CN1091521A - 靶成分测定法 - Google Patents

Abstract

一种测定样品中靶成分的改进的测定法，该方法 使用了能改变比重的颗粒，该颗粒是通过将特异性抗 体而附着在靶成分上的。所附着的可变换比重的颗 粒最好是脂质体，当以样品在透明试管中进行离心处 理后，该脂质体会把样品中的靶成分漂浮或沉降到一 个恒定的水平。由于脂质体能含有多种荧光或非荧 光染料分子，而且该分子对抗体的结合能力具有最小 的位置干扰，因此脂质体就可以着重及更明确地显示 出样品中靶成分的存在。

Description

本发明涉及样品靶成分的测定，特别是涉及到通过同时改变比重和靶的强化或标记对生物样品中的靶细胞（颗粒或有机体，以下称做“靶”）进行检测和（或）定量分析。

1980年1月1日批准的S.C.Wardlaw等人的美国第4，181，609号专利公布了一项血液分析方法，该法通过增加某些血细胞（网织红细胞）的密度以使经离心处理的血样中形成清晰的细胞界面。这样，网织红细胞天然比重的改变就引出了一种改良性血液化验法。1982年1月1日批准的Allen等人的美国第4，332，785号专利也公布了一种特殊方法，该法在血样的网织红细胞定量分析中使用了荧光抗体来标记网织红细胞。1986年5月17日批准的Chang的美国第4，591，570号专利则公布了一种方法，即在免疫测定法中在载体上使用许多不同的抗体来捕获众多不同的抗原。而以前的技术未能给出一种普遍的方法，该方法乃改变许多不同样品成分的比重，以便能浓集经过离心处理的样品中的变化的成分并且标记成分使其易于识别。

本发明涉及样品靶成分的一种改良测定法，即使观测上可区别的脂质体有选择性地附着到相应的样品靶成分上。这些脂质体是通过其表面附着的抗体与样品成分相联系的。该抗体至少包括一种对已知存在于样品靶成分表面抗原具有特异性的抗体。不同的抗体可以同时附着到单个脂质体的表面上，这样，该测定法对许多不同靶中的每一个就都具有专一性。脂质体最好通过包裹在其内部或结合在磷脂双分子层中的肉眼可见的或仪器可识别的标记物来加以辨别。可识别的标记物可以是肉眼可见的染料，可以是仪器可识别的染料、放射性物体等类物质。

脂质体主要是由磷脂构成的细微、球型人造结构。脂质体可由一个或多个片层状磷脂泡囊构成，这种泡囊形成了一个负载或充满液体等物质的封闭性球型壳状结构。由于脂质体的大小为150-250nm，脂膜的平均厚度是2.5nm，显然脂质体的密度主要是由所包裹的物质（例如染料或指示剂、缓冲剂或载体介质）的密度来确定。制备及使用脂质体的方法见James    O′Connell的“脂质体：在诊断和治疗上的应用”一文，该文发表在《医疗器械和诊断行业》1988年12月期第31-36页。

本发明涉及特制脂质体的应用，以分离及强化样品中的不同组分。这些脂质体充满或负载着标记或强化物质，例如含有肉眼可见的或仪器可识别的染料（或某些其它可察觉成分）的液体。填充物质具有预先确定的比重，该比重因而决定了脂质体的比重。脂质体的外表面与一种或多种不同抗体相联结，它对所要测试的不同样品中各种靶上的不同表面抗原都具有特异性。这样，例如，脂质体可以充满比重为1.5的荧光液体，可以与A、B、C及D抗体相联结，而这4个抗体对a、b、c及d表面抗原又具有特异性。这些表面抗原可能是要定量或定性测试的不同的样品中一个或多个靶上的抗原。这样，通过实施例，应用下述方法，可用单一的测试介质来测定各种不同的样品。使用各种脂质体A-D（每一种均有其本身的密度）来同时测定上述a-d表面抗原也是可能的。

从上述一般性实施例中可以看出，本发明在医学领域的诊断及（或）定量化方法方面具有广泛的应用。人们只需知道要测组分的比重以及其含有何种表面抗原。一旦知道了这些事实，就可以制成脂质体来标记组分并且在其存在的样品中浓集脂质体。所使用的抗体可以是多克隆或单克隆抗体。

因而，本发明的目的就是为测定具特殊靶组分的样品提供一种改良性方法。

本发明的还一个目的是提供一种描述某种特性的方法，这种方法可以改变靶成分的比重并可强化靶成分以便使其在样品中得到检测。

本发明的另一目的是提供一种靶组分强化物质，该物质可同时对许多不同靶组分具有特异性。

本发明还具有一个目的，即为描述某种特性提供一种方法，该法可定量和（或）定性地测定样品中的靶组分。

配合应用本发明的脂质体附图，从下述一系列优选的具体实例的详细叙述中可以更加容易理解本发明的这些目的和优点。

如图所示，数字2通常代表单层泡囊脂质体。泡囊2的膜4非常薄，其厚度约为40埃而包围的体积较大。泡囊内部含有标记物液体6（例如染料等等），它可在流动载体中分散。抗体8附着在膜4的外部。例如，膜4的外界面上有4种不同的抗体A、B、C和D。如同上面指出的那样，如果需要，每一个泡囊实际上可附着数百（或数千）个不同的抗体。抗体相信可在泡囊2的外界面上移动，这样在所需的靶组分标记示踪中就不须泡囊的特异定向作用。应指出的是，由于泡囊中被包围的标记物6与膜4的差比很大，标记物6及（或）其载体的比重就决定了泡囊2的比重。

如同上述O′Connell文献中叙述的那样，泡囊2可通过在其产生时所包围的标记物6的任何常规方法而生产出来。Szoka和Pa-pahadjopoulos在其文章中曾叙述过使抗体附着到脂质体上的许多方法，该文题目为《脂质体：制备和特性》见1981年Elsevier/North    Holland生物医学出版社《从物理结构到医疗应用》一书的69-82页。例如，脂质体可通过把5mM荧光素磺酸标记物溶围在5mM乙二胺四醋酸缓冲液载体（pH值4.5）中而得到。抗体可通过西佛碱偶联到完整的脂质体上，依据Eiddler和Gray叙述的氰代硼氢化钠法（见《分析生物化学》第86卷716-724页），西佛碱在中性或碱性pH值下能还原成稳定性的酰胺。本方法应用了含10%（摩尔）的乳糖基脑苷脂或混合性脑神经节苷脂的脂质体，经高碘酸盐氧化作用。该氧化步骤是在酸性（pH值5.5）或碱性高碘酸盐氧化时间必须小心加以控制以防止高碘酸盐进入脂质体中。后来的使用氰代硼氢化钠的还原步骤是在中性pH值条件下进行的。反应中泡囊保持了完整性，这可由所截留的内容物未从脂质体中泄出且所截留的可被高碘酸裂解的成分未氧化的事实说明。应用上述技术的蛋白质偶联是有效率的。运用上述技术的蛋白质与蛋白质的交联或脂质体聚集作用不会发生严重问题。

本发明可应用于全血样品中网织红细胞的定量分析。网织红细胞是新特殊性红血球。对血样中网织红细胞的定量测定可用于确定身体中红细胞的生成速度。网织红细胞定量分析在确定贫血症原因方面是重要的，它还可以用于确定“代偿性血液损失”（即仅仅由于红血球异常性高速率生成才存在的正常量的红血球）的存在。这种代偿性血液损失可能是因恶性肿瘤或其它原因而造成的胃肠道出血的一个早期迹象。网织红细胞含有抗转铁蛋白抗体能结合的表面抗原转铁蛋白。因此，全血样品中网织红细胞可通过使抗铁转铁蛋白抗体附着到脂质体膜上来进行定量分析，该脂质体含有液体染剂（如染料或荧光染料），具有不同于网织红细胞和成熟红细胞的比重。标记性脂质体随后与血样相混合使达到将血样中所有网织红血胞都结合时的程度。然后将混合物放到S.C.Warklaw等人的美国专利4，027，660号中发明的血液分析试管理，并依据该专利中叙述的方法进行定量分析。

本发明还可用于检测和定量分析病人血液中的T-淋巴细胞及其亚型。T-淋巴细胞是作为细胞免疫介体的淋巴细胞亚辟，B-淋巴细胞是体液免疫的介体（抗体生产者）。

血液中淋巴细胞对特异抗原的反应性的讨论可见Robert    A.Levine和Stephen    C.Wardlaw1989年4月19日的美国专利申请07/340，248号。活化的淋巴细胞（淋巴母细胞）具有表面活化抗原，如转铁蛋白受体、HLA-Dr、Leu-23等等。为了检测淋巴母细胞，使对上述一种淋巴抗原具特异性的抗体附着到适宜标记物所结合的脂质体上。然后将标记性脂质体与血样混合一段时间，以足使脂质体和血样中的淋巴母细胞相结合。随后将混合液注入美国专利4，027，660号中所述的血液分析试管里，并按专利中叙述的方法进行测试。

由于所测定的细胞是白细胞，最好以比重（不同于白细胞）来选择标记物染料，以便能使所标记的淋巴细胞与其余白细胞分层而置，或在白细胞定位带中分层而置。用于淋巴细胞亚型选择T-淋巴细胞的脂质体的密度要低于1.017gm/ml。淋巴细胞的平均密度为1.06gm/ml，密度范围为1.055-1.070gm/ml。因此，所使用的脂质体能够降低使其上升到淋巴细胞层之顶端的靶T-淋巴细胞的密度。

下面是应用本发明来检测血样中T-淋巴细胞的一个实施例。把含有25μl未稀释的55-2/LEu-1抗体的标记组分偶联到带荧光素染料的脂质体（其比重低于1.017gm/ml）上，在其中加入1ml乙二胺四酯酸静脉血，再向该混合液中加入25μl未稀释的氟化钠贮液（配比为42g/10ml）。氟化钠在淋巴细胞带中形成了荧光和非荧光组分的明显分界。在上述混合液中加入50μl未稀释的草酸钾贮液（配比为1.1g/10ml），就产生了上面第一个文献中叙述的红细胞/粒性白细胞的明显界面。把形成的混合液培养5分钟，随后在毛细型（或其它）透明试管（其含有可扩展样品中多种细胞的塑料浮器）中对混合液进心离心处理来分离各种细胞类型。应用上述技术，在白细胞层中形成了清晰的荧光淋巴细胞带。通过检测试管中它的轴向幅度可对该带进行定量分析，所得出的数值即是血循环中T-淋巴细胞的数量。如果使用了具不同比重的染料或着色剂，所标记的细胞就可在离心处理的血样中某个位置沉淀下来。

本发明还可用以测定生物液体样品中的其它细胞、颗粒或有机体。人们知道，在老年性痴呆症（即一种衰退性神经疾病）患者和唐氏综合症（一种亦称三体21综合症的先天性紊乱）老年患者的大脑、皮肤和结肠粘膜中有异常量的β-淀粉蛋白（BAP）的出现。迄今为止，在血清中尚未检测到BAP。淋巴细胞型（或其它类型）的白血球中BAP的存在可通过使用联接脂质体的抗体进行检测，该抗体与BAP上的表面抗原相对应，而抗原又是暴露在产生BAP的血循环中的细胞的表面上。

就生物液体样品中有机体的检测而言，由于抗体无法穿透完整活细胞的红血球膜，疟原虫通常是通过免疫方式定位在红血球中的细胞内有机体。恶性疟原虫在受感染的红血球中产生了独特的红血球变化。把恶性疟与非恶性疟区分开来是至关重要的，因为前者常常是致命的而且对常用抗疟药具有抗性。对于非专业人员来说，要在形态上区分恶性疟和非恶性疟是困难的。使用标记的脂质体可以使技术人员对感染做出鉴定，因为该脂质体能够结合受恶性疟感染的红血球。脂质体上的抗体对红血球膜表面抗原具有特异性，而这种抗原是受恶性疟感染的红血球所独有的。

由于依据本发明的理论可使本发明所公开的实施方案发生很多变化和延展，因此不要把本发明局限于所附的权利要求范围之内。

Claims (8)

1、一种用于测定生物液体样品中的靶成分的可变换比重的标记颗粒，该颗粒包括：

a)脂质体泡囊；

b)附着在该泡囊外表面的一种抗体，该抗体对所述靶成分上表面抗原具有特异性；

c)掺入该泡囊中的标记物质，该标记物质使泡囊在生物液体样品中得到检测，该标记物质及(或)其载体使泡囊形成了不同于靶成分比重的比重。

2、一种可用于测定生物液体样品中许多靶成分中的某种靶成分的可变换比重的标记颗粒，该颗粒包括：

a）脂质体泡囊;

b）附着在该泡囊外表面上的至少两种不同的抗体，每一种抗体对靶成分上不同表面抗原具有特异性;

c）掺入该泡囊中的标记物质，该标记物质使泡囊在生物液体样品中得到检测，该标记物质使泡囊形成了不同于靶成分比重的比重。

3、用于测定生物液体样品中的多种靶成分的多种可变换比重的标记颗粒，该颗粒包括：

a）一组初级脂质体泡囊，每一种初级泡囊都含有附着在其外表面的初级抗体，该抗体对多种靶成分中一种的上面的表面抗原具有特异性;初级标记物质掺入到初级泡囊中，该初级标记物质使初级泡囊在生物液体样品中得到检测;该初级标记物质使初级泡囊形成了不同于靶成分任一比重的初级比重;

b）一组次级质体泡囊，每一种次级泡囊都含有附着在其外表面上的次级抗体;该次级抗体对多种靶成分中一种的表面抗原具有特异性;次级标记物质掺入到次级泡囊中，该次级标记物质使次级泡囊在生物液体样品中得到检测，该次级标记物质使次级泡囊形成了不同于靶成分之一的比重且不同于初级比重的次级比重。

4、一种用于测定生物液体样品中的靶成分的方法，该方法包括下列步骤：

a）提供多种脂质体泡囊，该泡囊含有附着在其外表面上的抗体，该抗体对靶成分上表面抗原具有特异性;该泡囊具有掺入的标记物质和（或）载体，它们使泡囊在生物液体样品中得到检测，该标记物质和（或）载体使泡囊形成了不同于靶成分比重的比重;

b）把泡囊加入液体样品中以形成混合物;

c）对混合液进行离心处理，用重力分析法把混合液中各种脂质体一靶组合物分离成清晰的带;

d）鉴定离心处理的混合液中的清晰的带并（或）进行定量分析。

5、一种用于分析生物液体样品中的至少两种靶成分的方法，该方法包括以下步骤：

a）提供多种脂质体泡囊，该泡囊含有附着在其外表面上的抗体，该抗体对靶成分之一上面的表面抗原具有特异性;初级泡囊具有参入的初级标记物质，其使初级泡囊在生物液体样品中得到检测，该初级标记物质使初级泡囊形成了不同于靶成分之一的比重的初级比重;

b）提供多种次级脂质体泡囊，该泡囊含有附着在其外表面上的次级抗体，该次级抗体对靶细胞上的表面抗原具有特异性;该次级泡囊含有参入的次级标记物质，其使次级泡囊在生物液体样品中得到检测，该次级标记物质使次级泡囊形成了不同于靶成分比重及不同于初级比重的比重;

c）把泡囊加到液体样品中，形成混合液;

d）对混合液进行离心处理，用重力分析法把混合液中任何脂质体一靶组合物分离成明显的带;

e）鉴定离心处理的混合液中的明显的带并（或）进行定量分析。

6、一种用于检测血样中BAP的存在的方法，该方法包括以下步骤：

a）提供多种脂质体泡囊，该泡囊含有附着在其外表面上的抗体，该抗体对能产生BAP的血细胞上的表面抗原具有特异性;该泡囊含有掺入的标记物质，该物质可使血样中的泡囊得到检测，该标记物质可使泡囊形成不同于产生BAP的细胞的比重的比重;

b）把该泡囊加到血样中形成混合液;

c）对混合液进行离心处理，用重力分析法把混合液中脂质体-血球组合物分离成清晰的带;

d）鉴定离心处理的混合液中的清晰的带并（或）进行定量分析。

7、一种用于测定血样中的恶性疟原虫的方法，该方法包括以下步骤：

a）提供多种脂质体泡囊，该泡囊含有附着在其外表面上的抗体，该抗体对受疟原虫感染的红血球上的表面抗原具有特异性;该泡囊含有参入的标记物质，其可使样品中的泡囊得到检测，该标记物质使泡囊形成与疟原虫比重不相同的比重;

b）把泡囊加到样品中形成混合液;

c）对混合液进行离心处理，用重力分析法把混合液中的脂质体-疟原虫组合物分离成清晰的带;

d）对离心处理的混合液中的清晰的带进行鉴定并（或）进行定量分析。

8、一种用于测定血样中T-淋巴细胞或其亚型的存在的方法，该方法包括以下步骤：

a）提供多种脂质体泡囊，其含有附着在其外表面上的抗体，该抗体对T-淋巴细胞或其亚型上的表面抗原具有特异性;该泡囊含有参入的标记物质，其可使样品中的泡囊得到检测，该标记物质可使泡囊形成与T-淋巴细胞或其亚型的比重不同的比重;

b）把泡囊加到样品中形成混合液;

c）对混合液进行离心处理，用重力分析法把混合液中的脂质体-T-淋巴细胞或其亚型组合物分离成清晰的带;

d）鉴定离心处理的混合液中清晰的带并（或）进行定量分析。