JP2901196B2

JP2901196B2 - （３ｓ，４ｓ）‐３‐［（１ｒ）‐１‐ヒドロキシエチル］‐２‐アゼチジノン誘導体の製造方法

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Publication number: JP2901196B2
Application number: JP2161333A
Authority: JP
Inventors: 武男吉岡; 裕之千葉; 吉雄渡辺; 俊彦熊本; 憲夫柴本; 弘刀根; 六郎岡本
Original assignee: MERUSHAN KK
Current assignee: MERUSHAN KK
Priority date: 1990-06-21
Filing date: 1990-06-21
Publication date: 1999-06-07
Anticipated expiration: 2014-06-07
Also published as: JPH0454182A

Description

【発明の詳細な説明】本発明は光学活性の（3S,4S）−３−［（1R）−１−
ヒドロキシエチル］−２−アゼチジノン誘導体の製造法
に関し、さらに詳しくは、（3S,4S）−３−アセチル−
２−アゼチジノン誘導体を或る種の微生物が産生する特
定のNADPオキシドリダクターゼの存在下に酵素的に変更
して下記式式中、 R¹及びR²は同一もしくは相互なり、各々水素原子、低級
アルキル基、フエニル基、ベンジル基又はジフエニルメ
チル基を表わすか、或いはR¹とR²は一緒になって低級ア
ルキレン基を表わし；Ｚは水素原子又はアミノ保護基を表わす、で示される光学活性の（3S,4S）−３−［（1R）−１−
ヒドロキシエチル］−２−アゼチジノン誘導体を高収率
で製造する方法に関する。

上記式（Ｉ）の化合物は（6S）−［（1R）−１−ヒド
ロキシエチル］基を有するカルバペネム系、ペネム系等
の各種のβ−ラクタム系抗菌性化合物の製造のための合
成中間体として有用である。

従来、光学活性の３−（１−ヒドロキシエチル）−２
−アゼチジノン誘導体の製造法としていくつかの方法が
提案されており、中には３−アセチル−２−アゼチジノ
ン誘導体を微生物還元して光学活性の３−（１−ヒドロ
キシエチル）−２−アゼチジノン誘導体に導く方法も提
案されている（例えば特開昭61−141894号及びテトラヘ
ドロンレタース、30巻、1107−1110ページ（1989）参
照）。しかしこの従来提案されている微生物還元法は、
ラセミの（3,4−トランス）−３−アセチル−４−エチ
ニル−２−アゼチジノン化合物（下記式Ａ）を基質とし
て用いているため、生成物は選択性に乏しく立体異性体
の混合物として得られ、それらの化合物を単離するには
クロマトグラフイーを必要とし実用的とは言えない。

一方、現在カルバペネム及びペネム抗生物質の分野に
おいて所望されている中間体はイミペネム（ジヤーナル
・オブ・メデイシヨナル・ケミストリイー、22巻、1435
−1436ページ、1979年）、RS−533（ジヤーナル・オブ
・アンテイビオテイクス、36巻、1034−1039ページ1983
年）FCE22101（ジヤーナル・オブ・アンテイビオテイク
ス、41巻、984−987ページ、1988年）等と同様の立体配
置を持つ化合物すなわち（3S）−（3,4−トランス）−
３−［（1R）−１−ヒドロキシエチル］−２−アゼチジ
ノン型化合物、例えば化合物Ｄ（下記式）である。

特開昭61−141894号公報には下記式Ａで示される化合
物の微生物還元について開示されており、そこに記載さ
れている微生物十数株のうち、この立体化学を有する化
合物を与える菌株はSaccharomyces roseiとSaccharomyc
es fermentatiの２株のみであり、他の全ての菌株は中
間体として利用できない3Rの立体化学を有する化合物に
変換されている。更に上記２株についてみても、下記の
ごとく３種類の立体異性体を下記の比率で与えるため所
望する立体化学を有する化合物Ｄは50％以下である。
（1R）−１−ヒドロキシ体（化合物Ｄ）と（1S）−１−
ヒドロキシ体（化合物Ｃ）の選択性の良い菌（Saccharo
myces rosei）においてもその生成比は3:2であり、立体
選択性に乏しいという欠点がある。

本発明者らは、前記式（Ｉ）で示される光学活性の
（3S,4S）−３−［（1R）−１−ヒドロキシエチル］−
２−アゼチジノン誘導体を高純度で収率よく製造するた
めの方法につき鋭意研究を行なった結果、今回、対応す
る（3S,4S）−３−アセチル−２−アゼチジノン誘導体
を、ストレプトミセス・オオミヤエンシス（Streptomyc
es omiyaensis）に属する或る種の微生物を用いて還元
すると、前記式（Ｉ）で示される立体配置をもつ化合物
が特異的に高純度かつ好収率で生成することを見い出
し、さらに上記還元反応は該微生物が産生する新規な
（3S,4S）−３−アセチル−２−アゼチジノンNADPオキ
シドリダクターゼによるものであることが判明し、本発
明を完成するに至った。

かくして、本発明によれば、式式中、 R¹及びR²は同一もしくは相異なり、各々水素原子、低級
アルキル基、フエニル基、ベンジル基又はジフエニルメ
チル基を表わすか、或いはR¹とR²は一緒になって低級ア
ルキレン基を表わし；Ｚは水素原子又はアミノ保護基を表わす、で示される（3S,4S）−３−アセチル−２−アゼチジノ
ン誘導体を、ストレプトミセス・オオミヤエンシスに属
する微生物が産生する（3S,4S）−３−アセチル−２−
アゼチジノンNADPオキシドリダクターゼの存在下に還元
することを特徴とする式式中、R¹、R²及びＺは前記の意味を有する、で示され
る光学活性の（3S,4S）−３−［（1R）−１−ヒドロキ
シエチル］−２−アゼチジノン誘導体の製造方法が提供
される。

本明細書において「低級」なる語は、この語が付され
た基又は化合物の炭素数が６以下、好ましくは４以下で
あることを意味する。

「低級アルキル基」は直鎖状又は分岐鎖状のいずれの
タイプのものであってもよく、例えば、メチル、エチ
ル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、sec−
ブチル、イソブチル、tert−ブチル、ｎ−ペンチル、イ
ソアミル、ｎ−ヘキシル等が挙げられ、また「低級アル
キレン基」もまた直鎖状又は分岐鎖状のいずれのタイプ
のものであってもよく、例えば、テトラメチレン、ペン
タメチレン、２−メチルブチレン等が挙げられ、特に炭
素数４〜５のものが好適である。

一方、「アミノ保護基」は、該アミノ保護基が結合し
ている化合物の他の部分に実質的に悪影響を及ぼすこと
なく、例えば加水分解、還元、酸化等の方法で離脱しう
る保護基を包含し、具体的には例えば、トリメチルシリ
ル、tert−ブチルジメチルシリルなどのトリ（低級アル
キル）シリル基；ベンジル、メトキシベンジル、ジメト
キシベンジルなどの１〜２個の低級アルコキシ基で置換
されていてもよいベンジル基；メトキシフエニル、ジメ
トキシフエニルなどの１〜２個の低級アルコキシ基で置
換されていてもよいフエニル基等が挙げられる。

本発明の方法において出発原料として使用される前記
式（Ｉ）の化合物はそれ自体既知のものであり（例え
ば、特開昭63−156788号公報参照）、その代表例を示せ
ば次のとおりである。

（3S,4S）−３−アセチル−４−［（4S）−2,2−ジメ
チル−1,3−ジオキソラン−４−イル］−１−（４−メ
トキシ）フエニル−２−アゼチジノン、（3S,4S）−３−アセチル−１−ベンジル−４−［（4
S）−2,2−ジメチル−1,3−ジオキソラン−４−イル］
−２−アゼチジノン、（3S,4S）−３−アセチル−１−（2,4−ジメトキシ）
フエニル−４−［（4S）−2,2−ジメチル−1,3−ジオキ
ソラン−４−イル］−２−アゼチジノン、（3S,4S）−３−アセチル−１−（４−メトキシ）ベ
ンジル−４−［（4S）−2,2−ジメチル−1,3−ジオキソ
ラン−４−イル］−２−アゼチジノン、（3S,4S）−３−アセチル−４−［（4S）−2,2−ジメ
チル−1,3−ジオキソラン−４−イル］−１−トリメチ
ルシリル−２−アゼチジノン、（3S,4S）−３−アセチル−１−（2,4−ジメトキシ）
ベンジル−４−［（4S）−２−フエニル−1,3−ジオキ
ソラン−４−イル］−２−アゼチジノン、（3S,4S）−３−アセチル−４−［（4S）−2,2−ジフ
エニル−1,3−ジオキソラン−４−イル］−１−（４−
メトキシ）フエニル−２−アゼチジノン、（3S,4S）−３−アセチル−４−［（4S）−1,3−ジオ
キソラン−４−イル］−１−（４−メトキシ）フエニル
−２−アゼチジノン、（3S,4S）−３−アセチル−４−［（4S）−2,2−ジメ
チル−1,3−ジオキソラン−４−イル］−１−tert−ブ
チルジメチルシリル−２−アゼチジノン、（3S,4S）−３−アセチル−１−ベンジル−４−［（4
S）−２−フエニル−1,3−ジオキソラン−４−イル］−
２−アゼチジノン、（3S,4S）−３−アセチル−１−（４−メトキシ）フ
エニル−４−［（2S）−1,4−ジオキサスピロ［4.5］デ
カン−２−イル］−２−アゼチジノン、（3S,4S）−３−アセチル−１−（４−メトキシ）フ
エニル−４−［（2S）−1,4−ジオキサスピロ［4.4］ノ
ナン−２−イル−２−アゼチジノン、（3S,4S）−３−アセチル−１−ベンジル−４−［（2
S）−1,4−ジオキサスピロ［4.5］デカン−２−イル］
−２−アゼチジノン、（3S,4S）−３−アセチル−４−［（4S）−2,2−ジメ
チル−1,3−ジオキソラン−４−イル］−２−アゼチジ
ノン、（3S,4S）−３−アセチル−４−［（4S）−２−フエ
ニル−1,3−ジオキソラン−４−イル］−２−アゼチジ
ノン、（3S,4S）−３−アセチル−４−［（4S）−1,3−ジオ
キソラン−４−イル］−２−アゼチジノン、（3S,4S）−３−アセチル−４−［（2S）−1,4−ジオ
キサスピロ［4.5］デカン−２−イル］−２−アゼチジ
ノン、（3S,4S）−３−アセチル−４−［（2S）−1,4−ジオ
キサスピロ［4.4］ノナン−２−イル］−２−アゼチジ
ノン。

本発明の方法に従い上記式（Ｉ）の化合物を還元する
に際して使用されるストレプトミセス・オオミヤエンシ
ス（Strepromyces omiyaensis）に属する菌株の代表的
なものとしては、本発明者らが熊本県八代市の土壌より
分離した新規な放射菌で、本発明者らがＷ−4028菌株と
番号を付した菌株が挙げられる。このＷ−4028菌株の菌
学的性状は次のとおりである、（１）形態良く分岐した基中菌糸より直状〜曲状（straight−fl
exuous）の気菌糸を伸長し、輪生は認められない。成熟
した気菌糸の先に10〜50個あるいは、それ以上の楕円〜
円筒形の胞子からなる胞子鎖を形成する。胞子のうは認
められない。胞子の大きさは0.8−1.0×1.5ミクロン位
で、胞子の表面は平滑であり、鞭毛は認められない。

（２）各種培地における生育状態培養はすべて28℃で行った。色調の記載はコンティナ
ー・コーポレーション・オブ・アメリカのカラー・ハー
モニー・マニュアル（container corporation of Ameri
caのcolor harmony manual）の（）内に示す符号で表示
する。

１）イースト・麦芽寒天培地生育は良好で、成熟した気菌糸は中灰色（ｅ）を呈
し、多くの連鎖した胞子を着生する。溶解生色素は認め
られない。

２）スターチ・寒天培地生育は良好で、多くの気菌糸と胞子を着生し、コロニ
ー表面の色は明るい灰色（ｄ）であり、溶解生色素の生
成はない。

３）ペプトン・イースト・アイロン寒天培地生育は中程度であるが、気菌糸、胞子は多く形成しコ
ロニー表面の色は明るい灰色（ｄ）である。メラノイド
色素の生成は認められない。

（３）各種炭素源の同化性ブリードハム・ゴトリーブ寒天培地を使用した。

１）Ｌ−アラビノース − ２）Ｄ−キシロース＋３）Ｄ−グルコース＋４）Ｄ−フラクトース − ５）シユークロース − ６）イノシトール − ７）Ｌーラムノース ± ８）ラフイノース − ９）Ｄ−マンニトール − ＋は同化する、−は同化しない、±は不定（４）細胞壁成分の性状細胞を加水分解したものをセルロースの薄層クロマト
グラフイーによって分析したところ、本菌の細胞壁成分
のジアミノピメリン酸（diaminopimelic acid）の異性
体型はLL−型であり、糖成分には特徴が無かった。

以上の菌学的性質から本菌はストレプトミセス（Stre
ptomyces）属の菌であることは明確であり、インターナ
シヨナル・ジヤーナル・オブ・システマテイツク・バク
テリオロジー、22巻、４号1972（International Journa
l of Systematic Bacteriology,Vol.22,No.4,1972）で
インターナシヨナル・ストレプトミセス・プロジエクト
（International Streptomyces Project）で承認したス
トレプトミセス（Streptomyces）属株の記載性状と比較
したところストレプトミセス・オオミヤエンシス（Stre
ptomyces omiyaensis）とＬ−ラムノースの同化性が疑
わしい以外は、ほぼ一致した性状を示した。

本菌株はストレプトミセス・オオミヤエンシスＷ−40
28（Streptomyces cmiyaensis w−4028）として通商産
業省工業技術院微生物工業技術研究所に平成２年１月22
日にFERM Ｐ−11210の番号で受託されている。

本発明で使用しうる菌株は上記Ｗ−4028菌株に限られ
るものではなく、本菌株と同様の酵素活性を示す（3S,4
S）−３−アセチル−２−アゼチジノンNADPオキシドリ
ダクターゼを産生する他の菌株も使用可能である。その
ような菌株の検索は、通常の方法で行なうことができ、
例えば、土壌より分離した菌を菌が生育しうる適当な培
地で１〜数日間培養する。この培養液に式（II）で示さ
れる（3S,4S）−３−アセチル−２−アゼチジノン誘導
体を加え数時間〜数十時間培養を続けた後、培養液を有
機溶媒で抽出し、その抽出液を薄層クロマトグラフイー
高速液体クロマトグラフイーに付し、それらの生成物を
確認することにより所望の菌株を検索することができ
る。

本発明で用いうるストレプトミセス・オオミヤエンシ
スの菌株の培養は放線菌の培養におけるそれ自体既知の
方法で行なうことができる。培地組成として例えば、炭
素源としては、グルコース、水飴、デキストリン、グリ
セロール、澱粉、糖蜜、動・植物油等を使用しうる。ま
た、窒素源としては、大豆粉、小麦胚芽、コーン・ステ
ィープ・リカー、綿実粕、肉エキス、ペプトン、酵母エ
キス、硫酸アンモニウム、硝酸ナトリウム、尿素等を使
用しうる。その他必要に応じ、ナトリウム、カリウム、
カルシウム、マグネシウム、コバルト、塩素、燐酸、硫
酸およびその他のイオンを生成することができる無機塩
類を添加することは有効である。そのような培地組成の
１例を挙げると次のとおりである：グリセロール2.5
％、肉エキス0.5％、ポリペプトン0.5％、酵母エキス１
％、塩化ナトリウム0.2％、硫酸ナトリウム・７水和物
0.05％、リン酸ニカリウム0.05％、沈降性炭酸カルシウ
ム0.32％、消泡剤0.05％（pH7.4）。

培養は好気的条件で行うことができ、培養に適当な温
度は25〜30℃であるが、多くの場合28℃付近である。ま
た、培養時間は通常１〜５日間であり、一般に振盪培養
を行う。

上記の如く培養して得られる菌体は、本発明の反応に
対してそのまま生菌体として又は乾燥菌体として使用す
ることができ、或いは該菌体を例えば超音波破砕、フレ
ンチプレス、ダイノミル等の方法で細胞膜を破砕した
もの；或いはアセトン、メタノール等の有機溶媒処理、
界面活性剤処理、細胞壁溶解酵素処理などの処理を施し
たものなどの菌体処理物又はそれからそれ自体既知の手
段で分離した粗酵素もしくは精製酵素の形で本発明の方
法に用いることもできる。また、上記菌体、その処理
物、酵素等は例えばポリアクリルアミド、アルギン酸塩
等に固定化して使用することもできる［以下、これらを
総称して菌体又はその処理物という］。

本発明の方法は、前述した式（II）の化合物を基質と
し、上記の菌体又はその処理物の存在下に還元反応する
ことにより行われる。この還元反応は、式（II）の化合
物に前述の如く培養して得られる生菌体を含む培養液を
加えて行なうことができ、或いは適当な緩衝液のような
水性媒体中で式（II）の化合物を上記の菌体又はその処
理物と接触させることによって行なうことができる。

反応温度は一般に約20〜35℃、好ましくは約25〜30℃
の範囲内とすることができ、また、反応系のpHは通常５
〜９、好ましくは６〜８の範囲内とすることができる。
基質の添加時期としては菌の増殖期が適当である。かか
る条件下に反応は大体３〜48時間程度で終るようにする
ことができる。

反応混合物からの前記式（Ｉ）の目的生成物の分離、
精製はそれ自体既知の方法、例えばトルエン、エーテ
ル、クロロホルム、酢酸エチル、酢酸ブチル等の溶媒で
抽出後に結晶化又はシリカゲルクロマトグラフイー等の
処理に付すことにより行なうことができる。

以上延べた方法によれば、原料の（3S,4S）−３−ア
セチル−２−アゼチジノン誘導体が通常80％以上の変換
率で（3S,4S）−３−（１−ヒドロキシエチル）−２−
アゼチジノン誘導体に変換され、そのうちの殆んど、例
えば90％以上が（3S,4S）−３−［（1R）−１−ヒドロ
キシエチル］−２−アゼチジノン誘導体であり、（3S,4
S）−３−［（1S）−１−ヒドロキシエチル］−２−ア
ゼチジノン誘導体は僅か数％以下にすぎず、光学活性の
（3S,4S）−３−［（1R）−１−ヒドロキシエチル］−
２−アゼチジノン誘導体が極めて高純度で得られる。

本発明の方法で製造しうる前記式（Ｉ）の化合物の具
体例を示せば次のとおりである。

（3S,4S）−４−［（4S）−2,2−ジメチル−1,3−ジ
オキソラン−４−イル］−３−［（1R）−１−ヒドロキ
シエチル］−１−（４−メトキシ）フエニル−２−アゼ
チジノン、（3S,4S）−１−ベンジル−４−［（4S）−2,2−ジメ
チル−1,3−ジオキソラン−４−イル］−３−［（1R）
−１−ヒドロキシエチル］−２−アゼチジノン、（3S,4S）−１−（2,4−ジメトキシ）フエニル−３−
［（1R）−１−ヒドロキシエチル］−４−［（4R）−２
−フエニル−1,3−ジオキソラン−４−イル］−２−ア
ゼチジノン、（3S,4S）−４−［（4S）−1,3−ジオキソラン−４−
イル］−３−［（1R）−１−ヒドロキシエチル］−１−
（４−メトキシ）ベンジル−２−アゼチジノン、（3S,4S）−４−［（4S）−2,2−ジメチル−1,3−ジ
オキソラン−４−イル］−３−［（1R）−１−ヒドロキ
シエチル］−１−トリメチルシリル−２−アゼチジノ
ン、（3S,4S）−１−（2,4−ジメトキシ）ベンジル−３−
［（1R）−１−ヒドロキシエチル］−４−［（4S）−２
−フエニル−1,3−ジオキソラン−４−イル］−２−ア
ゼチジノン、（3S,4S）−４−［（4S）−2,2−ジフエニル−1,3−
ジオキソラン−４−イル］−３−［（1R）−１−ヒドロ
キシエチル］−１−（４−メトキシ）フエニル−２−ア
ゼチジノン、（3S,4S）−４−［（4S）−1,3−ジオキソラン−４−
イル］−３−［（1R）−１−ヒドロキシエチル］−１−
（４−メトキシ）フエニル−２−アゼチジノン、（3S,4S）−４−［（4S）−2,2−ジメチル−1,3−ジ
オキソラン−４−イル］−１−tert−ブチルジメチルシ
リル−３−［（1R）−１−ヒドロキシエチル］−２−ア
ゼチジノン、（3S,4S）−１−ベンジル−３−［（1R）−１−ヒド
ロキシエチル］−４−［（4R）−２−フエニル−1,3−
ジオキソラン−４−イル］−２−アゼチジノン、（3S,4S）−３−［（1R）−１−ヒドロキシエチル］
−１−（４−メトキシ）フエニル−４−［（2S）−1,4
−ジオキサスピロ［4.5］デカン−２−イル］−２−ア
ゼチジノン、（3S,4S）−３−［（1R）−１−ヒドロキシエチル］
−１−（４−メトキシ）フエニル−４−［（2R）−1,4
−ジオキサスピロ［4.4］ノナン−２−イル］−２−ア
ゼチジノン、（3S,4S）−１−ベンジル−３−［（1R）−１−ヒド
ロキシエチル］−４−［（2R）−1,4−ジオキサスピロ
［4.5］デカン−２−イル］−２−アゼチジノン、（3S,4S）−４−［（4S）−2,2−ジメチル−1,3−ジ
オキソラン−４イル］−３−［（1R）−１−ヒドロキシ
エチル］−２−アゼチジノン、（3S,4S）−３−［（1R）−１−ヒドロキシエチル］
−４−［（4S）−２−フエニル−1,3−ジオキソラン−
４−イル］−２−アゼチジノン、（3S,4S）−４−［（4S）−1,3−ジオキソラン−４−
イル］−３−［（1R）−１−ヒドロキシエチル］−２−
アゼチジノン、（3S,4S）−４−［（2S）−1,4−ジオキサスピロ［4.
5］デカン−２−イル］−２−アゼチジノン、（3S,4S）−４−［（2S）−1,4−ジオキサスピロ［4.
4］ノナン−２−イル］−３−［（1R）−１−ヒドロキ
シエチル］−２−アゼチジノン。

上記式（Ｉ）の化合物は、前述したとおりβ−ラクタ
ム系抗菌性化合物の合成中間体として有用であり、例え
ば、下記反応式に示す経路を経て抗菌剤として知られて
いるホルムイミドイルチエナマイシン（イミペネム）に
導くことができる。

次に実施例を掲げて本発明をさらに具体的に説明す
る。

実施例１ 300mlエルレンマイヤーフラスコ15個に下記組成物の
培地を各50ml分注し、滅菌した（オートクレーブ、121
℃、15分間）後、ストレプトミセス・オオミヤエンシス
Ｗ−4028を植菌して28℃で24時間培養した。

［培地組成］グリセロール 25g/ 肉エキス 5g/ ポリペプトン 10g/ 酵母エキス 10g/ 塩化ナトリウム 2g/ 硫酸マグネシウムｔ水和物 0.5g/ リン酸二カルシウム 0.5g/ 沈降性炭酸カルシウム 3.2g/ 消泡剤 0.5g/ pH7.4に調整一方、100mg/mlの（3S,4S）−３−アセチル−４−
［（1S）−2,2−ジメチル−1,3−ジオキソラン−４−イ
ル］−１−（４−メトキシフエニル）−２−アゼチジノ
ンのクロロホルム溶液を500mlエルレンマイヤーフラス
コ４個に各1ml加え、（3S,4S）−３−アセチル−４−
［（1S）−2,2−ジメチル−1,3−ジオキソラン−４−イ
ル］−１−（４−メトキシフエニル）−２−アゼチジノ
ンが容器底部に薄膜状に残存するようにクロロホルムを
徐々に留去し、更には窒素ガスを吹きつけて完全に留去
した。

これに前記培養液を各250mlずつ加えて軽く振り混
ぜ、栓をして28℃で24時間振とうした（220rpm）。

その後各フラスコに酢酸ｎ−ブチルを各50ml加えて激
しく振とう混合した後、遠心分離を行った（2350rpm、1
0分間、10℃）。上層（酢酸ｎ−ブチル層）を分液し、
これを飽和食塩水で１回洗浄した。無水硫酸ナトリウム
で乾燥してこれを過した後、減圧下に溶媒を留去して
残留物約900mgを得た。これをシリカゲル35gを用いてカ
ラムクロマトグラフイーに付し、トルエン−酢酸エチル
（4:1v/v）流分より回収原料2.4mg、反応生成物333.9mg
を得た。

［TLCチエツク条件］トルエン：酢酸エチル＝1:1、UV検出Rf値‥基質:0.6
1、生成物:0.24 この反応生成物について、HPLC測定を行った。すなわ
ち、反応生成物1mgをとって、移動相1mlを加えて溶か
し、これより10μをカラムに注入した。

［HPLC測定条件］カラム:YMC−pack,A−312 ODS（6mmφ×150mm）カラム温度:20〜25℃の一定温度移動相：メタノール−0.01Mリン酸塩緩衝液（pH7.4）
＝45:55 流量:1.0ml/min 検出:UV254nm その結果、保留時間がおよそ19.3分及び20.4分の２つ
のピークが認められ、その比率は、前者：後者＝99.1:
0.9であった。

そこで次に、この２種の化合物をHPLCにて分取し、各
々について¹H−NMRスペクトルを測定し、特開昭63−156
788号公報の実施例５及び６のデータとの比較にょり、
主生成物（Retension Time≒19.3分）は（3S,4S）−３
−［（1R）−ヒドロキシエチル］−４−［（1S）−2,2
−ジメチル−1,3−ジオキソラン−４−イル］−１−
（４−メトキシフエニル）−２−アゼチジノンであり、
副生成物（保持時間≒20.4分）は（3S,4S）−３−［（1
S）−ヒドロキシエチル］−４−［（1S）−2,2−ジメチ
ル−1,3−ジオキソラン−４−イル］−１−（４−メト
キシフエニル）−２−アゼチジノンであることを確認し
た。

○ 主生成物（3S,4S）−３−［（1R）−ヒドロキシエ
チル］−４−［（1S）−2,2−ジメチル−1,3−ジオキソ
ラン−４−イル］−１−（４−メトキシフエニル）−２
−アゼチジノン¹ H−NMR（CDCl₃,400MHz）δ:1.32,1.38（ｓ×2,3H×2,O
CMe₂）,1.37（d,3H,J＝6Hz,C（２′）H₃）,2.31（brm.1
H,0H）,3.16（dd,1H,J＝2.2,6.6Hz,C（３）Ｈ）,3.78
（s,3H,Ph−OMe）,3.86（dd,1H,J＝6.6,8.2Hz,C
（５″）Ha）,4.09（dd,1H,J＝7.1,8.2Hz,C（５″）H
b）,4.19（m,2H,,C（４）H,C（１′）Ｈ）,4.50（m,1H,
J＝3.3,6.6,7.1Hz,C（４″）Ｈ）,6.86（d,2H,J＝8.8H
z,C（３）H,C（５）Ｈ）,7.34（d,2H,J＝8.8Hz,C
（２）H,C（６）Ｈ） ○ 副生成物（3S,4S）−３−［（1S）−ヒドロキシエ
チル］−４−［（1S）−2,2−ジメチル−1,3−ジオキソ
ラン−４−イル］−１−（４−メトキシフエニル）−２
−アゼチジノン¹ H−NMR（CDCl₃,400MHz）δ:1.32,1.38（ｓ×2,3H×2,O
CMe₂）,1.39（d,3H,J＝4.9Hz,C（２′）H₃）,2.34（br
m,1H,0H）,3.23（dd,1H,J＝2.2,5.5Hz,C（３）Ｈ）,3.7
8（s,3H,Ph−OMe）,3.78（dd,1H,J＝6.6,8.2Hz,C
（５″）Ha）,4.08（dd,1H,J＝2.8,3.9Hz,C（４）Ｈ）,
4.09（dd,1H,J＝6.6,8.2Hz,C（５″）Hb）,4.17（brm,1
H,C（１′）Ｈ）,4.50（td,1H,J＝3.3,6.6Hz,C（４″）
Ｈ）,6.86（d,2H,J＝8.8Hz,C（３）H,C（５）Ｈ）,
7.34（d,2H,J＝9.3Hz,C（２）H,C（６）Ｈ）実施例２実施例１と同様にして得られるストレプトミセス・オ
オミヤエンシスＷ−4028の培養４日後の培養液（300ml
エルレンマイヤーフラスコ中各50ml、４個）を試料と
する。これを遠心分離（3000rpm、10分）し、上清と菌
体とに分け、上清を試料とする。得られた菌体に上清
と同量の1/15Mリン酸緩衝液（pH6.8）を加えて懸濁し、
これから一部とって試料とする。その残りをフレンチ
・プレスに付し（1600psi、２回）、得られた液を遠心
分離（10000rpm、20分）して上清と不溶性画分に分け、
上清を試料とする。得られた不溶性画分に上清と同量
の1/15Mリン酸緩衝液（pH6.8）を加えて懸濁し、これを
試料とする。

基質（3S,4S）−３−アセチル−４−［（1S）−2,2−
ジメチル−1,3−ジオキソラン−４−イル］−１−（４
−メトキシフエニル）−２−アゼチジノンのクロロホル
ム溶液（100mg/ml）を試験管に12.5μずつ加え、基質
が試験管の底部に薄膜状に残存するようにクロロホルム
を徐々に留去し、更には減圧によって完全に留去した。
こうして用意した試験管に、先に用意した試料〜を
1mlずつ加え、栓をして28℃で18時間振とうした（220rp
m）。

その後各試験管に酢酸ｎ−ブチルを125μずつ加え
て振とう混合した後、遠心分離を行った（3000rpm、３
分）。上清（酢酸ｎ−ブチル層）から10μとって減圧
下に溶媒を留去し、移動相0.1ml加えて溶かし、これに
より10μカラムに注入してHPLC測定を行い、変換率及
び（1R）体と（1S）体の生成比を求めた。

HPLCの測定条件は実施例１に同じ。また、変換率は次
式により算出した。

実施例３実施例１と同様にして得られるストレプトミセス・オ
オミヤエンシスＷ−4028の培養４日後の培養液（300ml
エルレンマイヤーフラスコ中各50ml、15個）を遠心分離
（4000rpm、10分）し、上清と菌体に分ける（上清には
活性なし）。得られた菌体から50gとって、1/15Mリン酸
緩衝液（pH6.8）を加えて懸濁し、これをフレンチ・プ
レスに付した（1600psi、２回）。得られた液166mlを遠
心分離（5000rpm、20分）し、上清と不溶性画分に分け
る（上清には活性なし）。得られた不溶性画分に上清と
同量の1/15Mリン酸緩衝液（pH6.8）を加えて懸濁液とし
た（検鏡によって細胞破砕を確認）。……懸濁液
（Ａ）。

この懸濁液（Ａ）5mlに、ｎ−オクチル−β−Ｄ−チ
オグルコシドの１％溶液（リン酸緩衝液希釈）5mlを加
え、10℃で２時間撹拌した。これを遠心分離（10000rp
m、20分）し、上清と不溶画分を分離した（上清には活
性なし）。得られた不溶画分に上清と同量の1/15Mリン
酸緩衝液（pH6.8）を加えて懸濁液とした……懸濁液
（Ｂ）基質（3S,4S）−３−アセチル−４−［（1S）−2,2−
ジメチル−1,3−ジオキソラン−４−イル］−１−（４
−メトキシフエニル）−２−アゼチジノンのクロロホル
ム溶液（100mg/ml）を試験管に12.5μずつ加え、基質
が試験管の底部に薄膜状に残存するようにクロロホルム
を徐々に留去し、更には減圧によって完全に留去した。
こうして用意した試験管に、以下のようにして調製した
試料1mlを加え（各条件２本ずつ）、栓をして28℃で14
時間振とうした（220rpm）。

１）コントロール（懸濁液（Ａ））２）コントロール（懸濁液（Ａ））、加熱処理（100
℃、5min）３）懸濁液（Ｂ）４）懸濁液（Ｂ）、β−NADPHの0.01M溶液添加（リン
酸緩衝液希釈、20μ）５）懸濁液（Ｂ）、加熱処理（100℃、5min）６）懸濁液（Ｂ）、加熱処理（100℃、5min）β−NAD
PHの0.01M溶液添加（リン酸緩衝液希釈、20μ）７）β−NADPHの0.01M溶液（リン酸緩衝液希釈）その後酢酸ｎ−ブチルを各試験管に125μずつ加え
て振とう混合した後、遠心分離を行った（3000rpm、３
分）。上清（酢酸ｎ−ブチル層）から10μとって減圧
下に溶媒を留去し、移動相0.1ml加えて溶かし、これよ
り10μカラムに注入してHPLC測定を行い、変換率を求
め、コントロール（懸濁液（Ａ））の活性を100とした
場合の各条件における相対比を求めた（各条件２本の平
均）。その結果を下記表に示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩ (Ｃ１２Ｎ 9/04 Ｃ１２Ｒ 1:465） (72)発明者柴本憲夫神奈川県茅ケ崎市松ケ丘２―２―52― 202 (72)発明者刀根弘神奈川県横浜市金沢区並木３―７―４― 1003 (72)発明者岡本六郎神奈川県藤沢市花の木２―18 (58)調査した分野(Int.Cl.⁶，ＤＢ名) C12P 17/00 - 17/18 C12N 9/04 C07D 405/04 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】式式中、 R¹及びR²は同一もしくは相異なり、各々水素原子、低級
アルキル基、フエニル基、ベンジル基又はジフエニルメ
チル基を表わすか、或いはR¹とR²は一緒になって低級アルキレン基を表わ
し；Ｚは水素原子又はアミノ保護基を表わす、で示される（3S,4S）−３−アセチル−２−アゼチジノ
ン誘導体をストレプトミセス・オオミヤエンシス（Stre
ptomyces omiyaensis）に属する微生物が産生する（3S,
4S）−３−アセチル−２−アゼチジノンNADPオキシドリ
ダクターゼの存在下に還元することを特徴とする式式中、R¹、R²及びＺは前記の意味を有する、で示される
（3S,4S）−３−［（1R）−１−ヒドロキシエチル］−
２−アゼチジノン誘導体の製造方法。