JP2792396B2 - 塩基配列決定装置 - Google Patents
塩基配列決定装置Info
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- JP2792396B2 JP2792396B2 JP5141367A JP14136793A JP2792396B2 JP 2792396 B2 JP2792396 B2 JP 2792396B2 JP 5141367 A JP5141367 A JP 5141367A JP 14136793 A JP14136793 A JP 14136793A JP 2792396 B2 JP2792396 B2 JP 2792396B2
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- Japan
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- electrophoresis
- nucleic acid
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- acid fragment
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- Investigating, Analyzing Materials By Fluorescence Or Luminescence (AREA)
- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明はサンガー法によって処理
された核酸断片試料を末端塩基の種類毎に泳動路を分け
て電気泳動させるゲル電気泳動装置を備え、その溶出順
序から核酸の塩基配列を決定するオンライン式の塩基配
列決定装置に関するものである。
された核酸断片試料を末端塩基の種類毎に泳動路を分け
て電気泳動させるゲル電気泳動装置を備え、その溶出順
序から核酸の塩基配列を決定するオンライン式の塩基配
列決定装置に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】オンライン式塩基配列決定装置では、電
気泳動ゲルから溶出する核酸断片試料を検出するため
に、サンガー法によって処理されたラベルされた核酸断
片試料を溶出順に検出している。ラベル物質としてはオ
フライン方法で使用されていたラジオアイソトープを使
用することが検討されたが、装置が大型になり、取扱い
も不便なことから、蛍光ラベルを用いる方法（Nature
誌、Vol.321, pp.674-679(1986年)参照）や、安定同位
体ラベルを用いる方法（特開平２−１７６５５２号公報
参照）が行なわれている。
気泳動ゲルから溶出する核酸断片試料を検出するため
に、サンガー法によって処理されたラベルされた核酸断
片試料を溶出順に検出している。ラベル物質としてはオ
フライン方法で使用されていたラジオアイソトープを使
用することが検討されたが、装置が大型になり、取扱い
も不便なことから、蛍光ラベルを用いる方法（Nature
誌、Vol.321, pp.674-679(1986年)参照）や、安定同位
体ラベルを用いる方法（特開平２−１７６５５２号公報
参照）が行なわれている。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】ラジオアイソトープに
よらない上記の塩基配列決定方法では、サンガー法によ
る前処理の前に、ＤＮＡの一部を蛍光物質や同位体でラ
ベルする処理工程が必要になる。ラベルの方法（物質や
部位）によっては、サンガー反応自体に影響を及ぼし、
またラジオアイソトープによる方法で用いていた固有の
プライマやその他の化学物質が使えなくなるなどの問題
がある。
よらない上記の塩基配列決定方法では、サンガー法によ
る前処理の前に、ＤＮＡの一部を蛍光物質や同位体でラ
ベルする処理工程が必要になる。ラベルの方法（物質や
部位）によっては、サンガー反応自体に影響を及ぼし、
またラジオアイソトープによる方法で用いていた固有の
プライマやその他の化学物質が使えなくなるなどの問題
がある。
【０００４】最近になって、蛍光物質や同位体でラベル
しないＤＮＡ断片試料をゲル充填キャピラリー電気泳動
させ、泳動中のＤＮＡ断片試料に紫外線を照射して励起
し、発生した蛍光を検出する試みが報告されている（An
al. Chem.,Vol. 65, No. 2,153-157 (1993)参照)。しか
し、ゲルからも蛍光が発生してバックグラウンドが大き
くなるだけでなく、ＤＮＡ断片試料から発生した蛍光が
ゲルで吸収されるため、ＤＮＡ断片試料からの蛍光を検
出するのは容易ではない。ＤＮＡ断片試料からの蛍光発
生効率を上げるために、キャピラリー内を強酸性又は強
アルカリ性にしているが、例えば強酸性のゲル内を泳動
させるとＤＮＡ断片試料が分解してしまい、サンガー法
により調製した末端塩基別のＤＮＡ断片試料の状態を維
持できなくなる。したがって、強酸性にしたゲル充填キ
ャピラリーを用いた電気泳動ではラベルしないＤＮＡ断
片試料からの蛍光を仮りに感度よく検出できたとして
も、ＤＮＡの塩基配列を決定することはできない。
しないＤＮＡ断片試料をゲル充填キャピラリー電気泳動
させ、泳動中のＤＮＡ断片試料に紫外線を照射して励起
し、発生した蛍光を検出する試みが報告されている（An
al. Chem.,Vol. 65, No. 2,153-157 (1993)参照)。しか
し、ゲルからも蛍光が発生してバックグラウンドが大き
くなるだけでなく、ＤＮＡ断片試料から発生した蛍光が
ゲルで吸収されるため、ＤＮＡ断片試料からの蛍光を検
出するのは容易ではない。ＤＮＡ断片試料からの蛍光発
生効率を上げるために、キャピラリー内を強酸性又は強
アルカリ性にしているが、例えば強酸性のゲル内を泳動
させるとＤＮＡ断片試料が分解してしまい、サンガー法
により調製した末端塩基別のＤＮＡ断片試料の状態を維
持できなくなる。したがって、強酸性にしたゲル充填キ
ャピラリーを用いた電気泳動ではラベルしないＤＮＡ断
片試料からの蛍光を仮りに感度よく検出できたとして
も、ＤＮＡの塩基配列を決定することはできない。
【０００５】本発明はオンライン式塩基配列決定装置に
おいて、螢光物質や同位体でラベルする必要をなくすこ
とを目的とするものである。
おいて、螢光物質や同位体でラベルする必要をなくすこ
とを目的とするものである。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明では、電気泳動部
から溶出する核酸断片試料を強酸性環境下に導き、その
強酸性環境下の核酸断片試料に紫外線を照射して核酸断
片試料から蛍光を発生させ、その蛍光を検出することに
より塩基配列を決定する。溶出した核酸断片試料を導く
強酸性環境はｐＨ０.１〜３.０、好ましくはｐＨ１.０
付近の酸性液中である。
から溶出する核酸断片試料を強酸性環境下に導き、その
強酸性環境下の核酸断片試料に紫外線を照射して核酸断
片試料から蛍光を発生させ、その蛍光を検出することに
より塩基配列を決定する。溶出した核酸断片試料を導く
強酸性環境はｐＨ０.１〜３.０、好ましくはｐＨ１.０
付近の酸性液中である。
【０００７】
【作用】核酸断片試料はｐＨ０.１〜３.０の環境に置く
と、２２０〜３２０ｎｍの紫外光で励起することによっ
て３４０〜３９０ｎｍの蛍光を発することが本発明者ら
により見出された。これは、酸性下で核酸断片が分解し
てアデノシンやグアノシンが生成し、その生成したアデ
ノシンやグアノシンが２２０〜３２０ｎｍの紫外光で励
起されて蛍光を発するものである。
と、２２０〜３２０ｎｍの紫外光で励起することによっ
て３４０〜３９０ｎｍの蛍光を発することが本発明者ら
により見出された。これは、酸性下で核酸断片が分解し
てアデノシンやグアノシンが生成し、その生成したアデ
ノシンやグアノシンが２２０〜３２０ｎｍの紫外光で励
起されて蛍光を発するものである。
【０００８】サンガー法によって前処理された核酸断片
試料は、ポリアクリルアミド中の電気泳動によって分離
され、配列に対応した順序で溶出する。溶出した核酸断
片試料は拡散しない間に強酸性下に置かれて分解し、ア
デノシンやグアノシンを生成する。そこに２２０〜３２
０ｎｍの光が当てられると３４０〜３９０ｎｍの蛍光を
生じて、核酸断片試料が検出される。これにより無ラベ
ルによる核酸断片試料の塩基配列決定が可能になる。
試料は、ポリアクリルアミド中の電気泳動によって分離
され、配列に対応した順序で溶出する。溶出した核酸断
片試料は拡散しない間に強酸性下に置かれて分解し、ア
デノシンやグアノシンを生成する。そこに２２０〜３２
０ｎｍの光が当てられると３４０〜３９０ｎｍの蛍光を
生じて、核酸断片試料が検出される。これにより無ラベ
ルによる核酸断片試料の塩基配列決定が可能になる。
【０００９】
【実施例】図１は一実施例を概略的に表わしたものであ
る。泳動管２はキャピラリにポリアクリルアミドゲルが
充填されたものであり、サンガー法によって処理された
ＤＮＡ断片試料の末端塩基Ａ（アデニン），Ｇ（グアニ
ン），Ｃ（シトシン），Ｔ（チミン）毎に用意されてい
る。各泳動管２の上端はカソード電極槽４中の電解液６
に浸されており、各泳動管２の上端開口がサンプル投入
場所となっている。各泳動管２の下端部には強酸性溶液
をさや流として流すさや流部１０が設けられており、さ
や流部１０にはｐＨ０.１〜３.０、好ましくはｐＨ１.
０の硫酸溶液が連続的に流されて泳動管２の下端出口近
傍１２に硫酸溶液のさや流を形成している。さや流部１
０は石英ガラスなど紫外線を透過させ、その透過紫外線
では蛍光を発生しない材質で形成されている。キャピラ
リ泳動管の末端をさや流中に置くことはすでに行なわれ
ており、例えば Anal. Chem., Vol. 63, No. 24, 2835-
2841 (1991)にも記載されている。
る。泳動管２はキャピラリにポリアクリルアミドゲルが
充填されたものであり、サンガー法によって処理された
ＤＮＡ断片試料の末端塩基Ａ（アデニン），Ｇ（グアニ
ン），Ｃ（シトシン），Ｔ（チミン）毎に用意されてい
る。各泳動管２の上端はカソード電極槽４中の電解液６
に浸されており、各泳動管２の上端開口がサンプル投入
場所となっている。各泳動管２の下端部には強酸性溶液
をさや流として流すさや流部１０が設けられており、さ
や流部１０にはｐＨ０.１〜３.０、好ましくはｐＨ１.
０の硫酸溶液が連続的に流されて泳動管２の下端出口近
傍１２に硫酸溶液のさや流を形成している。さや流部１
０は石英ガラスなど紫外線を透過させ、その透過紫外線
では蛍光を発生しない材質で形成されている。キャピラ
リ泳動管の末端をさや流中に置くことはすでに行なわれ
ており、例えば Anal. Chem., Vol. 63, No. 24, 2835-
2841 (1991)にも記載されている。
【００１０】各泳動管２に泳動電圧を印加するために、
カソード電極槽４の電解液６中にはカソード電極２８が
設けられ、各泳動管の下端部のさや流部１０の硫酸溶液
中にはアノード電極３０がそれぞれ設けられており、カ
ソード電極２８とアノード電極３０の間には高圧電源３
２によって泳動電圧が印加される。
カソード電極槽４の電解液６中にはカソード電極２８が
設けられ、各泳動管の下端部のさや流部１０の硫酸溶液
中にはアノード電極３０がそれぞれ設けられており、カ
ソード電極２８とアノード電極３０の間には高圧電源３
２によって泳動電圧が印加される。
【００１１】泳動管２の下端出口近傍はさや流中にあ
り、そこに紫外光源からの２２０〜３２０ｎｍ、好まし
くは２６０ｎｍ付近の光１４がレンズ１６で集光されて
照射される。４つの泳動管２の下端部は一直線上に配列
されており、１番目の泳動管下端部を透過した励起光が
２番目の泳動管下端部を照射し、さらに３番目、４番目
と順次照射し、かつ照射効率を上げるために、照射後の
励起光は別のレンズで再び集光されて次の泳動管下端部
付近を照射するようになっている。これにより、１つの
光源で４本の泳動管下端部付近を全て照射する。最後の
キャピラリー下端部付近から透過した光を受けるため
に、光トラップ１８が設けられている。
り、そこに紫外光源からの２２０〜３２０ｎｍ、好まし
くは２６０ｎｍ付近の光１４がレンズ１６で集光されて
照射される。４つの泳動管２の下端部は一直線上に配列
されており、１番目の泳動管下端部を透過した励起光が
２番目の泳動管下端部を照射し、さらに３番目、４番目
と順次照射し、かつ照射効率を上げるために、照射後の
励起光は別のレンズで再び集光されて次の泳動管下端部
付近を照射するようになっている。これにより、１つの
光源で４本の泳動管下端部付近を全て照射する。最後の
キャピラリー下端部付近から透過した光を受けるため
に、光トラップ１８が設けられている。
【００１２】紫外光源としては、例えばアルゴンイオン
レーザ（２７５.４ｎｍ）、ＫｒＦレーザ（波長２４８
ｎｍ）、ＸｅＣｌレーザ（波長３０８ｎｍ）、ガラスＹ
ＡＧレーザ（波長２６３〜２６６ｎｍ）又は種々の可視
レーザの第２高調波などを用いることができる。
レーザ（２７５.４ｎｍ）、ＫｒＦレーザ（波長２４８
ｎｍ）、ＸｅＣｌレーザ（波長３０８ｎｍ）、ガラスＹ
ＡＧレーザ（波長２６３〜２６６ｎｍ）又は種々の可視
レーザの第２高調波などを用いることができる。
【００１３】励起光照射方向と直交する方向に蛍光を取
り出して検出するために、各泳動管下端部には蛍光を集
光させるレンズ２０と、レンズ２０で集光されて取り出
された蛍光から３４０〜３９０ｎｍの蛍光を選択する干
渉フィルタ２２、干渉フィルタ２２で分光された蛍光を
検出する光電子増倍管２４とが検出系として設けられて
いる。各泳動管毎の光電子増倍管２４で検出された蛍光
は光電子増倍管で電気信号に変換され、Ａ／Ｄ変換器で
デジタル信号に変換された後、コンピュータ２６に取り
込まれる。検出系は４本の泳動管２に対してそれぞれ設
置されており、末端塩基Ａ，Ｇ，Ｃ，Ｔ別のＤＮＡ断片
試料がそれぞれの泳動管２に投入されるので、４本の光
電子増倍管２４の出力を順に同定することにより塩基配
列が決定される。
り出して検出するために、各泳動管下端部には蛍光を集
光させるレンズ２０と、レンズ２０で集光されて取り出
された蛍光から３４０〜３９０ｎｍの蛍光を選択する干
渉フィルタ２２、干渉フィルタ２２で分光された蛍光を
検出する光電子増倍管２４とが検出系として設けられて
いる。各泳動管毎の光電子増倍管２４で検出された蛍光
は光電子増倍管で電気信号に変換され、Ａ／Ｄ変換器で
デジタル信号に変換された後、コンピュータ２６に取り
込まれる。検出系は４本の泳動管２に対してそれぞれ設
置されており、末端塩基Ａ，Ｇ，Ｃ，Ｔ別のＤＮＡ断片
試料がそれぞれの泳動管２に投入されるので、４本の光
電子増倍管２４の出力を順に同定することにより塩基配
列が決定される。
【００１４】図２はｐＨ１.０の環境下におけるＤＮＡ
の蛍光スペクトルを示したものであり、励起波長は２６
５ｎｍである。この蛍光スペクトルは分光光度計(島津
ＲＦ−５４０)で測定したものである。ピーク波長は３
７０ｎｍであるが、スペクトルは３４０〜３９０付近に
広く分布している。
の蛍光スペクトルを示したものであり、励起波長は２６
５ｎｍである。この蛍光スペクトルは分光光度計(島津
ＲＦ−５４０)で測定したものである。ピーク波長は３
７０ｎｍであるが、スペクトルは３４０〜３９０付近に
広く分布している。
【００１５】図１の実施例の動作について説明する。末
端塩基Ａ用の泳動管２の下端出口に電気泳動によってＤ
ＮＡ断片が溶出してくれば、さや流によって直ちにｐＨ
１.０の環境下に置かれる。そして、泳動管の下端出口
付近が２６０ｎｍの紫外線で照射されているので、３４
０〜３９０ｎｍ付近の蛍光を発生する。その蛍光は各泳
動管毎に設けられた検出系の光電子増倍管２４で検出さ
れる。末端塩基Ｇ，Ｃ，Ｔ用の各泳動管２についても同
様であり、それぞれで溶出したＤＮＡ断片がその発生す
る蛍光によって検出され、コンピュータ２６で塩基配列
が決定される。本発明はスラブゲルを用いた電気泳動装
置にも適用することができる。本発明は実施例に限定さ
れるものではなく、特許請求の範囲内で種々に変形する
ことができる。
端塩基Ａ用の泳動管２の下端出口に電気泳動によってＤ
ＮＡ断片が溶出してくれば、さや流によって直ちにｐＨ
１.０の環境下に置かれる。そして、泳動管の下端出口
付近が２６０ｎｍの紫外線で照射されているので、３４
０〜３９０ｎｍ付近の蛍光を発生する。その蛍光は各泳
動管毎に設けられた検出系の光電子増倍管２４で検出さ
れる。末端塩基Ｇ，Ｃ，Ｔ用の各泳動管２についても同
様であり、それぞれで溶出したＤＮＡ断片がその発生す
る蛍光によって検出され、コンピュータ２６で塩基配列
が決定される。本発明はスラブゲルを用いた電気泳動装
置にも適用することができる。本発明は実施例に限定さ
れるものではなく、特許請求の範囲内で種々に変形する
ことができる。
【００１６】
【発明の効果】本発明ではオンラインで核酸断片の塩基
配列を決定するに際し、試料を螢光物質や同位体でラベ
ルする必要がなくなるので、操作が極めて容易になる。
配列を決定するに際し、試料を螢光物質や同位体でラベ
ルする必要がなくなるので、操作が極めて容易になる。
【図１】一実施例を示す概略構成図である。
【図２】ＤＮＡのｐＨ１.０における蛍光スペクトルを
示す図である。
示す図である。
２ 泳動管 ４ カソード電極槽 ６ 電解液 １０ さや流部 １２ 泳動管下端部 １４ 励起光 ２４ 光電子増倍管 ３２ 高圧電源
フロントページの続き (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) G01N 21/64 G01N 27/447
Claims (1)
- 【請求項１】 サンガー法によって処理された核酸断片
試料を末端塩基の種類毎に泳動路を分けて電気泳動させ
るゲル電気泳動装置を備え、その溶出順序から核酸の塩
基配列を決定する装置において、電気泳動部から溶出す
る核酸断片試料を強酸性環境下に導く手段と、その強酸
性環境下の核酸断片試料に紫外線を照射する手段と、照
射された核酸断片試料から発生する蛍光を検出する手段
とを備えたことを特徴とする塩基配列決定装置。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5141367A JP2792396B2 (ja) | 1992-05-29 | 1993-05-19 | 塩基配列決定装置 |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP16350792 | 1992-05-29 | ||
| JP4-163507 | 1992-05-29 | ||
| JP5141367A JP2792396B2 (ja) | 1992-05-29 | 1993-05-19 | 塩基配列決定装置 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0643136A JPH0643136A (ja) | 1994-02-18 |
| JP2792396B2 true JP2792396B2 (ja) | 1998-09-03 |
Family
ID=26473613
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP5141367A Expired - Fee Related JP2792396B2 (ja) | 1992-05-29 | 1993-05-19 | 塩基配列決定装置 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2792396B2 (ja) |
-
1993
- 1993-05-19 JP JP5141367A patent/JP2792396B2/ja not_active Expired - Fee Related
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| ＡＮＡＬ．ＣＨＥＭ．，ＶＯＬ．６３，ＮＯ．２４，Ｐ．２８３５−２８４１ （１９９１） |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0643136A (ja) | 1994-02-18 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| FPAY | Renewal fee payment (prs date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20080619 Year of fee payment: 10 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (prs date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20090619 Year of fee payment: 11 |
|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |