JP2702818B2 - Biosensors and their preparation - Google Patents

Biosensors and their preparation


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【0001】 [0001]

【産業上の利用分野】本発明は種々の微量の生体試料中の特定成分について、試料液を希釈することなく迅速かつ簡便に定量することのできるバイオセンサおよびその製造法に関する。 The present invention relates for a specific component in a biological sample a variety of trace relates biosensor and a manufacturing method capable of rapidly and simply quantifying without diluting the sample solution.

【0002】 [0002]

【従来の技術】試料液の希釈や撹拌などを行なうことなく、血液などの生体試料中の特定成分について簡易に定量しうる方式として、以下のようなバイオセンサを既に提案している(特願平1−274194号参照)。 BACKGROUND ART without performing such dilution or agitation of a sample solution, a method that can be quantified easily for a particular component in a biological sample such as blood, has already proposed a biosensor as described below (Japanese Patent Application No. see JP flat 1-274194).

【0003】このバイオセンサは絶縁性の基板上にスクリ−ン印刷等の方法で電極系を形成し、上記電極系上に親水性高分子と酸化還元酵素を含む層、親水性高分子層および電子受容体を含む層を順に形成したものである。 [0003] The biosensor subscription on an insulating substrate - forming an electrode system by the method of screen printing or the like, a layer containing an oxidoreductase and a hydrophilic polymer on the electrode system, the hydrophilic polymer layer and a layer containing an electron acceptor is obtained by forming in sequence.
試料液を酵素反応層上へ滴下すると反応層が溶解し、試料液中の基質との間で酵素反応が進行し、電子受容体が還元される。 The sample solution dissolved the reaction layer and added dropwise to the enzyme reaction layer, the enzyme reaction proceeds between the substrate in the sample solution, the electron acceptor is reduced. 酵素反応終了後、この還元された電子受容体を電気化学的に酸化し、このとき得られる酸化電流値から試料液中の基質濃度を求めるものである。 After completion of the enzyme reaction, and electrochemically oxidizing the reduced electron acceptor, and requests substrate concentration in the sample solution from the oxidation current value obtained at this time.

【0004】 [0004]

【発明が解決しようとする課題】このような従来の構成では、センサを作製した時点で酸化還元酵素が電極表面に吸着すること等によって有効な電極面積が減少し、安定なセンサ応答が得られないことがあった。 BRIEF Problem to be Solved] In such a conventional configuration, an effective electrode area is reduced, such as by an oxidoreductase upon to produce a sensor is adsorbed on the electrode surface obtained stable sensor response there was to be no. また、センサ製造工程において酸化還元酵素を含む層を形成した後は酵素活性に影響があるような温度条件下に置くことができなかった。 Further, after forming a layer containing an oxidoreductase in the sensor manufacturing process could not be placed in a temperature such that the effect on the enzymatic activity.

【0005】本発明は上記課題を解決するもので、広い温度条件下でも製造可能で、安定した高精度のセンサを提供することを目的としている。 [0005] The present invention is intended to solve the above problems, it can be manufactured in a wide temperature conditions, and its object is to provide a sensor of the stable and accurate.

【0006】 [0006]

【課題を解決するための手段】本発明は上記目的を達成するために、 絶縁性の基板上に形成した少なくとも測定 The present invention SUMMARY OF] In order to achieve the above object, at least measured formed on an insulating substrate
極と対極からなる電極系と、前記電極系上に接して設け An electrode system consisting of electrode and a counter electrode provided over and in contact with the electrode system
た水溶性の反応層からなり、前記反応層が親水性高分子 Were made water-soluble reaction layer, the reaction layer is a hydrophilic polymer
と電子受容体を含み前記電極系に接して設けた水溶性の And the contact is provided with a water-soluble the electrode system comprises an electron acceptor
第1の層、親水性高分子からなり第1の層上に設けた水 The first layer, the water provided to the first layer consists of a hydrophilic polymer
溶性の第2の層、および第2層の上に設けた酸化還元酵 A second layer of soluble, and redox enzyme provided on the second layer
素を含む水溶性の第3の層の少なくとも3層からなるこ This of at least three layers of water-soluble third layer including iodine
とを特徴とするバイオセンサである。 A biosensor characterized and.

【0007】さらに、絶縁性の基板上に少くとも測定極と対極からなる電極系を設けた後、前記電極系上に親水性高分子と電子受容体を含む第1の層を形成し、次に親水性高分子の有機溶媒溶液を前記第1の層上に展開して親水性高分子からなる第2の層を形成し、さらに酸化還元酵素の水溶液を第2の層上に展開して酸化還元酵素を含む第3の層を形成することによりバイオセンサを製造するものである。 Furthermore, after providing the electrode system consisting of measuring electrode and a counter electrode at least on an insulating substrate, a first layer comprising a hydrophilic polymer and an electron acceptor formed on the electrode system, the following in an organic solvent solution of a hydrophilic polymer to expand on said first layer forming a second layer of hydrophilic polymer, further expanded the aqueous solution of the oxidoreductase on the second layer it is to produce a biosensor by forming a third layer containing a redox enzyme.

【0008】 [0008]

【作用】この型のバイオセンサにおいては、まず最初に試料液中の特定成分と酸化還元酵素による酵素反応が進行する。 In the biosensor of the effects this type, first enzymatic reaction by the specific component and the oxidoreductase in the sample liquid proceeds. 上記した本発明の構成によると、酸化還元酵素が反応層表面近くに位置しているため、反応層全体が溶解する前に酸化還元酵素部分が溶解した段階で酵素反応が開始し、その結果、測定に要する時間を従来のセンサより短かくすることができる。 According to the configuration of the present invention described above, since the oxidoreductase is positioned near the reaction layer surface, the enzyme reaction was initiated at a stage where the oxidoreductase portion before the entire reaction layer is dissolved dissolved, as a result, the time required for measurement can be shortened than conventional sensors. また、酸化還元酵素が電極表面と接触していないため、酸化還元酵素やそれに含まれる不純物等が電極表面を不活性化することを防ぐことができる。 Also, the oxidoreductase is not in contact with the electrode surface, it is possible to prevent impurities or the like contained in the oxidoreductase and it inactivates the electrode surface. これによって非常に精度の高いバイオセンサが得られる。 This biosensor highly accurate by is obtained.

【0009】さらに、酸化還元酵素は一般に温度数十℃ [0009] In addition, the oxidation-reduction enzyme is generally a temperature of several tens ℃
以上で取り扱うとその活性が著しく低下するものが多いが、本発明の製造法によると酸化還元酵素を含む層の作製工程以前においては目的に応じて加温操作をすることが可能となる。 When dealing with higher Although many of its activity is significantly reduced, it is possible to warming operation in accordance with the purpose in the manufacturing process before the layer containing the oxidoreductase according to the preparation of the present invention. すなわち、親水性高分子と電子受容体を含む層や親水性高分子層を加温して短時間に作製することや、温度制御によって反応層の性状を制御することができる。 That, and making a layer or a hydrophilic polymer layer comprising a hydrophilic polymer and an electron acceptor in a short time with heating, it is possible to control the properties of the reaction layer by a temperature control.

【0010】 [0010]

【実施例】以下、本発明の一実施例について図1および図2を参照しながら説明する。 EXAMPLES Hereinafter, with reference to FIGS. 1 and 2 for one embodiment of the present invention. バイオセンサの一例として グルコ−スセンサについて説明する。 Susensa explained - gluco as an example of biosensor. 図1は本発明のバイオセンサの一実施例として作製したグルコ−スセンサのカバ−及びスペ−サを除いたものの断面図であり、図2は同じく本発明の一実施例における反応層を除いたグルコ−スセンサの分解斜視図である。 Figure 1 is glucoamylase was produced as an embodiment of the biosensor of the present invention - Susensa birch - and space - a cross-sectional view but excluding the service, except for the reaction layer in one embodiment of Figure 2 also present invention it is an exploded perspective view of Susensa - gluco.

【0011】 図2において、ポリエチレンテレフタレートからなる絶縁性の基板1上に、スクリーン印刷法によって銀ペーストを印刷しリード2、3を形成した。 [0011] In FIG. 2, on an insulating substrate 1 made of polyethylene terephthalate, silver paste was printed to form a lead 2,3 by screen printing. さら Further
に印刷により、樹脂バインダーを含む導電性カーボンペ By printing, conductive comprise a resin binder Kabonpe
ーストからなる電極系(測定極4、対極5)および絶縁 Electrode system (measuring electrode 4, the counter electrode 5) made of paste and insulating
性ペーストからなる絶縁層6を形成した。 To form an insulating layer 6 made of sexual paste. 絶縁層6は電 The insulating layer 6 electrostatic
極系の露出部分の面積を一定とし、かつリードを部分的 A constant area of the exposed portion of the electrode system, and partially the lead
に覆っている。 It is covered in.

【0012】次に、測定極4および対極5の露出部分を研磨後、空気中で100℃にて4時間熱処理を施した。 [0012] Next, after polishing the exposed portions of the measuring electrode 4 and counter electrode 5 was subjected to 4 hours heat treatment at 100 ° C. in air.
このようにして電極部分を構成した後、親水性高分子として、カルボキシメチルセルロ−ス(以下、CMCという)の0.5wt%水溶液を電極上へ展開、乾燥させてC After forming such electrode portion in the, as a hydrophilic polymer, carboxymethylcellulose - scan (hereinafter, referred to as CMC) with a 0.5 wt% aqueous solution of deployment on an electrode, dried C
MC層を形成した。 The formation of the MC layer. 次に、このCMC層上へ電子受容体としてフェリシアン化カリウムの水溶液を滴下、加熱乾燥させてCMC−フェリシアン化カリウム層7を形成した。 Next, this addition an aqueous solution of potassium ferricyanide as an electron acceptor to the CMC layer was formed on the CMC- potassium ferricyanide layer 7 by heating and drying.

【0013】このときの加熱温度によって乾燥に要する時間が変化し、その結果フェリシアン化カリウムの結晶粒径を制御することができる。 [0013] vary the time required for drying by heating temperature at this time, it is possible to control the crystal grain size of the resulting potassium ferricyanide. 乾燥時間を短くすると結晶粒径は小さくなり、試料液への溶解速度が高められる。 Grain size and to shorten the drying time is reduced, the rate of dissolution in the sample solution is enhanced. よってセンサ応答速度を速くすることが可能である。 Thus it is possible to increase the sensor response speed. 従来は酸化還元酵素が存在していたためにこのような加熱は不可能であった。 Which has been conventionally impossible Such heating for the oxidoreductase is present. 加温はその酵素活性に影響を与えるからである。 Warming is because affect its enzymatic activity. 一方、CMCを含む溶液は粘性が高いために、あまりに温度を上げて乾燥時間を短くすると溶液中の気体成分が十分抜けず、泡を含んだ層が形成される。 Meanwhile, a solution containing the CMC due to high viscosity, not sufficiently escape too gaseous component in the solution A shorter drying time by increasing the temperature, the layer containing the bubbles is formed. これはセンサ応答に大きな影響を与えるために避けなければならない。 This must be avoided in order to give a significant effect on the sensor response. したがって、このCMC−フェリシアン化カリウム層7の作製温度は20℃〜100℃の範囲であることが望ましい。 Therefore, manufacturing temperature of the CMC- potassium ferricyanide layer 7 is preferably in the range of 20 ° C. to 100 ° C..

【0014】このCMC−フェリシアン化カリウム層7 [0014] The CMC- potassium ferricyanide layer 7
上を完全に覆うようにして、ポリビニルピロリドン(以下、PVPという)の1%エタノ−ル溶液を展開し、乾燥させ、PVP層8を形成した。 So as to cover the complete, polyvinylpyrrolidone (hereinafter referred to as PVP) 1% ethanol in - Le solution is expanded, and then dried to form a PVP layer 8. PVP層8を設けることによって、全血など固形成分を含む試料液に対するセンサ応答度の低下を最小限にすることができる。 By providing the PVP layer 8, a reduction of the sensor responsivity with respect to a sample liquid containing whole blood, such as solid components can be minimized. さらに、フェリシアン化カリウムと後述の酸化還元酵素を分離することで、センサの保存特性を著しく向上させることができる。 Furthermore, by separating the oxidoreductase below with potassium ferricyanide, it can significantly improve the storage characteristics of the sensor.

【0015】このPVP層8上へ、酵素としてグルコ− [0015] to top this PVP layer 8, glucoamylase as an enzyme -
スオキシダ−ゼ(以下、GODという)の水溶液を展開し、乾燥させ、GOD層9を形成した。 Suokishida - Ze (hereinafter, referred to as GOD) Expand aqueous, dried to form a GOD layer 9. この場合、PV In this case, PV
Pが親水性高分子であるために、GOD層9は部分的にPVP層8と混合された状態で薄膜状となっているが、 For P is a hydrophilic polymer, GOD layer 9 but has a partially thin film in a state of being mixed with the PVP layer 8,
撹拌等を伴わないためマクロ的には分離した層としてみることができる。 The macro for without agitation, etc. can be seen as a separate layer.

【0016】さらに、界面活性剤であるレシチンの1% Furthermore, 1% Lecithin is a surface active agent
トルエン溶液を滴下、図2に示すセンサの試料供給孔1 Dropwise a toluene solution, the sample supply hole 1 in the sensor shown in FIG. 2
3に相当する基板先端部分から反応層上に至るまで展開し、乾燥させることによってレシチン層10を形成した。 From the substrate tip portion corresponding to 3 until the reaction layer to expand to form a lecithin layer 10 by drying. ここでレシチンは試料液を円滑に反応層上へ導入する役割を果たす。 Here lecithin serves to introduce into the reaction smoothly layer the sample solution.

【0017】レシチン層10を形成する際の溶媒として本実施例ではトルエンを用いたが、このように反応層が難溶性を示す溶媒を用いることによって、反応層を乱すことなく一様に広げることが可能である。 [0017] While the present embodiment is a solvent for forming the lecithin layer 10 using toluene, by this way reaction layer used solvent having poor solubility, uniformly spread it without disturbing the reaction layer it is possible.

【0018】上記のようにして反応層を作製した後、図2に示すようにカバ−12およびスペ−サ−11を図2 [0018] After producing the reaction layer as described above, cover -12 and space as shown in Figure 2 - a service -11 2
中一点鎖線で示すような位置関係をもって接着した。 It was bonded in a positional relationship as shown by a chain line in. カバ−およびスペ−サ−11に透明な高分子材料を用いると、反応層の状態や試料液の導入状況を外部から極めて容易に判断することも可能である。 Cover - and space - the use of transparent polymeric materials in service -11 can be very easily determine deployment status of the state or the sample solution in the reaction layer from the outside. カバ−12を装着することによって、試料液をセンサ先端の試料供給孔13 By attaching the cover -12, the sample liquid probe tips of the sample supply hole 13
に接触させるだけの簡易操作で容易に試料液が反応層部分へ導入される。 Easily sample liquid by a simple operation of only contacting is introduced into the reaction layer portion. 試料液の供給量はカバ−12とスペ− The supply amount of the sample liquid cover -12 and space -
サ−11によって生じる空間の容積に依存するため予め定量する必要もない。 There is no need to pre-quantitative because it depends on the volume of the space caused by Sa -11. さらに、測定中の試料液の蒸発を最小限に抑えることができ、精度の高い測定が可能となる。 Furthermore, the evaporation of the sample liquid in the measurement can be minimized, thereby enabling highly accurate measurement.

【0019】こうして作製したグルコ−スセンサに試料液としてグルコ−ス標準液3μlを試料供給孔より供給し、40秒後に対極を基準にして測定極にアノ−ド方向へ+0.5Vのパルス電圧を印加し、5秒後の電流値を測定した。 [0019] Thus fabricated gluco - gluco as a sample solution Susensa - scan standard solution 3μl supplied from the sample supply port, the measuring electrode relative to the counter electrode after 40 seconds anode - a pulse voltage to the de direction + 0.5V the applied, a current value was measured after 5 seconds. 試料液が反応層へ到達すると、GOD層、P When the sample solution reaches the reaction layer, GOD layer, P
VP層、CMC−フェリシアン化カリウム層が順次試料液に溶解する。 VP layer, CMC-potassium ferricyanide layer is dissolved sequentially sample solution. 試料液中のグルコ−スはGODによって酸化され、そこで移動した電子によってフェリシアン化カリウムがフェロシアン化カリウムに還元される。 Glucoside in the sample solution - scan is oxidized by GOD, where potassium ferricyanide by the mobile electrons is reduced to potassium ferrocyanide. つぎに、上記のパルス電圧の印加により、生成したフェロシアン化カリウムの濃度に基づく酸化電流が得られ、この電流値は基質であるグルコ−スの濃度に対応した。 Next, the application of the pulse voltage, the generated oxidation current based on the concentration of the potassium ferrocyanide is obtained, the current value is glucosyl a substrate - corresponding to the scan concentration.

【0020】上記グルコ−スセンサの測定域は、900 [0020] The glucoside - measurement range of Susensa is, 900
mg/dl(0.05モル/l)以上という高濃度まで良好な直線関係が得られた。 mg / dl good linear relationship up to a high concentration of (0.05 mol / l) or more was obtained. さらに、上記グルコ−スセンサに全血試料を3μl供給して40秒後の応答電流を測定したところ450mg/dl(0.025モル/l)以上までの直線関係が得られ、同一全血試料についてセンサ3 Furthermore, the gluco - Susensa linear relationship a whole blood sample to the point where 450 mg / dl (0.025 mol / l) or more measured response current after and 3μl supply 40 seconds is obtained, for the same whole blood sample sensor 3
0個を用いたときの変動係数も3%以下と非常に再現性のよい応答が得られた。 0 coefficient of variation which may respond with more than 3% and highly reproducible when using the was obtained. なお、上記実施例ではグルコ−スセンサについて示したが、本発明はアルコ−ルセンサや乳酸センサ、コレステロ−ルセンサなど酸化還元酵素の関与する反応系に広く用いることができる。 In the above embodiment gluco - has been described Susensa, the present invention is alcohol - Rusensa and lactic sensor, cholesterol - Rusensa like can be widely used in the reaction system involved in the oxidation-reduction enzyme.

【0021】上記実施例では親水性高分子としてCMC [0021] In the above embodiment CMC as the hydrophilic polymer
およびPVPを用いたが、これらに限定されることはなく、ビニルアルコ−ル系、セルロ−ス系、ビニルピロリドン系、ゼラチン系、アクリル酸塩系、デンプン系、無水マレイン酸系、アクリルアミド系、メタクリレ−ト樹脂などをそれぞれ用いても同様の効果が得られた。 And was used PVP, it is not limited thereto, vinylalcohol - Le system, cellulose - scan system, vinylpyrrolidone, gelatin-based, acrylate-based, starch-based, maleic acid anhydride, acrylamide, methacrylates - it is used such as preparative resin each the same effect was obtained. これらの親水性高分子を適当な濃度の溶液にしたものを塗布、乾燥することにより、必要な膜厚の親水性高分子層を電極上に形成することができる。 Applying those these hydrophilic polymers to a solution of appropriate concentration, followed by drying, it is possible to form a hydrophilic polymer layer of the required thickness on the electrode.

【0022】また、上記実施例では、測定極と対極のみの二極電極系について述べたが、参照極を加えた三電極方式にすれば、より正確な測定が可能である。 [0022] In the above embodiment has been described bipolar electrode system of the measuring electrode and the counter electrode only, if the three-electrode system plus a reference electrode, it is possible to more accurate measurements.

【0023】一方、電子受容体としては、上記実施例に示したフェリシアン化カリウム以外に、p−ベンゾキノン、フェナジンメトサルフェ−ト、フェロセンなども使用できる。 On the other hand, as the electron acceptor, in addition to potassium ferricyanide shown in the above example, p- benzoquinone, phenazine meth monkey Fe - DOO, ferrocene, etc. can be used.

【0024】さらに、酸化還元酵素としてはグルコ−スオキシダ−ゼ以外に、アルコ−ルオキシダ−ゼ、乳酸オキシダ−ゼ、コレステロ−ルオキシダ−ゼ、キサンチンオキシダ−ゼ、アミノ酸オキシダ−ゼ等も用いることができる。 Furthermore, gluco as oxidoreductase - besides zero, alcohol - - Suokishida Ruokishida - Ze, lactic Okishida - Ze, cholesterol - Ruokishida - Ze, xanthine oxy da - can also be used peptidase etc. - peptidase, amino Okishida .

【0025】 [0025]

【発明の効果】以上の実施例から明らかなように本発明によれば、従来より短い時間で高精度測定のできるバイオセンサを提供することができる。 According to apparent the present invention from the above embodiment according to the present invention, it is possible to provide a biosensor that can highly accurately measured in less than a conventional time. さらに、本発明の製造法によると親水性高分子と電子受容体を含む層などを加温して短時間に作製することや、温度制御によって反応層の性状を制御することができ、高精度バイオセンサを高歩留まりで効率よく製造することができる。 Further, and it according to the preparation of the present invention and a layer containing a hydrophilic polymer and an electron acceptor to produce in a short time with heating, it is possible to control the properties of the reaction layer by a temperature control, high precision it can be efficiently produced a biosensor at a high yield.


【図1】本発明の一実施例のバイオセンサのカバ−およびスペ−サを除いた断面図 [1] of the biosensor according to an embodiment of the present invention cover - and space - sectional view, excluding the service

【図2】本発明の一実施例のバイオセンサの反応層を除いた分解斜視図 Exploded perspective view, excluding the reaction layer of the biosensor of one embodiment of the present invention; FIG


1 絶縁性の基板 4 測定極 5 対極 7 CMC−フェリシアン化カリウム層(第1の層) 8 PVP層(第2の層) 9 GOD層(第3の層) 1 insulating substrate 4 measuring electrode 5 counter electrode 7 CMC-potassium ferricyanide layer (first layer) 8 PVP layer (second layer) 9 GOD layer (third layer)

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 特開 平3−54447(JP,A) 特開 昭60−173459(JP,A) 特開 昭64−23153(JP,A) ────────────────────────────────────────────────── ─── of the front page continued (56) reference Patent flat 3-54447 (JP, a) JP Akira 60-173459 (JP, a) JP Akira 64-23153 (JP, a)

Claims (2)

    (57)【特許請求の範囲】 (57) [the claims]
  1. 【請求項1】絶縁性の基板上に形成した少なくとも測定極と対極からなる電極系と、前記電極系上に接して設けた水溶性の反応層からなり、前記反応層が親水性高分子と電子受容体を含み前記電極系に接して設けた水溶性の第1の層、親水性高分子からなり第1の層上に設けた水溶性の第2の層、および第2層の上に設けた酸化還元酵素を含む水溶性の第3の層の少なくとも3層からなることを特徴とするバイオセンサ。 And 1. A least measuring electrode and the electrode system consisting of a counter electrode formed on an insulating substrate, and consists of water-soluble reaction layer provided in contact on the electrode system, the reaction layer and a hydrophilic polymer first layer of the contact provided water-soluble the electrode system comprises an electron acceptor, a second layer of water soluble provided on the first layer consists of a hydrophilic polymer, and on the second layer biosensor characterized in that it consists of at least three layers of the third layer of a water-soluble, including the oxidoreductase provided.
  2. 【請求項2】絶縁性の基板上に少なくとも測定極と対極からなる電極系を設けた後、前記電極系上に親水性高分子と電子受容体を含む水溶液を展開し、乾燥させることにより第1の層を形成し、次に親水性高分子の有機溶媒溶液を前記第1の層上に展開し、乾燥させることにより親水性高分子からなる第2の層を形成し、さらに酸化還元酵素の水溶液を第2の層上に展開し、乾燥させることにより酸化還元酵素を含む第3の層を形成することを特徴とするバイオセンサの製造法。 Wherein after providing the electrode system consisting of at least the measurement electrode and a counter electrode on an insulating substrate, an aqueous solution containing a hydrophilic polymer and an electron acceptor spread on the electrode system, the by drying forming a first layer, then the organic solvent solution of the hydrophilic polymer to expand on the first layer to form a second layer of hydrophilic polymer by drying, further oxidoreductase preparation of a biosensor, characterized in that the aqueous solution was spread on a second layer, by drying to form a third layer comprising a redox enzyme.
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