JP2846433B2 - 薬剤スクリーニングアッセイ - Google Patents
薬剤スクリーニングアッセイInfo
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- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/74—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving hormones or other non-cytokine intercellular protein regulatory factors such as growth factors, including receptors to hormones and growth factors
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Description
【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明の技術分野は、天然レセプターへの化合物の結
合特性の測定である。
合特性の測定である。
多数の薬剤はレセプター化合物への結合に関係してお
り、例えば、シグナルが膜を通って変換され得、または
薬剤の有効濃度がレセプターへの結合により変更され、
またはレセプターとリガンドとの結合がアロステリック
的に変更され得る。大部分は、特定の部位への結合に最
適であろう空間のコンホメーションおよび電荷の分布を
限定する方法は現存しない。従って、ほとんどの薬剤設
計は、天然に結合する物質および効果的であることがわ
かっている現存の薬剤との比較、幾つかの分子モデル作
製、および様々な技術により提供されている他のいずれ
かの物理的または化学的洞察を必要とする。更に、入手
可能な多量の情報にもかかわらず、薬剤設計は多くの経
験的な面を有する。薬剤が何に似ているかを記述するの
にあらゆる識見を使い尽くした後、次に様々な化合物を
合成しそしてそれらの効力を測定することに向かう。加
えて、多数の化合物を製造するが、これは種々のアッセ
イが比較的高いコストであるためにスクリーニングされ
ない。従って、同様なリガンド係合親和性を有する化合
物を同定することができる方法を提供することに大きな
関心がある。この方法では、スクリーニングが迅速で、
効率的で且つ費用がかからないであろう。
り、例えば、シグナルが膜を通って変換され得、または
薬剤の有効濃度がレセプターへの結合により変更され、
またはレセプターとリガンドとの結合がアロステリック
的に変更され得る。大部分は、特定の部位への結合に最
適であろう空間のコンホメーションおよび電荷の分布を
限定する方法は現存しない。従って、ほとんどの薬剤設
計は、天然に結合する物質および効果的であることがわ
かっている現存の薬剤との比較、幾つかの分子モデル作
製、および様々な技術により提供されている他のいずれ
かの物理的または化学的洞察を必要とする。更に、入手
可能な多量の情報にもかかわらず、薬剤設計は多くの経
験的な面を有する。薬剤が何に似ているかを記述するの
にあらゆる識見を使い尽くした後、次に様々な化合物を
合成しそしてそれらの効力を測定することに向かう。加
えて、多数の化合物を製造するが、これは種々のアッセ
イが比較的高いコストであるためにスクリーニングされ
ない。従って、同様なリガンド係合親和性を有する化合
物を同定することができる方法を提供することに大きな
関心がある。この方法では、スクリーニングが迅速で、
効率的で且つ費用がかからないであろう。
米国特許第4,708,929号およびPCT/US/85−02095を参
照のこと。
照のこと。
天然リガンドまたは交差反応性化合物をβ−ガラクト
シダーゼの酵素供与体断片と接合することにより、天然
のタンパク様レセプターまたはそれのサブユニットへの
結合について化合物がスクリーニングされる。レセプタ
ーまたはアロステリック部位に結合するレセプターを目
当てに、接合体と実験化合物とが競争するようにするこ
とにより、酵素受容体をアッセイ媒質に添加した時に得
られる酵素活性に関連づけて、実験化合物の結合特性を
決定することができる。
シダーゼの酵素供与体断片と接合することにより、天然
のタンパク様レセプターまたはそれのサブユニットへの
結合について化合物がスクリーニングされる。レセプタ
ーまたはアロステリック部位に結合するレセプターを目
当てに、接合体と実験化合物とが競争するようにするこ
とにより、酵素受容体をアッセイ媒質に添加した時に得
られる酵素活性に関連づけて、実験化合物の結合特性を
決定することができる。
本発明によれば、レセプターの結合部位またはレセプ
ターのアロステリック部位への実験化合物の結合が、β
−ガラクトシダーゼの酵素供与体断片に共有結合したレ
セプター結合部位のためのリガンドの接合体を使うこと
により測定できることが発見された。酵素供与体断片と
接合されたリガンドへ結合する抗体と対比して、レセプ
ターへのリガンドの天然結合に類似した方法でレセプタ
ーが接合体のリガンドに結合することがわかった。リガ
ンドとレセプターとの間の高親和性および有意な接触数
のため、レセプターへの結合は、抗体へのリガンドの結
合とは異なると思われる。
ターのアロステリック部位への実験化合物の結合が、β
−ガラクトシダーゼの酵素供与体断片に共有結合したレ
セプター結合部位のためのリガンドの接合体を使うこと
により測定できることが発見された。酵素供与体断片と
接合されたリガンドへ結合する抗体と対比して、レセプ
ターへのリガンドの天然結合に類似した方法でレセプタ
ーが接合体のリガンドに結合することがわかった。リガ
ンドとレセプターとの間の高親和性および有意な接触数
のため、レセプターへの結合は、抗体へのリガンドの結
合とは異なると思われる。
レセプターの場合は、酵素受容体が複合体形成を妨げ
るかまたは酵素供与体と酵素受容体との複合体が活性に
なるのを妨げるかのいずれかにより、レセプターが酵素
活性を阻害するらしい。対して、抗体は、複合体形成の
速度をスローダウンさせると思われ、そのため複合体形
成が起こっている初期速度を測定することにより、接合
体のリガンドに結合した抗体の量を測定することができ
る。レセプターへのリガンドの天然結合のため、実験化
合物と接合体との間の競合において酵素活性を測定する
ことにより、潜在的アゴニストまたはアンタゴニストの
交差反応性を測定することができる。
るかまたは酵素供与体と酵素受容体との複合体が活性に
なるのを妨げるかのいずれかにより、レセプターが酵素
活性を阻害するらしい。対して、抗体は、複合体形成の
速度をスローダウンさせると思われ、そのため複合体形
成が起こっている初期速度を測定することにより、接合
体のリガンドに結合した抗体の量を測定することができ
る。レセプターへのリガンドの天然結合のため、実験化
合物と接合体との間の競合において酵素活性を測定する
ことにより、潜在的アゴニストまたはアンタゴニストの
交差反応性を測定することができる。
酵素受容体と共に活性酵素複合体を形成する際にβ−
ガラクトシダーゼの酵素供与体の活性に結合が影響を及
ぼすので、天然レセプターとそれのハプテンリガンドと
の結合と、抗体との結合とでは性質上違いがあると思わ
れる。レセプターとそれのハプテンリガンドとの結合の
強度並びにレセプターとそれのハプテンリガンドとの結
合の空間的関係は、酵素供与体の活性に関連づけること
ができる。このようにして、観察される酵素活性の変化
は、レセプターへのハプテンリガンドの結合の性質に関
連づけることができる。
ガラクトシダーゼの酵素供与体の活性に結合が影響を及
ぼすので、天然レセプターとそれのハプテンリガンドと
の結合と、抗体との結合とでは性質上違いがあると思わ
れる。レセプターとそれのハプテンリガンドとの結合の
強度並びにレセプターとそれのハプテンリガンドとの結
合の空間的関係は、酵素供与体の活性に関連づけること
ができる。このようにして、観察される酵素活性の変化
は、レセプターへのハプテンリガンドの結合の性質に関
連づけることができる。
加えて、アロステリック的に結合する実験化合物の酵
素活性に及ぼす効果を測定することにより、アロステリ
ック効果を測定することができる。ここでアロステリッ
ク効果とは、レセプターへのリガンドの結合を増加させ
るかまたは減少させることである。
素活性に及ぼす効果を測定することにより、アロステリ
ック効果を測定することができる。ここでアロステリッ
ク効果とは、レセプターへのリガンドの結合を増加させ
るかまたは減少させることである。
アッセイを実施する上で、実験化合物、酵素供与体−
リガンド接合体、リガンドレセプター、および他の試薬
をどんな順序で添加してもよい。ただし、通常、少なく
とも実験化合物と酵素供与体−リガンド接合体の反応の
開始が起こるよりも早くなく酵素受容体が添加されるだ
ろう。
リガンド接合体、リガンドレセプター、および他の試薬
をどんな順序で添加してもよい。ただし、通常、少なく
とも実験化合物と酵素供与体−リガンド接合体の反応の
開始が起こるよりも早くなく酵素受容体が添加されるだ
ろう。
好ましい態様によれば、実験化合物を適当な緩衝媒質
中でレセプターと混合し、そして少なくとも実質的に平
衡に近づくのに十分な時間、混合物をインキュベートす
る。この混合物に、リガンドと酵素供与体との接合体を
添加し、そして予め決められた温度で更にインキュベー
トする。第二のインキュベーション後、酵素受容体試薬
を添加し、次いで更にインキュベートし、そして酵素速
度を測定する。
中でレセプターと混合し、そして少なくとも実質的に平
衡に近づくのに十分な時間、混合物をインキュベートす
る。この混合物に、リガンドと酵素供与体との接合体を
添加し、そして予め決められた温度で更にインキュベー
トする。第二のインキュベーション後、酵素受容体試薬
を添加し、次いで更にインキュベートし、そして酵素速
度を測定する。
好ましい態様では、第一段階で緩衝媒質中での実験化
合物とレセプターとの混合である。通常、２つの成分の
濃度は、比較的短時間、通常約５〜60分、好ましくは５
〜30分以内に平衡に達するように選択される。温度は約
４℃〜40℃の範囲であり、便利には室温が使われるだろ
う。pHは通常約５〜13の範囲内であり、実験化合物と結
合性化合物との間の反応にとって好都合であるpHが選択
されるだろう。所望であれば、第一溶液のアリコートを
使用してもよい。
合物とレセプターとの混合である。通常、２つの成分の
濃度は、比較的短時間、通常約５〜60分、好ましくは５
〜30分以内に平衡に達するように選択される。温度は約
４℃〜40℃の範囲であり、便利には室温が使われるだろ
う。pHは通常約５〜13の範囲内であり、実験化合物と結
合性化合物との間の反応にとって好都合であるpHが選択
されるだろう。所望であれば、第一溶液のアリコートを
使用してもよい。
次の段階では、上記で調製した溶液が接合体溶液と混
合される。接合体溶液は、通常、レセプターの結合親和
力と共に変化するであろう濃度で接合体を含有するだろ
う。従って、濃度は1pM〜約１μＭの範囲で異なるであ
ろう。便利には、接合体溶液は、追加の段階を避けるた
めにβ−ガラクトシダーゼの基質を含んでいてもよい。
あるいは、該基質は酵素受容体試薬と共に含まれていて
もよい。酵素供与体接合体溶液は、一般に約５〜９、通
常6.5〜7.5の範囲のpHに緩衝化されるだろう。他の添加
剤としては、キレート化剤、例えばエチレングリコール
四酢酸、安定剤、例えばアジ化ナトリウムおよびジチオ
トレイトール、並びに非イオン性界面活性剤を挙げるこ
とができる。緩衝剤は、アッセイ媒質中で緩衝能力を維
持するのに十分な濃度、通常約50〜500mMの範囲で存在
するだろう。キレート化剤およびアジ化物は通常約５〜
50mMの範囲であり、一方界面活性剤は約0.01〜0.1％で
存在し、そしてジチオトレイトールは約0.01〜0.1mMで
存在するだろう。
合される。接合体溶液は、通常、レセプターの結合親和
力と共に変化するであろう濃度で接合体を含有するだろ
う。従って、濃度は1pM〜約１μＭの範囲で異なるであ
ろう。便利には、接合体溶液は、追加の段階を避けるた
めにβ−ガラクトシダーゼの基質を含んでいてもよい。
あるいは、該基質は酵素受容体試薬と共に含まれていて
もよい。酵素供与体接合体溶液は、一般に約５〜９、通
常6.5〜7.5の範囲のpHに緩衝化されるだろう。他の添加
剤としては、キレート化剤、例えばエチレングリコール
四酢酸、安定剤、例えばアジ化ナトリウムおよびジチオ
トレイトール、並びに非イオン性界面活性剤を挙げるこ
とができる。緩衝剤は、アッセイ媒質中で緩衝能力を維
持するのに十分な濃度、通常約50〜500mMの範囲で存在
するだろう。キレート化剤およびアジ化物は通常約５〜
50mMの範囲であり、一方界面活性剤は約0.01〜0.1％で
存在し、そしてジチオトレイトールは約0.01〜0.1mMで
存在するだろう。
一般に、第一溶液の量は、酵素供与体接合体試薬溶液
中の緩衝剤がpHを調節できるように、酵素供与体接合体
試薬溶液の量よりも実質的に少ないであろう。容量比は
通常約1:1〜５であろう。
中の緩衝剤がpHを調節できるように、酵素供与体接合体
試薬溶液の量よりも実質的に少ないであろう。容量比は
通常約1:1〜５であろう。
レセプターは通常、それが実験化合物試料溶液に添加
される時は試薬溶液といて使われるだろう。大部分で
は、レセプターは約５〜９の範囲のpHの緩衝液として使
用され、ここで緩衝剤は約50〜500mMの範囲内で存在
し、そして安定のために他の化合物が添加されてもよ
い。例えば、0.1〜２％の不活性タンパク質、例えば血
清アルブミン、約0.1〜２％の界面活性剤、例えばLubro
l、および約５〜50mMのアジ化ナトリムウが存在しても
よい。使用される様々な物質は、レセプターの性質に応
じて、ある程度異なるであろう。
される時は試薬溶液といて使われるだろう。大部分で
は、レセプターは約５〜９の範囲のpHの緩衝液として使
用され、ここで緩衝剤は約50〜500mMの範囲内で存在
し、そして安定のために他の化合物が添加されてもよ
い。例えば、0.1〜２％の不活性タンパク質、例えば血
清アルブミン、約0.1〜２％の界面活性剤、例えばLubro
l、および約５〜50mMのアジ化ナトリムウが存在しても
よい。使用される様々な物質は、レセプターの性質に応
じて、ある程度異なるであろう。
試料、レセプターおよび酵素供与体結合体を含んで成
る混合溶液は、短時間、普通約１〜10分間、より普通に
は約２〜５分間、望ましくは生理的温度にてインキュベ
ートされ得る。温度は約４〜40℃を使用することができ
るが、好ましくは、温度は約25〜37℃、より好ましくは
37℃であろう。次いでこの溶液に酵素受容体を添加し、
そして主としてレセプターの結合親和力、そのサイズ、
溶液中の様々な成分の濃度、温度等に応じて、混合物を
十分な時間、普通約１〜30分間、より普通には約２〜15
分間インキュベートする。同様に、いずれの温度でも使
用できるが、好ましくは約25〜37℃、より好ましくは約
37℃の温度が使用され得る。
る混合溶液は、短時間、普通約１〜10分間、より普通に
は約２〜５分間、望ましくは生理的温度にてインキュベ
ートされ得る。温度は約４〜40℃を使用することができ
るが、好ましくは、温度は約25〜37℃、より好ましくは
37℃であろう。次いでこの溶液に酵素受容体を添加し、
そして主としてレセプターの結合親和力、そのサイズ、
溶液中の様々な成分の濃度、温度等に応じて、混合物を
十分な時間、普通約１〜30分間、より普通には約２〜15
分間インキュベートする。同様に、いずれの温度でも使
用できるが、好ましくは約25〜37℃、より好ましくは約
37℃の温度が使用され得る。
試料の全容量は、望ましくは酵素受容体の添加により
主な希釈が起こるであろう場合、通常約50〜500μの
範囲内であろう。この容量は、それらの濃度が競合中は
高くなろうであろうから、レセプターと試料化合物およ
び接合体との間のより迅速な反応が起こるように考慮さ
れる。多量の酵素受容体が使用できるので、酵素受容体
による希釈が酵素供与体と酵素受容体との間の複合体形
成の速度に有意な影響を与える必要がない。
主な希釈が起こるであろう場合、通常約50〜500μの
範囲内であろう。この容量は、それらの濃度が競合中は
高くなろうであろうから、レセプターと試料化合物およ
び接合体との間のより迅速な反応が起こるように考慮さ
れる。多量の酵素受容体が使用できるので、酵素受容体
による希釈が酵素供与体と酵素受容体との間の複合体形
成の速度に有意な影響を与える必要がない。
酵素複合体を形成するのに十分な時間の後、アッセイ
媒質中の酵素活性の量を常法に従って測定することがで
きる。紫外または可視領域、好ましくは可視領域に強い
吸収を有する生成物を与えるような適当な基質を使用す
ることにより、分光光度計において吸収の変化量を読み
取ることができる。
媒質中の酵素活性の量を常法に従って測定することがで
きる。紫外または可視領域、好ましくは可視領域に強い
吸収を有する生成物を与えるような適当な基質を使用す
ることにより、分光光度計において吸収の変化量を読み
取ることができる。
当該プロトコールは、特に自動化された機器を用いて
適用できる。この場合、様々な混合物を試料に添加し、
そして自動的にインキュベートした後、反応混合物また
はそのアリコートを速度測定のために光線路に導入する
ことができる。従って、多数の試料を迅速にスクリーニ
ングすることができ、ここで同じレセプターに結合する
試料化合物を評価するために同じ試料を使用することが
できる。
適用できる。この場合、様々な混合物を試料に添加し、
そして自動的にインキュベートした後、反応混合物また
はそのアリコートを速度測定のために光線路に導入する
ことができる。従って、多数の試料を迅速にスクリーニ
ングすることができ、ここで同じレセプターに結合する
試料化合物を評価するために同じ試料を使用することが
できる。
多数の化合物がタンパク質レセプターに結合すること
が知られており、ここで化合物の結合親和力を評価する
ことができるものが着目される。そのような化合物は、
大部分は、約５キロダルトン（kDal）以下、通常2kDal
以下の分子量を有する小さい有機分子であろう。レセプ
ターのためのリガンドが5kDalよりも実質的に大きい場
合、大きいリガンドを実質的に模倣することのできるず
っと小さい配列が知られている限り、その配列が代わり
に役立ち得る。例えば、インスリンレセプターのような
レセプターに結合するオリゴペプチドが知られており、
そしてインスリンの代わりに、各々のレセプターについ
て他の化合物の結合親和力を測定するのに役立ち得る。
が知られており、ここで化合物の結合親和力を評価する
ことができるものが着目される。そのような化合物は、
大部分は、約５キロダルトン（kDal）以下、通常2kDal
以下の分子量を有する小さい有機分子であろう。レセプ
ターのためのリガンドが5kDalよりも実質的に大きい場
合、大きいリガンドを実質的に模倣することのできるず
っと小さい配列が知られている限り、その配列が代わり
に役立ち得る。例えば、インスリンレセプターのような
レセプターに結合するオリゴペプチドが知られており、
そしてインスリンの代わりに、各々のレセプターについ
て他の化合物の結合親和力を測定するのに役立ち得る。
レセプターは天然源から単離された純粋な組成物であ
るか、遺伝子操作法により調製されるか、粗製の細胞溶
解物、膜断片、または部分的には精製されたものである
ことができる。レセプターは、アッセイの目的を妨害し
ない形で使用されるだろう。
るか、遺伝子操作法により調製されるか、粗製の細胞溶
解物、膜断片、または部分的には精製されたものである
ことができる。レセプターは、アッセイの目的を妨害し
ない形で使用されるだろう。
レセプターは、膜タンパク質レセプター、特にＧタン
パク質、CDタンパク質、神経伝達物質レセプター、成長
因子レセプター、ステロイドレセプター、ビタミンＤレ
セプター、サイトカインレセプター等を包合する形質膜
タンパク質レセプター；血液タンパク質レセプター、例
えばポリヨードチロニンレセプター、コレステロールレ
セプター等；または個々の器官、例えば筋肉、皮膚、
腸、心臓、CNS、膵臓等に関連する他のレセプターであ
ることができる。レセプターは、可溶性タンパク質とし
て、膜断片において使用でき、または不溶性タンク質を
可溶性にするように変更でき、例えば経膜組込み配列を
除去することができる。リガンドとレセプターの中に
は、葉酸と葉酸結合タンパク質、チロキシンまたはトリ
ヨードチロニンとチロキシン結合タンパク質、B12と内
因子、コレステロールと低密度リポタンパク質、グルコ
コルチコイドとグルココルチコイド結合タンパク質、ア
セチルコリンとアセチルコリンレセプターがある。
パク質、CDタンパク質、神経伝達物質レセプター、成長
因子レセプター、ステロイドレセプター、ビタミンＤレ
セプター、サイトカインレセプター等を包合する形質膜
タンパク質レセプター；血液タンパク質レセプター、例
えばポリヨードチロニンレセプター、コレステロールレ
セプター等；または個々の器官、例えば筋肉、皮膚、
腸、心臓、CNS、膵臓等に関連する他のレセプターであ
ることができる。レセプターは、可溶性タンパク質とし
て、膜断片において使用でき、または不溶性タンク質を
可溶性にするように変更でき、例えば経膜組込み配列を
除去することができる。リガンドとレセプターの中に
は、葉酸と葉酸結合タンパク質、チロキシンまたはトリ
ヨードチロニンとチロキシン結合タンパク質、B12と内
因子、コレステロールと低密度リポタンパク質、グルコ
コルチコイドとグルココルチコイド結合タンパク質、ア
セチルコリンとアセチルコリンレセプターがある。
大部分は、レセプターへの化合物の結合の領域は、既
知であるかまたは幾つかの誘導体を調製することにより
容易に決定され得る。どの場合でも、リガンド上に存在
する利用可能な官能基を使用してもよく、または官能基
を導入してもよい。文献は、他の化合物とリガンドの接
合体を十分に備えている。ここで該接合体は、抗体の形
成のための試薬として、アッセイにおける試薬として、
または他の目的で使われている。該接合体がそれの天然
レセプターへの結合のために使われている場合、この接
合体は一般に十分であろう。
知であるかまたは幾つかの誘導体を調製することにより
容易に決定され得る。どの場合でも、リガンド上に存在
する利用可能な官能基を使用してもよく、または官能基
を導入してもよい。文献は、他の化合物とリガンドの接
合体を十分に備えている。ここで該接合体は、抗体の形
成のための試薬として、アッセイにおける試薬として、
または他の目的で使われている。該接合体がそれの天然
レセプターへの結合のために使われている場合、この接
合体は一般に十分であろう。
様々な官能基が、リガンドを酵素供与起体断片に結合
するために使用できる。結合は、チオールと活性オレフ
ィンとの間の結合、リガンド上にカルボキシが通常存在
する場合、ペプチド結合、還元アミノ化等であることが
できる。酵素供与体接合体の調製方法は、米国特許第4,
708,929号中に詳細に記載されている。大部分は、該接
合体は、天然に存在するかまたは酵素供与体断片中に導
入されたものであるシステインまたはリジンの所で形成
されるだろう。
するために使用できる。結合は、チオールと活性オレフ
ィンとの間の結合、リガンド上にカルボキシが通常存在
する場合、ペプチド結合、還元アミノ化等であることが
できる。酵素供与体接合体の調製方法は、米国特許第4,
708,929号中に詳細に記載されている。大部分は、該接
合体は、天然に存在するかまたは酵素供与体断片中に導
入されたものであるシステインまたはリジンの所で形成
されるだろう。
大部分は、使用されるβ−ガラクトシダーゼ供与体断
片の天然配列は、システインまたはリジンの導入のため
に１または複数の置換を受けるであろう。参考にされる
基本配列は次のものである。
片の天然配列は、システインまたはリジンの導入のため
に１または複数の置換を受けるであろう。参考にされる
基本配列は次のものである。
文字の下の数字は、野生型β−ガラクトシダーゼ番号
を示す。
を示す。
＊印は、ＣまたはＫへのアミノ酸置換を示す。
好ましい置換領域は、約アミノ酸20からアミノ酸30ま
で；アミノ酸35からアミノ酸45まで；アミノ酸60からア
ミノ酸89までを含む。複数の置換が使われる場合、置換
は少なくとも約５アミノ酸、好ましくは少なくとも約10
アミノ酸、より好ましくは約20〜60アミノ酸により隔て
られているが好ましい。特定の置換部位は、有意な程度
接合体の性質に依存するだろうけれども、好ましくは約
アミノ酸48から61までの領域は置換に利用されない。あ
る接合体を別の接合体と比較して調製する時、ある部位
がその他の部位よりも好ましいかもしれない。
で；アミノ酸35からアミノ酸45まで；アミノ酸60からア
ミノ酸89までを含む。複数の置換が使われる場合、置換
は少なくとも約５アミノ酸、好ましくは少なくとも約10
アミノ酸、より好ましくは約20〜60アミノ酸により隔て
られているが好ましい。特定の置換部位は、有意な程度
接合体の性質に依存するだろうけれども、好ましくは約
アミノ酸48から61までの領域は置換に利用されない。あ
る接合体を別の接合体と比較して調製する時、ある部位
がその他の部位よりも好ましいかもしれない。
特定の着目の部位としては、アミノ酸4,23,25,39,42,
45,68および86が挙げられる。欠失領域としては、アミ
ノ酸１から20まで、特に５から20まで、またはその中の
いずれかの配列が挙げられる。接合部位以外の着目の置
換領域としては、約75から85まで、特に約72から80ま
で、より特定的には74から77までが挙げられ、ここでよ
り多数のまたはより少数のアミノ酸を導入してもよく、
置換は保存性または非保存性置換であってもよい。保存
性とは、同じまたは実質的に同じ電荷タイプおよび一般
のコンホメーションを有することを意味し、例えば、天
然アミノ酸を別の天然アミノ酸に置換でき、芳香族アミ
ノ酸を別の芳香族アミノ酸に、荷電アミノ酸を同じ電荷
タイプの別の荷電アミノ酸に、等置換することができ
る。更に、保存性置換は、親水性領域に比べて疎水性領
域を保持し、一方非保存性置換は、領域の性質を親水性
から疎水性へまたはその逆に変えるものと考えることが
できる。
45,68および86が挙げられる。欠失領域としては、アミ
ノ酸１から20まで、特に５から20まで、またはその中の
いずれかの配列が挙げられる。接合部位以外の着目の置
換領域としては、約75から85まで、特に約72から80ま
で、より特定的には74から77までが挙げられ、ここでよ
り多数のまたはより少数のアミノ酸を導入してもよく、
置換は保存性または非保存性置換であってもよい。保存
性とは、同じまたは実質的に同じ電荷タイプおよび一般
のコンホメーションを有することを意味し、例えば、天
然アミノ酸を別の天然アミノ酸に置換でき、芳香族アミ
ノ酸を別の芳香族アミノ酸に、荷電アミノ酸を同じ電荷
タイプの別の荷電アミノ酸に、等置換することができ
る。更に、保存性置換は、親水性領域に比べて疎水性領
域を保持し、一方非保存性置換は、領域の性質を親水性
から疎水性へまたはその逆に変えるものと考えることが
できる。
種々様々な特異的結合ペアメンバーをED中に存在する
官能基を結合させるために、多数の連結基を使用するこ
とができる。既に指摘した様に、大部分は、結合のため
のED上に存在する官能基がメルカプタンまたはアミノ基
であろう。メルカプタンには、特に着目されるのは、活
性ハロゲン、活性オレフィンまたはメルカプトを含む広
範な容易に入手可能な試薬であり、ここで最初の２つは
チオエーテルを形成し、３つめはジスルフィドを形成す
る。特定の化合物としては、Ｎ−マレイミド安息香酸、
α−ブロモアセトアミドシクロヘキサンカルボン酸、Ｎ
−マレイミドコハク酸、メチルジチオ酢酸、等が挙げら
れる。アミノ基には、様々な種類の活性ハロゲンまたは
カルボン酸基、特に活性カルボン酸基を使用でき、ここ
でカルボン酸基は、カルボジイミド、活性エステル、例
えばＮ−ヒドロキシスクシンイミド、ｏ−ニトロフェノ
ール、ｐ−ニトロフェノール等により活性化することが
できる。接合方法は文献から公知であり、そして米国特
許No.3,817,837;4,262,089;4,233,401;4,220,722および
4,374,925により詳細に記載されている。
官能基を結合させるために、多数の連結基を使用するこ
とができる。既に指摘した様に、大部分は、結合のため
のED上に存在する官能基がメルカプタンまたはアミノ基
であろう。メルカプタンには、特に着目されるのは、活
性ハロゲン、活性オレフィンまたはメルカプトを含む広
範な容易に入手可能な試薬であり、ここで最初の２つは
チオエーテルを形成し、３つめはジスルフィドを形成す
る。特定の化合物としては、Ｎ−マレイミド安息香酸、
α−ブロモアセトアミドシクロヘキサンカルボン酸、Ｎ
−マレイミドコハク酸、メチルジチオ酢酸、等が挙げら
れる。アミノ基には、様々な種類の活性ハロゲンまたは
カルボン酸基、特に活性カルボン酸基を使用でき、ここ
でカルボン酸基は、カルボジイミド、活性エステル、例
えばＮ−ヒドロキシスクシンイミド、ｏ−ニトロフェノ
ール、ｐ−ニトロフェノール等により活性化することが
できる。接合方法は文献から公知であり、そして米国特
許No.3,817,837;4,262,089;4,233,401;4,220,722および
4,374,925により詳細に記載されている。
連結基は、例えばリガンドがEDのアミノ基との反応の
ために活性化され得るカルボン酸基を有する場合、単に
結合であることができ、または水素以外の１もしくは複
数の原子、普通は約１〜24個の原子、より普通には約１
〜12個の原子を有するものであることができる。その鎖
の中の原子としては、炭素原子の他に、窒素、硫黄、酸
素等が含まれ得る。
ために活性化され得るカルボン酸基を有する場合、単に
結合であることができ、または水素以外の１もしくは複
数の原子、普通は約１〜24個の原子、より普通には約１
〜12個の原子を有するものであることができる。その鎖
の中の原子としては、炭素原子の他に、窒素、硫黄、酸
素等が含まれ得る。
化学反応による接合の他に、着目のペプチドと免疫学
的に交差反応性であるアミノ酸配列に連結されたEDをコ
ードするヌクレオチド配列を調製することにより、融合
タンパク質に備えることができる。着目のエピトープと
EDとの融合タンパク質に備えて適当なデオキシヌクレオ
チド鎖を合成することができ、ここで着目のエピトープ
は、EDのＮ−末端またはＣ−末端、好ましくはＮ−末端
にあることができる。
的に交差反応性であるアミノ酸配列に連結されたEDをコ
ードするヌクレオチド配列を調製することにより、融合
タンパク質に備えることができる。着目のエピトープと
EDとの融合タンパク質に備えて適当なデオキシヌクレオ
チド鎖を合成することができ、ここで着目のエピトープ
は、EDのＮ−末端またはＣ−末端、好ましくはＮ−末端
にあることができる。
融合タンパク質はいずれのサイズでもよく、普通は約
500アミノ酸以下、より普通には約200アミノ酸以下、好
ましくは約150アミノ酸以下であり、ED配列を含む。
500アミノ酸以下、より普通には約200アミノ酸以下、好
ましくは約150アミノ酸以下であり、ED配列を含む。
酵素受容体 酵素受容体は、天然のものでも合成のものでもよい。
合成とは、所望のアミノ酸配列を提供するための組換え
DNA技術の利用を意味する。大部分については、M13の配
列が酵素受容体（EA）のための基本配列として使用され
るだろう。特に着目されるのは、配列中に存在する多数
の利用可能なスルフヒドリル基の削減である。EA M15
は、表面上に利用可能な５個のシステイン残基を有す
る。好ましいEAは、システインの置換、好ましくは保存
性置換、例えばG,A,M,S,T等による置換の結果として、
５個より少ない、好ましくは３個より少ない露出された
システイン残基を有する。
合成とは、所望のアミノ酸配列を提供するための組換え
DNA技術の利用を意味する。大部分については、M13の配
列が酵素受容体（EA）のための基本配列として使用され
るだろう。特に着目されるのは、配列中に存在する多数
の利用可能なスルフヒドリル基の削減である。EA M15
は、表面上に利用可能な５個のシステイン残基を有す
る。好ましいEAは、システインの置換、好ましくは保存
性置換、例えばG,A,M,S,T等による置換の結果として、
５個より少ない、好ましくは３個より少ない露出された
システイン残基を有する。
調製方法 当該ポリペプチド配列は、いずれの便利な手段によっ
ても調製することができる。該配列は市販のシンセサイ
ザー上で合成してもよい。しかしながら、配列が約50ア
ミノ酸より大きい場合、合成効率が下がるので、他の方
法より興味あるものになるであろう。別の方法の１つ
は、組換え技術の利用であり、この場合着目の配列また
はそれと相補的な配列の部分をコードする一本鎖デオキ
シヌクレオチド配列が調製される。該一本鎖は、ハイブ
リダイスおよび連結した時、生じた二本鎖DNA配列が所
望のアミノ酸配列をコードするように、大部分がオーバ
ーラップしている。次いで該配列をいずれかの便利な発
現ベクター中に挿入することができる。
ても調製することができる。該配列は市販のシンセサイ
ザー上で合成してもよい。しかしながら、配列が約50ア
ミノ酸より大きい場合、合成効率が下がるので、他の方
法より興味あるものになるであろう。別の方法の１つ
は、組換え技術の利用であり、この場合着目の配列また
はそれと相補的な配列の部分をコードする一本鎖デオキ
シヌクレオチド配列が調製される。該一本鎖は、ハイブ
リダイスおよび連結した時、生じた二本鎖DNA配列が所
望のアミノ酸配列をコードするように、大部分がオーバ
ーラップしている。次いで該配列をいずれかの便利な発
現ベクター中に挿入することができる。
多数の発現ベクターが商業的に入手可能であるかまた
は文献中に記載されている。大部分は原核生物宿主が使
用されるが、或る場合、特に融合タンパク質が存在し、
そしてその融合タンパク質をプロセシングすることを所
望する場合、真核生物宿主が望ましいであろう。ベクタ
ーは通常、発現カセットを提供するように、コード配
列、転写方向でコード配列の５′側に転写開始調節領域
またはプロモーター、および転写方向でコード配列の
３′側に転写および翻訳終結調節領域を含んで成る。特
に、原核生物中への形質転換のためには、宿主中で機械
的でありそしてベクターの安定な維持に備えた複製系が
存在するだろう。
は文献中に記載されている。大部分は原核生物宿主が使
用されるが、或る場合、特に融合タンパク質が存在し、
そしてその融合タンパク質をプロセシングすることを所
望する場合、真核生物宿主が望ましいであろう。ベクタ
ーは通常、発現カセットを提供するように、コード配
列、転写方向でコード配列の５′側に転写開始調節領域
またはプロモーター、および転写方向でコード配列の
３′側に転写および翻訳終結調節領域を含んで成る。特
に、原核生物中への形質転換のためには、宿主中で機械
的でありそしてベクターの安定な維持に備えた複製系が
存在するだろう。
広範な複製系が同定されており、原核生物並びに真核
生物において使われている。また、ベクターで形質転換
された宿主細胞の選択のためのマーカーも通常存在する
だろう。該マーカーは、大部分は毒素、例えば抗生物質
に対する耐性であるか、または原栄養性を提供するため
の栄養素要求性宿主の補完のために用意されるものであ
ろう。
生物において使われている。また、ベクターで形質転換
された宿主細胞の選択のためのマーカーも通常存在する
だろう。該マーカーは、大部分は毒素、例えば抗生物質
に対する耐性であるか、または原栄養性を提供するため
の栄養素要求性宿主の補完のために用意されるものであ
ろう。
形質転換は、ウイルスベクターを使ったトランスフェ
クション、プロトプラスト融合、カルシウム沈澱された
DNAを使った形質転換、または他の便利な手法により行
うことができる。形質転換の方法は常用のものであり、
そしてManiatisら、Molecular Cloning:A Laboratory M
anual,Coldspring Harbor Laboratory,Coldspring Harb
or,NY 1982中に見つけることができる。
クション、プロトプラスト融合、カルシウム沈澱された
DNAを使った形質転換、または他の便利な手法により行
うことができる。形質転換の方法は常用のものであり、
そしてManiatisら、Molecular Cloning:A Laboratory M
anual,Coldspring Harbor Laboratory,Coldspring Harb
or,NY 1982中に見つけることができる。
所望であれば、該配列は、宿主からのポリペプチド生
成物の分泌のためのシグナル配列を含んでいてもよい。
様々なシグナル配列が利用可能であり、特に真核生物に
利用可能である。シグナル配列を使わない場合、所望の
ポリペプチドを抽出するために細胞を溶解させることが
必要であろう。
成物の分泌のためのシグナル配列を含んでいてもよい。
様々なシグナル配列が利用可能であり、特に真核生物に
利用可能である。シグナル配列を使わない場合、所望の
ポリペプチドを抽出するために細胞を溶解させることが
必要であろう。
形質転換された宿主は、所望のポリペプチドが形成さ
れるのに十分な時間の間適当な培地中で増殖され、そし
て生産物が分泌されるかまたは細胞質中に保持されるか
に応じた方法で、生産物が単離される。生成物が一度単
離されれば、クロマトグラフィー、電気泳動、密度勾配
分離等により、常用の方法で精製することができる。
れるのに十分な時間の間適当な培地中で増殖され、そし
て生産物が分泌されるかまたは細胞質中に保持されるか
に応じた方法で、生産物が単離される。生成物が一度単
離されれば、クロマトグラフィー、電気泳動、密度勾配
分離等により、常用の方法で精製することができる。
酵素受容体は、同様にして調製されるか、またはM15
配列を天然に生産する宿主から単離され得る。酵素受容
体を生産する特定の方法は、本発明にとって重要ではな
い。
配列を天然に生産する宿主から単離され得る。酵素受容
体を生産する特定の方法は、本発明にとって重要ではな
い。
断片が得られれば、上述のようにしてそれを修飾する
ことができる。酵素受容体の場合、スルフヒドリル基を
キャップするか、そうでなければ適当に修飾することが
できる。接合体の特異的結合ペアメンバー部分との反応
のために、該ポリペプチドに連結基を導入してもよく、
または修飾してもよい。次いで該ポリペプチドが特異的
結合ペアメンバーまたはその類似体と混合され、そして
官能基の性質および反応に必要な条件に従って反応され
る。大部分は、穏和な条件下で、通常約60℃以下、好ま
しくは約40℃以下で、水性媒質が使用されるだろう。
ことができる。酵素受容体の場合、スルフヒドリル基を
キャップするか、そうでなければ適当に修飾することが
できる。接合体の特異的結合ペアメンバー部分との反応
のために、該ポリペプチドに連結基を導入してもよく、
または修飾してもよい。次いで該ポリペプチドが特異的
結合ペアメンバーまたはその類似体と混合され、そして
官能基の性質および反応に必要な条件に従って反応され
る。大部分は、穏和な条件下で、通常約60℃以下、好ま
しくは約40℃以下で、水性媒質が使用されるだろう。
酵素により開裂された時にアッセイ媒質の吸光（光学
濃度）または発光の量に変化をもたらす酵素基質が使用
される。即ち、基質の開裂は着色または蛍光生成物の出
現または消失をもたらす。好ましい酵素基質としては、
ｏ−ニトロフェニルガラクトシド（ONPG）およびクロロ
フェノールレッド−β−ガラクトシド（CPRG）が挙げら
れる。ONPG,CPRGおよびその他の匹敵する酵素基質は商
業的に入手可能である。ONPGは、通常約0.5〜2.0mg/ml
の濃度で使用されるだろう。他の基質は、ONPGに匹敵す
るシグナルを提供するような濃度で使用されるだろう。
濃度）または発光の量に変化をもたらす酵素基質が使用
される。即ち、基質の開裂は着色または蛍光生成物の出
現または消失をもたらす。好ましい酵素基質としては、
ｏ−ニトロフェニルガラクトシド（ONPG）およびクロロ
フェノールレッド−β−ガラクトシド（CPRG）が挙げら
れる。ONPG,CPRGおよびその他の匹敵する酵素基質は商
業的に入手可能である。ONPGは、通常約0.5〜2.0mg/ml
の濃度で使用されるだろう。他の基質は、ONPGに匹敵す
るシグナルを提供するような濃度で使用されるだろう。
次の例は、例示のために提供されるのであって、決し
て限定のためではない。
て限定のためではない。
実施例１ A.B12−ED4接合体の調製 ａ）活性化B12誘導体の調製 1.18mgのシアノコバラミン−Ｎ−プロピルアミン（対
応するカルホン酸から調製、J.F.KolhouseおよびR.H.Al
len,J.Clin.Invest.,1977,60,1381）を0.1mlの50mMリン
酸ナトリウム（pH＝7.3）緩衝液に溶かした。次いで0.1
mlの同緩衝液中の2.2mgのスルホスクシンイミジル４−
（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボ
キシレート（SMCC）（Pierce Chemical Company）を添
加した。生じた溶液を渦動攪拌し、そして室温で30分間
放置した。粗反応混合物を分析用μBondapak Phenyl HP
LCカラム（Waters Associates）に注入した。適切な画
分を合わせ、−70℃で凍結し、そして凍結乾燥した。
応するカルホン酸から調製、J.F.KolhouseおよびR.H.Al
len,J.Clin.Invest.,1977,60,1381）を0.1mlの50mMリン
酸ナトリウム（pH＝7.3）緩衝液に溶かした。次いで0.1
mlの同緩衝液中の2.2mgのスルホスクシンイミジル４−
（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボ
キシレート（SMCC）（Pierce Chemical Company）を添
加した。生じた溶液を渦動攪拌し、そして室温で30分間
放置した。粗反応混合物を分析用μBondapak Phenyl HP
LCカラム（Waters Associates）に注入した。適切な画
分を合わせ、−70℃で凍結し、そして凍結乾燥した。
ｂ）ED4−B12接合体の調製 上記調製からの約0.25部の凍結乾燥生成物を200μ
の50mMリン酸ナトリウム（pH＝7.3）に溶かした。200μ
の50mMリン酸ナトリウム（pH＝7.3）中の1.1mgのED4
（PCT/US/85−02095中ではH6と称するもの）の溶液を前
記ビタミンB12誘導体溶液に添加し、生じた溶液を徹底
的に攪拌し、そして室温で１時間放置しておいた。Wate
rs社のμBondapak Phenylカラム上でのHPLC精製によ
り、純粋なED4−ビタミンB12−C3−SMCCを得た。適切な
画分をバイオアッセイと360nmでの吸光度によって同定
した。それらの画分を凍結し、凍結乾燥し、そして−70
℃で保存した。
の50mMリン酸ナトリウム（pH＝7.3）に溶かした。200μ
の50mMリン酸ナトリウム（pH＝7.3）中の1.1mgのED4
（PCT/US/85−02095中ではH6と称するもの）の溶液を前
記ビタミンB12誘導体溶液に添加し、生じた溶液を徹底
的に攪拌し、そして室温で１時間放置しておいた。Wate
rs社のμBondapak Phenylカラム上でのHPLC精製によ
り、純粋なED4−ビタミンB12−C3−SMCCを得た。適切な
画分をバイオアッセイと360nmでの吸光度によって同定
した。それらの画分を凍結し、凍結乾燥し、そして−70
℃で保存した。
B.内因子（レセプター）によるED4−B12接合体の阻害 次の試薬を調製する： 結合タンパク質レセプター試薬は、150mMリン酸カリ
ウム、50mMホウ酸ナトリウム、１％BSA（B12グレードBS
A,Sigma）、１％Lubrolおよび20mMアジ化ナトリウム（p
H7.0）中に約1:2000希釈されたブタ内因子（0.5mg/ml,S
cripps Laboratories,San Diego）から成る。
ウム、50mMホウ酸ナトリウム、１％BSA（B12グレードBS
A,Sigma）、１％Lubrolおよび20mMアジ化ナトリウム（p
H7.0）中に約1:2000希釈されたブタ内因子（0.5mg/ml,S
cripps Laboratories,San Diego）から成る。
ED4−B12接合体／基質試薬は、約450pMのED4−B12、
2.0mg/mlのCPRG（クロロフェノールレッド−β−Ｄ−ガ
ラクトピラノシド（Boehringer Mannheim）、100mMリン
酸ナトリウム、150mMリン酸カリムウ、10mMエチレング
リコール四酢酸、20mMアジ化ナトリウム、0.05mMジチオ
トレイトールを有する0.05％Tween20（pH7.0）を含む。
2.0mg/mlのCPRG（クロロフェノールレッド−β−Ｄ−ガ
ラクトピラノシド（Boehringer Mannheim）、100mMリン
酸ナトリウム、150mMリン酸カリムウ、10mMエチレング
リコール四酢酸、20mMアジ化ナトリウム、0.05mMジチオ
トレイトールを有する0.05％Tween20（pH7.0）を含む。
EA試薬は、100mMリン酸ナトリウム、150mMリン酸カリ
ウム、10mMエチレングリコール四酢酸、5mM酢酸マグネ
シウム、20mMアジ化ナトリウム、0.05mMジチオトレイト
ールを含む0.05％Tween20（pH7.0）中の、β−ガラクト
シダーゼのカルボキシル末端に似た組換えタンパク質
（PCT/US/85−0295 EA22参照）から成る。EA濃度は約9.
0μＭである。
ウム、10mMエチレングリコール四酢酸、5mM酢酸マグネ
シウム、20mMアジ化ナトリウム、0.05mMジチオトレイト
ールを含む0.05％Tween20（pH7.0）中の、β−ガラクト
シダーゼのカルボキシル末端に似た組換えタンパク質
（PCT/US/85−0295 EA22参照）から成る。EA濃度は約9.
0μＭである。
アッセイ方法は、300μのB12試薬を100μの300mM
炭酸ナトリウム（pH12.7）および100μの結合タンパ
ク質試薬と混合することを含む。この溶液を室温で＞15
分間インキュベートする。これを前処理試料とする。30
μの前処理試料を100μのED−B12/基質試薬に加え
るように機器（臨床化学分析機器）をプログラミングす
る。これを37℃で２〜５分間インキュベートする。次い
で機器により反応混合物に50μのEA試薬を添加し、そ
して37℃にて11分間インキュベートする。酵素速度を１
〜４分間の570nmでの吸光度変化により読み取る。次の
表は、典型的なアッセイの実施を示す。
炭酸ナトリウム（pH12.7）および100μの結合タンパ
ク質試薬と混合することを含む。この溶液を室温で＞15
分間インキュベートする。これを前処理試料とする。30
μの前処理試料を100μのED−B12/基質試薬に加え
るように機器（臨床化学分析機器）をプログラミングす
る。これを37℃で２〜５分間インキュベートする。次い
で機器により反応混合物に50μのEA試薬を添加し、そ
して37℃にて11分間インキュベートする。酵素速度を１
〜４分間の570nmでの吸光度変化により読み取る。次の
表は、典型的なアッセイの実施を示す。
結合タンパク質試薬をより濃くする（即ちScripp Lab
s IFの1:400または1:500希釈液）と、より完全な阻害が
達成され得る。
s IFの1:400または1:500希釈液）と、より完全な阻害が
達成され得る。
プロトコールは50μのBP試薬、200μのED/基質、
60μのEA試薬を使用した。
60μのEA試薬を使用した。
実施例２ A.ED4−T4接合体の調製 該接合体は、PCT/US/02095中にH6−T4と命名されたも
のである。
のである。
B.チロキシン結合タンパク質レセプターによるED4−T4
接合体の阻害 次の試薬を使用する： EA試薬／緩衝液 緩衝液＝20mM NaPO4、10mM EGTA、2mM MgOAc、 3.6％グリセロール、5mMショ糖、 20mM NaN3、pH7.0 試 薬＝5U EA/テストまたはEA緩衝液中31.25U/mlのE
A ED試薬／緩衝液 緩衝液＝20mM NaPO4、10mM EGTA、 6.25mg/ml ONPG、 0.05％Tween/DTT、20mM NaN3、 pH7.0 試 薬＝18nMのED4−T4系濃度またはED試薬緩衝液中1
12.5nMのED4−T4 機械プログラムパラメーター； 波 長： 420nM 読取り時間： ３−４分 R1とR2の間の遅れ： 50秒 温 度： 37℃ EA試薬R1 :160μ ED試薬R2 : 40μ 試料 : 20μ H2O : 30μ 全アッセイ容量:250μ レセプターの説明 レセプターは、PBS中に希釈された精製TBG（Protus L
aboratories,South San Francisco,CAから）であった。
接合体の阻害 次の試薬を使用する： EA試薬／緩衝液 緩衝液＝20mM NaPO4、10mM EGTA、2mM MgOAc、 3.6％グリセロール、5mMショ糖、 20mM NaN3、pH7.0 試 薬＝5U EA/テストまたはEA緩衝液中31.25U/mlのE
A ED試薬／緩衝液 緩衝液＝20mM NaPO4、10mM EGTA、 6.25mg/ml ONPG、 0.05％Tween/DTT、20mM NaN3、 pH7.0 試 薬＝18nMのED4−T4系濃度またはED試薬緩衝液中1
12.5nMのED4−T4 機械プログラムパラメーター； 波 長： 420nM 読取り時間： ３−４分 R1とR2の間の遅れ： 50秒 温 度： 37℃ EA試薬R1 :160μ ED試薬R2 : 40μ 試料 : 20μ H2O : 30μ 全アッセイ容量:250μ レセプターの説明 レセプターは、PBS中に希釈された精製TBG（Protus L
aboratories,South San Francisco,CAから）であった。
データ 次の表は、チロキシン結合グロブリンによるED−T4接
合体の阻害％を示す。
合体の阻害％を示す。
実施例３ A.ED4−葉酸接合体の調製 葉酸（10.0mg）、ジシクロヘキシルカルボジイミド
（DCC,4.6mg）およびＮ−ヒドロキシスクシンイミド（N
HS,2.8mg）を1.5mlのエッペンドルフ管中で温めなが
ら、新しく蒸留したジメチルホルムアミド（1.0ml）中
に溶解させ、そして室温で２時間攪拌した。ほとんど全
ての葉酸が溶解した。混合物を超遠心分離し、そして上
清（200μｇ）を、0.2Mホウ酸塩pH7.8（600μ）およ
びジメチルホルムアミド（150μ）中のED4（400μ
ｇ）に添加した。生じた混合物を穏やかに１時間攪拌
し、次いでエッペンドルフ管中で超遠心分離した。20mM
TRIS（pH＝8.5）で予め平衡化されている10mlのＧ−25
カラム（Pharmacia）に上清を負荷し、そして20mM TRIS
（pH＝8.5）で溶出させた。該当する画分を合わせてイ
オン交換クロマトグラフィーにより精製した。カラム:P
harmacia Q Sepharose 5×50mm。溶離液:A）20mM TRIS
（pH＝8.5）;B）Ａ＋3.5M NaCl。勾配:40分間で０−100
％。流速:1.0ml/分。検出:280nm。約29m（？）で溶出す
る画分が95％阻害を有することがわかった。生成物を含
む画分を−70℃で保存した。
（DCC,4.6mg）およびＮ−ヒドロキシスクシンイミド（N
HS,2.8mg）を1.5mlのエッペンドルフ管中で温めなが
ら、新しく蒸留したジメチルホルムアミド（1.0ml）中
に溶解させ、そして室温で２時間攪拌した。ほとんど全
ての葉酸が溶解した。混合物を超遠心分離し、そして上
清（200μｇ）を、0.2Mホウ酸塩pH7.8（600μ）およ
びジメチルホルムアミド（150μ）中のED4（400μ
ｇ）に添加した。生じた混合物を穏やかに１時間攪拌
し、次いでエッペンドルフ管中で超遠心分離した。20mM
TRIS（pH＝8.5）で予め平衡化されている10mlのＧ−25
カラム（Pharmacia）に上清を負荷し、そして20mM TRIS
（pH＝8.5）で溶出させた。該当する画分を合わせてイ
オン交換クロマトグラフィーにより精製した。カラム:P
harmacia Q Sepharose 5×50mm。溶離液:A）20mM TRIS
（pH＝8.5）;B）Ａ＋3.5M NaCl。勾配:40分間で０−100
％。流速:1.0ml/分。検出:280nm。約29m（？）で溶出す
る画分が95％阻害を有することがわかった。生成物を含
む画分を−70℃で保存した。
B.葉酸結合タンパク質（レセプター）によるED−葉酸接
合体の阻害 次の試薬を調製する： 結合タンパク質試薬は、150mMリン酸カリウム、50mM
ホウ酸ナトリウム、１％ BSA（B12グレードBSA,Sigm
a）,1％Lubrolおよび20mMアジ化ナトリウム（pH7.0）中
に約1:2500希釈されたウシ葉酸結合タンパク質（Bioche
mical Inc.,Englewood,CO）から成る。
合体の阻害 次の試薬を調製する： 結合タンパク質試薬は、150mMリン酸カリウム、50mM
ホウ酸ナトリウム、１％ BSA（B12グレードBSA,Sigm
a）,1％Lubrolおよび20mMアジ化ナトリウム（pH7.0）中
に約1:2500希釈されたウシ葉酸結合タンパク質（Bioche
mical Inc.,Englewood,CO）から成る。
ED14−葉酸結合体／基質試薬は、約6.3nMのED−葉酸、
1.0mg/mlのOCNPG（ｏ−クロロ−ｐ−ニトロフェノール
ガラクトピラノシド）、100mMリン酸ナトリウム、150mM
リン酸カリウム、10mMエチレングリコール四酢酸、20mM
アジ化ナトリウム、0.05mMジチオトレイトールを有する
0.05％Tween 20（pH7.0）を含む。
1.0mg/mlのOCNPG（ｏ−クロロ−ｐ−ニトロフェノール
ガラクトピラノシド）、100mMリン酸ナトリウム、150mM
リン酸カリウム、10mMエチレングリコール四酢酸、20mM
アジ化ナトリウム、0.05mMジチオトレイトールを有する
0.05％Tween 20（pH7.0）を含む。
EA試薬は、100mMリン酸ナトリウム、150mMリン酸カリ
ムウ、10mMエチレングリコール四酢酸、5mM酢酸マグネ
シウム、20mMアジ化ナトリウム、0.05mMジチオトレイト
ールを有する0.05％Tween 20（pH7.0）中の、β−ガラ
クトシダーゼのカルボキシル末端に似た組換えタンパク
質から成る。EA濃度は約2.2μＭである。
ムウ、10mMエチレングリコール四酢酸、5mM酢酸マグネ
シウム、20mMアジ化ナトリウム、0.05mMジチオトレイト
ールを有する0.05％Tween 20（pH7.0）中の、β−ガラ
クトシダーゼのカルボキシル末端に似た組換えタンパク
質から成る。EA濃度は約2.2μＭである。
アッセイ方法は、300μの葉酸試料と100μの結合
タンパク質試薬との混合および室温での15分間のインキ
ュベーションを含む。これは前処理試料になる。30μ
の前処理試料を37℃で２〜５分間100μのED−葉酸試
薬を加えるように機器（臨床化学分析機器）をプログラ
ミングする。この後、機器により反応混合物に220μ
のEA試薬を添加し、そして405nmでの吸光度変化により
酵素速度を読み取る。次の表は典型的なアッセイの実施
を示す。
タンパク質試薬との混合および室温での15分間のインキ
ュベーションを含む。これは前処理試料になる。30μ
の前処理試料を37℃で２〜５分間100μのED−葉酸試
薬を加えるように機器（臨床化学分析機器）をプログラ
ミングする。この後、機器により反応混合物に220μ
のEA試薬を添加し、そして405nmでの吸光度変化により
酵素速度を読み取る。次の表は典型的なアッセイの実施
を示す。
〔発明の効果〕 上記結果から、本発明の方法が、結合親和力の測定の
ために、結合部位またはアロステリック結合部位のいず
れかにおける天然レセプターへの結合について広範な化
合物をスクリーニングする迅速で且つ便利な手段を提供
することは明らかである。このアッセイは自動化するこ
とができ、そのため再現性のある正確な比較を与えるよ
うな比較条件下で迅速で且つ効率的な方法で多数の化合
物をスクリーニングすることができる。リガンドへのレ
セプターの本来の結合を実質上模倣した接合体へのレセ
プターの結合のため、試料化合物の結合と通常のリガン
ドの結合との間で正確な比較を行うことができる。この
関係は、酵素活性の単純な測定により容易に決定するこ
とができる。
ために、結合部位またはアロステリック結合部位のいず
れかにおける天然レセプターへの結合について広範な化
合物をスクリーニングする迅速で且つ便利な手段を提供
することは明らかである。このアッセイは自動化するこ
とができ、そのため再現性のある正確な比較を与えるよ
うな比較条件下で迅速で且つ効率的な方法で多数の化合
物をスクリーニングすることができる。リガンドへのレ
セプターの本来の結合を実質上模倣した接合体へのレセ
プターの結合のため、試料化合物の結合と通常のリガン
ドの結合との間で正確な比較を行うことができる。この
関係は、酵素活性の単純な測定により容易に決定するこ
とができる。
Claims (10)
- 【請求項１】酵素供与体断片および酵素受容体断片を使
ってレセプターの天然リガンドに対する結合に影響を及
ぼす化合物の能力を評価するための方法であって、ここ
で前記断片は複号してホロ酵素を形成するものである、 アッセイ媒質中で、前記レセプター、前記化合物、及び
酵素供与体断片と前記天然リガンドのそのレセプターに
対する結合を模倣することのできる成分または前記レセ
プターのアロステリック結合部位に結合することのでき
る成分との接合体を混合し； 酵素受容体断片を前記媒質に添加し、ここで当該酵素受
容体断片はレセプターに結合していない接合体と前記ホ
ロ酵素を形成することができる； 前記レセプターに対する前記化合物の結合の尺度とし
て、前記媒質の酵素活性を測定する； ことを含んで成る方法。 - 【請求項２】前記リガンドがハプテンである、請求項１
記載の方法。 - 【請求項３】前記化合物が前記レセプターのアロステリ
ック結合部位に結合する、請求項１記載の方法。 - 【請求項４】前記レセプターが表面膜レセプターであ
る、請求項１〜３のいづれか１項記載の方法。 - 【請求項５】前記レセプターが細胞溶解物として存在す
る、請求項１〜３のいづれか１項記載の方法。 - 【請求項６】前記接合体を前記アッセイ媒質に添加する
前に、前記アッセイ媒質中で、複合体形成が起こるのに
十分な時間の間、前記レセプターおよび前記化合物を混
合する、請求項１〜５のいづれか１項記載の方法。 - 【請求項７】前記リガンドがチロキシン、葉酸またはビ
タミンB12である、請求項１〜６のいづれか１項記載の
方法。 - 【請求項８】複数種の化合物を評価する、請求項１〜７
のいづれか１項記載の方法。 - 【請求項９】前記ホロ酵素がβ−ガラクトシダーゼであ
る、請求項１〜８のいづれか１項記載の方法。 - 【請求項１０】前記酵素供与体断片が10箇所以下におい
てシステイン又はリジンにより置換されている、請求項
９記載の方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US39401789A | 1989-08-15 | 1989-08-15 | |
| US394017 | 1989-08-15 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH03175360A JPH03175360A (ja) | 1991-07-30 |
| JP2846433B2 true JP2846433B2 (ja) | 1999-01-13 |
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ID=23557200
Family Applications (1)
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|---|---|---|---|
| JP2213801A Expired - Fee Related JP2846433B2 (ja) | 1989-08-15 | 1990-08-14 | 薬剤スクリーニングアッセイ |
Country Status (7)
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|---|---|
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| EP (1) | EP0421589B1 (ja) |
| JP (1) | JP2846433B2 (ja) |
| AU (1) | AU649958B2 (ja) |
| CA (1) | CA1335707C (ja) |
| DE (1) | DE69026328T2 (ja) |
| ES (1) | ES2088416T3 (ja) |
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| US5976857A (en) * | 1996-01-26 | 1999-11-02 | Boehringer Mannheim Corporation | Cross-linked polypeptide fragments of β-galactosidase |
| DE69709448T2 (de) * | 1996-01-26 | 2002-09-19 | Roche Diagnostics Corp | Bismaleinsäureimid-vernetzer |
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| DE60321768D1 (de) * | 2002-01-29 | 2008-08-07 | Discoverx Inc | Enzymaktivierungsprotease-assay |
| US20030228621A1 (en) * | 2002-05-24 | 2003-12-11 | Yong Qin | Common ligand universal enzyme assay and compositions for use therein |
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| US4375459A (en) * | 1980-06-20 | 1983-03-01 | The Regents Of The University Of California | Cytoreceptor assay |
| EP0069450B1 (en) * | 1981-06-22 | 1985-04-10 | TECHNICON INSTRUMENTS CORPORATION (a New York corporation) | Labelled vitamin b12 derivatives, their preparation and use |
| US4399228A (en) * | 1981-07-30 | 1983-08-16 | Corning Glass Works | Polate competitive protein binding assay |
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| DE3587549T2 (de) * | 1984-10-29 | 1994-02-17 | Microgenics Corp | Ergänzungstestverfahren von proteine bindenden enzymen. |
| US4760029A (en) * | 1984-11-19 | 1988-07-26 | Schering Corporation | Assay for D-1 antagonistic activity of neuroleptic drugs |
| DE3546014A1 (de) * | 1985-12-24 | 1987-06-25 | Boehringer Mannheim Gmbh | Verfahren zur bestimmung der bindungskapazitaet des thyroxin bindenden tbg |
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| US4997771A (en) * | 1987-04-27 | 1991-03-05 | Schering Corporation | Method for measuring the BZ-1 receptor binding activity in a test sample or test compound |
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| US4950591A (en) * | 1987-08-14 | 1990-08-21 | Cherksey Bruce D | Membrane Na+ channel protein and related therapeutic compounds |
| EP0338045B1 (en) * | 1987-09-21 | 1994-08-24 | Microgenics Corporation | Solid-phase non-separation enzyme assay |
| JP2579672B2 (ja) * | 1987-10-02 | 1997-02-05 | マイクロジェニクス コーポレイション | 均質なｔ−４取込み分析法 |
| DE68914305T2 (de) * | 1988-02-02 | 1994-10-06 | Microgenics Corp | Rezeptorpreincubations-Enzymtest. |
| WO1990013569A1 (en) * | 1989-05-05 | 1990-11-15 | Microgenics Corporation | Method for protein binding enzyme complementation assays |
| US5328830A (en) * | 1992-09-08 | 1994-07-12 | Miles Inc. | Potassium channel modulators |
-
1989
- 1989-09-28 CA CA000613938A patent/CA1335707C/en not_active Expired - Fee Related
-
1990
- 1990-08-13 ES ES90308891T patent/ES2088416T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1990-08-13 EP EP90308891A patent/EP0421589B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1990-08-13 DE DE69026328T patent/DE69026328T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1990-08-14 AU AU60993/90A patent/AU649958B2/en not_active Ceased
- 1990-08-14 JP JP2213801A patent/JP2846433B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
1993
- 1993-07-21 US US08/095,267 patent/US5434052A/en not_active Expired - Lifetime
Also Published As
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| EP0421589A2 (en) | 1991-04-10 |
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| DE69026328D1 (de) | 1996-05-09 |
| EP0421589B1 (en) | 1996-04-03 |
| DE69026328T2 (de) | 1996-10-02 |
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| AU649958B2 (en) | 1994-06-09 |
| AU6099390A (en) | 1991-02-21 |
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|---|---|---|---|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |