JP2925105B2 - 標的成分アッセイ法 - Google Patents
標的成分アッセイ法Info
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- JP2925105B2 JP2925105B2 JP5035368A JP3536893A JP2925105B2 JP 2925105 B2 JP2925105 B2 JP 2925105B2 JP 5035368 A JP5035368 A JP 5035368A JP 3536893 A JP3536893 A JP 3536893A JP 2925105 B2 JP2925105 B2 JP 2925105B2
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- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/536—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with immune complex formed in liquid phase
- G01N33/537—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with immune complex formed in liquid phase with separation of immune complex from unbound antigen or antibody
- G01N33/5375—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with immune complex formed in liquid phase with separation of immune complex from unbound antigen or antibody by changing the physical or chemical properties of the medium or immunochemicals, e.g. temperature, density, pH, partitioning
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Description
【０００１】本発明は、標本試料中の標的成分のアッセ
イに関するものである。更に特定的には、本発明は、標
的の比重および明別または標識の同時修飾による生物学
的標本試料における標的細胞、粒子または生物（以下、
標的と称する）の検出および／または定量に関するもの
である。
イに関するものである。更に特定的には、本発明は、標
的の比重および明別または標識の同時修飾による生物学
的標本試料における標的細胞、粒子または生物（以下、
標的と称する）の検出および／または定量に関するもの
である。
【０００２】１９８０年１月１日にＳ．Ｃ．Ｗａｒｄｌ
ａｗ等に許された米国特許４，１８１，６０９は、遠心
分離された血液試料において明確な細胞界面が形成され
るようにある特定の血液細胞（赤血球）が高密度化され
る血液分析法が開示されている。従って、赤血球の本来
の密度の変更は、改良された血液試験を与える。１９８
２年１月１日にＡｌｌｅｎ等に許された米国特許４，３
３２，７８５は、血液試料中の赤血球の定量分析におい
て赤血球を標識するための蛍光抗体の使用が開示され、
１９８６年５月２７日にＣｈａｎｇに許された米国特許
４，５９１，５７０は、イムノアッセイ法における複数
の異なる抗原を捕捉する為の担体にスポットされた多く
の異なる抗体の使用が開示されている。しかしながら、
先行技術には、遠心分離された標本試料において変更さ
れた成分を集中させ、容易に同定可能とすべく該成分を
標識するために、多くの異なる標本試料成分の比重の変
更を含む一般的方法の開示はない。
ａｗ等に許された米国特許４，１８１，６０９は、遠心
分離された血液試料において明確な細胞界面が形成され
るようにある特定の血液細胞（赤血球）が高密度化され
る血液分析法が開示されている。従って、赤血球の本来
の密度の変更は、改良された血液試験を与える。１９８
２年１月１日にＡｌｌｅｎ等に許された米国特許４，３
３２，７８５は、血液試料中の赤血球の定量分析におい
て赤血球を標識するための蛍光抗体の使用が開示され、
１９８６年５月２７日にＣｈａｎｇに許された米国特許
４，５９１，５７０は、イムノアッセイ法における複数
の異なる抗原を捕捉する為の担体にスポットされた多く
の異なる抗体の使用が開示されている。しかしながら、
先行技術には、遠心分離された標本試料において変更さ
れた成分を集中させ、容易に同定可能とすべく該成分を
標識するために、多くの異なる標本試料成分の比重の変
更を含む一般的方法の開示はない。
【０００３】本発明は、観測可能に区別されるリポソー
ムを、各試料の標的成分に選択的に結合することを含む
標本試料の標的成分の改良されたアッセイに関するもの
である。該リポソームは、その表面に固定された抗体に
よって、標本成分に結合される。該抗体は、試料標的成
分上に生じることが知られている表面抗原に対して特異
的な少なくとも１種の抗体を含むであろう。異なる抗体
を単一のリポソームの表面に同時に結合することがで
き、従ってアッセイは多くの異なる標的のそれぞれに対
して特異的で有り得る。リポソームの区別は、好ましく
はリポソーム内部に封入されるか、あるいはリン脂質二
重層に取り込まれた可視的または機械読みとり可能な識
別マーカーにより与えられる。該識別マーカーは、可視
的染料、機械読みとり可能な染料、放射性物質等であり
得る。
ムを、各試料の標的成分に選択的に結合することを含む
標本試料の標的成分の改良されたアッセイに関するもの
である。該リポソームは、その表面に固定された抗体に
よって、標本成分に結合される。該抗体は、試料標的成
分上に生じることが知られている表面抗原に対して特異
的な少なくとも１種の抗体を含むであろう。異なる抗体
を単一のリポソームの表面に同時に結合することがで
き、従ってアッセイは多くの異なる標的のそれぞれに対
して特異的で有り得る。リポソームの区別は、好ましく
はリポソーム内部に封入されるか、あるいはリン脂質二
重層に取り込まれた可視的または機械読みとり可能な識
別マーカーにより与えられる。該識別マーカーは、可視
的染料、機械読みとり可能な染料、放射性物質等であり
得る。
【０００４】リポソームは、主にリン脂質からなる顕微
鏡的球状の人工構造物である。リポソームは、脂質等の
物質が負荷または充填され得る閉じた球状殻を形成す
る、一つ以上のラメラ状リン脂質小胞からなってもよ
い。リポソームは、１５０−２５０ｎｍの範囲の大きさ
を有し、脂質膜の平均的厚さは２．５ｎｍであるため、
リポソームの密度は、一義的には、封入される物質、す
なわち染料または指示薬、および緩衝剤または担体の密
度により決定される。リポソームの調製および使用方法
は、Ｊａｍｅｓ Ｏ’Ｃｏｎｎｅｌｌによる［Ｌｉｐｏ
ｓｏｍｅｓ：Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ ａｎｄ Ｔｈｅｒ
ａｐｅｕｔｉｃ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ」１９８８年
１２月，Ｍｅｄｉｃａｌ Ｄｅｖｉｃｅ ａｎｄ Ｉｎ
ｄｕｓｔｒｙ発行の３１−３６頁に開示されている。
鏡的球状の人工構造物である。リポソームは、脂質等の
物質が負荷または充填され得る閉じた球状殻を形成す
る、一つ以上のラメラ状リン脂質小胞からなってもよ
い。リポソームは、１５０−２５０ｎｍの範囲の大きさ
を有し、脂質膜の平均的厚さは２．５ｎｍであるため、
リポソームの密度は、一義的には、封入される物質、す
なわち染料または指示薬、および緩衝剤または担体の密
度により決定される。リポソームの調製および使用方法
は、Ｊａｍｅｓ Ｏ’Ｃｏｎｎｅｌｌによる［Ｌｉｐｏ
ｓｏｍｅｓ：Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ ａｎｄ Ｔｈｅｒ
ａｐｅｕｔｉｃ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ」１９８８年
１２月，Ｍｅｄｉｃａｌ Ｄｅｖｉｃｅ ａｎｄ Ｉｎ
ｄｕｓｔｒｙ発行の３１−３６頁に開示されている。
【０００５】この発明は、標本試料の異なる成分を分離
し明別するために特に調製されたリポソームの使用に関
する。該リポソームは、可視的または機械読みとり可能
な着色料、または他の感受性成分を含む液体等の標識ま
たは明別物質で充填または負荷されるであろう。該充填
物質は、あらかじめ定められた比重を有し、しかしてこ
れはリポソームの比重を定める。リポソームの外部表面
は、それに結合された１個以上の異なる抗体を有し、こ
れらは試験されるべき異なる試料における異なる標的上
に存在することが知られている異なる表面抗原に対して
特異的である。しかして、例えばリポソームは、比重
１．５を有する蛍光性液体にて充填され、かつ表面抗原
ａ、ｂ、ｃ、およびｄに対して特異的な抗体Ａ、Ｂ、
Ｃ、およびＤが結合されるであろう。これらの表面抗原
は、定性的あるいは定量的にアッセイされる異なる標本
試料に１種以上存在することが知られている抗原であ
る。しかして単一のアッセイ媒体を、以下に例として示
す様式で数種の異なる試料をアッセイする為に使用され
得る。それぞれ固有の密度を有する異なるリポソームＡ
−Ｄを、前記ａ−ｄの表面抗原を同時にアッセイするた
めに使用することも可能である。
し明別するために特に調製されたリポソームの使用に関
する。該リポソームは、可視的または機械読みとり可能
な着色料、または他の感受性成分を含む液体等の標識ま
たは明別物質で充填または負荷されるであろう。該充填
物質は、あらかじめ定められた比重を有し、しかしてこ
れはリポソームの比重を定める。リポソームの外部表面
は、それに結合された１個以上の異なる抗体を有し、こ
れらは試験されるべき異なる試料における異なる標的上
に存在することが知られている異なる表面抗原に対して
特異的である。しかして、例えばリポソームは、比重
１．５を有する蛍光性液体にて充填され、かつ表面抗原
ａ、ｂ、ｃ、およびｄに対して特異的な抗体Ａ、Ｂ、
Ｃ、およびＤが結合されるであろう。これらの表面抗原
は、定性的あるいは定量的にアッセイされる異なる標本
試料に１種以上存在することが知られている抗原であ
る。しかして単一のアッセイ媒体を、以下に例として示
す様式で数種の異なる試料をアッセイする為に使用され
得る。それぞれ固有の密度を有する異なるリポソームＡ
−Ｄを、前記ａ−ｄの表面抗原を同時にアッセイするた
めに使用することも可能である。
【０００６】前述の一般的な例から、本発明が診断およ
び／または定量法の為の医学分野で多くの応用を有する
ことが認識されるであろう。単にアッセイされるべき成
分の比重、およびそれがどの表面抗原を有するかを知る
ことが必要とされる。一旦、これらの事実が知られたの
であれば、リポソームは、該成分を標識し、それが存在
する試料中でそれを集中させるべく作製され得る。使用
される抗体は、ポリクローナルまたはモノクローナル抗
体で有り得る。
び／または定量法の為の医学分野で多くの応用を有する
ことが認識されるであろう。単にアッセイされるべき成
分の比重、およびそれがどの表面抗原を有するかを知る
ことが必要とされる。一旦、これらの事実が知られたの
であれば、リポソームは、該成分を標識し、それが存在
する試料中でそれを集中させるべく作製され得る。使用
される抗体は、ポリクローナルまたはモノクローナル抗
体で有り得る。
【０００７】従って、存在する特定の標的成分に関して
標本試料をアッセイする為の改良方法を提供することが
本発明の目的である。更に、標的成分の比重を変更し、
かつそれらが試料中で検出可能となるように該標的成分
を明別するような、記述された特徴の方法を提供するこ
とも本発明の目的である。
標本試料をアッセイする為の改良方法を提供することが
本発明の目的である。更に、標的成分の比重を変更し、
かつそれらが試料中で検出可能となるように該標的成分
を明別するような、記述された特徴の方法を提供するこ
とも本発明の目的である。
【０００８】また多くの異なる標的成分に対して同時に
特異的に調製され得る標的成分明別物質を提供すること
は、本発明の別の目的である。試料中の標的成分を定性
的および／または定量的にアッセイするような、記述さ
れた特徴を有する方法を提供することも、本発明の更に
別の目的である。
特異的に調製され得る標的成分明別物質を提供すること
は、本発明の別の目的である。試料中の標的成分を定性
的および／または定量的にアッセイするような、記述さ
れた特徴を有する方法を提供することも、本発明の更に
別の目的である。
【０００９】本発明の、これらのおよび他の目的および
優位点は、以下のいくつかの好適な実施態様の詳細な記
述を、本発明に関連して使用するために修飾されたリポ
ソームの模式的概観を示す添付した図と関連づけること
により更に明らかになるであろう。
優位点は、以下のいくつかの好適な実施態様の詳細な記
述を、本発明に関連して使用するために修飾されたリポ
ソームの模式的概観を示す添付した図と関連づけること
により更に明らかになるであろう。
【００１０】図面を参照すると、番号２によって全体的
に表される単一ラメラ小胞リポソームが示されている。
小胞２の膜４は、厚さ約４Ａと極めて薄いものである
が、相対的に大きい体積を封入している。小胞の内部に
は、液体担体に分散されていてもよいマーカー液体６が
含まれる。抗体８は、膜４の外部に結合されている。例
として、４種の異なる抗体Ａ、Ｂ、Ｃ、およびＤが、膜
４の外部にしめされている。先に示したように、所望に
より百種（または千種）の異なる抗体を、実際に各小胞
に結合することができる。抗体類は、小胞２の外部に亘
って移動可能であると考えられており、標的成分の所望
の標識を得るために小胞の特定の配向を必要としない。
該小胞における膜４に対する封入マーカー６のより大き
い割合のために、マーカー６および／またはその担体の
比重が、小胞２の比重を決定することが知られるであろ
う。
に表される単一ラメラ小胞リポソームが示されている。
小胞２の膜４は、厚さ約４Ａと極めて薄いものである
が、相対的に大きい体積を封入している。小胞の内部に
は、液体担体に分散されていてもよいマーカー液体６が
含まれる。抗体８は、膜４の外部に結合されている。例
として、４種の異なる抗体Ａ、Ｂ、Ｃ、およびＤが、膜
４の外部にしめされている。先に示したように、所望に
より百種（または千種）の異なる抗体を、実際に各小胞
に結合することができる。抗体類は、小胞２の外部に亘
って移動可能であると考えられており、標的成分の所望
の標識を得るために小胞の特定の配向を必要としない。
該小胞における膜４に対する封入マーカー６のより大き
い割合のために、マーカー６および／またはその担体の
比重が、小胞２の比重を決定することが知られるであろ
う。
【００１１】小胞２は、上記のＯ’Ｃｏｎｎｅｌｌの参
考文献に記述されているように、小胞調製の間にマーカ
ー６を封入する慣用の方法によって製造され得る。Ｓｚ
ｏｋａおよびＰａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓは、Ｐｈ
ｙｓｉｃａｌ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｔｏ Ｔｈｅｒａ
ｐｅｕｔｉｃ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｅｌｓｅｖ
ｉｅｒ／Ｎｏｒｔｈ Ｈｏｌｌａｎｄ Ｂｉｏｍｅｄｉ
ｃａｌ Ｐｒｅｓｓ１９８１の６９−８２頁の記事「Ｌ
ｉｐｏｓｏｍｅｓ：Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎａｎｄ Ｃ
ｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｉｔｏｎ」に、抗体をリポソー
ムに結合するいくつかの方法を記述している。例えば、
リポソームは、ｐＨ４．５を有する５ｍＭのＥＤＴＡ緩
衝担体に溶解された５ｍＭの硫酸フルオレセインを封入
することにより調製され得る。抗体は、Ｆｉｄｄｌｅｒ
およびＧｒａｙによるＡｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃ
ｈｅｍｉｓｔｒｙ、第８６巻、７１６−７２４頁に記述
されているナトリウム シアノボロヒドリド法により、
中性またはアルカリ性ｐＨで安定なアミドに還元される
シッフ塩基を介して本来のリポソームに結合され得る。
この方法は、１０モル％のラクトシルセレブロシドまた
は混合脳ガングリオシドを含むリポソームの過ヨウ素酸
酸化を含む。酸化工程は、酸性（ｐＨ５．５）またはア
ルカリ性（ｐＨ８．４）のいずれかの条件下で行われ
る。ｐＨ５．５における過ヨウ素酸酸化の時間は、過ヨ
ウ素酸がリポソームに入ることを防止する為に注意深く
制御されなければならない。引き続くナトリウムシアノ
ボロヒドリドによる還元工程は、中性のｐＨにて行われ
る。小胞の完全性は、捕捉された成分がリポソームから
漏れ出すことなく、かつ捕捉された過ヨウ素酸で切断可
能な成分が酸化されないという事実により示されるよう
に、反応の間維持される。蛋白質の結合は、前述の技術
により効率的である。蛋白質−蛋白質の交差結合、また
はリポソームの凝集は、前述の技術では深刻な問題では
ない。
考文献に記述されているように、小胞調製の間にマーカ
ー６を封入する慣用の方法によって製造され得る。Ｓｚ
ｏｋａおよびＰａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓは、Ｐｈ
ｙｓｉｃａｌ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｔｏ Ｔｈｅｒａ
ｐｅｕｔｉｃ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｅｌｓｅｖ
ｉｅｒ／Ｎｏｒｔｈ Ｈｏｌｌａｎｄ Ｂｉｏｍｅｄｉ
ｃａｌ Ｐｒｅｓｓ１９８１の６９−８２頁の記事「Ｌ
ｉｐｏｓｏｍｅｓ：Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎａｎｄ Ｃ
ｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｉｔｏｎ」に、抗体をリポソー
ムに結合するいくつかの方法を記述している。例えば、
リポソームは、ｐＨ４．５を有する５ｍＭのＥＤＴＡ緩
衝担体に溶解された５ｍＭの硫酸フルオレセインを封入
することにより調製され得る。抗体は、Ｆｉｄｄｌｅｒ
およびＧｒａｙによるＡｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃ
ｈｅｍｉｓｔｒｙ、第８６巻、７１６−７２４頁に記述
されているナトリウム シアノボロヒドリド法により、
中性またはアルカリ性ｐＨで安定なアミドに還元される
シッフ塩基を介して本来のリポソームに結合され得る。
この方法は、１０モル％のラクトシルセレブロシドまた
は混合脳ガングリオシドを含むリポソームの過ヨウ素酸
酸化を含む。酸化工程は、酸性（ｐＨ５．５）またはア
ルカリ性（ｐＨ８．４）のいずれかの条件下で行われ
る。ｐＨ５．５における過ヨウ素酸酸化の時間は、過ヨ
ウ素酸がリポソームに入ることを防止する為に注意深く
制御されなければならない。引き続くナトリウムシアノ
ボロヒドリドによる還元工程は、中性のｐＨにて行われ
る。小胞の完全性は、捕捉された成分がリポソームから
漏れ出すことなく、かつ捕捉された過ヨウ素酸で切断可
能な成分が酸化されないという事実により示されるよう
に、反応の間維持される。蛋白質の結合は、前述の技術
により効率的である。蛋白質−蛋白質の交差結合、また
はリポソームの凝集は、前述の技術では深刻な問題では
ない。
【００１２】この発明は、全血試料中の網状赤血球の定
量に使用され得る。網状赤血球は、幼若赤血球であり、
血液試料中の網状赤血球の定量的測定は、体内の赤血球
細胞の産生速度の測定に使用され得る。網状赤血球の定
量は、貧血の原因の決定に重要であり、また、補償血液
損失、すなわち異常に高い赤血球産生によってのみ存在
する赤血球細胞の正常な量の確認に使用され得る。その
ような補償血液損失は、悪性疾患または他の原因による
消化管出血の存在の初期症状で有り得る。網状赤血球
は、抗トランスフェリン抗体が結合し得る表面抗原トラ
ンスフェリンを有している。しかして全血試料の網状赤
血球母集合は、網状赤血球および成熟赤血球とは異なる
比重を有する染料または蛍光剤等の液体着色剤を含むリ
ポソームの膜に抗トランスフェリン抗体を結合すること
により定量され得る。次いで標識リポソームは、血液試
料中のすべての網状赤血球に結合するために充分な程度
に、血液試料と混合される。該混合物は、次いでＳ．
Ｃ，Ｗａｒｄｌａｗに許された米国特許４，０２７，６
６０に開示された発明の血液分析チューブに入れられ、
それに記述された方法に従って定量される。
量に使用され得る。網状赤血球は、幼若赤血球であり、
血液試料中の網状赤血球の定量的測定は、体内の赤血球
細胞の産生速度の測定に使用され得る。網状赤血球の定
量は、貧血の原因の決定に重要であり、また、補償血液
損失、すなわち異常に高い赤血球産生によってのみ存在
する赤血球細胞の正常な量の確認に使用され得る。その
ような補償血液損失は、悪性疾患または他の原因による
消化管出血の存在の初期症状で有り得る。網状赤血球
は、抗トランスフェリン抗体が結合し得る表面抗原トラ
ンスフェリンを有している。しかして全血試料の網状赤
血球母集合は、網状赤血球および成熟赤血球とは異なる
比重を有する染料または蛍光剤等の液体着色剤を含むリ
ポソームの膜に抗トランスフェリン抗体を結合すること
により定量され得る。次いで標識リポソームは、血液試
料中のすべての網状赤血球に結合するために充分な程度
に、血液試料と混合される。該混合物は、次いでＳ．
Ｃ，Ｗａｒｄｌａｗに許された米国特許４，０２７，６
６０に開示された発明の血液分析チューブに入れられ、
それに記述された方法に従って定量される。
【００１３】この発明は、対象血液中のＴ−リンパ球お
よびそれらの部分集合の検出および定量にも使用され得
る。Ｔ−リンパ球は、細胞性免疫を媒介するリンパ球の
部分群であり、またＢ−リンパ球は、液性免疫の媒体
（抗体産生細胞）である。
よびそれらの部分集合の検出および定量にも使用され得
る。Ｔ−リンパ球は、細胞性免疫を媒介するリンパ球の
部分群であり、またＢ−リンパ球は、液性免疫の媒体
（抗体産生細胞）である。
【００１４】血中の特定抗原に対するリンパ球の反応性
の議論は、Ｒｏｂｅｒｔ Ａ， ＬｅｖｉｎｅおよびＳ
ｔｅｐｈｅｎ Ｃ． Ｗａｒｄｌａｗにより１９８９年
４月１９日荷出願された米国特許出願番号０７／３４
０，２４８に含まれている。活性リンパ球（リンパ芽
球）は、トランスフェリンレセプタ、ＨＬＡ−Ｄｒ，Ｌ
ｅｕ−２３等の表面活性化抗原を有している。リンパ芽
球を検出するためには、前記リンパ球抗原の一つに特異
的な抗体が、適当なマーカーを組み込んだリポソームに
結合される。次いで、該標識リポソームは、血液試料
と、該血液試料中に存在するであろうリンパ芽球にリポ
ソームが結合するに充分な時間をもって混合される。次
いで該混合物は、米国特許４，０２７，６６０に開示さ
れている形式の血液分析チューブに注入され、それに記
述される方法に従って試験される。
の議論は、Ｒｏｂｅｒｔ Ａ， ＬｅｖｉｎｅおよびＳ
ｔｅｐｈｅｎ Ｃ． Ｗａｒｄｌａｗにより１９８９年
４月１９日荷出願された米国特許出願番号０７／３４
０，２４８に含まれている。活性リンパ球（リンパ芽
球）は、トランスフェリンレセプタ、ＨＬＡ−Ｄｒ，Ｌ
ｅｕ−２３等の表面活性化抗原を有している。リンパ芽
球を検出するためには、前記リンパ球抗原の一つに特異
的な抗体が、適当なマーカーを組み込んだリポソームに
結合される。次いで、該標識リポソームは、血液試料
と、該血液試料中に存在するであろうリンパ芽球にリポ
ソームが結合するに充分な時間をもって混合される。次
いで該混合物は、米国特許４，０２７，６６０に開示さ
れている形式の血液分析チューブに注入され、それに記
述される方法に従って試験される。
【００１５】アッセイされるべき細胞が白血球であるた
め、マーカー染料は、標識リンパ芽球を他の白血球細胞
から層分離し、または白血球細胞中で局在化するよう
に、白血球とは異なる比重を持つように選択される。リ
ンパ球−部分集合においてＴ−リンパ球に対して使用さ
れるリポソームは、１．０１７ｇｍ／ｍｌ未満の密度を
有する。リンパ球は、平均密度１．０６ｇｍ／ｍｌおよ
び密度範囲１．０５５−１．０７０ｇｍ／ｍｌを有す
る。従って、使用されるリポソームは、標的Ｔ−リンパ
球の密度を減少することができ、それらをリンパ球層の
最上部に位置させることができる。
め、マーカー染料は、標識リンパ芽球を他の白血球細胞
から層分離し、または白血球細胞中で局在化するよう
に、白血球とは異なる比重を持つように選択される。リ
ンパ球−部分集合においてＴ−リンパ球に対して使用さ
れるリポソームは、１．０１７ｇｍ／ｍｌ未満の密度を
有する。リンパ球は、平均密度１．０６ｇｍ／ｍｌおよ
び密度範囲１．０５５−１．０７０ｇｍ／ｍｌを有す
る。従って、使用されるリポソームは、標的Ｔ−リンパ
球の密度を減少することができ、それらをリンパ球層の
最上部に位置させることができる。
【００１６】
【実施例】以下は、本発明を血液試料においてＴ−リン
パ球を検出するために使用する例である。１．０１７ｇ
ｍ／ｍｌ未満の比重を有するフルオレセイン（蛍光剤）
染料が負荷されたリポソームに結合する未希釈の５５−
２／ＬＥＵ−１抗体の２５μｌを含むマーカー組成物
を、１ｍｌＥＤＴＡ静脈血、および未希釈の混合物２５
μｌに混合した。４２ｇ／１０ｍｌのフッ化ナトリウム
の保存溶液を、添加した。フッ化ナトリウムは、リンパ
球細胞バンドの非蛍光および蛍光成分のより明確な分離
を生じる。前記混合物に、オキサール酸カリウムの未希
釈の１．１ｇ／１０ｍｌ保存溶液５０μｌを加え、最初
に引用した先行技術に記述されたように明確な赤血球／
顆粒球分離を与えた。得られた混合物を、５分間インキ
ュベートし、その後該混合物をキャピラリーまたは試料
中の種々細胞を拡大するプラスチックフロートを含む透
明チューブ中で遠心分離して、種々の細胞型を分離し
た。前述の技術を使用して、蛍光性リンパ球の明確なバ
ンドが、白血球層に形成された。このバンドは、チュー
ブ内の縦の範囲の測定によって定量された。得られた値
は、血液中の循環しているＴ−リンパ球を示すものであ
る。異なる比重を有する染色または着色が使用される場
合、標識細胞は、遠心血液試料中の別の位置に置かれ得
る。
パ球を検出するために使用する例である。１．０１７ｇ
ｍ／ｍｌ未満の比重を有するフルオレセイン（蛍光剤）
染料が負荷されたリポソームに結合する未希釈の５５−
２／ＬＥＵ−１抗体の２５μｌを含むマーカー組成物
を、１ｍｌＥＤＴＡ静脈血、および未希釈の混合物２５
μｌに混合した。４２ｇ／１０ｍｌのフッ化ナトリウム
の保存溶液を、添加した。フッ化ナトリウムは、リンパ
球細胞バンドの非蛍光および蛍光成分のより明確な分離
を生じる。前記混合物に、オキサール酸カリウムの未希
釈の１．１ｇ／１０ｍｌ保存溶液５０μｌを加え、最初
に引用した先行技術に記述されたように明確な赤血球／
顆粒球分離を与えた。得られた混合物を、５分間インキ
ュベートし、その後該混合物をキャピラリーまたは試料
中の種々細胞を拡大するプラスチックフロートを含む透
明チューブ中で遠心分離して、種々の細胞型を分離し
た。前述の技術を使用して、蛍光性リンパ球の明確なバ
ンドが、白血球層に形成された。このバンドは、チュー
ブ内の縦の範囲の測定によって定量された。得られた値
は、血液中の循環しているＴ−リンパ球を示すものであ
る。異なる比重を有する染色または着色が使用される場
合、標識細胞は、遠心血液試料中の別の位置に置かれ得
る。
【００１７】本発明は、生物学的液体試料中の他の細
胞、粒子または生物のアッセイにも使用され得る。ベー
タ−アミロイド蛋白質（ＢＡＰ）の異常量の存在は、ア
ルツハイマー病、退行性神経疾患の患者、およびトリソ
ミー２１としても知られている先天的疾患であるダウン
症候群の高年齢の患者の脳、皮膚および結腸粘膜におい
て起こることが知られている。ＢＡＰは、今日まで血清
中では検出可能でない。リンパ球型または他の型の白血
球細胞におけるＢＡＰの存在は、ＢＡＰを生産している
循環細胞の表面に露出される抗原であるＢＡＰの表面抗
原に対するものであり、リポソームに結合された抗体を
使用することにより検出可能であろう。
胞、粒子または生物のアッセイにも使用され得る。ベー
タ−アミロイド蛋白質（ＢＡＰ）の異常量の存在は、ア
ルツハイマー病、退行性神経疾患の患者、およびトリソ
ミー２１としても知られている先天的疾患であるダウン
症候群の高年齢の患者の脳、皮膚および結腸粘膜におい
て起こることが知られている。ＢＡＰは、今日まで血清
中では検出可能でない。リンパ球型または他の型の白血
球細胞におけるＢＡＰの存在は、ＢＡＰを生産している
循環細胞の表面に露出される抗原であるＢＡＰの表面抗
原に対するものであり、リポソームに結合された抗体を
使用することにより検出可能であろう。
【００１８】生物学的液体試料中の生物の検出に関して
は、本来の生細胞では抗体類は赤血球細胞膜に侵入出来
ないため、免疫学的意味においてマラリアプロトゾア
は、一般に赤血球細胞間に位置する細胞外生物である。
ファルシパルム型のマラリアプロトゾアは、感染赤血球
細胞において特徴的な赤血球細胞の変化を生じる。ファ
ルシパルムマラリアは、しばしば致死的でありまたしば
しば一般に使用されている抗マラリア剤に抵抗性である
ため、ファルシパルムマラリアを非ファルシパルムマラ
リアと識別することが必要である。専門家でない者にと
ってファルシパルムマラリアと非ファルシパルムマラリ
アとを形態学的に識別することは困難である。ファルシ
パルムマラリアに感染した赤血球に結合し得る標識リポ
ソームの使用は、技術者が感染を特定することを可能と
する。リポソーム上の抗体は、ファルシパルム感染赤血
球に特有の赤血球細胞膜に特異的である。
は、本来の生細胞では抗体類は赤血球細胞膜に侵入出来
ないため、免疫学的意味においてマラリアプロトゾア
は、一般に赤血球細胞間に位置する細胞外生物である。
ファルシパルム型のマラリアプロトゾアは、感染赤血球
細胞において特徴的な赤血球細胞の変化を生じる。ファ
ルシパルムマラリアは、しばしば致死的でありまたしば
しば一般に使用されている抗マラリア剤に抵抗性である
ため、ファルシパルムマラリアを非ファルシパルムマラ
リアと識別することが必要である。専門家でない者にと
ってファルシパルムマラリアと非ファルシパルムマラリ
アとを形態学的に識別することは困難である。ファルシ
パルムマラリアに感染した赤血球に結合し得る標識リポ
ソームの使用は、技術者が感染を特定することを可能と
する。リポソーム上の抗体は、ファルシパルム感染赤血
球に特有の赤血球細胞膜に特異的である。
【００１９】本発明の概念を離れることなく、本発明の
開示された実施態様の多くの変更および変形が行われ得
るため、添付のクレームに要求されるもの以外に本発明
を限定するものではない。
開示された実施態様の多くの変更および変形が行われ得
るため、添付のクレームに要求されるもの以外に本発明
を限定するものではない。
【図１】図面は、本発明のリポソームの模式図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (73)特許権者 999999999 ベクトン ディキンソン アンド カン パニー アメリカ合衆国 ニュージャージー州, フランクリン レイクス，ワン ベクト ン ドライブ（番地なし) (72)発明者 ロバート エイ． レビン アメリカ合衆国 コネチカット州，ギル フォード，ピルグリム レーン 31 (72)発明者 スチーブン シー． ワードロウ アメリカ合衆国 コネチカット州，オー ルド セイブルック，ノース コウブ ロード 191 (72)発明者 ロドルフォ ロドリゲツ アメリカ合衆国メリーランド州オーウィ ングズ ミルズ，ウオータースパウト コート 12633 (72)発明者 ジュディス ブリッツ アメリカ合衆国メリーランド州ローレ ル，パタックセント リッジ ウェイ 10549 (72)発明者 トーマス ジェイ． メルコリノ アメリカ合衆国ニュージャージー州スト ックトン，ランバービル エィチ．キュ ー．ロード 121 (56)参考文献 特開 昭63−45563（ＪＰ，Ａ) 特開 平２−311761（ＪＰ，Ａ) 米国特許4332785（ＵＳ，Ａ) 英国公開2239197（ＧＢ，Ａ)
Claims (5)
- 【請求項１】 生物学的液体試料中の標的成分の存在に
ついての同試料のアッセイ方法であって、 ａ）リポソーム小胞の外部表面に結合された抗体で前記
標的成分の表面抗原に対して特異的な抗体を有する複数
の同リポソ−ム小胞を用意し、前記小胞は同小胞を生物
学的液体試料中で検出可能とする取り込まれたマーカー
物質を有し、かつ前記マーカー物質は、前記小胞に前記
標的成分の比重とは異なる比重を付与するものであり； ｂ）前記小胞を液体試料に添加してそれらの混合物を形
成し； ｃ）同混合物を遠心分離して混合物中のリポソ−ム−標
的結合体を重量分析的に別個のバンドに分離し；次いで ｄ）前記遠心分離混合物中の前記別個のバンドを同定お
よび／または定量する、但し、材料を遠心分離管内にと
どめたまま標的成分の同定および／または定量を行う、
工程を含んでなるアッセイ方法。 - 【請求項２】 抗凝固処理全血試料中のＴリンパ球また
はそれらの部分集合の存在についての同試料のアッセイ
方法であって、 ａ）リポソーム小胞の外部表面に結合された抗体でＴリ
ンパ球またはそれらの部分集合の表面抗原に対して特異
的な抗体を有する複数のリポソーム小胞を用意し、前記
小胞は同小胞を試料中で検出可能とする取り込まれたマ
ーカー物質を有し、かつ前記マーカー物質が、前記小胞
に前記Ｔリンパ球またはそれらの部分集合の比重とは異
なる比重を付与するものであり； ｂ）前記小胞を試料に添加してそれらの混合物を形成
し； ｃ）同混合物を遠心分離して混合物中のリポソーム−Ｔ
リンパ球またはそれらの部分集合の結合体を重量分析的
に別個のバンドに分離し；次いで ｄ）前記遠心分離混合物中の前記別個のバンドを同定お
よび／または定量する、但し、試料を遠心分離管内にと
どめたまま標的成分の同定および／または定量を行う、
工程を含んでなるアッセイ方法。 - 【請求項３】 抗凝固処理全血試料中の標的成分の存在
についての同試料のアッセイ方法であって、 ａ）リポソーム小胞の外部表面に結合された抗体で前記
標的成分の表面抗原に対して特異的な抗体を有する複数
のリポソーム小胞を用意し、前記小胞は同小胞を試料中
で検出可能とする取り込まれたマーカー物質を有し、か
つ前記マーカー物質が、前記小胞に前記標的成分の比重
とは異なる比重を付与するものであり； ｂ）前記小胞を試料に添加してそれらの混合物を形成
し； ｃ）同混合物を遠心分離して混合物中のリポソーム−標
的成分結合体を重量分析的に別個のバンドに分離し；次
いで ｄ）前記遠心分離混合物中の前記別個のバンドを同定お
よび／または定量する、但し、試料を遠心分離管内にと
どめたまま標的成分の同定および／または定量を行う、
工程を含んでなるアッセイ方法。 - 【請求項４】 標的成分が特定の型の血液細胞である請
求項３に記載の方法。 - 【請求項５】 生物学的液体試料中の少なくとも２種の
標的成分の存在についての同試料のアッセイ方法であっ
て、 ａ）第１のリポソーム小胞の外部表面に結合された第１
の抗体で前記標的成分の内の一つの表面抗原に対して特
異的な第１の抗体を有する複数の第１のリポソーム小胞
を用意し、前記第１の小胞は同第１の小胞を該生物学的
液体試料中で検出可能とする取り込まれた第１のマーカ
ー物質を有し、かつ前記第１のマーカー物質が、前記第
１の小胞に前記標的成分の内の一つの比重とは異なる第
１の比重を付与するものであり； ｂ）第２のリポソーム小胞の外部表面に結合された第２
の抗体で前記標的成分の他の一つの表面抗原に対して特
異的な第２の抗体を有する複数の第２のリポソーム小胞
を用意し、前記第２の小胞は同第２の小胞を該生物学的
液体試料中で検出可能とする取り込まれた第２のマーカ
ー物質を有し、かつ前記第２のマーカー物質が、前記第
２の小胞に前記他の一つの標的成分の比重とは異なり、
かつ前記第１の比重とも異なる比重を付与するものであ
り； ｃ）前記小胞を該液体試料に添加してそれらの混合物を
形成し； ｄ）該混合物を遠心分離して混合物中のリポソーム−標
的結合体を重量分析的に別個のバンドに分離し；次いで ｅ）前記遠心分離混合物中の前記別個のバンドを同定お
よび／または定量する、但し、試料を遠心分離管内にと
どめたまま標的成分の同定および／または定量を行う、
工程を含んでなるアッセイ方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US84197692A | 1992-02-25 | 1992-02-25 | |
| US841976 | 2001-04-25 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0821833A JPH0821833A (ja) | 1996-01-23 |
| JP2925105B2 true JP2925105B2 (ja) | 1999-07-28 |
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ID=25286232
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP5035368A Expired - Lifetime JP2925105B2 (ja) | 1992-02-25 | 1993-02-24 | 標的成分アッセイ法 |
Country Status (17)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5593848A (ja) |
| EP (1) | EP0557595B1 (ja) |
| JP (1) | JP2925105B2 (ja) |
| CN (1) | CN1091521A (ja) |
| AT (1) | ATE155889T1 (ja) |
| AU (1) | AU662571B2 (ja) |
| BR (1) | BR9300639A (ja) |
| CA (1) | CA2090282A1 (ja) |
| DE (1) | DE69221118T2 (ja) |
| DK (1) | DK0557595T3 (ja) |
| ES (1) | ES2106121T3 (ja) |
| FI (1) | FI930821A (ja) |
| GR (1) | GR3024970T3 (ja) |
| MX (1) | MX9300965A (ja) |
| NO (1) | NO930649L (ja) |
| RU (1) | RU2116068C1 (ja) |
| TW (1) | TW246716B (ja) |
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| US5342790A (en) * | 1992-10-30 | 1994-08-30 | Becton Dickinson And Company | Apparatus for indirect fluorescent assay of blood samples |
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| AU9233698A (en) * | 1997-11-22 | 1999-06-17 | Robert A. Levine | Method for the detection, identification, enumeration and confirmation of circulating cancer cells and/or hematologic progenitor cells in whole blood |
| US6197523B1 (en) | 1997-11-24 | 2001-03-06 | Robert A. Levine | Method for the detection, identification, enumeration and confirmation of circulating cancer and/or hematologic progenitor cells in whole blood |
| US6911315B2 (en) * | 1997-11-24 | 2005-06-28 | David L. Rimm | Method for the detection, identification, enumeration and confirmation of virally infected cells and other epitopically defined cells in whole blood |
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| WO2005016141A1 (en) * | 2003-07-09 | 2005-02-24 | California Pacific Medical Center | Remote detection of substance delivery to cells |
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- 1997-10-09 GR GR970402612T patent/GR3024970T3/el unknown
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