JP2001330581A - Substrate concentration determination method - Google Patents

Substrate concentration determination method

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JP2001330581A
JP2001330581A JP2000147688A JP2000147688A JP2001330581A JP 2001330581 A JP2001330581 A JP 2001330581A JP 2000147688 A JP2000147688 A JP 2000147688A JP 2000147688 A JP2000147688 A JP 2000147688A JP 2001330581 A JP2001330581 A JP 2001330581A
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liquid
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Makoto Ikeda
Shiro Nankai
史朗 南海
信 池田
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Matsushita Electric Ind Co Ltd
松下電器産業株式会社
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Abstract

PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a substrate concentration determination method capable of determining the supply state of sample liquid easily and surely, and having high precision and little dispersion. SOLUTION: This substrate concentration determination method includes a process for judging the necessity of execution of a substrate concentration determination process, based on a period of time from the contact of the sample liquid with a working electrode 5 and a counter electrode 8 until the contact thereof with a liquid junction detection electrode 7, by using a biosensor in which the working electrode 5, the counter electrode 8, the liquid junction detection electrode 7, a reagent layer and a sample liquid supply opening 11 are provided and the liquid junction detection electrode 7 is arranged on the position separated from the sample liquid supply opening 11 furthermore than the working electrode 5 and the counter electrode 8.

Description

【発明の詳細な説明】 DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

【0001】 [0001]

【発明の属する技術分野】本発明は、バイオセンサを用いた基質濃度定量法に関する。 The present invention relates to relates to substrate concentration quantification method using a biosensor.

【0002】 [0002]

【従来の技術】スクロース、グルコースなど糖類の定量分析法として、施光度計法、比色法、還元滴定法および各種クロマトグラフィーを用いた方法等が開発されている。 BACKGROUND OF THE INVENTION Sucrose, as a quantitative analysis method of saccharides such as glucose, polarimetry dilatometry, colorimetry and the method using a reductive titration and various kinds of chromatography has been developed. しかし、これらの方法はいずれも、糖類に対する特異性があまり高くないので精度が悪い。 However, none of these methods, accuracy is poor because there is not very high specificity for sugar. また、これらの方法のうち施光度計法は、操作は簡便ではあるが、操作時の温度の影響を大きく受ける。 Further, polarimetry dilatometry of these methods, the operation is convenient, but greatly influenced by the temperature during operation. 従って、施光度計法は、一般の人々が家庭などで簡易に糖類を定量する方法としては適切でない。 Therefore, optical rotation meter method is not suitable as a method for the general public is to quantify the sugars into simple, such as at home.

【0003】ところで、近年、酵素の有する特異的触媒作用を利用した種々のタイプのバイオセンサが開発されている。 In recent years, various types of biosensors utilizing a specific catalytic action possessed by enzyme have been developed.

【0004】以下に、試料液中の基質の定量法の一例としてグルコースの定量法について説明する。 [0004] Hereinafter, description will be given Determination of glucose as an example of the determination of a substrate in a sample solution. 電気化学的なグルコースの定量法としては、グルコースオキシダーゼ(EC1.1.3.4:以下GODと略す)と酸素電極あるいは過酸化水素電極とを使用して行う方法が一般に知られている(例えば、鈴木周一編「バイオセンサー」講談社)。 The determination of electrochemical glucose, glucose oxidase (EC 1.1.3.4: hereinafter abbreviated to GOD) and a method carried out using an oxygen electrode or a hydrogen peroxide electrode is generally known (e.g. , Shuichi Suzuki, ed., "biosensor" Kodansha).

【0005】GODは、酸素を電子伝達体として、基質であるβ−D−グルコースをD−グルコノ−δ−ラクトンに選択的に酸化する。 [0005] GOD is oxygen as an electron mediator, selectively oxidizing beta-D- glucose is a substrate to D- glucono -δ- lactone. 酸素の存在下で、GODによる酸化反応過程において、酸素が過酸化水素に還元される。 In the presence of oxygen, the oxidation reaction process by GOD, oxygen is reduced to hydrogen peroxide. 酸素電極によって、この酸素の減少量を計測するか、あるいは過酸化水素電極によって過酸化水素の増加量を計る。 By the oxygen electrode, or to measure the amount of reduction of the oxygen, or measure the amount of increase in the hydrogen peroxide by a hydrogen peroxide electrode. 酸素の減少量及び過酸化水素の増加量は、試料液中のグルコースの含有量に比例するので、酸素の減少量または過酸化水素の増加量からグルコースの定量が行われる。 Reduction and increased amount of hydrogen peroxide of oxygen is proportional to the amount of glucose in the sample solution, determination of glucose is carried out from the increasing amount of reduced oxygen content or hydrogen peroxide.

【0006】上記方法では、その反応過程からも推測できるように、測定結果は試料液に含まれる酸素濃度の影響を大きく受ける欠点があり、また試料液に酸素が存在しない場合では測定が不可能となる。 [0006] In the above method, the so can be inferred from the reaction process, the measurement results has the disadvantage that greatly affected by the oxygen concentration in the sample solution, also impossible to measure with the absence of oxygen in the sample solution to become.

【0007】そこで、酸素を電子伝達体として用いず、 [0007] Therefore, without using oxygen as an electron mediator
フェリシアン化カリウム、フェロセン誘導体、キノン誘導体等の有機化合物や金属錯体を電子伝達体として用いる新しいタイプのグルコースセンサが開発されてきた。 Potassium ferricyanide, ferrocene derivatives, a new type of glucose sensor using an organic compound or a metal complex such as quinone derivative as an electron mediator has been developed.
このタイプのセンサでは、酵素反応の結果生じた電子伝達体の還元体を電極上で酸化することにより、その酸化電流量から試料液中に含まれるグルコース濃度が求められる。 This type of sensor, by oxidizing a reductant of the resulting electron mediator in the enzyme reaction on the electrode, the glucose concentration in the sample solution from the oxidation current amount is determined. このような有機化合物や金属錯体を酸素の代わりに電子伝達体として用いることで、既知量のGODとそれらの電子伝達体を安定な状態で正確に電極上に担持させて試薬層を形成することが可能となる。 By using such an organic compound or metal complex as the electron mediator in place of oxygen, to form a reagent layer is supported on a precisely on the electrode a known amount of GOD and their electron carrier in a stable state it is possible. この場合、試薬層を乾燥状態に近い状態で電極系と一体化させることもできるので、この技術に基づいた使い捨て型のバイオセンサが近年多くの注目を集めている。 In this case, since it is also possible to integrate the electrode system and a state close to the reagent layer dryness, disposable biosensors based on this technology has attracted recent lot of attention. その代表的な例が、特許第2517153号公報に示されるバイオセンサである。 A typical example is a biosensor disclosed in Japanese Patent No. 2517153. このバイオセンサにおいては、測定器に着脱可能に接続されたセンサに試料液を導入するだけで容易にグルコース濃度を測定器で測定することができる。 The biosensor can be easily glucose concentration by simply introducing a sample solution into detachably connected sensor to the measuring instrument for measuring the measuring instrument. このような手法は、グルコースの定量だけに限らず、試料液中に含まれる他の基質の定量にも応用可能である。 Such an approach is not limited to quantification of glucose, it is also applicable to the determination of other substrate contained in the sample solution.

【0008】 [0008]

【発明が解決しようとする課題】上記のようなバイオセンサでは、二電極間(作用極と対極間)の抵抗値の変化に基づいて試料液の供給を検知し、検知をトリガーとして基質の測定を開始する場合が多い。 In the biosensor as defined above which INVENTION SUMMARY is] detects the supply of the sample solution based on a change in resistance between the two electrodes (between the working electrode and the counter electrode), substrate measuring of the detection as a trigger in many cases to start. しかしながらこのような検知法の場合、二電極間に試料液が達すれば、試料液の供給量が不十分で、両電極が十分に試料液に接していない状態でも基質の測定が開始する場合があり、測定結果にばらつきが生ずる場合があった。 However, when such a detection method, if the sample liquid reaches a between the two electrodes, an insufficient supply amount of the sample solution, if both electrodes are measurement of the substrate is started even when no sufficient contact with the sample liquid There, there is a case where variations in measurement results occur.

【0009】また、作用極及び対極が、空間部を介して相互に対向する位置に配置されている場合、目視によっても、試料液のセンサへの供給が判別し難く、上記と同様の問題が生じる場合があった。 Further, the working electrode and the counter electrode, if it is arranged at a position opposed to each other via the space, by visual observation, it is difficult to determine the supply to the sensor of the sample solution, the above and similar problems there was a case that occurs.

【0010】これらの問題を解決するため、作用極及び対極に加えて、液絡検知用電極として使用される第3の電極を、作用極及び対極よりも試料液供給口から離れた位置に備えたバイオセンサ及びそれを用いた基質の定量法が、特開平8−320304号公報に開示されている。 [0010] To solve these problems, in addition to the working electrode and a counter electrode, a third electrode is used as the liquid-fault detector electrode, provided at a position away from the liquid sample supply inlet than the working electrode and a counter electrode biosensor and assay of a substrate using the same is disclosed in JP-a-8-320304. これによると、試料液の反応層への供給によって生じた、対極と第3の電極との間の電気的変化を検知することにより、試料液の供給を確実に検知することができる。 According to this, caused by the supply to the reaction layer of the sample liquid, by detecting an electrical change between the counter electrode and the third electrode, it is possible to reliably detect the supply of the sample solution.

【0011】しかし、このバイオセンサ及びそれを用いた基質の定量法では、試料量不足を補うために再度試料の供給を実施した場合であっても測定が開始するので、 [0011] However, in this biosensor and assay of a substrate using the same, since the measurement is started even when carrying out the supply of the sample again in order to compensate for the sample shortage,
正確な測定結果が得られないことがあった。 There is not an accurate measurement result is obtained.

【0012】さらに、妨害物質の影響や、参照極を用いないことにより生ずる印加電圧の摂動を抑制することが要望されていた。 Furthermore, the influence of interfering substances, suppressing perturbations applied voltage caused by not using the reference electrode has been desired.

【0013】そこで本発明は、上記の問題点に鑑み、試料液の供給状態を容易に判別することができ、高精度で、ばらつきが少ない基質濃度定量法を提供することを目的とする。 [0013] The present invention has been made in view of the above problems, the supply state of the sample solution can be easily determined with high accuracy, and to provide a less variation substrate concentration determination method.

【0014】 [0014]

【課題を解決するための手段】上記の課題を解決するために、本発明による基質濃度定量法は、作用極、対極、 In order to solve the above problems BRIEF SUMMARY OF THE INVENTION, substrate concentration quantification method according to the invention, the working electrode, counter electrode,
液絡検知電極、少なくとも酵素及び電子伝達体を包含する試薬層、並びに試料液供給口を備え、前記液絡検知電極が、前記作用極及び前記対極よりも前記試料液供給口から離れた位置に配置されているバイオセンサを用い、 Liquid junction sensing electrode, the reagent layer includes at least an enzyme and an electron mediator, and comprises a liquid sample supply inlet, the liquid junction sensing electrode is spaced apart from the liquid sample supply inlet than the working electrode and the counter electrode using a biosensor is disposed,
前記作用極に前記電子伝達体を酸化する電位を印加する工程(A)及び前記作用極と前記対極間の電流値を測定する工程(B)を有する基質濃度定量工程において得られた前記電流値に基づいて試料液中の基質濃度を定量する基質濃度定量法であって、少なくとも、前記試料液供給口から前記試料液を供給する工程(C)、前記試料液が前記作用極及び前記対極に接触したことを検知する工程(D)、前記試料液が前記液絡検知電極に接触したことを検知する工程(E)、前記試料液が前記作用極及び前記対極に接触してから、前記試料液が前記液絡検知電極に接触するまでの時間(T1)を計測する工程(F)、前記T1に基づいて前記基質濃度定量工程の実施または中止を決定する工程(G)、及び前記決定に基づいて前記基質濃度定量 Applying a potential to oxidize the electron mediator to the working electrode step (A) and the current value obtained at substrate concentrations quantification step comprises the step of measuring (B) a current value between the said working electrode counter electrode a substrate concentration assay to quantify the substrate concentration in the sample solution on the basis of, at least, the step of supplying the sample solution from the sample solution supply port (C), the sample solution is the working electrode and the counter electrode a step of detecting that the contact with (D), the step of the sample solution is detected that contacts the liquid junction sensing electrode (E), from the sample liquid is in contact with the working electrode and the counter electrode, wherein the sample process the liquid to measure the time (T1) until the contact with the liquid junction sensing electrode (F), wherein the step of determining the implementation or suspension of the substrate concentration quantitative process based on T1 (G), and the determination the substrate concentration quantified based 程を実施または中止する工程(H)を含むことを特徴とする。 Characterized in that it comprises a step (H) to implement or discontinue extent.

【0015】ここで、工程(D)において、作用極と対極間の電気的信号の変化により、試料液が前記作用極及び前記対極に接触したことを検知し、工程(E)において、前記作用極と液絡検知電極間、または前記対極と前記液絡検知電極間の電気的信号の変化により、前記試料液が前記液絡検知電極に接触したことを検知し、工程(F)において、前記作用極と前記対極間の電気的信号の変化を検知してから、前記作用極と前記液絡検知電極間、または前記対極と前記液絡検知電極間の電気的信号の変化を検知するまでの時間(T2)を計測し、前記T [0015] In the step (D), by a change in electrical signal between the working electrode and the counter electrode, it detects that the sample liquid is in contact with the working electrode and the counter electrode, in the step (E), the working between electrode and liquid junction sensing electrode, or by a change in electrical signal between the liquid junction sensing electrode and the counter electrode, detects that the sample liquid is brought into contact with the said liquid junction sensing electrode, in step (F), wherein after detecting a change in electrical signal between the working electrode the counter electrode, to detect a change in electrical signal between between said working electrode the liquid junction sensing electrode, or the counter electrode the liquid junction sensing electrode by measuring the time (T2), the T
2をT1とすることが好ましい。 It is preferred that 2 to T1.

【0016】また、少なくとも工程(D)の前に、作用極と対極間に電圧を印加する工程を有し、かつ少なくとも工程(E)の前に、前記作用極と液絡検知電極間、または前記対極と前記液絡検知電極間に電圧を印加する工程を有することが好ましい。 Further, before at least step (D), comprising the step of applying a voltage between the working electrode and the counter electrode, and before at least step (E), wherein between the working electrode and the liquid junction sensing electrode, or it is preferable to have a process for applying a voltage between the liquid junction sensing electrode and the counter electrode.

【0017】また、少なくとも工程(D)の前に、作用極、対極及び液絡検知電極に電位を印加する工程を有していてもよい。 Further, before at least step (D), the working electrode may have a step of applying a potential to the counter electrode and the liquid junction sensing electrode.

【0018】また、作用極、対極及び液絡検知電極が同一基板上に配置されているバイオセンサを用いてもよい。 Further, the working electrode may be used biosensor counter electrode and liquid junction sensing electrode is disposed on the same substrate.

【0019】また、作用極及び対極が、空間部を介して相互に対向する位置に配置されているバイオセンサを用いてもよい。 Further, the working electrode and counter electrode, may be used biosensor is arranged at a position opposed to each other via a space.

【0020】また、試薬層及び液絡検知電極が、空間部を介して相互に対向する位置に配置されているバイオセンサを用い、対極と前記液絡検知電極間の電流値を測定することにより妨害物質の検知を行う工程を有することが好ましい。 Further, the reagent layer and the liquid junction sensing electrode, using a biosensor is disposed at a position opposed to each other via the space, by measuring the current value between the liquid junction sensing electrode and a counter electrode it is preferable to have a step for detection of the interfering substances.

【0021】また、液絡検知電極が参照極として機能することが好ましい。 Further, it is preferable that the liquid junction sensing electrode functions as a reference electrode.

【0022】 [0022]

【発明の実施の形態】以下、本発明の実施の形態を説明する。 BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION Hereinafter, an embodiment of the present invention.

【0023】上記の課題を解決するために、本発明による基質濃度定量法は、作用極、対極、液絡検知電極、少なくとも酵素及び電子伝達体を包含する試薬層、並びに試料液供給口を備え、前記液絡検知電極が、前記作用極及び前記対極よりも前記試料液供給口から離れた位置に配置されているバイオセンサを用い、前記作用極に前記電子伝達体を酸化する電位を印加する工程(A)及び前記作用極と前記対極間の電流値(以下、応答電流値と略称する)を測定する工程(B)を有する基質濃度定量工程において得られた前記応答電流値に基づいて試料液中の基質濃度を定量する基質濃度定量法であって、少なくとも、前記試料液供給口から前記試料液を供給する工程(C)、前記試料液が前記作用極及び前記対極に接触したことを検知する [0023] In order to solve the above problem, the substrate concentration quantification method according to the invention, the working electrode comprises a counter electrode, the liquid junction sensing electrode, the reagent layer includes at least an enzyme and an electron mediator, and a liquid sample supply inlet the liquid junction sensing electrode, using a biosensor that is located away from the liquid sample supply inlet than said working electrode and said counter electrode, applying a potential to oxidize the electron mediator to the working electrode step (a) and the current value between the said working electrode the counter electrode (hereinafter, abbreviated as the response current value) based on the response current value obtained at substrate concentrations quantification step comprises the step of measuring the (B) sample a substrate concentration assay to quantify the substrate concentration in the liquid, at least, the step of supplying the sample solution from the sample solution supply port (C), said sample solution is brought into contact with the said working electrode and said counter electrode to detect 程(D)、前記試料液が前記液絡検知電極に接触したことを検知する工程(E)、前記試料液が前記作用極及び前記対極に接触してから、前記試料液が前記液絡検知電極に接触するまでの時間(T1)を計測する工程(F)、前記T1に基づいて前記基質濃度定量工程の実施または中止を決定する工程(G)、及び前記決定に基づいて前記基質濃度定量工程を実施または中止する工程(H)を含むことを特徴とする。 Degree (D), the step of the sample solution is detected that contacts the liquid junction sensing electrode (E), from the sample liquid is in contact with the working electrode and the counter electrode, the liquid junction sensing the sample fluid step of measuring a time (T1) until the contact with the electrode (F), wherein the step of determining the implementation or suspension of the substrate concentration quantitative process based on T1 (G), and the substrate concentration quantified based on the determination characterized in that it comprises a step (H) to implement or discontinue process.

【0024】この方法によると、T1に基づいて試料液の供給状態を容易かつ確実に判別することができ、試料液が適切に供給された場合のみ、基質濃度定量工程が実施されるので、高精度でばらつきの少ない測定を行うことができる。 [0024] According to this method, it is possible to easily and reliably determine the supply state of the sample liquid based on T1, only if the sample solution is properly supplied, since the substrate concentration quantification step is performed, high it can be performed with less measurement variation in accuracy.

【0025】本発明の好ましい態様においては、工程(D)において、作用極と対極間の電気的信号の変化により、試料液が前記作用極及び前記対極に接触したことを検知し、工程(E)において、前記作用極と液絡検知電極間、または前記対極と前記液絡検知電極間の電気的信号の変化により、前記試料液が前記液絡検知電極に接触したことを検知し、工程(F)において、前記作用極と前記対極間の電気的信号の変化を検知してから、前記作用極と前記液絡検知電極間、または前記対極と前記液絡検知電極間の電気的信号の変化を検知するまでの時間(T2)を計測し、前記T2をT1とする。 In a preferred embodiment of the present invention, in the step (D), detects that the change in the electrical signal between the working electrode and the counter electrode, the liquid sample is in contact with the working electrode and the counter electrode, the step (E in), detects that the inter-working electrode and the liquid junction sensing electrode, or by a change in electrical signal between the said counter electrode liquid junction sensing electrode, wherein the sample solution is brought into contact with the said liquid junction sensing electrode, the step ( in F), a change in electrical signal between the after detecting a change in electrical signal between the working electrode and the counter electrode, between said working electrode the liquid junction sensing electrode, or the counter electrode and the liquid junction sensing electrode It measures the time (T2) until detecting a, the T2 and T1.

【0026】この方法によると、試料液が各電極に接触したことを電気的信号の変化から容易に検知することができ、かつ、T2をT1として用い、T2に基づいて試料液の供給状態を容易かつ確実に判別することができ、 [0026] According to this method, it is possible to easily detect that the sample liquid is brought into contact with the respective electrodes from a change in the electrical signal, and using the T2 as T1, the supply state of the sample liquid based on the T2 can be easily and reliably determined,
試料液が適切に供給された場合のみ、基質濃度定量工程が実施されるので、高精度でばらつきの少ない測定を行うことができる。 Only if the sample solution is properly supplied, since the substrate concentration quantification step is performed, it is possible to perform fewer measurement variations with high accuracy.

【0027】また、本発明による基質濃度定量法は、少なくとも工程(D)の前に、作用極と対極間に電圧を印加する工程を有し、かつ少なくとも工程(E)の前に、 Further, substrate concentration quantification method according to the present invention, before at least step (D), comprising the step of applying a voltage between the working electrode and the counter electrode, and before at least step (E),
前記作用極と液絡検知電極間、または前記対極と前記液絡検知電極間に電圧を印加する工程を有することが好ましい。 It is preferable to have a process for applying a voltage between the liquid junction sensing electrode and the inter-working electrode and the liquid junction sensing electrode, or the counter electrode.

【0028】また、少なくとも工程(D)の前に、作用極、対極及び液絡検知電極に電位を印加する工程を有していてもよい。 Further, before at least step (D), the working electrode may have a step of applying a potential to the counter electrode and the liquid junction sensing electrode. このようにすると、電圧または電位を印加する工程が少なくなり、工程数を低減することができる。 In this way, it is possible that the step of applying a voltage or potential is reduced, to reduce the number of steps.

【0029】本発明の基質濃度定量法において、作用極、対極及び液絡検知電極が同一基板上に配置されているバイオセンサを用いても良い。 [0029] In the substrate concentration determination method of the present invention, the working electrode may be used biosensor counter electrode and liquid junction sensing electrode is disposed on the same substrate.

【0030】また、作用極及び対極が、空間部を介して相互に対向する位置に配置されているバイオセンサを用いても良い。 Further, the working electrode and the counter electrode, may be used biosensor is arranged at a position opposed to each other via a space.

【0031】また、試薬層及び液絡検知電極が、空間部を介して相互に対向する位置に配置されているバイオセンサを用い、対極と前記液絡検知電極間の電流値を測定することにより妨害物質の検知を行う工程を有することが好ましい。 Further, the reagent layer and the liquid junction sensing electrode, using a biosensor is disposed at a position opposed to each other via the space, by measuring the current value between the liquid junction sensing electrode and a counter electrode it is preferable to have a step for detection of the interfering substances. ここで、妨害物質とは、基質濃度定量工程において、作用極または対極上で電気化学的に反応することにより、応答電流値に影響を与えて基質濃度の測定結果に誤差を生じさせる物質のことであり、例えば、アスコルビン酸、尿酸等の易酸化性物質が挙げられる。 Here, the interfering substance, at substrate concentrations quantified step, by reacting electrochemically on the working electrode or the counter electrode, it influences the response current value of the measurement result of the substrate concentration of a substance causing error , and the example, ascorbic acid, oxidizable substances such as uric acid. このようにすると、試料液中の基質と試薬層中の酵素及び電子伝達体との反応により生じた反応物質が液絡検知電極に到達する前に、試料液が液絡検知電極に接触するので、試料液が液絡検知電極に接触してから、前記反応物質が液絡検知電極に到達するまでの間に、対極と液絡検知電極間の電流値を測定することにより、容易に妨害物質の検知を行うことができる。 In this way, before the reactants produced by the reaction between the enzyme and the electron mediator of the substrate and the reagent layer in the sample liquid reaches the liquid junction sensing electrode, the sample solution is brought into contact with the liquid junction sensing electrode , the sample solution from contact with the liquid junction sensing electrode, until the reactants reach the liquid junction sensing electrode, by measuring the current value between the counter electrode and the liquid junction sensing electrode, easily interfering substances it is possible to perform the detection. 従って、試薬層妨害物質検知用に新たに電極を追加することなく、測定結果から妨害物質の影響を除くことができるので、センサ構成を複雑にしたり製造工程を煩雑にしたりすることなく、高精度な基質濃度の定量を行うことができる。 Thus, without adding a new electrode to a reagent layer interfering substance detection, it is possible from the measurement results excluding the influence of interfering substances, without or complicated complex in or manufacturing process of the sensor arrangement, high precision substrate concentration quantification can be performed such.

【0032】また、液絡検知電極が参照極として機能することが好ましい。 Further, it is preferable that the liquid junction sensing electrode functions as a reference electrode. このようにすると参照極用に新たに電極を追加することなく、作用極の電位を安定させることができるため、センサ構成を複雑にしたり製造工程を煩雑にしたりすることなく、基質濃度に対して良好な直線性を有する応答電流値が得られるので、高精度な基質濃度の定量を行うことができる。 Thus without adding a new electrode for the reference electrode and to, since it is possible to stabilize the potential of the working electrode, without or complicated complex in or manufacturing process of the sensor arrangement, with respect to the substrate concentration the response current value with good linearity can be obtained, it is possible to perform high-precision substrate concentration quantitation.

【0033】本発明において、試薬層に含有される酵素としては、試料液に含まれる基質に応じて適切なものが選択される。 [0033] In the present invention, the enzyme contained in the reagent layer, appropriate is selected according to the substrate contained in the sample solution. 酵素としては、例えば、フルクトースデヒドロゲナーゼ、グルコースオキシダーゼ、アルコールオキシダーゼ、乳酸オキシダーゼ、コレステロールオキシダーゼ、キサンチンオキシダーゼ、アミノ酸オキシダーゼなどがあげられる。 As the enzyme, for example, fructose dehydrogenase, glucose oxidase, alcohol oxidase, lactate oxidase, cholesterol oxidase, xanthine oxidase, and amino acid oxidase and the like.

【0034】また、電子伝達体としては、フェリシアン化カリウム、p−ベンゾキノン、フェナジンメトサルフェート、メチレンブルー、フェロセン誘導体などがあげられる。 Further, as the electron mediator, potassium ferricyanide, p- benzoquinone, phenazine methosulfate, methylene blue, etc. ferrocene derivatives. また、酸素を電子伝達体とした場合にも電流応答が得られる。 Further, current response can be obtained oxygen when the electron mediator. 電子伝達体は、これらの一種または二種以上が使用される。 Electron carrier is These one or two or more kinds are used.

【0035】 [0035]

【実施例】以下、本発明の実施例を、図1〜3を用いて説明する。 EXAMPLES Hereinafter, the embodiments of the present invention will be described with reference to FIGS. 図1〜3は本発明の実施例におけるグルコースセンサの試薬層を除去した状態の分解斜視図である。 Figure 1-3 is an exploded perspective view showing a state in which the removal of the reagent layer of the glucose sensor in the embodiment of the present invention.

【0036】(実施例1)バイオセンサの一例として、 [0036] As an example (Example 1) biosensor,
グルコースセンサについて説明する。 The glucose sensor is described. 本実施例では図1 In the present embodiment FIG. 1
に示すグルコースセンサを使用した。 Using glucose sensor shown in. このグルコースセンサは、ポリエチレンテレフタレートからなる絶縁性の基板1と、カバー9と、基板1およびカバー9の間に挟まれるスペーサ10とを有する。 The glucose sensor has a substrate 1 of insulating made of polyethylene terephthalate, a cover 9, and a spacer 10 sandwiched between the substrate 1 and the cover 9. これらは図1の中の一点鎖線で示すような位置関係をもって接着されてグルコースセンサが構成される。 These glucose sensor is constructed are bonded in a positional relationship as shown by a chain line in FIG.

【0037】スペーサ10には試料液供給口11が形成され、また、カバー9には空気孔12が形成されている。 [0037] The spacer 10 is formed a sample solution supply port 11, The air hole 12 is formed in the cover 9. 基板1上にスペーサ10を介してカバー9を積層接着すると、基板1、スペーサ10及びカバー9によって試料液供給口11に通じる空間部(図示しない)が形成され、空間部の終端部は空気孔12に連通する。 When the cover 9 through the spacer 10 on the substrate 1 is laminated bonding, substrate 1, a space portion communicating with the liquid sample supply inlet 11 by spacers 10 and the cover 9 (not shown) is formed, the end of the space portion air hole communicating with the 12.

【0038】基板1には、作用極5、対極8、及び液絡検知電極7が設けられ、さらにこれらに電気接続されるリード2、3、4が設けられている。 [0038] substrate 1, the working electrode 5, counter electrode 8, and liquid junction sensing electrode 7 is provided, it leads 2, 3, 4 is provided which is further electrically connected thereto. 作用極5は、リング状の対極8の内側に配置されている。 Working electrode 5 is disposed inside the ring-shaped counter electrode 8. 液絡検知電極7 Liquid junction detecting electrode 7
は、作用極5及び対極8よりも試料液供給口11から離れた位置に配置されている。 It is located at a distance from the liquid sample supply inlet 11 than the working electrode 5 and counter electrode 8.

【0039】上記グルコースセンサは以下のようにして作製した。 [0039] The glucose sensor was manufactured as follows.

【0040】ポリエチレンテレフタレートからなる絶縁性の基板1上に、スクリーン印刷により銀ペーストを印刷しリード2、3、4をそれぞれ形成した。 [0040] On an insulating substrate 1 made of polyethylene terephthalate, a silver paste was printed by screen printing to form leads 2, 3 and 4 respectively. 次に、樹脂バインダーを含む導電性カーボンペーストを基板1上に印刷して作用極5を形成した。 Next, to form the working electrode 5 by printing a conductive carbon paste containing a resin binder on a substrate 1. 作用極5はリード2と接触している。 Working electrode 5 is in contact with the lead 2.

【0041】次に、その基板1上に、絶縁性ペーストを印刷して絶縁層6を形成した。 Next, on the substrate 1, to form an insulating layer 6 by printing an insulating paste. 絶縁層6は、作用極5の外周部を覆っており、これによって作用極5の露出部分の面積は一定に保たれる。 The insulating layer 6 covers the outer peripheral portion of the working electrode 5, which area of ​​the exposed portion of the working electrode 5 by is kept constant. 絶縁層6は、リード2、3、 The insulating layer 6, lead 2 and 3,
4の一部を覆っている。 And it covers a part of the 4. リード3の先端を露出させることにより、液絡検知電極7を形成した。 By exposing the tip of the lead 3, thereby forming a liquid junction sensing electrode 7.

【0042】次に、樹脂バインダーを含む導電性カーボンペーストをリード4と接触するように基板1上に印刷して対極8を形成した。 Next, to form a counter electrode 8 by printing on the substrate 1 so as to contact the conductive carbon paste containing a resin binder and a lead 4.

【0043】次に、作用極5及び対極8上にカルボキシメチルセルロース(以下、CMCと略称する)水溶液を滴下し、乾燥させることでCMC層を形成した。 Next, the working electrode 5 and counter electrode 8 on carboxymethylcellulose (hereinafter abbreviated as CMC) was added dropwise an aqueous solution to form a CMC layer by drying. さらに、CMC層上に、酵素としてGOD、電子伝達体としてフェリシアン化カリウムを含有する水溶液を滴下し、 Furthermore, on the CMC layer, it was added dropwise GOD as an enzyme, an aqueous solution containing potassium ferricyanide as the electron mediator,
乾燥させることで試薬層を形成した。 To form a reagent layer by drying.

【0044】次に、上記試薬層上に、試料液の試薬層への供給をより一層円滑にするために、レシチンのトルエン溶液を、試料液供給口11から試薬層上にわたって広げ、乾燥させることでレシチン層を形成した。 Next, onto the reagent layer, in order to further facilitate the supply of the sample liquid reagent layer, a toluene solution of lecithin, spread over the reagent layer from the liquid sample supply inlet 11, and dried in the formation of the lecithin layer. なお、レシチン層を形成するためにトルエンを用いたが、他の有機溶媒を用いてもよい。 Although using toluene to form a lecithin layer may be other organic solvents. 次に、基板1に、カバー9及びスペーサ10を図1中の一点鎖線で示すような位置関係をもって接着してグルコースセンサを作製した。 Next, the substrate 1, to prepare a glucose sensor by adhering a positional relationship as shown the cover 9 and the spacer 10 by the one-dot chain line in FIG.

【0045】このグルコースセンサを測定器(図示せず)に装着し、まず、作用極5と対極8間に500mV The wearing the glucose sensor to the measuring instrument (not shown), first, 500 mV between the working electrode 5 and counter electrode 8
の電圧を印加した。 A voltage is applied. 次にこのセンサに、試料液としてグルコース濃度定量に十分な量の血液を試料液供給口11 Next to the sensor, the sample solution and the glucose concentration quantitative sufficient amount of blood as a sample solution supply port 11
より供給した。 It was more supply. 毛管現象により血液が空間部に導入され、血液が作用極5まで達して作用極5に接触すると、 Blood by capillarity is introduced into the space portion, when the blood comes into contact with the working electrode 5 reaches the working electrode 5,
測定器が、作用極5と対極8間における電気的信号の変化として、電気抵抗値の変化を検知した。 Meter, as a change in electrical signal between the working electrode 5 and counter electrode 8, and detects a change in electrical resistance. この変化の検知と同時に測定タイマーが始動し、次に、作用極5と液絡検知電極7間に500mVの電圧を印加した。 This change in detection and simultaneous measurement timer is started, and then applying a voltage of 500mV between the working electrode 5 and the liquid junction sensing electrode 7. 作用極5、対極8に引き続き、血液が液絡検知電極7にまで到達して液絡検知電極7に接触すると、作用極5と液絡検知電極7間の電気抵抗値に変化が生じ、その変化を測定器で検知した。 Working electrode 5, subsequent to the counter electrode 8, when the blood comes into contact with the liquid junction sensing electrode 7 to reach the liquid junction sensing electrode 7, a change occurs in the electrical resistance between the working electrode 5 and the liquid junction sensing electrode 7, the the changes detected by the instrument. ここで、測定タイマーが始動してから作用極5と液絡検知電極7間の電気抵抗値に変化が生じるまでの時間(以下、T2と略称する)を、測定タイマーにより計測した。 Here, time from the start of the measurement timer to change the electric resistance value between the working electrode 5 and the liquid junction sensing electrode 7 occurs (hereinafter, abbreviated as T2), measured by the measuring timer.

【0046】この試料供給検知工程に引き続き、基質濃度定量工程を実施した。 [0046] Following the sample supply detection steps were performed substrate concentration quantification step. 作用極5と液絡検知電極7間における電気抵抗値の変化を検知してから25秒経過後に500mVの電位を作用極5に印加し、5秒後に作用極5と対極8間の電流値を測定した。 Is applied to the working electrode 5 a 500mV potential after detecting a change in electric resistance value after a lapse of 25 seconds between the working electrode 5 and the liquid junction sensing electrode 7, the current value between the working electrode 5 and counter electrode 8 after 5 seconds It was measured. 血液中のグルコースと、試薬層から溶解したフェリシアン化イオン及びGO And glucose in the blood, ferricyanide ion and GO dissolved from the reagent layer
Dが反応し、その結果、グルコースがグルコノラクトンに酸化され、フェリシアン化イオンがフェロシアン化イオンに還元される。 D is reacted, as a result, the glucose is oxidized to gluconolactone, ferricyanide ions are reduced to ferrocyanide ions. このフェロシアン化イオンを作用極5において酸化することで電流応答が得られる。 Current response is obtained by oxidizing the ferrocyanide ions at the working electrode 5. その結果、試料液中のグルコース濃度に依存した応答電流値が得られた。 As a result, the response current value that depends on the glucose concentration in the sample liquid was obtained.

【0047】電極配置、測定環境(温度、湿度等)、血液性状(ヘマトクリット値、粘度等)の個人差等にもよるが、十分な量の血液が供給された場合、試料液が作用極及び対極に接触してから、試料液が液絡検知電極に接触するまでの時間(以下、T1と略称する)は長くても1〜2秒程度である。 The electrode arrangement, measurement environment (temperature, humidity, etc.), Hematological (hematocrit, viscosity, etc.) depending on the individual difference or the like of, if a sufficient amount of blood has been supplied, the sample liquid working electrode and after contact with the counter electrode, the time until the sample liquid comes into contact with the liquid junction sensing electrode (hereinafter, abbreviated as T1) is about 1 to 2 seconds at the longest. またここで、T2はT1とほぼ等しいとみなすことができる。 Also here, T2 can be considered as approximately equal to T1. そこで、T2が2秒以下の場合に得られた定量結果と、T2が2秒を超えた場合に得られた定量結果とを比較したところ、T2が2秒以下の場合に得られた結果では、測定値の精度、ばらつきが大幅に抑制されていた。 Therefore, the quantitative results obtained in the case of T2 is less than 2 seconds, was compared with the quantitative results obtained when T2 exceeds 2 seconds, with results obtained for T2 is less than 2 seconds , the accuracy of the measurements, the variation has been considerably reduced. T2が2秒を超えた場合は、1 If the T2 is greater than 2 seconds, 1
回の試料供給で十分な量の試料が供給されなかった場合、または試料量不足を補うため再度試料の供給を実施した場合が考えられ、これにより定量結果に影響が生じたものと考えられる。 If the sample of sufficient amount in the sample supply times is not supplied, or when carrying out the supply of re samples to compensate for the sample shortage is considered, thereby believed to affect the quantitative results occurs.

【0048】このような試料量不足による測定誤差を軽減するために、T2を計測する工程の後に、T2が2秒以下の場合には以降の基質濃度定量工程を実施し、T2 [0048] In order to reduce the measurement error due to such a sample shortage, after the step of measuring the T2, in the case of T2 is less than 2 seconds was performed subsequent substrate concentration quantification step, T2
が2秒よりも大きい場合には中止するように判断する工程を測定器に組み込み、同様の測定を行った。 There is is greater than 2 seconds built the step of determining to stop the instrument, the same measurement was carried out. その結果、1回で十分な量の試料が供給された場合のみ測定が実施されるようになったため、測定誤差は大幅に軽減された。 As a result, only when a sufficient amount of sample has been supplied at once measurement came to be performed, measurement error is greatly reduced.

【0049】(実施例2)本実施例では、実施例1と同様のグルコースセンサを使用した。 [0049] Example 2 In this Example, using a similar glucose sensor of Example 1.

【0050】このグルコースセンサを測定器に装着し、 [0050] wearing the glucose sensor to the measuring instrument,
対極8を基準にして、作用極5と対極8間に500m The counter electrode 8 with reference, 500 meters between the working electrode 5 and counter electrode 8
V、対極8と液絡検知電極7間に500mVの電圧を印加した。 V, the applied voltage was 500mV between the counter electrode 8 and the liquid junction sensing electrode 7. 次にこのセンサに、試料液としてグルコース濃度定量に十分な量の血液を試料液供給口11より供給した。 Next to the sensor, the glucose concentration quantitative sufficient amount of blood has been supplied from the liquid sample supply inlet 11 as a sample solution. 毛管現象により血液が空間部に導入され、血液が作用極5に達すると、測定器が作用極5と対極8間における電気抵抗値の変化を検知し、それと同時に測定タイマーが始動した。 Blood by capillarity is introduced into the space portion, when the blood reaches the working electrode 5, the instrument detects a change in electrical resistance between the working electrode 5 and counter electrode 8, the same was started at the same time measuring timer. 作用極5、対極8に引き続き、血液が液絡検知電極7にまで到達して液絡検知電極7に接触すると、作用極5と液絡検知電極7間の電気抵抗値に変化が生じ、その変化を測定器で検知した。 Working electrode 5, subsequent to the counter electrode 8, when the blood comes into contact with the liquid junction sensing electrode 7 to reach the liquid junction sensing electrode 7, a change occurs in the electrical resistance between the working electrode 5 and the liquid junction sensing electrode 7, the the changes detected by the instrument. ここで、測定タイマーが始動してから作用極5と液絡検知電極7間の電気抵抗値に変化が生じるまでの時間(T2)を、測定タイマーにより計測した。 Here, the time (T2) from when the measuring timer is started until the change in the electrical resistance value between the working electrode 5 and the liquid junction sensing electrode 7 occurs was measured by the measurement timer.

【0051】この試料供給検知工程に引き続き、基質濃度定量工程を実施した。 [0051] Following the sample supply detection steps were performed substrate concentration quantification step. 対極8と液絡検知電極7間における電気的信号の変化を検知してから25秒経過後に5 5 detects the change in electrical signal between the counter electrode 8 and the liquid junction sensing electrode 7 after 25 seconds
00mVの電位を作用極5に印加し、5秒後に作用極5 Applying a potential of 00mV to the working electrode 5, the working electrode 5 after 5 seconds
と対極8間の電流値を測定した。 And a current value was measured between the counter electrode 8. その結果、実施例1と同様に、試料液中のグルコース濃度に依存した応答電流値が得られた。 As a result, in the same manner as in Example 1, the response current value that depends on the glucose concentration in the sample liquid was obtained.

【0052】実施例1と同様に、T2が2秒以下の場合に得られた定量結果と、T2が2秒を超えた場合に得られた定量結果とを比較したところ、T2が2秒以下の場合に得られた結果では、測定値の精度、ばらつきが大幅に抑制されていた。 [0052] Similarly to Example 1, where T2 is compared with quantitative results obtained in the case of less than 2 seconds, and a quantitative result obtained when T2 exceeds 2 seconds, T2 is 2 seconds or less in the results obtained in the case of the precision of the measurements, the variation has been considerably reduced.

【0053】そこで、T2を計測する工程の後に、T2 [0053] Thus, after the step of measuring the T2, T2
が2秒以下の場合には以降の基質濃度定量工程を実施し、T2が2秒よりも大きい場合には中止するように判断する工程を測定器に組み込み、同様の測定を行った。 There the case of less than 2 seconds was performed subsequent substrate concentration quantification step, T2 is built into the meter the step of determining to stop if greater than 2 seconds, the same measurement was carried out.
その結果、1回で十分な量の試料が供給された場合のみ測定が実施されるようになったため、実施例1と同様に、測定誤差は大幅に軽減された。 As a result, only when a sufficient amount of sample has been supplied at once measurement it is now carried out in the same manner as in Example 1, measurement error is greatly reduced.

【0054】(実施例3)本実施例では、図2に示すグルコースセンサを用いた。 [0054] (Embodiment 3) In this embodiment, using the glucose sensor shown in FIG.

【0055】ポリエチレンテレフタレ−トからなる絶縁性の基板1上に、パラジウムからなる電極及びリードを形成した。 [0055] Polyethylene terephthalate - on an insulating substrate 1 made of bets, to form an electrode and a lead made of palladium. 次に、試料供給口11を有するスペーサ10 Next, a spacer 10 having a sample-supplying port 11
を、図2中の一点鎖線で示すような位置関係をもって基板1に接着し、作用極5、対極8、液絡検知電極7及びリード2、3、4を区画した。 And adhered to the substrate 1 with a positional relationship as shown by the one-dot chain line in FIG. 2, the working electrode 5, counter electrode 8, and partitions the liquid junction sensing electrode 7 and the lead 2,3,4. 区画内に実施例1と同様に試薬層を作製した後、空気孔12を有するカバー9を貼り合わせることで、グルコースセンサを作製した。 After producing the reagent layer in the same manner as in Example 1 in the compartment, by attaching the cover 9 having an air hole 12, to produce a glucose sensor.

【0056】実施例1と同様に、試料供給検知工程及び基質濃度定量工程により、血液中のグルコース濃度の測定を行った結果、実施例1と同様の効果が得られ、T2 [0056] As in Example 1, the sample supply detection step and substrate concentration quantification step, a result of measurement of glucose concentration in blood, obtained the same effect as in Example 1, T2
に基づいた判別を行うことで試料量不足による測定誤差は大幅に抑制された。 Measurement errors due to sample shortage by performing discrimination based on was greatly suppressed.

【0057】なお、本実施例におけるグルコースセンサの場合、試料供給口11より供給された試料液は対極8、作用極5を順次経て、最後に液絡検知電極7へと到達するように各電極が配置されているが、これに限定されず、対極8と作用極5の配置が逆で、作用極、対極、 [0057] In the case of the glucose sensor in this embodiment, the sample solution supplied from the sample supply port 11 is the counter electrode 8, sequentially through the working electrode 5, the end to each electrode so as to reach the liquid junction sensing electrode 7 Although but are arranged, not limited to this, a reverse arrangement of the working electrode 5 and counter electrode 8, the working electrode, counter electrode,
液絡検知電極の順に試料が到達する場合においても、同様の結果が得られた。 Even when the sample in the order of the liquid junction sensing electrode reaches, similar results were obtained.

【0058】(実施例4)本実施例では、図3に示すグルコースセンサを用いた。 [0058] Example 4 In this example, using the glucose sensor shown in FIG.

【0059】ポリエチレンテレフタレ−トからなる絶縁性の作用極基板13上に、スクリ−ン印刷により銀ペーストを印刷し、リ−ド2を形成した。 On consisting gate insulating properties of the working electrode substrate 13, subscriptions - - [0059] Polyethylene terephthalate silver paste was printed by screen printing, Li - to form a de 2. ついで、樹脂バインダーを含む導電性カーボンペーストを作用極基板13 Then, working a conductive carbon paste containing a resin binder pole substrate 13
上に印刷して作用極5を形成した。 To form a working electrode 5 by printing thereon. この作用極5は、リ−ド2と接触している。 The working electrode 5 is re - in contact with the de-2. さらに、作用極基板13上に、 Moreover, on the working electrode substrate 13,
絶縁性ペ−ストを印刷して絶縁層6を形成した。 Insulating Bae - by printing strike to form an insulating layer 6. 絶縁層6は、作用極5の外周部を覆っており、これにより作用極5の露出部分の面積を一定に保っている。 The insulating layer 6 covers the outer peripheral portion of the working electrode 5, thereby keeping constant the area of ​​the exposed portion of the working electrode 5.

【0060】同様の手順にて、絶縁性の対極基板14上に対極8及び液絡検知電極7を形成した。 [0060] In a similar procedure, to form a counter electrode 8 and the liquid junction sensing electrode 7 on an insulating counter substrate 14.

【0061】実施例1と同様にして作用極5上に試薬層を作製した後、作用極基板13、空気孔12を備えた対極基板14及びスペーサ10を図3中の一点鎖線で示すような位置関係をもって接着し、バイオセンサを作製した。 [0061] After producing the reagent layer on the working electrode 5 in the same manner as in Example 1, the working electrode substrate 13, the counter electrode substrate 14 and the spacer 10 with an air hole 12 as shown by a chain line in FIG. 3 bonded in a positional relationship, to produce a biosensor. スペーサ10には、両基板間に試料液供給路を形成するためのスリットが設けてある。 The spacer 10, the slit for forming the sample solution supply path is provided between the substrates. 試料供給口11は、 Sample supply port 11,
その試料供給路の開口部に相当する。 Corresponding to the opening of the sample supply path.

【0062】次いで、血液中のグルコースの測定を行った。 [0062] was then carried out the measurement of glucose in the blood. まず、作用極5と対極8間に500mVの電圧を印加した。 First, the applied voltage was 500mV between the working electrode 5 and counter electrode 8. 次にこのセンサに、試料液として、妨害物質であるアスコルビン酸を含むグルコース濃度定量に十分な量の血液を試料液供給口11より供給した。 Next to the sensor, as a sample solution was supplied a sufficient amount of blood from the liquid sample supply inlet 11 to the glucose concentration quantification containing ascorbic acid as a interfering substance. 毛管現象により血液が空間部に導入され、血液が作用極5に達して作用極5に接触すると、測定器が作用極5と対極8間における電気抵抗値の変化を検知した。 Blood is introduced into the space by capillary action, the blood is in contact with the working electrode 5 reaches the working electrode 5, the instrument detects a change in the electrical resistance value between the working electrode 5 and counter electrode 8. この電気抵抗値変化の検知と同時に測定タイマーが始動し、次に、作用極5と液絡検知電極7間に500mVの電圧を印加した。 The detection and simultaneous measurement timer in the electrical resistance change is started, then, applying a voltage of 500mV between the working electrode 5 and the liquid junction sensing electrode 7.
作用極5、対極8に引き続き、血液が液絡検知電極7にまで到達して液絡検知電極7に接触すると、作用極5と液絡検知電極7間の電気抵抗値に変化が生じ、その変化を測定器で検知した。 Working electrode 5, subsequent to the counter electrode 8, when the blood comes into contact with the liquid junction sensing electrode 7 to reach the liquid junction sensing electrode 7, a change occurs in the electrical resistance between the working electrode 5 and the liquid junction sensing electrode 7, the the changes detected by the instrument. ここで、測定タイマーが始動してから作用極5と液絡検知電極7間の電気抵抗値に変化が生じるまでの時間(T2)を、測定タイマーにより計測した。 Here, the time (T2) from when the measuring timer is started until the change in the electrical resistance value between the working electrode 5 and the liquid junction sensing electrode 7 occurs was measured by the measurement timer. 次に、このT2が2秒以下であったことから以降の基質濃度定量工程行うことを決定した。 Next, the T2 decides to perform subsequent substrate concentration quantitative process since was less than 2 seconds.

【0063】次に、作用極5と液絡検知電極7間の電気抵抗値変化を検知するのとほぼ同時に、液絡検知電極7 Next, at approximately the same time as detecting the electric resistance value change between the working electrode 5 and the liquid junction sensing electrode 7, the liquid junction sensing electrode 7
と対極8間に500mVの電圧を100ミリ秒間印加し、両電極間の電流値(以下、I1と略称する)を測定した。 And a voltage of 500mV was applied for 100 milliseconds between the counter electrode 8, the current value between the electrodes (hereinafter, referred to as I1) were measured. I1は、妨害物質として含まれるアスコルビン酸の酸化反応に起因し、その濃度に対して比例関係を与えた。 I1 is due to oxidation of ascorbic acid contained as an interfering substance, it gave a proportional relationship with its concentration. I1の測定後、液絡検知電極7と対極8間の電圧印加を解除した。 After the measurement of I1, releasing the voltage applied between the liquid junction sensing electrode 7 and the counter electrode 8.

【0064】上述したように、液絡検知電極7は、試薬層が配置されていない対極基板14上に配置されている。 [0064] As described above, liquid junction sensing electrode 7 is disposed on the counter electrode substrate 14 in which the reagent layer is not disposed. よって、酵素反応の結果生成したフェロシアン化イオンが液絡検知電極7近傍に到達するまでには、若干の時間を必要とする。 Therefore, ferrocyanide ions produced result of enzymatic reaction in until it reaches the vicinity of the liquid junction sensing electrode 7, and requires some time. すなわち、フェロシアン化イオン到達までの時間内における液絡検知電極7と対極8間の電流値I1は、主にアスコルビン酸の濃度のみを反映する。 That is, the current value I1 between liquid junction sensing electrode 7 and the counter electrode 8 in the time to ferrocyanide ions reach mainly reflects only the concentration of ascorbic acid.

【0065】I1を測定してから約25秒経過後に、5 [0065] from by measuring the I1 after the lapse of about 25 seconds, 5
00mVの電位を作用極5に印加し、5秒後の応答電流値I2を測定した。 Applying a potential of 00mV to working electrode 5 was measured response current value I2 after 5 seconds. この応答電流値I2は、試料中のグルコース濃度に比例するフェロシアン化イオンと、試料中にあらかじめ存在するアスコルビン酸の酸化反応に起因する。 The response current value I2 is a ferrocyanide ion is proportional to the glucose concentration in the sample, due to the oxidation of ascorbic acid present in advance in the sample. すなわち、アスコルビン酸が測定結果に正の誤差を与えることとなる。 In other words, so that the ascorbic acid gives a positive error in the measurement result. そこで、電流値I1に基づいて応答電流値I2を補正することにより得られた電流値I Therefore, the current value I obtained by correcting the response current value I2 based on the current value I1
3より、アスコルビン酸の影響を除去し正確なグルコース濃度を求めることができる。 Than 3, it is possible to obtain an accurate glucose concentration by removing the influence of ascorbic acid.

【0066】本実施例によれば、液絡検知電極7が妨害物質検知電極としても機能することにより、妨害物質の影響を補正することができるので、妨害物質検知用に新たに電極を追加することなく、より高精度な基質の測定が可能となった。 According to [0066] this embodiment, by liquid junction sensing electrode 7 also functions as an interference substance detection electrode, it is possible to correct the influence of interfering substances, newly adds the electrode for interfering substance detection without became possible to measure more accurate substrates.

【0067】(実施例5)実施例4と同様のグルコースセンサを用い、実施例4と同様の手順にて、血液中のグルコースの測定を行った。 [0067] (Example 5) using the glucose sensor as in Example 4, in the same procedure as in Example 4, was measured glucose in the blood. 但し、作用極5と対極8間の応答電流値を得るために電位印加を行う際、液絡検知電極7を基準にして、700mVの電位を作用極5に印加し、200mVの電位を対極8に印加した。 However, when performing the electric potential applied in order to obtain a response current value between the working electrode 5 and counter electrode 8, based on the liquid junction sensing electrode 7 and applying a potential of 700mV to the working electrode 5, counter electrode 8 a 200mV potential It was applied to. すなわち、 That is,
液絡検知電極7を参照極として用いた三電極式での測定を行った。 It was measured by three-electrode using a liquid junction sensing electrode 7 as a reference electrode.

【0068】その結果、作用極5の電位が安定したことにより電位摂動の影響が抑制されたため、グルコース濃度に対する応答電流値の直線性が向上した。 [0068] As a result, the potential of the working electrode 5 is the influence of the potential perturbations by stable was suppressed, with improved linearity of response current to glucose concentration.

【0069】本実施例によれば、液絡検知電極7は、妨害物質検知電極及び参照極としての併用ができるので、 [0069] According to this embodiment, the liquid junction sensing electrode 7, since it is used in combination as a interfering substance detecting electrode and the reference electrode,
妨害物質検知電極または参照極用として新たに電極を追加することなく、より高精度な基質の測定が可能となった。 Without adding new electrodes for the interfering substance detecting electrode or the reference electrode has enabled more accurate measurements substrates.

【0070】なお、上記の実施例において、試料液検知、妨害物質検知及び基質濃度定量のために電極系へ印加する電位または電圧値を記載したが、これに限定されることはない。 [0070] In the above embodiments, the liquid sample detection has been described the potential or voltage applied to the electrode system for interfering substance detection and substrate concentrations quantified, but is not limited thereto. 試料液検知の際には電気的信号の変化が観察される電位または電圧、妨害物質検知の際には妨害物質が電極上で反応する電位または電圧、また基質濃度定量の際には一連の反応の結果生じた電子伝達体の還元体が酸化される電位または電圧であればよい。 Potential or voltage change in an electrical signal is observed when the sample liquid detection, the potential or voltage interfering substances react on the electrode during the interfering substance detection, also when the substrate concentration quantification series of reactions the reduction of resulting electron mediator may be any potential or voltage is oxidized.

【0071】また、基質濃度定量工程の実施または中止を判断する工程において、T2と比較する時間を2秒に設定しているが、これに限定されることはない。 [0071] In the step of determining the implementation or suspension of substrate concentration quantification process, but to set the time to be compared with T2 to 2 seconds, but is not limited thereto. T2 T2
は、電極間距離、試料の粘度、温度等を因子とする値であり、これらの因子に応じて適切な時間が設定される。 The distance between the electrodes, the viscosity of the sample, a value for the factor temperature, etc., appropriate time is set depending on these factors.
また、電流値を測定する時間についても、実施例に記載の特定値に限定されることはない。 Also, the time of measuring the current value also is not limited to the specific values ​​described in the Examples.

【0072】実施例1及び実施例3〜5では、試料液が液絡検知電極に接触したことを確認するために、作用極と液絡検知電極間に電圧を印加し、作用極と液絡検知電極間の電気的信号の変化を検知したが、これに代えて、 [0072] In Example 1 and Example 3-5, in order to confirm that the sample solution comes into contact with the liquid junction sensing electrode, a voltage is applied between the working electrode and the liquid junction sensing electrode, working electrode and liquid junction Although detects a change in electrical signal between the detection electrodes, instead of this,
対極と液絡検知電極間に電圧を印加し、対極と液絡検知電極間の電気的信号の変化を検知してもよい。 A voltage is applied between the counter electrode and the liquid junction sensing electrode may sense a change in electrical signal between the counter electrode and the liquid junction sensing electrode. また、実施例2では、試料液が液絡検知電極に到達したことを確認するために、作用極と液絡検知電極間の電気的信号の変化を検知したが、これに代えて、対極と液絡検知電極間の電気的信号の変化を検知してもよい。 In Example 2, in order to confirm that the sample solution reaches the liquid junction sensing electrode, but detects a change in electrical signal between the working electrode and the liquid junction sensing electrode, instead of this, a counter electrode changes in electrical signals between the liquid junction sensing electrode may be detected.

【0073】また、上記実施例では、試料液が各電極に接触したことを確認するために、電気的信号として、電気抵抗値の変化を検知したが、これに限定されず、電流値、電極電位、容量成分等の変化を検知してもよい。 [0073] In the above embodiment, in order to confirm that the sample liquid in contact with the electrodes, as an electrical signal, has been detected a change in the electrical resistance value is not limited to this, the current value, the electrode potential may detect a change, such as capacitive component.

【0074】上記実施例では、センサ構造の例を図示したが、電極及びリードの形状、電極及びリードの配置、 [0074] In the above embodiment has been illustrated an example of sensor structure, the shape of the electrodes and leads, the placement of the electrodes and leads,
センサ部材の組み合わせ方法等はこれらに限定されるものではない。 The combination method and the like of the sensor member is not limited thereto.

【0075】また、上記実施例では、電極材料としてカーボンまたはパラジウムについて述べたが、これに限定されることはない。 [0075] In the above embodiment has dealt with the carbon or palladium as the electrode material is not limited thereto. 作用極材料としては、電子伝達体を酸化する際にそれ自身が酸化されない導電性材料であれば使用できる。 The working electrode material, can be used as long as conductive material itself is not oxidized when oxidizing the electron mediator. また、対極材料としては、銀、白金等の一般的に用いられる導電性材料であれば使用できる。 As the counter electrode material, silver, can be used as long as generally conductive material used such as platinum. また電極系の作製法もスクリーン印刷法、スパッタリング法に限定されず、蒸着法等、他の手法にて作製された電極系でも使用できる。 The manufacturing method of the electrode system is also a screen printing method is not limited to sputtering, vapor deposition or the like, can be used in electrode systems which are produced in other methods.

【0076】また、試薬層を作用極に固定化することによって、酵素や電子伝達体を不溶化させてもよい。 [0076] Further, by immobilizing the working electrode reagent layer, it may be insolubilized enzyme and electron mediator. 固定化する場合は、架橋固定法あるいは吸着法が好ましい。 If to be immobilized, cross-linked fixed method or adsorption method is preferred.
また、酵素や電子伝達体を電極材料中に混合させてもよい。 Further, it may be mixed enzyme and electron mediator on the electrode material.

【0077】 [0077]

【発明の効果】以上のように本発明によると、試料液の供給状態を容易かつ確実に判別することができ、高精度で、ばらつきが少ない基質濃度定量法を提供することができる。 According to the present invention as described above, according to the present invention, it is possible to determine the supply state of the sample liquid easily and reliably, accurately, it is possible to provide a less variation substrate concentration determination method.

【図面の簡単な説明】 BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS

【図1】本発明の一実施例におけるグルコースセンサの試薬層を除去した状態の分解斜視図 Exploded perspective view showing a state in which the removal of the reagent layer of the glucose sensor according to an embodiment of the present invention; FIG

【図2】本発明の他の実施例におけるグルコースセンサの試薬層を除去した状態の分解斜視図 Exploded perspective view showing a state in which the removal of the reagent layer of the glucose sensor according to another embodiment of the present invention; FIG

【図3】本発明のさらに他の実施例におけるグルコースセンサの試薬層を除去した状態の分解斜視図 Exploded perspective view showing a state in which the removal of the reagent layer of the glucose sensor in another embodiment of the present invention; FIG

【符号の説明】 DESCRIPTION OF SYMBOLS

1 基板 2,3,4 リ−ド 5 作用極 6 絶縁層 7 液絡検知電極 8 対極 9 カバー 10 スペーサ 11 試料液供給口 12 空気孔 13 作用極基板 14 対極基板 1 substrate 2,3,4 Li - de 5 working electrode 6 insulating layer 7 a liquid junction sensing electrode 8 counter 9 cover 10 spacer 11 liquid sample supply inlet 12 air hole 13 the working electrode substrate 14 counter substrate

Claims (8)

    【特許請求の範囲】 [The claims]
  1. 【請求項1】作用極、対極、液絡検知電極、少なくとも酵素及び電子伝達体を包含する試薬層、並びに試料液供給口を備え、前記液絡検知電極が、前記作用極及び前記対極よりも前記試料液供給口から離れた位置に配置されているバイオセンサを用い、前記作用極に前記電子伝達体を酸化する電位を印加する工程(A)及び前記作用極と前記対極間の電流値を測定する工程(B)を有する基質濃度定量工程において得られた前記電流値に基づいて試料液中の基質濃度を定量する基質濃度定量法であって、少なくとも、前記試料液供給口から前記試料液を供給する工程(C)、前記試料液が前記作用極及び前記対極に接触したことを検知する工程(D)、前記試料液が前記液絡検知電極に接触したことを検知する工程(E)、前記試料液が前記 1. A working electrode, a counter electrode, the liquid junction sensing electrode, the reagent layer includes at least an enzyme and an electron mediator, and comprises a liquid sample supply inlet, the liquid junction sensing electrode, than the working electrode and the counter electrode using a biosensor that is located away from the liquid sample supply inlet, wherein the step of applying a potential to oxidize the electron mediator to the working electrode (a) and and the working electrode a current value between the counter electrode a substrate concentration assay to quantify the substrate concentration in the sample solution on the basis of the current value obtained at substrate concentrations quantitative process comprising the step (B) to be measured, at least, the sample liquid from said liquid sample supply inlet providing a (C), the step of detecting that the sample liquid is in contact with the working electrode and the counter electrode (D), the step of the sample solution is detected that contacts the liquid junction sensing electrode (E) , the sample solution is the 用極及び前記対極に接触してから、前記試料液が前記液絡検知電極に接触するまでの時間(T1)を計測する工程(F)、前記T1に基づいて前記基質濃度定量工程の実施または中止を決定する工程(G)、及び前記決定に基づいて前記基質濃度定量工程を実施または中止する工程(H)を含むことを特徴とする基質濃度定量法。 After contact with the use electrode and the counter electrode, the step of the sample solution to measure time (T1) until the contact with the liquid junction sensing electrode (F), the implementation of the substrate concentration quantitative process based on the T1 or determining a stop (G), and substrate concentration quantification method characterized by comprising the step (H) to implement or discontinue the substrate concentration quantitative process based on the determination.
  2. 【請求項2】工程(D)において、作用極と対極間の電気的信号の変化により、試料液が前記作用極及び前記対極に接触したことを検知し、工程(E)において、前記作用極と液絡検知電極間、または前記対極と前記液絡検知電極間の電気的信号の変化により、前記試料液が前記液絡検知電極に接触したことを検知し、工程(F)において、前記作用極と前記対極間の電気的信号の変化を検知してから、前記作用極と前記液絡検知電極間、または前記対極と前記液絡検知電極間の電気的信号の変化を検知するまでの時間(T2)を計測し、前記T2をT1とすることを特徴とする、請求項1記載の基質濃度定量法。 2. A step (D), by a change in electrical signal between the working electrode and the counter electrode, detects that the sample liquid is in contact with the working electrode and the counter electrode, in the step (E), said working electrode and between a liquid junction sensing electrode or by a change in electrical signal between the said counter electrode liquid junction sensing electrode, it detects that the sample liquid is brought into contact with the said liquid junction sensing electrode, in step (F), the working time to detection from the detection of the change in the electrical signal between poles to the counter electrode, between said working electrode the liquid junction sensing electrode, or a change in electrical signal between the said counter electrode liquid junction sensing electrode (T2) was measured, the T2, characterized in that the T1, substrate concentration determination method according to claim 1.
  3. 【請求項3】少なくとも工程(D)の前に、作用極と対極間に電圧を印加する工程を有し、かつ少なくとも工程(E)の前に、前記作用極と液絡検知電極間、または前記対極と前記液絡検知電極間に電圧を印加する工程を有することを特徴とする、請求項2記載の基質濃度定量法。 To 3. A before at least step (D), comprising the step of applying a voltage between the working electrode and the counter electrode, and before at least step (E), wherein between the working electrode and the liquid junction sensing electrode, or It characterized by having a step of applying a voltage between the liquid junction sensing electrode and the counter electrode, substrate concentration assay of claim 2 wherein.
  4. 【請求項4】少なくとも工程(D)の前に、作用極、対極及び液絡検知電極に電位を印加する工程を有することを特徴とする、請求項2記載の基質濃度定量法。 4. A before at least step (D), the working electrode, characterized by having a step of applying a potential to the counter electrode and the liquid junction sensing electrode, substrate concentration assay of claim 2 wherein.
  5. 【請求項5】作用極、対極及び液絡検知電極が同一基板上に配置されているバイオセンサを用いることを特徴とする、請求項1〜4のいずれかに記載の基質濃度定量法。 5. A working electrode, characterized by using a biosensor counter electrode and liquid junction sensing electrode is disposed on the same substrate, substrate concentration determination method according to claim 1.
  6. 【請求項6】作用極及び対極が、空間部を介して相互に対向する位置に配置されているバイオセンサを用いることを特徴とする、請求項1〜4のいずれかに記載の基質濃度定量法。 6. The working electrode and counter electrode, characterized by using a biosensor is disposed at a position opposed to each other via a space, a substrate concentration quantified according to claim 1 law.
  7. 【請求項7】試薬層及び液絡検知電極が、空間部を介して相互に対向する位置に配置されているバイオセンサを用い、対極と前記液絡検知電極間の電流値を測定することにより妨害物質の検知を行う工程を有することを特徴とする、請求項1〜6のいずれかに記載の基質濃度定量法。 7. The reagent layer and the liquid junction sensing electrode, using a biosensor is disposed at a position opposed to each other via the space, by measuring the current value between the liquid junction sensing electrode and a counter electrode characterized by having a step for detection of the interfering substances, substrate concentration determination method according to any one of claims 1 to 6.
  8. 【請求項8】液絡検知電極が参照極として機能することを特徴とする、請求項1〜7のいずれかに記載の基質濃度定量法。 8., characterized in that liquid junction sensing electrode functions as a reference electrode, substrate concentration determination method according to claim 1.
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