JP2856538B2 - 活性酸素を利用した物質の定量方法 - Google Patents
活性酸素を利用した物質の定量方法Info
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Description
本発明は、活性酸素の発生系に作用する物質の定量方
法に関し、特に生体中に存在するカタラーゼ等の酵素を
活性酸素の選択的な測定を利用して定量する方法に関す
る。
法に関し、特に生体中に存在するカタラーゼ等の酵素を
活性酸素の選択的な測定を利用して定量する方法に関す
る。
多くの生物は、酸素（3O2）を呼吸によって体内に取
り込んで生命を維持しており、酸素は生命活動にとって
不可欠のものである。ところが、地球誕生時には地球上
には現在の数千分の１ないし１万分の１程度の酸素が存
在していたのみであり、光合成により地球上の酸素が増
加する過程で酸素による生物体への障害についての防御
機能を獲得した生物が酸素を利用する能力を獲得して増
殖したといわれている。 生物が酸素や水を体内で利用できるのは、酵素の働き
によって生成する活性酸素が重要な役割を果たしてい
る。活性酸素は基質の酸化や各種の反応に利用されてい
るが、一方では活性酸素は極めて高い反応性を有してい
るために、生物体では活性酸素の濃度を必要以上に高め
ないような機能（酸素分圧調整）や、生成した活性酸素
を消去する防御機能によって酸素を安全に利用してい
る。 活性酸素には、スーパーオキサイドラジカル（O
2 -・）をはじめとして、ヒドロキシルラジカル（・O
H）、過酸化水素（H2O2）、１重項酸素（1O2）等がある
が、これらは、生体中での生化学的な反応に利用する以
外にも好中球による殺菌作用のような生体防御機能にお
いて重要な役割を果たしている。 活性酸素の代謝の一例を第９図に示すように、ヒポキ
サンチンはキサンチンオキシダーゼ（XOD）の作用によ
って、酸素と反応して活性酸素の１種であるユーパーオ
キサイドラジカル（O2 -・）を生成し、スーパーオキサ
イドラジカルは酸性条件下でH+を得て過酸化水素を生成
する。生成したキサンチンはさらにキサンチンオキシダ
ーゼ（XOD）の作用によって尿酸に酸化され、この過程
においても同様にスーパーオキサイドラジカルが生成す
る。 また、ヒドロキシルラジカル（・OH）は、スーパーオ
キサイドラジカル（O2 -・）によって生成した過酸化水
素と次のように金属イオンが触媒となって発生する。 Fe3+＋O2 -・→Fe2+＋O2 2O2 -・＋2H+→H2O2＋O2 Fe2+＋H2O2→Fe3+＋・OH＋OH- このような酸化酵素の作用による活性酸素の発生以外
にも、放射線、紫外線、過酸化物、金属イオン等の外的
な要因や、生体が受けるストレス、ショック、虚血等に
よっても生成し、活性酸素が過剰に生成すると生体に対
して悪影響を及ぼすことが明らかとなった。 著名な除草剤であるパラコートの毒性も活性酸素によ
って細胞の機能が破壊されることによるものであり、ま
たキノン系の制がん剤のようにがん細胞の増殖を活性酸
素の作用によって抑制するものも知られている。 さらに、活性酸素の量とある種の疾患とが有意の関係
を有することも明らかにされ、活性酸素の量の測定によ
って各種の疾患の早期発見および経過の把握が可能なこ
とが報告されており、活性酸素の発生系に存在する物質
を正確に測定する方法の開発が望まれている。
り込んで生命を維持しており、酸素は生命活動にとって
不可欠のものである。ところが、地球誕生時には地球上
には現在の数千分の１ないし１万分の１程度の酸素が存
在していたのみであり、光合成により地球上の酸素が増
加する過程で酸素による生物体への障害についての防御
機能を獲得した生物が酸素を利用する能力を獲得して増
殖したといわれている。 生物が酸素や水を体内で利用できるのは、酵素の働き
によって生成する活性酸素が重要な役割を果たしてい
る。活性酸素は基質の酸化や各種の反応に利用されてい
るが、一方では活性酸素は極めて高い反応性を有してい
るために、生物体では活性酸素の濃度を必要以上に高め
ないような機能（酸素分圧調整）や、生成した活性酸素
を消去する防御機能によって酸素を安全に利用してい
る。 活性酸素には、スーパーオキサイドラジカル（O
2 -・）をはじめとして、ヒドロキシルラジカル（・O
H）、過酸化水素（H2O2）、１重項酸素（1O2）等がある
が、これらは、生体中での生化学的な反応に利用する以
外にも好中球による殺菌作用のような生体防御機能にお
いて重要な役割を果たしている。 活性酸素の代謝の一例を第９図に示すように、ヒポキ
サンチンはキサンチンオキシダーゼ（XOD）の作用によ
って、酸素と反応して活性酸素の１種であるユーパーオ
キサイドラジカル（O2 -・）を生成し、スーパーオキサ
イドラジカルは酸性条件下でH+を得て過酸化水素を生成
する。生成したキサンチンはさらにキサンチンオキシダ
ーゼ（XOD）の作用によって尿酸に酸化され、この過程
においても同様にスーパーオキサイドラジカルが生成す
る。 また、ヒドロキシルラジカル（・OH）は、スーパーオ
キサイドラジカル（O2 -・）によって生成した過酸化水
素と次のように金属イオンが触媒となって発生する。 Fe3+＋O2 -・→Fe2+＋O2 2O2 -・＋2H+→H2O2＋O2 Fe2+＋H2O2→Fe3+＋・OH＋OH- このような酸化酵素の作用による活性酸素の発生以外
にも、放射線、紫外線、過酸化物、金属イオン等の外的
な要因や、生体が受けるストレス、ショック、虚血等に
よっても生成し、活性酸素が過剰に生成すると生体に対
して悪影響を及ぼすことが明らかとなった。 著名な除草剤であるパラコートの毒性も活性酸素によ
って細胞の機能が破壊されることによるものであり、ま
たキノン系の制がん剤のようにがん細胞の増殖を活性酸
素の作用によって抑制するものも知られている。 さらに、活性酸素の量とある種の疾患とが有意の関係
を有することも明らかにされ、活性酸素の量の測定によ
って各種の疾患の早期発見および経過の把握が可能なこ
とが報告されており、活性酸素の発生系に存在する物質
を正確に測定する方法の開発が望まれている。
これまで行われてきた活性酸素の発生系に存在する物
質の測定方法は、非酵素的な自動酸化反応を利用する方
法、酸素産生酵素反応を利用する方法、活性酸素による
還元反応を利用する方法などが用いられていたが、いず
れの方法も各種の試薬による処理の後に、得られた呈色
を比色分析法によって測定することが行われていた。 例えば、第９図に示すヒポキサンチンがキサンチンオ
キシダーゼによって酸化される過程で発生するスーパー
オキサイドラジカルをニトロブルーテトラゾリウム（NB
T）、チトクロームＣと反応させて得られるジホルマザ
ンと還元型チトクロームＣを比色分析によって定量する
方法が知られている。 また、過酸化水素を不均化する触媒として働くカタラ
ーゼの分析は、カタラーゼが過酸化水素を水と酸素に不
均化した量から過酸化水素の濃度をポーラログラフィー
のような電気化学的な手段、あるいは過酸化水素が酸性
溶液中において４価のチタンと反応して生成する過酸化
チタニウム複合体の吸光度を測定することにより測定し
ている。 ところが、このような従来の方法では、分析方法の選
択性が充分ではなく共存する酸化性の物質によって影響
を受けて測定値が不正確なものとなったり、あるいは比
色分析を行う際には、ヘモグロビンのような試料自身が
着色しているものを含む場合は正確な測定が困難であ
り、また試料の前処理に多くの処理を行うことが必要で
あるなどの問題があった。 本発明者らは、活性酸素の一種であるスーパーオキサ
イドおよびスーパーオキサイドディスムターゼを電子ス
ピン共鳴装置を使用して分析する方法について提案して
いるが、本発明は、活性酸素の発生系における反応物質
を高い選択性をもって定量する方法を提供するものであ
る。
質の測定方法は、非酵素的な自動酸化反応を利用する方
法、酸素産生酵素反応を利用する方法、活性酸素による
還元反応を利用する方法などが用いられていたが、いず
れの方法も各種の試薬による処理の後に、得られた呈色
を比色分析法によって測定することが行われていた。 例えば、第９図に示すヒポキサンチンがキサンチンオ
キシダーゼによって酸化される過程で発生するスーパー
オキサイドラジカルをニトロブルーテトラゾリウム（NB
T）、チトクロームＣと反応させて得られるジホルマザ
ンと還元型チトクロームＣを比色分析によって定量する
方法が知られている。 また、過酸化水素を不均化する触媒として働くカタラ
ーゼの分析は、カタラーゼが過酸化水素を水と酸素に不
均化した量から過酸化水素の濃度をポーラログラフィー
のような電気化学的な手段、あるいは過酸化水素が酸性
溶液中において４価のチタンと反応して生成する過酸化
チタニウム複合体の吸光度を測定することにより測定し
ている。 ところが、このような従来の方法では、分析方法の選
択性が充分ではなく共存する酸化性の物質によって影響
を受けて測定値が不正確なものとなったり、あるいは比
色分析を行う際には、ヘモグロビンのような試料自身が
着色しているものを含む場合は正確な測定が困難であ
り、また試料の前処理に多くの処理を行うことが必要で
あるなどの問題があった。 本発明者らは、活性酸素の一種であるスーパーオキサ
イドおよびスーパーオキサイドディスムターゼを電子ス
ピン共鳴装置を使用して分析する方法について提案して
いるが、本発明は、活性酸素の発生系における反応物質
を高い選択性をもって定量する方法を提供するものであ
る。
本発明は、活性酸素の発生する系における物質を、ス
ピントラップ剤によって安定ラジカル（スピンアダク
ト）として捕捉し、電子スピン共鳴装置（ESR）または
電子常磁性共鳴装置（EPR）を使用してスピンアダクト
として測定するものであるが、とくに測定対象物の作用
を抑制する選択性の大きな物質を使用して、抑制する物
質の添加の前後のスピンアダクトの測定値から測定対象
物の量を正確に把握する方法である。 本発明をカタラーゼの測定を例として説明すると、カ
タラーゼは 2H2O2→O2＋2H2O で示される過酸化水素を水と酸素に不均化する触媒とし
て作用する酵素としてよく知られている。 第１図に示すように、過酸化水素の不均化反応１は、
過酸化水素を基質２とした鉄などの金属イオン３により
活性酸素であるヒドロキシルラジカルの生成反応４と競
争反応の関係にある。 そして、過酸化水素から生じる活性酸素の量は、カタ
ラーゼの触媒作用による不均化反応によって減少した過
酸化水素の量に応じて減少するので、過酸化水素から生
じる活性酸素の測定値の減少した値からカタラーゼの量
を知ることが可能となる。 ところが、過酸化水素あるいは生成したヒドロキシル
ラジカル等の活性酸素と反応する各種の酵素等が存在し
ている可能性のある試料を測定する場合には、過酸化水
素から発生したスピンアダクトの測定値の減少部分を直
ちにカタラーゼの量として同定することはできない。そ
こで、このような試料の場合には、カタラーゼの作用を
選択的に阻害するアジド化合物（アジ化ナトリウム、ア
ミノトリアゾール）等を添加して、阻害する物質の添加
前の測定値と比較し、両者の測定結果からカタラーゼの
有無による活性酸素の生成量の差を測定することが必要
となる。 したがって、試料が生体物質のような各種の成分を含
んでいる場合には、カタラーゼ以外の活性酸素の生成を
抑制する物質あるいは生成した活性酸素を消去する物質
が存在していることが考えられるが、カタラーゼの作用
のみを阻害することができる選択性が高い物質を添加す
ることにより、カタラーゼによって減少した活性酸素の
量を正確に知ることが可能となる。 本発明の方法に使用する試薬等について説明すると、
活性酸素としてヒドロキシルラジカルを利用する場合に
は、過酸化水素と金属イオンとの反応を利用したフェン
トン反応などで発生させることができるが、金属イオン
としては硫酸第１鉄を等濃度のキレート化剤であるDETA
PAC（diethylene−triamine−pentaacetic−acid）に配
位させたものなどを使用して、過度にヒドロキシルラジ
カルが発生することを防止することが好ましい。 この反応によって生成するヒドロキシルラジカル（・
OH）は寿命が短く、また試料中に存在する各種の物質と
容易に反応するので、このままでは正確なラジカルの量
を電子スピン共鳴装置によって測定することが困難であ
るので、スピントラップ剤を添加して安定なスピンアダ
クトを得ている。 スピントラップ剤には、DMPO（5,5−dimethyl−１−p
yrroline−１−oxide）、DBNBS（3,5−dibromo−４−ni
troso−benzensulfonic acid sodium salt hydrate）、
PBN（α−phenyl−Ｎ−ｔ−buthylnitrone）等を使用す
ることができる。第２図には、これらによるスピンアダ
クトの発生の化学反応式を示すが、活性酸素と安定なラ
ジカルを生成するものであれば任意のスピントラップ剤
が使用可能である。 また、スピンアダクトの量は、TEMPOL（2,2,6,6−tet
ramethyl−４−hydroxyl−piperidine−１−oxyl）のよ
うな安定なラジカルを標準物質として測定する。 スピンアダクトの量の測定は、まず過酸化水素の濃度
を変化させた場合のスピンアダクトの量を測定して、過
酸化水素に関する検量線を作成し、つづいて過酸化水素
中へ添加するカタラーゼの濃度を変化させて、カタラー
ゼの量による検量線を作成し、得られた検量線に基づい
て測定すべき試料中のカタラーゼの量を測定する。 そして、試料が純物質ではなく生体成分のように測定
に影響を与える可能性を有する物質を含む場合には、試
料にアジ化ナトリウム、アミノトリゾール等のカタラー
ゼの触媒作用を阻害する物質を加えたものと加えないも
のとから得られる測定値を比較することにより、カタラ
ーゼによって減少したスピンアダクトの量を知ることが
でき、これから試料中のカタラーゼを定量することが可
能となる。 また、本発明の方法は、カタラーゼの定量に限らず、
基質から活性酸素を生成する反応に対して競争反応であ
る基質を不均化あるいは活性酸素の生成を抑制する物質
の測定に利用することができる。 また、基質については、活性酸素を生成するものであ
れば、酸素、過酸化水素等の過酸化物、ｔ−ブチルヒド
ロペルオキシド（ｔ−BuOOH）等の有機過酸化物等を使
用することができる。 そして、測定対象の物質には、カタラーゼとアジド化
合物（アジ化ナトリウム、アミノトリアゾール）等をあ
げることができ、測定に使用する試料は比色分析等で必
要な各種の前処理をする必要がなく、着色している試料
や浮遊物あるいは懸濁状態の試料であっても問題なく測
定することが可能である。
ピントラップ剤によって安定ラジカル（スピンアダク
ト）として捕捉し、電子スピン共鳴装置（ESR）または
電子常磁性共鳴装置（EPR）を使用してスピンアダクト
として測定するものであるが、とくに測定対象物の作用
を抑制する選択性の大きな物質を使用して、抑制する物
質の添加の前後のスピンアダクトの測定値から測定対象
物の量を正確に把握する方法である。 本発明をカタラーゼの測定を例として説明すると、カ
タラーゼは 2H2O2→O2＋2H2O で示される過酸化水素を水と酸素に不均化する触媒とし
て作用する酵素としてよく知られている。 第１図に示すように、過酸化水素の不均化反応１は、
過酸化水素を基質２とした鉄などの金属イオン３により
活性酸素であるヒドロキシルラジカルの生成反応４と競
争反応の関係にある。 そして、過酸化水素から生じる活性酸素の量は、カタ
ラーゼの触媒作用による不均化反応によって減少した過
酸化水素の量に応じて減少するので、過酸化水素から生
じる活性酸素の測定値の減少した値からカタラーゼの量
を知ることが可能となる。 ところが、過酸化水素あるいは生成したヒドロキシル
ラジカル等の活性酸素と反応する各種の酵素等が存在し
ている可能性のある試料を測定する場合には、過酸化水
素から発生したスピンアダクトの測定値の減少部分を直
ちにカタラーゼの量として同定することはできない。そ
こで、このような試料の場合には、カタラーゼの作用を
選択的に阻害するアジド化合物（アジ化ナトリウム、ア
ミノトリアゾール）等を添加して、阻害する物質の添加
前の測定値と比較し、両者の測定結果からカタラーゼの
有無による活性酸素の生成量の差を測定することが必要
となる。 したがって、試料が生体物質のような各種の成分を含
んでいる場合には、カタラーゼ以外の活性酸素の生成を
抑制する物質あるいは生成した活性酸素を消去する物質
が存在していることが考えられるが、カタラーゼの作用
のみを阻害することができる選択性が高い物質を添加す
ることにより、カタラーゼによって減少した活性酸素の
量を正確に知ることが可能となる。 本発明の方法に使用する試薬等について説明すると、
活性酸素としてヒドロキシルラジカルを利用する場合に
は、過酸化水素と金属イオンとの反応を利用したフェン
トン反応などで発生させることができるが、金属イオン
としては硫酸第１鉄を等濃度のキレート化剤であるDETA
PAC（diethylene−triamine−pentaacetic−acid）に配
位させたものなどを使用して、過度にヒドロキシルラジ
カルが発生することを防止することが好ましい。 この反応によって生成するヒドロキシルラジカル（・
OH）は寿命が短く、また試料中に存在する各種の物質と
容易に反応するので、このままでは正確なラジカルの量
を電子スピン共鳴装置によって測定することが困難であ
るので、スピントラップ剤を添加して安定なスピンアダ
クトを得ている。 スピントラップ剤には、DMPO（5,5−dimethyl−１−p
yrroline−１−oxide）、DBNBS（3,5−dibromo−４−ni
troso−benzensulfonic acid sodium salt hydrate）、
PBN（α−phenyl−Ｎ−ｔ−buthylnitrone）等を使用す
ることができる。第２図には、これらによるスピンアダ
クトの発生の化学反応式を示すが、活性酸素と安定なラ
ジカルを生成するものであれば任意のスピントラップ剤
が使用可能である。 また、スピンアダクトの量は、TEMPOL（2,2,6,6−tet
ramethyl−４−hydroxyl−piperidine−１−oxyl）のよ
うな安定なラジカルを標準物質として測定する。 スピンアダクトの量の測定は、まず過酸化水素の濃度
を変化させた場合のスピンアダクトの量を測定して、過
酸化水素に関する検量線を作成し、つづいて過酸化水素
中へ添加するカタラーゼの濃度を変化させて、カタラー
ゼの量による検量線を作成し、得られた検量線に基づい
て測定すべき試料中のカタラーゼの量を測定する。 そして、試料が純物質ではなく生体成分のように測定
に影響を与える可能性を有する物質を含む場合には、試
料にアジ化ナトリウム、アミノトリゾール等のカタラー
ゼの触媒作用を阻害する物質を加えたものと加えないも
のとから得られる測定値を比較することにより、カタラ
ーゼによって減少したスピンアダクトの量を知ることが
でき、これから試料中のカタラーゼを定量することが可
能となる。 また、本発明の方法は、カタラーゼの定量に限らず、
基質から活性酸素を生成する反応に対して競争反応であ
る基質を不均化あるいは活性酸素の生成を抑制する物質
の測定に利用することができる。 また、基質については、活性酸素を生成するものであ
れば、酸素、過酸化水素等の過酸化物、ｔ−ブチルヒド
ロペルオキシド（ｔ−BuOOH）等の有機過酸化物等を使
用することができる。 そして、測定対象の物質には、カタラーゼとアジド化
合物（アジ化ナトリウム、アミノトリアゾール）等をあ
げることができ、測定に使用する試料は比色分析等で必
要な各種の前処理をする必要がなく、着色している試料
や浮遊物あるいは懸濁状態の試料であっても問題なく測
定することが可能である。
本発明は、酸素または過酸化物を基質として発生する
活性酸素の発生系に活性酸素の発生を阻害もしくは該基
質を分解あるいは不均化する物質または該物質の作用を
阻害する物質を加えた後に、発生した活性酸素をスピン
トラップ剤によって捕捉したスピンアダクトの量を電子
スピン共鳴装置によって測定し、該基質を分解あるいは
不均化する物質または該物質の作用を阻害する物質を測
定することが可能である。
活性酸素の発生系に活性酸素の発生を阻害もしくは該基
質を分解あるいは不均化する物質または該物質の作用を
阻害する物質を加えた後に、発生した活性酸素をスピン
トラップ剤によって捕捉したスピンアダクトの量を電子
スピン共鳴装置によって測定し、該基質を分解あるいは
不均化する物質または該物質の作用を阻害する物質を測
定することが可能である。
以下に本発明の実施例を示し、さらに詳細に本発明を
説明する。 実施例１ 0.1mMに調整した硫酸第１鉄を等濃度のキレート化剤
であるDETAPAC（diethylene−triamine−pentaacetic−
acid）に配位させて得られたFe−DETAPACキレートと1mM
の過酸化水素を反応（フェントン反応）させ、生じるヒ
ドロキシルラジカル（・OH）を60mMに調整したDMPO、DB
NBSからなるスピントラップ剤によって捕捉しスピンア
ダクトを電子スピン共鳴装置によって測定した。 測定は日本電子（株）製電子スピン共鳴装置（JESRE1
X）を用い、磁場:3370±50G、磁場変調:100KHz、0.8G、
増幅比:100ないし500、応答時間:0.1秒、掃引時間:2分
の条件で測定した。 測定は上記の0.1mMのFe−DETAPACキレート溶液の75μ
ｌに50μｌの水を混合して、この溶液に60mMのDMPO、DB
NBSを加え、1mMの過酸化水素水の75μｌを加え、10秒間
撹拌した後に、水溶液用のセルに移し、40秒後に測定を
開始し、２分間で測定した。 第３図に、得られたDMPOおよびDBNBSをトラップ剤と
した場合のヒドロキシルラジカルのESRスペクトルを示
す。 そして、TEMPOL（2,2,6,6−tetramethyl−４−hydrox
yl−piperidine−１−oxyl）によって得られるESRスペ
クトルとの比較定量法によってスピンアダクトの量を求
めた。 この条件において、第４図に過酸化水素濃度を変化さ
せて得られたスピンアダクトの量を過酸化水素濃度を横
軸に相対信号強度を縦軸として示すが、過酸化水素濃度
と相対信号強度が比例関係にあることがわかる。 また、試料中にヒドロキシルラジカルの消去剤である
メタノール、ジメチルスルフォオキサイドの添加によっ
てスペクトルのピークが消失することから、DMPOおよび
DBNBSでヒドロキシルラジカルが測定されることが確か
められた。 次に、0.1mMのFe−DETAPACキレート溶液の75μｌにカ
タラーゼを2.8μＭないし1.5nMを加えて、この溶液に60
mMのDMPO、あるいはDBNBSを加え、1mMの過酸化水素水を
75μｌ加え、カタラーゼを添加しない場合と同様にして
ESRでヒドロキシルラジカルの量を測定したところ、ス
ピントラップ剤としてDMPOを使用した場合には第５図に
示すようなスペクトルが、またDBNBSを使用した場合に
は第６図に示すようなスペクトルがそれぞれ得られた。 DMPOを使った場合、このようにカタラーゼの添加量の
増大にともなってスピンアダクトの量が減少することが
確認できた。カタラーゼを添加しない場合のスペクトル
の信号強度I0とカタラーゼを添加した場合の信号強度Ｉ
から、相対信号強度（I0/I−１）を求め、相対信号強度
を縦軸に、横軸にはカタラーゼの濃度をとってプロット
したところ両者の関係を示す第７図が得られた。 この図からは、被検液中に添加したカタラーゼの量と
相対信号強度の間に、0.997371の相対係数が得られ、本
発明の方法によって活性酸素の発生系のカタラーゼの濃
度が測定可能であることが明らかである。 ところが、生体物質を被検液とする場合には、被検液
中にはヒドロキシルラジカルの消去能を有する多くの物
質が存在している可能性があるので、ヒドロキシルラジ
カルから生成したスピンアダクトのESRスペクトルの信
号強度の低下がカタラーゼによって過酸化水素が消費さ
れたことによるものか、あるいはヒドロキシルラジカル
が消費されたものであるのか否かを確認しなければなら
ない。 このためには、カタラーゼの機能を阻害する物質を加
えて、カタラーゼの機能の消去の前後における測定値か
ら被検液中のカタラーゼの濃度を測定することが必要と
なる。 カタラーゼの機能を阻害する物質としてアジド化合物
（アジ化ナトリウム、アミノトリアゾール）を加えれば
よい。 第８図には、あらかじめナトリウムアジドを0.1mM加
えた0.1mMのFe−DETAPACキレート溶液の75μｌに60mMの
DMPOと1mMの過酸化水素水を75μｌ加え、カタラーゼの
添加量を変化させた場合のカタラーゼ濃度の測定値の減
少割合を示すが、カタラーゼ濃度が0.02mM以下では完全
にカタラーゼの機能が阻害されたことが確認できた。
説明する。 実施例１ 0.1mMに調整した硫酸第１鉄を等濃度のキレート化剤
であるDETAPAC（diethylene−triamine−pentaacetic−
acid）に配位させて得られたFe−DETAPACキレートと1mM
の過酸化水素を反応（フェントン反応）させ、生じるヒ
ドロキシルラジカル（・OH）を60mMに調整したDMPO、DB
NBSからなるスピントラップ剤によって捕捉しスピンア
ダクトを電子スピン共鳴装置によって測定した。 測定は日本電子（株）製電子スピン共鳴装置（JESRE1
X）を用い、磁場:3370±50G、磁場変調:100KHz、0.8G、
増幅比:100ないし500、応答時間:0.1秒、掃引時間:2分
の条件で測定した。 測定は上記の0.1mMのFe−DETAPACキレート溶液の75μ
ｌに50μｌの水を混合して、この溶液に60mMのDMPO、DB
NBSを加え、1mMの過酸化水素水の75μｌを加え、10秒間
撹拌した後に、水溶液用のセルに移し、40秒後に測定を
開始し、２分間で測定した。 第３図に、得られたDMPOおよびDBNBSをトラップ剤と
した場合のヒドロキシルラジカルのESRスペクトルを示
す。 そして、TEMPOL（2,2,6,6−tetramethyl−４−hydrox
yl−piperidine−１−oxyl）によって得られるESRスペ
クトルとの比較定量法によってスピンアダクトの量を求
めた。 この条件において、第４図に過酸化水素濃度を変化さ
せて得られたスピンアダクトの量を過酸化水素濃度を横
軸に相対信号強度を縦軸として示すが、過酸化水素濃度
と相対信号強度が比例関係にあることがわかる。 また、試料中にヒドロキシルラジカルの消去剤である
メタノール、ジメチルスルフォオキサイドの添加によっ
てスペクトルのピークが消失することから、DMPOおよび
DBNBSでヒドロキシルラジカルが測定されることが確か
められた。 次に、0.1mMのFe−DETAPACキレート溶液の75μｌにカ
タラーゼを2.8μＭないし1.5nMを加えて、この溶液に60
mMのDMPO、あるいはDBNBSを加え、1mMの過酸化水素水を
75μｌ加え、カタラーゼを添加しない場合と同様にして
ESRでヒドロキシルラジカルの量を測定したところ、ス
ピントラップ剤としてDMPOを使用した場合には第５図に
示すようなスペクトルが、またDBNBSを使用した場合に
は第６図に示すようなスペクトルがそれぞれ得られた。 DMPOを使った場合、このようにカタラーゼの添加量の
増大にともなってスピンアダクトの量が減少することが
確認できた。カタラーゼを添加しない場合のスペクトル
の信号強度I0とカタラーゼを添加した場合の信号強度Ｉ
から、相対信号強度（I0/I−１）を求め、相対信号強度
を縦軸に、横軸にはカタラーゼの濃度をとってプロット
したところ両者の関係を示す第７図が得られた。 この図からは、被検液中に添加したカタラーゼの量と
相対信号強度の間に、0.997371の相対係数が得られ、本
発明の方法によって活性酸素の発生系のカタラーゼの濃
度が測定可能であることが明らかである。 ところが、生体物質を被検液とする場合には、被検液
中にはヒドロキシルラジカルの消去能を有する多くの物
質が存在している可能性があるので、ヒドロキシルラジ
カルから生成したスピンアダクトのESRスペクトルの信
号強度の低下がカタラーゼによって過酸化水素が消費さ
れたことによるものか、あるいはヒドロキシルラジカル
が消費されたものであるのか否かを確認しなければなら
ない。 このためには、カタラーゼの機能を阻害する物質を加
えて、カタラーゼの機能の消去の前後における測定値か
ら被検液中のカタラーゼの濃度を測定することが必要と
なる。 カタラーゼの機能を阻害する物質としてアジド化合物
（アジ化ナトリウム、アミノトリアゾール）を加えれば
よい。 第８図には、あらかじめナトリウムアジドを0.1mM加
えた0.1mMのFe−DETAPACキレート溶液の75μｌに60mMの
DMPOと1mMの過酸化水素水を75μｌ加え、カタラーゼの
添加量を変化させた場合のカタラーゼ濃度の測定値の減
少割合を示すが、カタラーゼ濃度が0.02mM以下では完全
にカタラーゼの機能が阻害されたことが確認できた。
本発明は、酸素または過酸化物を基質として発生する
活性酸素の発生系にカタラーゼのような基質を不均化し
活性酸素の発生量を低下させる物質を加え、活性酸素の
生成量をスピントラップ剤によって捕捉したスピンアダ
クトの量を電子スピン共鳴装置によって測定し、活性酸
素の発生量を低下させた物質を定量したり、あるいはさ
らに活性酸素の発生量を低下させる物質の機能を阻害す
るアジ化ナトリウム等を加えることにより、該機能を阻
害する物質の添加の前後における活性酸素の測定値の比
較から、カタラーゼのような基質を不均化する物質の量
を選択的に定量することを可能としたもので、活性酸素
と反応する物質を含む被検液から各種の前処理などを行
うことなく、着色している試料、浮遊物あるいは懸濁状
態の試料であっても問題なく測定することが可能であ
る。
活性酸素の発生系にカタラーゼのような基質を不均化し
活性酸素の発生量を低下させる物質を加え、活性酸素の
生成量をスピントラップ剤によって捕捉したスピンアダ
クトの量を電子スピン共鳴装置によって測定し、活性酸
素の発生量を低下させた物質を定量したり、あるいはさ
らに活性酸素の発生量を低下させる物質の機能を阻害す
るアジ化ナトリウム等を加えることにより、該機能を阻
害する物質の添加の前後における活性酸素の測定値の比
較から、カタラーゼのような基質を不均化する物質の量
を選択的に定量することを可能としたもので、活性酸素
と反応する物質を含む被検液から各種の前処理などを行
うことなく、着色している試料、浮遊物あるいは懸濁状
態の試料であっても問題なく測定することが可能であ
る。
第１図は、過酸化水素およびカタラーゼが関与する活性
酸素反応系での化学反応を示す図、第２図は、スピント
ラップ剤による活性酸素の捕捉の結果生じるスピンアダ
クトを示す化学反応式示す図、第３図は、DMPOおよびDB
NBSをトラップ剤とした場合のヒドロキシルラジカルのE
SRスペクトルを示し、第４図は、過酸化水素濃度を変化
させて得られたスピンアダクトの量を過酸化水素濃度を
横軸に相対信号強度を縦軸として示し、第５図は、スピ
ントラップ剤としてDMPOを使用して、カタラーゼの濃度
を測定したスペクトルを示し、第６図は、スピントラッ
プ剤としてDBNBSを使用して、カタラーゼの濃度を測定
したスペクトルを示し、第７図は、横軸にはカタラーゼ
の濃度をとって、相対信号強度を縦軸にとって、濃度と
相対信号強度の関係を示し、第８図は、アジ化ナトリウ
ムを0.1mM加えた場合のカタラーゼの測定値の変化を示
し、第９図は、活性酸素がが関与する物質の代謝を示す
図である。 １……過酸化水素の不均化反応、２……基質、３……金
属イオン、４……ヒドロキシルラジカルの生成反応
酸素反応系での化学反応を示す図、第２図は、スピント
ラップ剤による活性酸素の捕捉の結果生じるスピンアダ
クトを示す化学反応式示す図、第３図は、DMPOおよびDB
NBSをトラップ剤とした場合のヒドロキシルラジカルのE
SRスペクトルを示し、第４図は、過酸化水素濃度を変化
させて得られたスピンアダクトの量を過酸化水素濃度を
横軸に相対信号強度を縦軸として示し、第５図は、スピ
ントラップ剤としてDMPOを使用して、カタラーゼの濃度
を測定したスペクトルを示し、第６図は、スピントラッ
プ剤としてDBNBSを使用して、カタラーゼの濃度を測定
したスペクトルを示し、第７図は、横軸にはカタラーゼ
の濃度をとって、相対信号強度を縦軸にとって、濃度と
相対信号強度の関係を示し、第８図は、アジ化ナトリウ
ムを0.1mM加えた場合のカタラーゼの測定値の変化を示
し、第９図は、活性酸素がが関与する物質の代謝を示す
図である。 １……過酸化水素の不均化反応、２……基質、３……金
属イオン、４……ヒドロキシルラジカルの生成反応
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 蛋白質核酸酵素，33（16）（通巻425 号）（1988．12．10）ｐ．2693−2698 日本皮膚科学会雑誌，99（1989）ｐ. 163−166 Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏ ｌ．，94（1990）ｐ．227−229 (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) C12Q 1/30
Claims (2)
- 【請求項１】酸素または過酸化物を基質として発生する
活性酸素の発生系に、活性酸素発生系に作用して活性酸
素の発生の抑制または促進する物質を含む試料を添加
し、発生した活性酸素をスピントラップ剤によって捕捉
して生成したスピンアダクトの量を電子スピン共鳴装置
によって測定するとともに、試料中に活性酸素の発生系
に作用する物質の機能を阻害する物質を添加して同様に
測定して、両者の測定値の差から活性酸素の発生を抑制
または促進する物質を定量することを特徴とする活性酸
素を利用した物質の定量方法。 - 【請求項２】活性酸素の発生系が過酸化水素と金属イオ
ンによるヒドロキシルラジカルの発生系であり、活性酸
素の発生系に作用する物質がカタラーゼであることを特
徴とする請求項１記載の活性酸素を利用した物質の定量
方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP29839090A JP2856538B2 (ja) | 1990-11-02 | 1990-11-02 | 活性酸素を利用した物質の定量方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP29839090A JP2856538B2 (ja) | 1990-11-02 | 1990-11-02 | 活性酸素を利用した物質の定量方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH04169197A JPH04169197A (ja) | 1992-06-17 |
| JP2856538B2 true JP2856538B2 (ja) | 1999-02-10 |
Family
ID=17859085
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP29839090A Expired - Fee Related JP2856538B2 (ja) | 1990-11-02 | 1990-11-02 | 活性酸素を利用した物質の定量方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2856538B2 (ja) |
Families Citing this family (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP3231223B2 (ja) * | 1994-12-28 | 2001-11-19 | サントリー株式会社 | 電子スピン共鳴を用いた発酵酒の香味安定性判定法 |
| JPH11218507A (ja) * | 1998-02-03 | 1999-08-10 | Jeol Ltd | 電子スピン共鳴を用いた血漿の酸化還元状態判定法及び透析進行状況の判定法 |
| JP3955914B2 (ja) * | 2002-04-26 | 2007-08-08 | 敏一 吉川 | 生体レドックス均衡度の測定による抗酸化能の評価方法 |
| JP2006094735A (ja) * | 2004-09-29 | 2006-04-13 | Tohoku Univ | 抗アレルギー剤のスクリーニング法 |
| JP5357855B2 (ja) * | 2010-10-14 | 2013-12-04 | 株式会社エーゼット | 殺菌剤、口腔用殺菌剤、殺菌方法、殺菌装置および殺菌剤の評価方法 |
| US9504752B2 (en) | 2011-12-01 | 2016-11-29 | Az Co., Ltd. | Sterilizer, oral cavity sterilizer, sterilization method, sterilization apparatus, and sterilizer evaluation method |
| CN110632061B (zh) * | 2019-01-18 | 2022-01-14 | 长沙理工大学 | 一种氨基三唑的可视化比色检测方法 |
| CN113252756A (zh) * | 2020-02-12 | 2021-08-13 | 福建医科大学 | 基于牛血清白蛋白-二氧化钌纳米粒子构建的电化学分析方法检测细胞内过氧化氢 |
-
1990
- 1990-11-02 JP JP29839090A patent/JP2856538B2/ja not_active Expired - Fee Related
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．，９４（１９９０）ｐ．２２７−２２９ |
| 日本皮膚科学会雑誌，９９（１９８９）ｐ．１６３−１６６ |
| 蛋白質核酸酵素，３３（１６）（通巻４２５号）（１９８８．１２．１０）ｐ．２６９３−２６９８ |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH04169197A (ja) | 1992-06-17 |
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