JP2800412B2

JP2800412B2 - 免疫抑制作用増強剤

Info

Publication number: JP2800412B2
Application number: JP5510782A
Authority: JP
Inventors: 武城奥本; 健治千葉; 幸夫星野; 弘嗣小松; 真理子長澤; 秀和荒谷; 道夫寺澤; 稔森脇
Original assignee: 吉富製薬株式会社
Priority date: 1991-12-11
Filing date: 1992-12-10
Publication date: 1998-09-21
Anticipated expiration: 2013-09-21

Description

【発明の詳細な説明】「技術分野」本発明は、特定のチエノトリアゾロジアセピン化合物
からなる細胞接着阻害剤または免疫抑制作用増強剤に関
する。

「背景技術」近年、臓器移植が盛んに行われるようになり、その際
に生じる拒絶反応を抑制するために、シクロポリン、ア
ザチオプリン、ステロイド剤などの免疫抑制作用剤が使
用されている。しかしなから、これら免疫抑制剤を多用
すると、腎毒性やその他重篤な副作用が出現し、医療分
野では問題となっていた。

ところで、炎症性疾患やアレルギー性疾患などの治療
薬として期待されている血小板活性化因子拮抗剤（PAF
拮抗剤）がシクロスポリンの免疫抑制作用を増強するこ
とが、たとえばTransplantation Proceedings第20巻第
２号追補１（２月）1988年第313〜315頁に、また特表平
３−500898号公報にはチエノトリアゾロジアゼピン化合
物と併用することによりシクロスポリンの副作用が減少
する旨記載されている。

また、細胞接着分子が臓器移植の際の拒絶反応に重要
な役割をしていることが明らかにされた。細胞接着分子
として知られているLFA−１（leukocyte function−ass
ociated antigen−１といい、CD11a（α鎖）とCD18（β
鎖）から成る分子）およびICAM−１（interce11ular ad
hesion molecule−１という）に特異的に結合する抗体
を、同種心移植を行ったマウスに投与したところ、臓器
移植に伴う拒絶反応は抑制され、移植心は長期に生着す
ることが報告された（Science,225巻、1125〜1127頁、1
992年２月28日）。したがって、細胞接着分子であるLFA
−１とICAM−１を介する細胞接着を特異抗体で阻害する
ことにより、臓器移植に伴う拒絶反応を抑制することが
可能である。

したがって、細胞接着分子LFA−１、ICAM−１等を介
する細胞接着を阻害する薬物、あるいはこれら細胞接着
分子の細胞表面への発現を抑制する薬物は、臓器移植に
伴う拒絶反応を抑制することが期待されている。

「発明の開示」本発明者らが、上記課題を解決するために鋭意検討を
行ったところ、ジアゼピン環の２位がアルキル化された
チエノトリアゾロジアゼピン化合物がシクロスポリンな
どの免疫抑制剤の作用を増強することおよび血管内皮細
胞への白血球接着を阻害する作用を有していることを見
出し、本発明を完成させるに至った。

すなわち、本発明はジアゼピン環の２位がアルキル化
されたチエノトリアゾロジアゼピン化合物（以下、本化
合物ともいう）を有効成分とする細胞接着阻害剤を提供
する。

本化合物中、アルキルとは炭素数１〜６個の直鎖また
は分枝鎖状のアルキルであり、メチルが好ましい。

本化合物とは、４−（２−クロロフェニル）−２−
（２−（４−イソブチルフェニル）エチル）−6,9ジメ
チル−6H−チエノ〔3,2−ｆ〕〔1,2,4〕トリアゾロ〔4,
3−ａ〕〔1,4〕ジアゼピン（以下、化合物Ａともい
う）、３−〔４−（２−クロロフェニル）−6,9−ジメ
チル−6H−チエノ〔3,2−ｆ〕〔1,2,4〕トリアゾロ〔4,
3−ａ〕〔1,4〕ジアゼピン−２イル〕プロピオン酸モル
ホリド（以下、化合物Ｂともいう）またはそれらの光学
異性体（たとえば、6S−（−）体）、または（＋）−６
−（２−クロロフェニル）−３−シクロプロパンカルボ
ニル8,11−ジメチル−2,3,4,5−テトラヒドロ−8H−ピ
リド〔4',3':4,5〕チエノ〔3,2−ｆ〕〔1,2,4〕トリア
ゾロ〔4,3−ａ〕〔1,4〕ジアゼピン（以下、化合物Ｃと
もいう）など、またはそれらの医薬上許容されうる塩
（塩酸塩、臭化水素酸塩、マレイン酸塩など）もしくは
水和物（１水和物、1/2水和物、3/2水和物、２水和物、
３水和物など）が好ましく、これらの化合物は特開平１
−156982号、同２−256681号、同２−256682号の各公報
に記載された方法により製造され、これら公報を本明細
書に参考として引用する。

本発明は、さらに化合物Ａ、その光学異性体または化
合物Ｃ、またはそれらの医薬上許容されうる酸付加塩も
しくは水和物を有効成分とする免疫抑制作用増強剤も提
供する。

本発明の医薬を製造するにあたって、本化合物は治療
上有効な量が含有されているのが好ましく、通常0.1〜5
0mg程度でよい。当該医薬はこれら有効成分の他に、医
薬上許容されうる担体、賦形剤、希釈剤、溶解補助剤、
崩壊剤、結合剤などと混合して錠剤、散剤、カプセル
剤、注射剤、坐剤、点滴剤などとすることにより経口的
または非経口的に安全に患者に投与することができう。
投与量は、通常１日当たり成人に対し、経口投与で５〜
100mg、静脈投与で１〜50mg程度である。

免疫抑制作用増強剤として免疫抑制剤と併用する場合
は、本化合物を含有する医薬と免疫抑制剤とを別個に投
与することが好ましく、このような投与形態も本発明の
範囲内であることはいうまでもない。この場合、免疫抑
制剤の処方は公知のものでもよいし、また当業者のなし
うる範囲内で改良された処方も使用でき、本化合物含有
医薬に対し、0.01〜50倍量の範囲内で併用可能である。
なお、臓器移植に際しては、ドナー側にも臓器移植前に
本発明において用いられる本化合物含有医薬を投与する
か、または摘出臓器に本化合物含有医薬を注入しておい
てもよい。

免疫抑制剤としてはシクロスポリン、アザチオプリ
ン、ステロイド剤、FK−506（EP−Ａ 18416公報な
ど）、ISP−Ｉおよびその関連化合物（WO90/02727公
報、特開平３−128347号公報）などがあげられる。

本発明の医薬は臓器や骨髄移植の際に生ずる拒絶反応
を抑制するために使用される。

「図面の簡単な説明」被検体無処置ラット、シクロスポリン（CsA）3mg/kg
投与ラットおよび化合物Ａ（Ｙ−24180と表示）10mg/kg
およびシクロスポリン3mg/kg投与のラットの７日目にお
ける皮膚移植実験における皮膚の移植状況を示す図面を
写真により第１〜３図に示す。すなわち、第１図は４週
齢の雄性WKAHラットの全層皮膚移植片を４週齢の雄性F3
44ラットの背部移植床に縫合により移植を行い、被検体
による処置を行わなかった事例を、第２図は同実験モデ
ルに対し。シクロスポリン（CsAと表示）3mg/kgを１日
１回腹腔内投与した事例を、第３図はシクロスポリン3m
g/kgを１日１回腹腔内投与し、同時に化合物Ａ（Ｙ−24
180と表示）を１日１回10mg/kg経口投与した事例を示
す。

「発明を実施するための最良の形態」以下、製剤処方例および実験例により本発明をより具
体的に説明するが、本発明はこれらに限定されないこと
はいうまでもない。

製剤処方例１（１）シクロスポリン内服薬（商品名：サンディミュン
内服薬）（２）化合物A0.5mg含有錠剤：化合物Ａを0.5部、乳糖25部、結晶セルロール35部およ
びコーンスターチ３部とをよく混和したのち、コーンス
ターチ２部で製した結合剤とよく練合した。この練合物
を16メッシュで篩過し、オーブン中50℃で乾燥後、24メ
ッシュで篩過した。ここに得た練合粉体とコーンスター
チ８部、結晶セルロース11部およびタルク９部とをよく
混合したのち、圧搾打錠し、１錠あたり有効成分0.5mg
含有の錠剤を得る。

臓器または骨髄移植手術前および／または後におい
て、それぞれを連続的に、または間欠的に患者に投与す
る。

製剤処方剤２（１）シクロスポリン注射剤（商品名：サンディミュン
注）（２）化合物B1mg含有注射剤：化合物B1.0mgと塩化ナトリウム9.0mgを注射用水にて溶
解し、濾過して発熱物質を除去し、濾液に無菌下にアン
プルに移し、殺菌して、溶融により密封することにより
製造される。

製剤処方例３化合物A0.5部、乳糖25部、結晶セルロース35部および
コーンスターチ３部とをよく混和したのち、コーンスタ
ーチ２部で製した結合剤とよく練合した。この練合物を
16メッシュで篩過し、オーブン中50℃で乾燥後、24メッ
シュで篩過した。ここに得た練合粉体とコーンスターチ
８部、結晶セルロース11部およびタルク９部とよく混合
したのち、圧搾打錠して１錠あたり有効成分0.5mg含有
の錠剤を得る。

製剤処方例４化合物A1.0mgと塩化ナトリウム9.0mgを注射用水に溶
解し、濾過して発熱物質を除去し、濾液を無菌下アンプ
ルに移し、殺菌後、溶融密封することにより有効成分1.
0mg含有注射剤を得る。

実験例1:ラット同種皮膚移植でのシクロスポリンとの併
用による生着延長効果の増強作用ラット同種皮膚移植は、以下の方法で行った。４週齢
の雄性WKAHラット（１群５匹）の全層皮膚移植片（２×
2cm）を４週齢の雄性F344ラットの背部移植床に縫合に
より移植を行い、無菌のガーゼでおおい包帯した。包帯
は移植後６日目に除去し、移植片が拒絶されるまで毎日
観察を行った。皮膚移植片の拒絶は、移植片の上皮が90
％以上褐色になり、壊死を起こした起点で判定した。移
植後から壊死を起こした時点までの日数を移植片の生着
日数とした。

試験化合物は0.5％メチルセルロールに懸濁して、移
植当日より１日１回、移植片が拒絶されるまで経口投与
を行った。

シクロスポリンは注射用製剤を生理食塩水で希釈し
て、１日１回、９日目まで10回腹腔内投与を行った。

結果は各ラットでの移植片の生着日数に基づき、平均
生着日数を求め、第１〜３表にまとめた。

第１表から明らかなように、シクロスポリンに化合物
Ａ、ＢまたはＣを併用投与すると、有意に移植片の生着
日数を延長することが判った。

表２から明らかなように、化合物Ａはシクロスポリン
投与群に対し、有意に、しかも用量依存的に移植片の生
着日数を延長することが判明した。

第３表から明らかなように、化合物Ａはシクロスポリ
ン高濃度処理群に対しても有意に移植片を生着日数を延
長させる。

実験例2:培養ヒト血管内皮細胞（HUVEC）へのU937細胞
（ヒト組織球性白血病細胞）接着阻害作用 HUVECを牛胎児血清（20％）、牛脳由来血管内皮細胞
増殖因子（20μg/ml）およびヘパリン（100μg/ml）を
含む199培地に浮遊させ、コラーゲンでコートされた96
ウェル組織培養用プレートに添加後、37℃、５％CO₂存
在下で培養した。細胞がコンフルエントに達した時点で
インターロイキン１（10U/ml）を添加し、さらに24時間
培養した。洗浄後、ロイコトリエンB4（１μＭ）および
試験化合物としての化合物Ａと共にU937細胞（３×105
細胞／ウェル）を添加し、30分間インキュベートした。
プレートを倒置することにより被接着細胞を除去した
後、ローズベンガル溶液（リン酸緩衝生理食塩水中0.25
％）を加え、５分間放置した。199培地を用いて非接着
細胞を２回洗浄・除去した後、リン酸緩衝生理食塩水で
希釈した50％エタノールを添加し、20分間放置すること
により細胞内取り込まれたローズベンガル色素を漏出さ
せた。96ウェルプレート用吸光度計を用いて570nmの吸
光度を測定し、HUVECのみのウェルの吸光度を差し引い
た値をU937細胞接着の指標とした。

実験結果は以下の第４表にまとめた通りである。

上記の表のように、化合物Ａは濃度依存的に血管内皮
細胞へのU937細胞接着を抑制し、そのIC₅₀値は約３μＭ
であった。

実験例3:ヒト末梢血好中球のCD18発現に対する作用ほとんどの白血球系細胞の表面に発揮する接着分子の
ひとつであるLFA−１のβ鎖を構成するCD18抗原の発現
に対する作用を検討した。

デキストランを用いて調製したヒト末梢血好中球を牛
胎児血清（20％）を含むRPMI1640培地に浮遊させ、ロイ
コトリエンB4（１μＭ）および試験化合物としての化合
物Ａと共に96ウェル濾過用プレートに添加した（２×10
5細胞／ウェル）。37℃、50％CO₂存在下で90分間培養し
た後、RPMI1640培地にて１回洗浄し、マウス抗ヒトCD18
モノクローナル抗体（４μg/ml）を添加した、氷冷下で
１時間放置した後、１回洗浄し、パーオキシダーゼ標識
抗マウスイムノグロブリン抗体（2.5μg/ml）を添加し
た。氷冷下で１時間放置した後、２回洗浄し、パーオキ
シダーゼ用基質〔2,2′−azino−bis（３−ethylbenzot
hiazoline−６−sufonic acid）〕を添加した。室温で3
0分間放置した後、96ウェルプレート用吸光度計を用い
て405nmの吸光度を測定し、CD18抗原発現の指標とし
た。

結果を以下の第５表に示す。

上記の第５表のように、化合物Ａは濃度依存的にヒト
末梢血好中球上のCD18発現を抑制し、そのIC₅₀値は約２
μＭであった。

「産業上の利用可能性」上記実験例などから明らかなように、本化合物はシク
ロスポリンなどの免疫抑制剤の作用を増強し、また、細
胞接着阻害作用を示すことから、免疫抑制作用増強剤ま
たは細胞接着阻害剤として有用である。

本発明を製剤処方例および各種実験例を含む明細書に
より具体的に説明したが、本発明の精神と範囲に反しな
い限り、種々に変更、修飾することができる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (31)優先権主張番号特願平4−129455 (32)優先日平４(1992)４月21日 (33)優先権主張国日本（ＪＰ） (72)発明者小松弘嗣埼玉県入間市小谷田３丁目７番25号吉富製薬株式会社東京研究所内 (72)発明者長澤真理子埼玉県入間市小谷田３丁目７番25号吉富製薬株式会社東京研究所内 (72)発明者荒谷秀和福岡県築上郡吉富町大字小祝955番地吉富製薬株式会社中央研究所内 (72)発明者寺澤道夫福岡県築上郡吉富町大字小祝955番地吉富製薬株式会社中央研究所内 (72)発明者森脇稔福岡県築上郡吉富町大字小祝955番地吉富製薬株式会社中央研究所内 (56)参考文献特開平２−243691（ＪＰ，Ａ) 特開平２−256682（ＪＰ，Ａ) 特開平２−275883（ＪＰ，Ａ) 特開平１−156982（ＪＰ，Ａ) Ｂｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ. （1991），Ｖｏｌ．102，Ｐ．239−245 Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．（1991），Ｖｏｌ．34，Ｐ．1440−1446 (58)調査した分野(Int.Cl.⁶，ＤＢ名) C07D 495/00 - 495/14 A61K 31/55 ＣＡ（ＳＴＮ) ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ) ＭＥＤＬＩＮＥ（ＳＴＮ) ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ)

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】４−（２−クロロフェニル）−２−（２−
（４−イソブチルフェニル）エチル）−6,9−ジメチル
−6H−チエノ〔3,2−ｆ〕〔1,2,4〕トリアゾロ〔4,3−
ａ〕〔1,4〕ジアゼピン、その光学異性体、または
（＋）−６−（２−クロロフェニル）−３−シクロプロ
パンカルボニル−8,11−ジメチル−2,3,4,5−テトラヒ
ドロ−8H−ピリド〔４′,3′:4,5〕チエノ〔3,2−ｆ〕
〔1,2,4〕トリアゾロ〔4,3−ａ〕〔1,4〕ジアゼピン、
またはそれらの医薬上許容されうる酸付加塩もしくは水
和物を有効成分とする免疫抑制作用増強剤。