることによる。ただし、実施例１で述べたよ
うに、酵素を固定化する際には何等問題とはならない。When the sample liquid is supplied from the sample supply hole 23 at the tip of the sensor, the sub-electrode system may be arranged at a position close to the sample supply hole as shown in FIG. It is valid. In other words, since the sample solution proceeds from the sample supply hole to the air hole, it is better to arrange the reaction layer containing GOD downstream rather than upstream of the flow of the sample solution so that the transfer probability of potassium ferricyanide onto the sub-electrode system is higher. Can be reduced. However, as described in Example 1, there is no problem when immobilizing the enzyme.
【００５１】（実施例４）バイオセンサの一例として、
フルクトースセンサについて説明する。(Embodiment 4) As an example of a biosensor,
The fructose sensor will be described.
【００５２】図４は本発明のバイオセンサのさらに別の
一実施例として作製したフルクトースセンサのベース平
面図である。FIG. 4 is a base plan view of a fructose sensor manufactured as still another embodiment of the biosensor of the present invention.
【００５３】図４のように、ポリエチレンテレフタレー
トからなる絶縁性の基板１に、スクリーン印刷により銀
ペ−ストを印刷しリ−ド２、３、４、５を形成した。つ
ぎに、樹脂バインダーを含む導電性カーボンペーストを
用いて主電極系の作用極６および副電極系の作用極８を
印刷形成した。つぎに、絶縁性ペーストを用いて絶縁層
１０を形成した。絶縁層１０は、作用極６および作用極
８の外周部を覆っており、これによって作用極６および
作用極８の露出部分の面積を一定に保っている。さら
に、絶縁層６は、リード２、３、４を部分的に覆ってい
る。As shown in FIG. 4, leads 2, 3, 4, and 5 were formed by printing silver paste on an insulating substrate 1 made of polyethylene terephthalate by screen printing. Next, the working electrode 6 of the main electrode system and the working electrode 8 of the sub-electrode system were printed using a conductive carbon paste containing a resin binder. Next, the insulating layer 10 was formed using an insulating paste. The insulating layer 10 covers the outer peripheral portions of the working electrode 6 and the working electrode 8, thereby keeping the area of the exposed portion of the working electrode 6 and the working electrode 8 constant. Further, the insulating layer 6 partially covers the leads 2, 3, and 4.
【００５４】最後に樹脂バインダーを含む導電性カーボ
ンペーストをリード３と接触するように印刷して対極７
を形成してベース１１を作製した。対極７は主電極系と
副電極系の共通対極である。Finally, a conductive carbon paste containing a resin binder is printed so as to be in contact with the lead 3 and the counter electrode 7 is printed.
Was formed to produce a base 11. The counter electrode 7 is a common counter electrode of the main electrode system and the sub electrode system.
【００５５】このように主電極系と副電極系の対極部分
を共通にすることによって製造工程を簡略化でき、また
リードを１本減らすことにより製造コストの低減にも寄
与することができる。さらに、センサ電極表面の起伏を
少なくすることで反応層の剥離を防ぎ、その結果保存安
定性の優れたセンサが得られるとともに、電極上の試料
液の移動をより円滑にし精度の高いセンサ応答が得られ
る。As described above, by making the counter electrode portions of the main electrode system and the sub-electrode system common, the manufacturing process can be simplified, and by reducing one lead, it is possible to contribute to a reduction in manufacturing cost. Furthermore, by reducing the unevenness of the sensor electrode surface, the separation of the reaction layer is prevented, and as a result, a sensor with excellent storage stability can be obtained. can get.
【００５６】次に、上記主電極系の作用極６上に酵素と
してフルクトースデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．９
９．１１；以下ＦＤＨと略す）および電子受容体として
フェリシアン化カリウムと親水性高分子としてヒドロキ
シエチルセルロース（以下ＨＥＣと略す）をリン酸緩衝
液（ｐＨ＝５）に溶解させた混合水溶液を滴下し、４０
℃の温風乾燥器中で１０分間乾燥させて反応層を形成し
た。Next, on the working electrode 6 of the main electrode system, fructose dehydrogenase (EC 1.1.9) was used as an enzyme.
9.11; a mixed aqueous solution obtained by dissolving potassium ferricyanide as an electron acceptor and hydroxyethylcellulose (hereinafter abbreviated as HEC) as a hydrophilic polymer in a phosphate buffer (pH = 5) is dropped. 40
The mixture was dried for 10 minutes in a warm air dryer at a temperature of 10 ° C. to form a reaction layer.
【００５７】さらに実施例１と同様にして、カバーおよ
びスペーサーと共に一体化してフルクトースセンサを作
製した。Further, in the same manner as in Example 1, a fructose sensor was manufactured integrally with the cover and the spacer.
【００５８】上記のフルクトースセンサに、フルクトー
スとアスコルビン酸の混合水溶液３μｌを供給し、実施
例１と同様にして基質であるフルクトース濃度を算出す
ると、アスコルビン酸濃度にかかわらず試料液中のフル
クトース濃度によく一致した。When 3 μl of a mixed aqueous solution of fructose and ascorbic acid was supplied to the fructose sensor, and the fructose concentration as a substrate was calculated in the same manner as in Example 1, the fructose concentration in the sample solution was determined regardless of the ascorbic acid concentration. Well matched.
【００５９】（実施例５）バイオセンサの一例として、
グルコースセンサについて説明する。(Embodiment 5) As an example of a biosensor,
The glucose sensor will be described.
【００６０】実施例１と同様にして図１に示すベースを
作製した。つぎに前記主電極系上に、酵素としてＧＯ
Ｄ、および電子受容体としてフェリシアン化カリウムお
よび親水性高分子としてＣＭＣの混合水溶液を滴下し、
５０℃の温風乾燥器中で１０分間乾燥させて反応層を形
成した。A base shown in FIG. 1 was produced in the same manner as in Example 1. Next, GO was used as an enzyme on the main electrode system.
D, and a mixed aqueous solution of potassium ferricyanide as an electron acceptor and CMC as a hydrophilic polymer is dropped,
It was dried in a hot air dryer at 50 ° C. for 10 minutes to form a reaction layer.
【００６１】上記のようにして反応層を形成した後、カ
バー２２およびスペーサー２１を図２中、一点鎖線で示
すような位置関係をもって接着した。After the formation of the reaction layer as described above, the cover 22 and the spacer 21 were adhered in a positional relationship as shown by a dashed line in FIG.
【００６２】上記のように作製したグルコースセンサに
試料液として全血を試料供給孔２３より供給した。試料
液を供給する前は、反応層を含めてバイオセンサ全体が
乾燥状態である。試料液である全血は、まず副電極系に
達し、副電極系の作用極８と対極９間のインピーダンス
が低下する。このインピーダンス変化をリード４、５を
介して検知する。The whole blood was supplied from the sample supply hole 23 as a sample liquid to the glucose sensor prepared as described above. Before supplying the sample liquid, the entire biosensor including the reaction layer is in a dry state. Whole blood, which is a sample liquid, first reaches the sub-electrode system, and the impedance between the working electrode 8 and the counter electrode 9 of the sub-electrode system decreases. This impedance change is detected via the leads 4 and 5.
【００６３】つぎに全血は主電極系上へ達し、主電極系
上の反応層が溶解すると、主電極系の作用極６と対極７
間のインピーダンスが低下する。このインピーダンス変
化をリード２、３を介して検知する。Next, the whole blood reaches the main electrode system, and when the reaction layer on the main electrode system is dissolved, the working electrode 6 and the counter electrode 7 of the main electrode system are dissolved.
The impedance between them decreases. This change in impedance is detected via the leads 2 and 3.
【００６４】反応層が全血に溶解すると、全血中のグル
コースがＧＯＤによって酸化されると同時に、フェリシ
アン化カリウムが還元されてフェロシアン化カリウムが
生成する。グルコースセンサに全血を供給して１分後
に、対極７を基準にして＋０．５Ｖを作用極６に印加
し、５秒後の酸化電流を測定した。この電流はフェロシ
アン化カリウムの酸化に伴うものであり、基質であるグ
ルコース濃度に比例する。When the reaction layer is dissolved in whole blood, glucose in the whole blood is oxidized by GOD, and at the same time, potassium ferricyanide is reduced to produce potassium ferrocyanide. One minute after the whole blood was supplied to the glucose sensor, +0.5 V was applied to the working electrode 6 with reference to the counter electrode 7, and the oxidation current was measured 5 seconds later. This current accompanies the oxidation of potassium ferrocyanide and is proportional to the concentration of glucose as a substrate.
【００６５】ヘマトクリットが２０％から６０％までの
全血試料を用いて、前記酸化電流値測定したところ、ヘ
マトクリットの増加に伴い酸化電流値は低下した。さら
に、副電極系と主電極系においてインピーダンス変化を
検知した時間の差をｔとして、ヘマトクリットが２０％
から６０％までの全血試料を用いたところ、ヘマトクリ
ットの増加に比例して前記ｔの増加がみられた。When the oxidation current value was measured using a whole blood sample having a hematocrit of 20% to 60%, the oxidation current value decreased as the hematocrit increased. Further, assuming that the difference between the times when the impedance change is detected between the sub electrode system and the main electrode system is t, the hematocrit is 20%.
Using up to 60% whole blood samples, the increase in t was seen in proportion to the increase in hematocrit.
【００６６】つぎに、前記酸化電流値を前記ｔ因子によ
って補正した値をセンサ応答とした。前記センサ応答
は、全血試料のヘマトクリットにかかわらず一定の値が
得られた。前記センサ応答は、試料液の全血中に含まれ
るグルコース濃度にきわめて良い一致を示した。Next, a value obtained by correcting the oxidation current value by the t factor was used as a sensor response. The sensor response obtained a constant value regardless of the hematocrit of the whole blood sample. The sensor response showed a very good agreement with the glucose concentration contained in whole blood of the sample solution.
【００６７】また、試料供給孔２３と空気孔２４は必ず
しも区別する必要はなく、試料供給孔２３を空気孔とし
て空気孔２４より試料液を供給することも可能である。
この場合は、まず主電極系においてインピーダンスの変
化を検知し、つぎに副電極系においてインピーダンス変
化を検知する。この時間的差異ｔ2は必ずしも前記ｔと
は一致しないが、予めｔ2とヘマトクリットとの関係を
調べることで同様の効果が得られる。The sample supply hole 23 and the air hole 24 need not always be distinguished from each other, and the sample supply hole 23 can be used as an air hole to supply a sample liquid from the air hole 24.
In this case, first, a change in impedance is detected in the main electrode system, and then a change in impedance is detected in the sub-electrode system. Although this time difference t 2 does not always coincide with the above-mentioned t, a similar effect can be obtained by checking the relationship between t 2 and hematocrit in advance.
【００６８】なお、上記実施例ではグルコースセンサと
フルクトースセンサについて示したが、本発明はスクロ
ースセンサや、乳酸センサ、コレステロールセンサ、ア
ルコールセンサ、アミノ酸センサなど酵素の関与する反
応系に広く用いることができる。In the above embodiments, the glucose sensor and the fructose sensor have been described. However, the present invention can be widely used in a reaction system involving enzymes such as a sucrose sensor, a lactic acid sensor, a cholesterol sensor, an alcohol sensor, and an amino acid sensor. .
【００６９】上記実施例では親水性高分子としてカルボ
キシメチルセルロースおよびヒドロキシエチルセルロー
スを用いたが、これらに限定されることはなく、ポリビ
ニルピロリドン,ポリビニルアルコール、ゼラチンおよ
びその誘導体、アクリル酸およびその塩、メタアクリル
酸およびその塩、スターチおよびその誘導体、無水マレ
イン酸およびその塩、そして、セルロース誘導体、具体
的には、ヒドロキシプロピルセルロース、メチルセルロ
ース、エチルセルロース、エチルヒドロキシエチルセル
ロース、カルボキシメチルエチルセルロースを用いても
同様の効果が得られた。In the above examples, carboxymethylcellulose and hydroxyethylcellulose were used as hydrophilic polymers. However, the present invention is not limited to these. For example, polyvinylpyrrolidone, polyvinyl alcohol, gelatin and its derivatives, acrylic acid and its salts, methacrylic Similar effects can be obtained by using acids and salts thereof, starch and derivatives thereof, maleic anhydride and salts thereof, and cellulose derivatives, specifically, hydroxypropyl cellulose, methyl cellulose, ethyl cellulose, ethyl hydroxyethyl cellulose, and carboxymethylethyl cellulose. Obtained.
【００７０】一方、電子受容体としては、上記実施例に
示したフェリシアン化カリウム以外に、ｐ−ベンゾキノ
ン、フェナジンメトサルフェート、メチレンブルー、フ
ェロセン誘導体なども使用できる。On the other hand, as the electron acceptor, p-benzoquinone, phenazine methosulfate, methylene blue, a ferrocene derivative and the like can be used in addition to the potassium ferricyanide shown in the above embodiment.
【００７１】さらに、酵素としてはグルコースオキシダ
ーゼ、フルクトースデヒドロゲナーゼ以外に、インベル
ターゼ、ムタロターゼ、乳酸オキシダーゼ、コレステロ
ールオキシダーゼ、アルコールオキシダーゼ、キサンチ
ンオキシダーゼ、アミノ酸オキシダーゼ等も用いること
ができる。Further, in addition to glucose oxidase and fructose dehydrogenase, invertase, mutarotase, lactate oxidase, cholesterol oxidase, alcohol oxidase, xanthine oxidase, amino acid oxidase and the like can also be used.
【００７２】また、上記実施例において酵素および電子
受容体については試料液に溶解する方式について示した
が、これに制限されることはなく、固定化によって試料
液に不溶化させた場合にも適用することができる。In the above examples, the method of dissolving the enzyme and the electron acceptor in the sample solution was described. However, the present invention is not limited to this, and the present invention can be applied to the case where the enzyme and the electron acceptor are insolubilized in the sample solution by immobilization. be able to.
【００７３】また、上記実施例では、測定極と対極のみ
の二極電極系について述べたが、参照極を加えた三電極
方式にすれば、より正確な測定が可能である。In the above embodiment, a bipolar electrode system having only a measurement electrode and a counter electrode has been described. However, if a three-electrode system including a reference electrode is used, more accurate measurement can be performed.
【００７４】[0074]
【発明の効果】以上のように本発明のバイオセンサによ
ると、センサ応答に妨害を与えるような還元性の物質が
含まれる試料液についても、妨害物除去の前処理をする
ことなく高精度な測定をすることができる。As described above, according to the biosensor of the present invention, even for a sample solution containing a reducing substance that interferes with the sensor response, a high precision can be obtained without performing a pretreatment for removing the interfering substance. You can make measurements.
【００７５】さらに、本発明のバイオセンサを用いた基
質濃度の測定方法によると、センサ応答のばらつきを極
めて小さくすることができる。Further, according to the method for measuring the substrate concentration using the biosensor of the present invention, the variation in sensor response can be extremely reduced.
【図１】本発明のバイオセンサの一実施例の反応層を除
いたグルコースセンサの平面図FIG. 1 is a plan view of a glucose sensor in one embodiment of the biosensor of the present invention, from which a reaction layer is removed.
【図２】本発明のバイオセンサの一実施例の反応層を除
いたグルコースセンサの分解斜視図FIG. 2 is an exploded perspective view of a glucose sensor in one embodiment of the biosensor of the present invention, from which a reaction layer is removed.
【図３】本発明のバイオセンサの他の実施例のグルコー
スセンサの平面図FIG. 3 is a plan view of a glucose sensor according to another embodiment of the biosensor of the present invention.
【図４】本発明のバイオセンサの他の実施例のフルクト
ースセンサの平面図FIG. 4 is a plan view of a fructose sensor according to another embodiment of the biosensor of the present invention.
１ 絶縁性の基板 ２、３、４、５ リード ６ 測定極 ７ 対極 ８ 測定極 ９ 対極 １０ 絶縁層 １１ ベース ２１ スペーサー ２２ カバー ２３ 試料供給孔 ２４ 空気孔 Reference Signs List 1 Insulating substrate 2, 3, 4, 5 Lead 6 Measurement pole 7 Counter electrode 8 Measurement pole 9 Counter electrode 10 Insulating layer 11 Base 21 Spacer 22 Cover 23 Sample supply hole 24 Air hole
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 特開 平２−129541（ＪＰ，Ａ) 特開 平１−253648（ＪＰ，Ａ) 特開 昭62−232554（ＪＰ，Ａ) 特開 平１−212345（ＪＰ，Ａ) ──────────────────────────────────────────────────続 き Continuation of the front page (56) References JP-A-2-129541 (JP, A) JP-A-1-253648 (JP, A) JP-A-62-2232554 (JP, A) JP-A-1 212345 (JP, A)
Claims (3)
形成された主電極系および副電極系と、前記主電極系上
に接して形成された反応層とからなり、前記反応層が酵
素と電子受容体を含有し、前記副電極系上に少なくとも
電子受容体とアルブミンを含有する層を有することを特
徴とするバイオセンサ。An insulating substrate; a main electrode system and a sub-electrode system formed on the insulating substrate; and a reaction layer formed in contact with the main electrode system. Contains an enzyme and an electron acceptor, and has a layer containing at least an electron acceptor and albumin on the sub-electrode system.
形成された主電極系および副電極系と、前記主電極系上
に接して形成された反応層とからなり、前記反応層が酵
素を含有することを特徴とするバイオセンサを用い、前
記主電極系における電気特性変化と前記副電極系におけ
る電気特性変化と前記両電極系における電気特性変化を
検知した時間的差異をもとに試料液を判定し、測定値を
補正することを特徴とする基質濃度の測定方法。2. An insulating substrate; a main electrode system and a sub-electrode system formed on the insulating substrate ;
Consists of a reaction layer formed in contact with, using a biosensor, wherein the reaction layer containing an enzyme, wherein the electrical property changes in the electrical properties change with the sub electrode system in the main electrode system both The sample liquid is judged based on the time difference when the change in the electrical characteristics in the electrode system is detected , and the measured value is determined.
A method for measuring a substrate concentration, which comprises correcting .
であることを特徴とする請求項２に記載の基質濃度の測
定方法。3. The method according to claim 2, wherein the physical property of the sample liquid is a volume ratio of red blood cells in blood.
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