JP2717924B2 - 安定化されたペルオキシダーゼ溶液 - Google Patents
安定化されたペルオキシダーゼ溶液Info
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、酵素免疫測定法（以下
ＥＩＡと略す）などに用いることのできるペルオキシダ
ーゼまたはペルオキシダーゼと配位子との結合体を含有
した溶液の腐敗防止方法，安定化方法に関する。
ＥＩＡと略す）などに用いることのできるペルオキシダ
ーゼまたはペルオキシダーゼと配位子との結合体を含有
した溶液の腐敗防止方法，安定化方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】溶液状態でのペルオキシダーゼの安定化
方法としては特開平３−８１９２２号公報においてメチ
ルチオフェノールなどを用いる方法がある。また防腐効
果をもたせる方法としては特開平２−１３５０９０号公
報にアジ化ナトリウムとペルオキシダーゼの安定化剤を
共存させる方法が記載されている。
方法としては特開平３−８１９２２号公報においてメチ
ルチオフェノールなどを用いる方法がある。また防腐効
果をもたせる方法としては特開平２−１３５０９０号公
報にアジ化ナトリウムとペルオキシダーゼの安定化剤を
共存させる方法が記載されている。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】しかしながら、メチル
チオフェノールのみを用いた場合は、ペルオキシダーゼ
の安定性は向上するものの１〜３ケ月間という長期間で
は酵素溶液を腐敗することなく保存することは困難であ
った。一方防腐剤としては各種化合物が知られている
が、サリチル酸ナトリウムはタンパク質溶液の防腐効果
が弱く、エチル水銀チオサリチル酸ナトリウムは、防腐
効果はあるものの水銀系の為、使用条件に制約がある。
アジ化ナトリムとペルオキシダーゼ安定化剤を用いた場
合は、防腐効果は向上するものの１〜３ケ月間という長
期間酵素活性を安定に保存することは困難であった。ま
た、いずれの条件でも冷蔵，冷凍以外の条件（１０℃以
上）での保存では、急速な酵素の活性低下をもたらす
為、保存が困難であった。
チオフェノールのみを用いた場合は、ペルオキシダーゼ
の安定性は向上するものの１〜３ケ月間という長期間で
は酵素溶液を腐敗することなく保存することは困難であ
った。一方防腐剤としては各種化合物が知られている
が、サリチル酸ナトリウムはタンパク質溶液の防腐効果
が弱く、エチル水銀チオサリチル酸ナトリウムは、防腐
効果はあるものの水銀系の為、使用条件に制約がある。
アジ化ナトリムとペルオキシダーゼ安定化剤を用いた場
合は、防腐効果は向上するものの１〜３ケ月間という長
期間酵素活性を安定に保存することは困難であった。ま
た、いずれの条件でも冷蔵，冷凍以外の条件（１０℃以
上）での保存では、急速な酵素の活性低下をもたらす
為、保存が困難であった。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、さらに安
定性のよいペルオキシダーゼもしくはペルオキシダーゼ
と配位子との結合体の含有溶液を開発すべく鋭意検討し
た結果本発明に到達した。
定性のよいペルオキシダーゼもしくはペルオキシダーゼ
と配位子との結合体の含有溶液を開発すべく鋭意検討し
た結果本発明に到達した。
【０００５】すなわち、本発明はペルオキシダーゼ（ａ
１）もしくはペルオキシダーゼと配位子との結合体（ａ
２）からなる溶液（Ａ）に、下記一般式（１）（式中Ｒ
は水素原子、炭素数１〜４のアルキル基、ハロゲン原
子、シアノ基、フェニル基、アミノ基、ニトロ基もしく
はモルホリノ基で、−Ｓ−ＣＨ2−ＲがＯＸ基に対して
オルト位またはパラ位に置換されている。式中Ｘは水素
原子、ナトリウム原子、カリウム原子を表す）で示され
るフェノール系化合物（Ｂ）とアジ化ナトリウム（Ｃ）
とを共存させることを特徴とする安定化されたペルオキ
シダーゼ溶液（Ｉ）（第１発明）；ならびにペルオキシ
ダーゼ（ａ１）もしくはペルオキシダーゼと配位子との
結合体（ａ２）からなる溶液（Ａ）のｐＨが５．５〜
６．５であることを特徴とする安定化されたペルオキシ
ダーゼ溶液（ＩＩ）（第２発明）に関するものである。
１）もしくはペルオキシダーゼと配位子との結合体（ａ
２）からなる溶液（Ａ）に、下記一般式（１）（式中Ｒ
は水素原子、炭素数１〜４のアルキル基、ハロゲン原
子、シアノ基、フェニル基、アミノ基、ニトロ基もしく
はモルホリノ基で、−Ｓ−ＣＨ2−ＲがＯＸ基に対して
オルト位またはパラ位に置換されている。式中Ｘは水素
原子、ナトリウム原子、カリウム原子を表す）で示され
るフェノール系化合物（Ｂ）とアジ化ナトリウム（Ｃ）
とを共存させることを特徴とする安定化されたペルオキ
シダーゼ溶液（Ｉ）（第１発明）；ならびにペルオキシ
ダーゼ（ａ１）もしくはペルオキシダーゼと配位子との
結合体（ａ２）からなる溶液（Ａ）のｐＨが５．５〜
６．５であることを特徴とする安定化されたペルオキシ
ダーゼ溶液（ＩＩ）（第２発明）に関するものである。
【０００６】
【化２】
【０００７】本第１発明の一般式（１）で示されるフェ
ノール系化合物（Ｂ）として好ましい化合物としては、
４−（メチルチオ）フェノール、４−（エチルチオ）フ
ェノール、４−（プロピルチオ）フェノール、４−（ブ
チルチオ）フェノール、４−（ペンチルチオ）フェノー
ル、４−（フルオロメチルチオ）フェノール、４−（ブ
ロモメチルチオ）フェノール、４−（クロロメチルチ
オ）フェノール、４−（ヨードメチルチオ）フェノー
ル、４−（シアノメチルチオ）フェノール、４−（ベン
ジルチオ）フェノール、４−（アミノメチルチオ）フェ
ノール、４−（ニトロメチルチオ）フェノール、４−
（モルホリノメチルチオ）フェノールなどが挙げられ
る。さらに好ましくは、４−（メチルチオ）フェノー
ル、４−（エチルチオ）フェノール、４−（プロピルチ
オ）フェノール、４−（ブチルチオ）フェノール、４−
（ペンチルチオ）フェノール、４−（フルオロメチルチ
オ）フェノールである。
ノール系化合物（Ｂ）として好ましい化合物としては、
４−（メチルチオ）フェノール、４−（エチルチオ）フ
ェノール、４−（プロピルチオ）フェノール、４−（ブ
チルチオ）フェノール、４−（ペンチルチオ）フェノー
ル、４−（フルオロメチルチオ）フェノール、４−（ブ
ロモメチルチオ）フェノール、４−（クロロメチルチ
オ）フェノール、４−（ヨードメチルチオ）フェノー
ル、４−（シアノメチルチオ）フェノール、４−（ベン
ジルチオ）フェノール、４−（アミノメチルチオ）フェ
ノール、４−（ニトロメチルチオ）フェノール、４−
（モルホリノメチルチオ）フェノールなどが挙げられ
る。さらに好ましくは、４−（メチルチオ）フェノー
ル、４−（エチルチオ）フェノール、４−（プロピルチ
オ）フェノール、４−（ブチルチオ）フェノール、４−
（ペンチルチオ）フェノール、４−（フルオロメチルチ
オ）フェノールである。
【０００８】該フェノール化合物（Ｂ）の添加量として
は、本第１発明の溶液中１０-4〜１重量／容量％（以
下、％と略す）、好ましくは１０-3〜０．５％である。
また、これらの化合物は単独で添加することも、２種以
上を組合わせて添加することも可能である。
は、本第１発明の溶液中１０-4〜１重量／容量％（以
下、％と略す）、好ましくは１０-3〜０．５％である。
また、これらの化合物は単独で添加することも、２種以
上を組合わせて添加することも可能である。
【０００９】アジ化ナトリウム（Ｃ）の添加量として
は、本第１発明の溶液中１０-3〜１％、好ましくは１０
-2〜０．５％である。アジ化ナトリウム（Ｃ）は、必ず
上述のフェノール系化合物（Ｂ）と共存させることが必
要である。
は、本第１発明の溶液中１０-3〜１％、好ましくは１０
-2〜０．５％である。アジ化ナトリウム（Ｃ）は、必ず
上述のフェノール系化合物（Ｂ）と共存させることが必
要である。
【００１０】本第１発明にけるペルオキシダーゼ（ａ
１）としては、西洋ワサビ、牛乳、白血球、赤血球等か
ら抽出されたペルオキシダーゼが挙げられ、特に好まし
くは西洋ワサビのペルオキシダーゼである。
１）としては、西洋ワサビ、牛乳、白血球、赤血球等か
ら抽出されたペルオキシダーゼが挙げられ、特に好まし
くは西洋ワサビのペルオキシダーゼである。
【００１１】また、ペルオキシダーゼは遊離のペルオキ
シダーゼ（ａ１）でも、配位子に結合したペルオキシダ
ーゼ（ａ２）でも、また両者の混合物でもよい。
シダーゼ（ａ１）でも、配位子に結合したペルオキシダ
ーゼ（ａ２）でも、また両者の混合物でもよい。
【００１２】この配位子は、特に限定されるものではな
いが、例えばα−フェトプロテイン（ＡＦＰ）、癌胎児
性抗原（ＣＥＡ）などの腫瘍マーカー抗原およびその抗
体；ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ＨＣＧ）、甲状腺刺激
ホルモン（ＴＳＨ）、黄体形成ホルモン（ＬＨ）などの
ホルモン抗原およびその抗体；サイロキシン、トリヨー
ドサイロニンなどのハプテンおよびその抗体；プロテイ
ンＡ、アビジン、ビオチンなどが挙げられる。また、抗
体としてはポリクローナル抗体でもモノクローナル抗体
のいずれでもよい。
いが、例えばα−フェトプロテイン（ＡＦＰ）、癌胎児
性抗原（ＣＥＡ）などの腫瘍マーカー抗原およびその抗
体；ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ＨＣＧ）、甲状腺刺激
ホルモン（ＴＳＨ）、黄体形成ホルモン（ＬＨ）などの
ホルモン抗原およびその抗体；サイロキシン、トリヨー
ドサイロニンなどのハプテンおよびその抗体；プロテイ
ンＡ、アビジン、ビオチンなどが挙げられる。また、抗
体としてはポリクローナル抗体でもモノクローナル抗体
のいずれでもよい。
【００１３】ペルオキシダーゼ（ａ１）と配位子を結合
させる方法を例示すると、例えばグルタルアルデヒド
を用い、ペルオキシダーゼ（ａ１）と抗体、抗原のアミ
ノ基の間で結合する方法［アブラメス等：イムノケミス
トリー、第６巻、４３ページ（１９６９年）］、ペル
オキシダーゼ（ａ１）に含まれる糖鎖を過ヨウ素酸で開
裂させアルデヒド基を導入した後、抗体、抗原のアミノ
基との間にシッフ塩基を形成させ結合する方法［ナカネ
等：ジェー、ヒストケム、サイトケム、第２２巻、１０
８４ページ（１９７４年）］などがある。
させる方法を例示すると、例えばグルタルアルデヒド
を用い、ペルオキシダーゼ（ａ１）と抗体、抗原のアミ
ノ基の間で結合する方法［アブラメス等：イムノケミス
トリー、第６巻、４３ページ（１９６９年）］、ペル
オキシダーゼ（ａ１）に含まれる糖鎖を過ヨウ素酸で開
裂させアルデヒド基を導入した後、抗体、抗原のアミノ
基との間にシッフ塩基を形成させ結合する方法［ナカネ
等：ジェー、ヒストケム、サイトケム、第２２巻、１０
８４ページ（１９７４年）］などがある。
【００１４】本発明のペルオキシダーゼ含有溶液（Ｉ）
のｐＨは、５.５〜６.５で、好ましくはｐＨ５.９〜６.
１である。緩衝液としてはこのｐＨを維持できる緩衝液
で、本発明の溶液に用いられる溶媒としては、例えばリ
ン酸緩衝液、トリス緩衝液、バルビタール緩衝液などの
緩衝液が挙げられるが、緩衝液の種類は特に限定される
ものではなく、その目的、用途に応じて最も適した緩衝
液の種類を選択すればよい。
のｐＨは、５.５〜６.５で、好ましくはｐＨ５.９〜６.
１である。緩衝液としてはこのｐＨを維持できる緩衝液
で、本発明の溶液に用いられる溶媒としては、例えばリ
ン酸緩衝液、トリス緩衝液、バルビタール緩衝液などの
緩衝液が挙げられるが、緩衝液の種類は特に限定される
ものではなく、その目的、用途に応じて最も適した緩衝
液の種類を選択すればよい。
【００１５】本第１発明のペルオキシダーゼ溶液（Ｉ）
の調製方法において、調製時におけるアジ化ナトリウム
（Ｃ）によるペルオキシダーゼ（ａ１）および配位子に
結合したペルオキシダーゼ（ａ２）の酵素活性の低下を
防止する為に、フェノール系化合物（Ｂ）は、ペルオキ
シダーゼ（ａ１）および配位子に結合したペルオキシダ
ーゼ（ａ２）を加える前に、添加溶解することが好まし
い。
の調製方法において、調製時におけるアジ化ナトリウム
（Ｃ）によるペルオキシダーゼ（ａ１）および配位子に
結合したペルオキシダーゼ（ａ２）の酵素活性の低下を
防止する為に、フェノール系化合物（Ｂ）は、ペルオキ
シダーゼ（ａ１）および配位子に結合したペルオキシダ
ーゼ（ａ２）を加える前に、添加溶解することが好まし
い。
【００１６】本第１発明において、必要により血清ある
いは血清由来蛋白を添加したほうがより一層ペルオキシ
ダーゼ溶液（Ｉ）の安定化に効果がある場合がある。こ
の場合、かかる血清としては家兎血清、人血清、馬血
清、牛胎児血清、牛血清、マウス血清、ラット血清など
が挙げられ、また血清由来蛋白としては牛血清アルブミ
ン（以下ＢＳＡと略す）、家兎血清アルブミン、人ガン
マグロブリン、馬ガンマグロブリン、牛ガンマグロブリ
ン、マウスガンマグロブリン、ラットガンマグロブリン
またはガンマグロブリンの酵素分解物などが挙げられ
る。血清または血清由来蛋白の添加量は、血清の場合溶
液中０．１〜５０％、血清由来蛋白の場合０．０１〜１
０％用いるのが好ましい。
いは血清由来蛋白を添加したほうがより一層ペルオキシ
ダーゼ溶液（Ｉ）の安定化に効果がある場合がある。こ
の場合、かかる血清としては家兎血清、人血清、馬血
清、牛胎児血清、牛血清、マウス血清、ラット血清など
が挙げられ、また血清由来蛋白としては牛血清アルブミ
ン（以下ＢＳＡと略す）、家兎血清アルブミン、人ガン
マグロブリン、馬ガンマグロブリン、牛ガンマグロブリ
ン、マウスガンマグロブリン、ラットガンマグロブリン
またはガンマグロブリンの酵素分解物などが挙げられ
る。血清または血清由来蛋白の添加量は、血清の場合溶
液中０．１〜５０％、血清由来蛋白の場合０．０１〜１
０％用いるのが好ましい。
【００１７】また本発明において、シュークロース、ラ
クトース、マンニトールなどの糖類、ホウ酸、ホウ砂な
どの無機質、界面活性剤類、カゼイン、ゼラチンのよう
な血清由来でない蛋白質をそれぞれの適量含有させ用い
るのが好ましい。
クトース、マンニトールなどの糖類、ホウ酸、ホウ砂な
どの無機質、界面活性剤類、カゼイン、ゼラチンのよう
な血清由来でない蛋白質をそれぞれの適量含有させ用い
るのが好ましい。
【００１８】かくして得られた本発明による溶液はＥＩ
Ａ用キットなど、保存安定性を要求される用途向けに好
適である。
Ａ用キットなど、保存安定性を要求される用途向けに好
適である。
【００１９】また、本第２発明は、ペルオキシダーゼ
（ａ１）もしくはペルオキシダーゼと配位子との結合体
（ａ２）からなる溶液（Ａ）のｐＨが５．５〜６．５で
あることを特徴とする安定化されたペルオキシダーゼ溶
液（ＩＩ）に関するものである。
（ａ１）もしくはペルオキシダーゼと配位子との結合体
（ａ２）からなる溶液（Ａ）のｐＨが５．５〜６．５で
あることを特徴とする安定化されたペルオキシダーゼ溶
液（ＩＩ）に関するものである。
【００２０】本発明の溶液（Ａ）のｐＨは、５.５〜６.
５で、好ましくはｐＨ５.９〜６.１である。緩衝液とし
てはこのｐＨを維持できる緩衝液で、前記第１発明のペ
ルオキシダーゼ溶液（Ｉ）で使用したものが同様に使用
できる。
５で、好ましくはｐＨ５.９〜６.１である。緩衝液とし
てはこのｐＨを維持できる緩衝液で、前記第１発明のペ
ルオキシダーゼ溶液（Ｉ）で使用したものが同様に使用
できる。
【００２１】また、ペルオキシダーゼ（ａ１）、ペルオ
キシダーゼと配位子との結合体（ａ２）、配位子、ペル
オキシダーゼと配位子との結合方法なども前記第１発明
のペルオキシダーゼ溶液（Ｉ）で使用したものが同様に
使用できる。
キシダーゼと配位子との結合体（ａ２）、配位子、ペル
オキシダーゼと配位子との結合方法なども前記第１発明
のペルオキシダーゼ溶液（Ｉ）で使用したものが同様に
使用できる。
【００２２】
【実施例】以下、実施例により本発明をさらに説明する
が、本発明はこれに限定されるものではない。 実施例１ １．フェノール系化合物，アジ化ナトリウム含有ペルオ
キシダーゼ標識抗ＡＦＰ抗体溶液（ア）の調製方法およ
び安定性評価 ペルオキシダーゼ標識抗ＡＦＰ抗体を０．５％ＢＳＡ含
有０．０２（モル／リットル）のリン酸緩衝液（ｐＨ
７．０）に溶解した。この溶液に４−（メチルチオ）フ
ェノール、４−（エチルチオ）フェノール、４−（プロ
ピルチオ）フェノール、４−（ブチルチオ）フェノー
ル、４−（シアノメチルチオ）フェノール、４−（フル
オロメチルチオ）フェノール、パラヨードフェノール、
パラクロロフェノール、フェノール、Ｎ-エチル-Ｎ-
（２-ヒドロキシ-３-スルホプロピル）-ｍ-トルイジン
各々を０．１％濃度になるよう添加溶解し次にアジ化ナ
トリウムを０．１％濃度になるよう添加した上記溶液、
またこれらフェノール系化合物のみまたはアジ化ナトリ
ウムのみを添加した上記溶液、サリチル酸ナトリウムを
０．１％添加した上記溶液、さらになにも添加していな
い上記溶液を同時に用意した。次いで調製したペルオキ
シダーゼ標識抗ＡＦＰ抗体溶液（ア）を４℃で保存し、
１ヶ月毎（３ケ月間）にアッセイ方法（ｉ）に準じて各
標識抗体溶液（ア）のアッセイ吸光度を測定した。その
結果を吸光度の低減の度合に基づき検討開始時のペルオ
キシダーゼ活性を１００％とし残存活性を百分率で算出
し、評価結果を表１に示した。
が、本発明はこれに限定されるものではない。 実施例１ １．フェノール系化合物，アジ化ナトリウム含有ペルオ
キシダーゼ標識抗ＡＦＰ抗体溶液（ア）の調製方法およ
び安定性評価 ペルオキシダーゼ標識抗ＡＦＰ抗体を０．５％ＢＳＡ含
有０．０２（モル／リットル）のリン酸緩衝液（ｐＨ
７．０）に溶解した。この溶液に４−（メチルチオ）フ
ェノール、４−（エチルチオ）フェノール、４−（プロ
ピルチオ）フェノール、４−（ブチルチオ）フェノー
ル、４−（シアノメチルチオ）フェノール、４−（フル
オロメチルチオ）フェノール、パラヨードフェノール、
パラクロロフェノール、フェノール、Ｎ-エチル-Ｎ-
（２-ヒドロキシ-３-スルホプロピル）-ｍ-トルイジン
各々を０．１％濃度になるよう添加溶解し次にアジ化ナ
トリウムを０．１％濃度になるよう添加した上記溶液、
またこれらフェノール系化合物のみまたはアジ化ナトリ
ウムのみを添加した上記溶液、サリチル酸ナトリウムを
０．１％添加した上記溶液、さらになにも添加していな
い上記溶液を同時に用意した。次いで調製したペルオキ
シダーゼ標識抗ＡＦＰ抗体溶液（ア）を４℃で保存し、
１ヶ月毎（３ケ月間）にアッセイ方法（ｉ）に準じて各
標識抗体溶液（ア）のアッセイ吸光度を測定した。その
結果を吸光度の低減の度合に基づき検討開始時のペルオ
キシダーゼ活性を１００％とし残存活性を百分率で算出
し、評価結果を表１に示した。
【００２３】
【表１】
【００２４】表１の結果から、４−（メチルチオ）フェ
ノール、４−（エチルチオ）フェノール、４−（プロピ
ルチオ）フェノール、４−（ブチルチオ）フェノール、
４−（シアノメチルチオ）フェノール、４−（フルオロ
メチルチオ）フェノールを添加したペルオキシダーゼ標
識抗体溶液ではアジ化ナトリウム共存下でも活性低下も
なく良好な結果が得られた。また従来から使用されてい
るパラヨードフェノール、パラクロロフェノール、フェ
ノール、Ｎ-エチル-Ｎ-（２-ヒドロキシ-３-スルホプロ
ピル）-ｍ-トルイジンを添加した溶液に比べて安定な結
果が得られた。
ノール、４−（エチルチオ）フェノール、４−（プロピ
ルチオ）フェノール、４−（ブチルチオ）フェノール、
４−（シアノメチルチオ）フェノール、４−（フルオロ
メチルチオ）フェノールを添加したペルオキシダーゼ標
識抗体溶液ではアジ化ナトリウム共存下でも活性低下も
なく良好な結果が得られた。また従来から使用されてい
るパラヨードフェノール、パラクロロフェノール、フェ
ノール、Ｎ-エチル-Ｎ-（２-ヒドロキシ-３-スルホプロ
ピル）-ｍ-トルイジンを添加した溶液に比べて安定な結
果が得られた。
【００２５】２．フェノール系化合物，アジ化ナトリウ
ム含有ペルオキシダーゼ標識抗ＡＦＰ抗体溶液（ア）の
防腐効果の評価 １．に準じて調製したペルオキシダーゼ標識抗ＡＦＰ抗
体溶液（ア）を調製後３７℃で保存し、１週間毎に溶液
の濁りから腐敗程度を評価した。検討開始時の腐敗がな
いクリアーな状態を−、腐敗の進行程度を＋の数で表
し、表２に示した。 （＋：濁りあり，＋＋：やや白
濁，＋＋＋以上：沈澱あり）
ム含有ペルオキシダーゼ標識抗ＡＦＰ抗体溶液（ア）の
防腐効果の評価 １．に準じて調製したペルオキシダーゼ標識抗ＡＦＰ抗
体溶液（ア）を調製後３７℃で保存し、１週間毎に溶液
の濁りから腐敗程度を評価した。検討開始時の腐敗がな
いクリアーな状態を−、腐敗の進行程度を＋の数で表
し、表２に示した。 （＋：濁りあり，＋＋：やや白
濁，＋＋＋以上：沈澱あり）
【００２６】
【表２】
【００２７】表２の結果から、４−（メチルチオ）フェ
ノール、４−（プロピルチオ）フェノール、４−（シア
ノメチルチオ）フェノール、パラヨードフェノール、パ
ラクロロフェノール、フェノールにアジ化ナトリウムを
共存させた標識抗体溶液は、アジ化ナトリウムと同等な
防腐効果を示す結果が得られた。
ノール、４−（プロピルチオ）フェノール、４−（シア
ノメチルチオ）フェノール、パラヨードフェノール、パ
ラクロロフェノール、フェノールにアジ化ナトリウムを
共存させた標識抗体溶液は、アジ化ナトリウムと同等な
防腐効果を示す結果が得られた。
【００２８】３．フェノール系化合物，アジ化ナトリウ
ム含有ペルオキシダーゼ標識抗ＡＦＰ抗体溶液（ｐＨ５
〜８）（イ）の調製方法および安定性評価 ペルオキシダーゼ標識抗ＡＦＰ抗体を０．５％ＢＳＡ、
０．１％４−（メチルチオ）フェノール、０．１％アジ
化ナトリウム含有０．０２（モル／リットル）の各種ｐ
Ｈのリン酸緩衝液（ｐＨ６．０、６．５、７．０、７．
５、８．０）及び各種ｐＨの酢酸緩衝液（ｐＨ５．０、
５．５）に溶解した。また４−（メチルチオ）フェノー
ル，アジ化ナトリウムを添加しない上記溶液（ｐＨ７．
０）を同時に用意した。次いで調製したペルオキシダー
ゼ標識抗ＡＦＰ抗体溶液（イ）を２５℃で保存し、１ヶ
月毎（３ケ月間）にアッセイ方法（ｉ）に準じて各標識
抗体溶液（イ）のアッセイ吸光度を測定した。その結果
を吸光度の低減の度合に基づき検討開始時のペルオキシ
ダーゼ活性を１００％とし残存活性を百分率で算出し、
評価結果を表３に示した。
ム含有ペルオキシダーゼ標識抗ＡＦＰ抗体溶液（ｐＨ５
〜８）（イ）の調製方法および安定性評価 ペルオキシダーゼ標識抗ＡＦＰ抗体を０．５％ＢＳＡ、
０．１％４−（メチルチオ）フェノール、０．１％アジ
化ナトリウム含有０．０２（モル／リットル）の各種ｐ
Ｈのリン酸緩衝液（ｐＨ６．０、６．５、７．０、７．
５、８．０）及び各種ｐＨの酢酸緩衝液（ｐＨ５．０、
５．５）に溶解した。また４−（メチルチオ）フェノー
ル，アジ化ナトリウムを添加しない上記溶液（ｐＨ７．
０）を同時に用意した。次いで調製したペルオキシダー
ゼ標識抗ＡＦＰ抗体溶液（イ）を２５℃で保存し、１ヶ
月毎（３ケ月間）にアッセイ方法（ｉ）に準じて各標識
抗体溶液（イ）のアッセイ吸光度を測定した。その結果
を吸光度の低減の度合に基づき検討開始時のペルオキシ
ダーゼ活性を１００％とし残存活性を百分率で算出し、
評価結果を表３に示した。
【００２９】
【表３】
【００３０】表３の結果から、ｐＨを５．５、６．０、
６．５に調製した４−（メチルチオ）フェノール、アジ
化ナトリウム含有ペルオキシダーゼ標識抗体溶液は、ｐ
Ｈ５．０、７．０、７．５、８．０に比べ安定な結果が
得られた。
６．５に調製した４−（メチルチオ）フェノール、アジ
化ナトリウム含有ペルオキシダーゼ標識抗体溶液は、ｐ
Ｈ５．０、７．０、７．５、８．０に比べ安定な結果が
得られた。
【００３１】４．アッセイ方法（ｉ） アッセイ用試験管にＡＦＰ６４０ｎｇ／ｍｌ溶液３０μ
ｌと上記個々のペルオキシダーゼ標識抗ＡＦＰ抗体溶液
を５００μｌ加え、均一溶液とした後、抗ＡＦＰ抗体
（ウサギ）結合ガラスビーズを加え、３７℃で６０分間
インキュベートした。反応終了後、未反応物をアスピレ
ーターで除去し、さらに生理食塩水１ｍｌで３回洗浄し
た。その後、０．３％ｏ−フェニレンジアミン、０．０
４％過酸化水素含有の基質溶液を加え、３７℃で６０分
間インキュベートした。１Ｎ硫酸５ｍｌで反応を停止さ
せた後、各々について４９２ｎｍの吸光度を測定した。
ｌと上記個々のペルオキシダーゼ標識抗ＡＦＰ抗体溶液
を５００μｌ加え、均一溶液とした後、抗ＡＦＰ抗体
（ウサギ）結合ガラスビーズを加え、３７℃で６０分間
インキュベートした。反応終了後、未反応物をアスピレ
ーターで除去し、さらに生理食塩水１ｍｌで３回洗浄し
た。その後、０．３％ｏ−フェニレンジアミン、０．０
４％過酸化水素含有の基質溶液を加え、３７℃で６０分
間インキュベートした。１Ｎ硫酸５ｍｌで反応を停止さ
せた後、各々について４９２ｎｍの吸光度を測定した。
【００３２】実施例２ １．フェノール系化合物，アジ化ナトリウム含有ペルオ
キシダーゼ標識抗ＣＥＡモノクローナル抗体溶液（ウ）
の調製方法および安定性評価 ペルオキシダーゼ標識抗ＣＥＡモノクローナル抗体を
０．５％ＢＳＡ含有０．０２（モル／リットル）のリン
酸緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解した。この溶液に４−
（メチルチオ）フェノール、４−（エチルチオ）フェノ
ール、４−（プロピルチオ）フェノール、４−（ブチル
チオ）フェノール、４−（シアノメチルチルチオ）フェ
ノール、４−（フルオロメチルチオ）フェノール、パラ
ヨードフェノール、パラクロロフェノール、フェノー
ル、Ｎ-エチル-Ｎ-（２-ヒドロキシ-３-スルホプロピ
ル）-ｍ-トルイジン各々を０．１％濃度になるよう添加
溶解し次にアジ化ナトリウムを０．１％濃度になるよう
添加した上記溶液、また、これらフェノール系化合物の
みまたはアジ化ナトリウムのみを添加した上記溶液、さ
らになにも添加していない上記溶液を同時に用意した。
次いで調製したペルオキシダーゼ標識抗ＣＥＡモノクロ
ーナル抗体溶液（ウ）を４℃で保存し、１ヶ月毎（３ケ
月間）にアッセイ方法（ｉｉ）に準じて各標識抗体溶液
（ウ）のアッセイ吸光度を測定した。その結果を吸光度
の低減の度合に基づき検討開始時のペルオキシダーゼ活
性を１００％とし残存活性を百分率で算出し、評価結果
を表４に示した。
キシダーゼ標識抗ＣＥＡモノクローナル抗体溶液（ウ）
の調製方法および安定性評価 ペルオキシダーゼ標識抗ＣＥＡモノクローナル抗体を
０．５％ＢＳＡ含有０．０２（モル／リットル）のリン
酸緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解した。この溶液に４−
（メチルチオ）フェノール、４−（エチルチオ）フェノ
ール、４−（プロピルチオ）フェノール、４−（ブチル
チオ）フェノール、４−（シアノメチルチルチオ）フェ
ノール、４−（フルオロメチルチオ）フェノール、パラ
ヨードフェノール、パラクロロフェノール、フェノー
ル、Ｎ-エチル-Ｎ-（２-ヒドロキシ-３-スルホプロピ
ル）-ｍ-トルイジン各々を０．１％濃度になるよう添加
溶解し次にアジ化ナトリウムを０．１％濃度になるよう
添加した上記溶液、また、これらフェノール系化合物の
みまたはアジ化ナトリウムのみを添加した上記溶液、さ
らになにも添加していない上記溶液を同時に用意した。
次いで調製したペルオキシダーゼ標識抗ＣＥＡモノクロ
ーナル抗体溶液（ウ）を４℃で保存し、１ヶ月毎（３ケ
月間）にアッセイ方法（ｉｉ）に準じて各標識抗体溶液
（ウ）のアッセイ吸光度を測定した。その結果を吸光度
の低減の度合に基づき検討開始時のペルオキシダーゼ活
性を１００％とし残存活性を百分率で算出し、評価結果
を表４に示した。
【００３３】
【表４】
【００３４】表４の結果から、４−（メチルチオ）フェ
ノール、４−（エチルチオ）フェノール、４−（プロピ
ルチオ）フェノール、４−（ブチルチオ）フェノール、
４−（シアノメチルチオ）フェノール、４−（フルオロ
メチルチオ）フェノールを添加したペルオキシダーゼ溶
液ではアジ化ナトリウム共存下でも活性低下もなく良好
な結果が得られた。また従来から使用されているパラヨ
ードフェノール、パラクロロフェノール、フェノール、
Ｎ-エチル-Ｎ-（２-ヒドロキシ-３-スルホプロピル）-
ｍ-トルイジンを添加した溶液に比べ安定な結果が得ら
れた。
ノール、４−（エチルチオ）フェノール、４−（プロピ
ルチオ）フェノール、４−（ブチルチオ）フェノール、
４−（シアノメチルチオ）フェノール、４−（フルオロ
メチルチオ）フェノールを添加したペルオキシダーゼ溶
液ではアジ化ナトリウム共存下でも活性低下もなく良好
な結果が得られた。また従来から使用されているパラヨ
ードフェノール、パラクロロフェノール、フェノール、
Ｎ-エチル-Ｎ-（２-ヒドロキシ-３-スルホプロピル）-
ｍ-トルイジンを添加した溶液に比べ安定な結果が得ら
れた。
【００３５】２．フェノール系化合物，アジ化ナトリウ
ム含有ペルオキシダーゼ標識抗ＣＥＡモノクローナル抗
体溶液（ｐＨ５〜８）（エ）の調製方法および安定性評
価 ペルオキシダーゼ標識抗ＣＥＡモノクローナル抗体を
０．５％ＢＳＡ、０．１％４−（メチルチオ）フェノー
ル、０．１％アジ化ナトリウム含有０．０２（モル／リ
ットル）の各種ｐＨのリン酸緩衝液（ｐＨ６．０、６．
５、７．０、７．５、８．０）及び各種ｐＨの酢酸緩衝
液（ｐＨ５．０、５．５）に溶解した。また４−（メチ
ルチオ）フェノール，アジ化ナトリウムを添加しない緩
衝液（ｐＨ７．０）も同時に用意した。次いで調製した
ペルオキシダーゼ標識抗ＣＥＡモノクローナル抗体溶液
（エ）を２５℃で保存し、１ヶ月毎（３ケ月間）にアッ
セイ方法（ｉｉ）に準じて各標識抗体溶液（エ）のアッ
セイ吸光度を測定した。その結果を吸光度の低減の度合
に基づき検討開始時のペルオキシダーゼ活性を１００％
とし残存活性を百分率で算出し、評価結果を表５に示し
た。
ム含有ペルオキシダーゼ標識抗ＣＥＡモノクローナル抗
体溶液（ｐＨ５〜８）（エ）の調製方法および安定性評
価 ペルオキシダーゼ標識抗ＣＥＡモノクローナル抗体を
０．５％ＢＳＡ、０．１％４−（メチルチオ）フェノー
ル、０．１％アジ化ナトリウム含有０．０２（モル／リ
ットル）の各種ｐＨのリン酸緩衝液（ｐＨ６．０、６．
５、７．０、７．５、８．０）及び各種ｐＨの酢酸緩衝
液（ｐＨ５．０、５．５）に溶解した。また４−（メチ
ルチオ）フェノール，アジ化ナトリウムを添加しない緩
衝液（ｐＨ７．０）も同時に用意した。次いで調製した
ペルオキシダーゼ標識抗ＣＥＡモノクローナル抗体溶液
（エ）を２５℃で保存し、１ヶ月毎（３ケ月間）にアッ
セイ方法（ｉｉ）に準じて各標識抗体溶液（エ）のアッ
セイ吸光度を測定した。その結果を吸光度の低減の度合
に基づき検討開始時のペルオキシダーゼ活性を１００％
とし残存活性を百分率で算出し、評価結果を表５に示し
た。
【００３６】
【表５】
【００３７】表５の結果から、ｐＨを５．５、６．０、
６．５に調製した４−（メチルチオ）フェノール、アジ
化ナトリウム含有酵素標識抗体溶液（エ）は、ｐＨ５．
０、７．０、７．５、８．０に比べ安定である結果が得
られた。
６．５に調製した４−（メチルチオ）フェノール、アジ
化ナトリウム含有酵素標識抗体溶液（エ）は、ｐＨ５．
０、７．０、７．５、８．０に比べ安定である結果が得
られた。
【００３８】３．アッセイ方法（ｉｉ） アッセイ用試験管にＣＥＡ６０ｎｇ／ｍｌ溶液１００μ
ｌと上記個々の溶液を５００μｌ加え、均一溶液とした
後、抗ＣＥＡ抗体（ウサギ）結合ガラスビーズを加え、
３７℃で６０分間インキュベートした。反応終了後、未
反応物をアスピレーターで除去し、さらに生理食塩水１
ｍｌで３回洗浄した。その後０．３％ｏ−フェニレンジ
アミン、０．０４％過酸化水素含有の基質溶液を加え、
３７℃で６０分間インキュベートした。１Ｎ硫酸５ｍｌ
で反応を停止させた後、各々について４９２ｎｍの吸光
度を測定した。
ｌと上記個々の溶液を５００μｌ加え、均一溶液とした
後、抗ＣＥＡ抗体（ウサギ）結合ガラスビーズを加え、
３７℃で６０分間インキュベートした。反応終了後、未
反応物をアスピレーターで除去し、さらに生理食塩水１
ｍｌで３回洗浄した。その後０．３％ｏ−フェニレンジ
アミン、０．０４％過酸化水素含有の基質溶液を加え、
３７℃で６０分間インキュベートした。１Ｎ硫酸５ｍｌ
で反応を停止させた後、各々について４９２ｎｍの吸光
度を測定した。
【００３９】実施例３ １．ペルオキシダーゼ標識抗ＡＦＰ抗体溶液（ｐＨ５〜
８）（オ）の調製方法および安定性評価 ペルオキシダーゼ標識抗ＡＦＰ抗体を０．５％ＢＳＡ、
０．０２（モル／リットル）の各種ｐＨのリン酸緩衝液
（ｐＨ６．０、６．５、７．０、７．５、８．０）及び
各種ｐＨの酢酸緩衝液（ｐＨ５．０，５．５）に溶解し
た。また各標識抗体溶液（オ）は滅菌したメンブレン
（０．４５μｍポアーサイズ）で除菌後、２５℃で保存
し、１ヶ月毎（３ケ月間）にアッセイ方法（ｉ）に準じ
て各標識抗体溶液（オ）のアッセイ吸光度を測定した。
その結果を吸光度の低減の度合に基づき検討開始時のペ
ルオキシダーゼ活性を１００％とし残存活性を百分率で
算出し、評価結果を表６に示した。
８）（オ）の調製方法および安定性評価 ペルオキシダーゼ標識抗ＡＦＰ抗体を０．５％ＢＳＡ、
０．０２（モル／リットル）の各種ｐＨのリン酸緩衝液
（ｐＨ６．０、６．５、７．０、７．５、８．０）及び
各種ｐＨの酢酸緩衝液（ｐＨ５．０，５．５）に溶解し
た。また各標識抗体溶液（オ）は滅菌したメンブレン
（０．４５μｍポアーサイズ）で除菌後、２５℃で保存
し、１ヶ月毎（３ケ月間）にアッセイ方法（ｉ）に準じ
て各標識抗体溶液（オ）のアッセイ吸光度を測定した。
その結果を吸光度の低減の度合に基づき検討開始時のペ
ルオキシダーゼ活性を１００％とし残存活性を百分率で
算出し、評価結果を表６に示した。
【００４０】
【表６】
【００４１】表６の結果から、ｐＨを５．５、６．０、
６．５に調製したペルオキシダーゼ標識抗体溶液は、ｐ
Ｈ５．０、７．０、７．５、８．０に比べ安定である結
果が得られた。
６．５に調製したペルオキシダーゼ標識抗体溶液は、ｐ
Ｈ５．０、７．０、７．５、８．０に比べ安定である結
果が得られた。
【００４２】実施例４ １．ペルオキシダーゼ標識抗ＣＥＡモノクローナル抗体
溶液（ｐＨ５〜８）（カ）の調製方法および安定性評価 ペルオキシダーゼ標識抗ＣＥＡモノクローナル抗体を
０．５％ＢＳＡ、０．０２（モル／リットル）の各種ｐ
Ｈのリン酸緩衝液（ｐＨ６．０、６．５、７．０、７．
５、８．０）及び各種ｐＨの酢酸緩衝液（ｐＨ５．０、
５．５）に溶解した。また各標識抗体溶液（カ）は滅菌
したメンブレン（０．４５μｍポアーサイズ）で除菌
後、２５℃で保存し、１ヶ月毎（３ケ月間）にアッセイ
方法（ｉｉ）に準じて各標識抗体溶液（カ）のアッセイ
吸光度を測定した。その結果を吸光度の低減の度合に基
づき検討開始時のペルオキシダーゼ活性を１００％とし
残存活性を百分率で算出し、評価結果を表７に示した。
溶液（ｐＨ５〜８）（カ）の調製方法および安定性評価 ペルオキシダーゼ標識抗ＣＥＡモノクローナル抗体を
０．５％ＢＳＡ、０．０２（モル／リットル）の各種ｐ
Ｈのリン酸緩衝液（ｐＨ６．０、６．５、７．０、７．
５、８．０）及び各種ｐＨの酢酸緩衝液（ｐＨ５．０、
５．５）に溶解した。また各標識抗体溶液（カ）は滅菌
したメンブレン（０．４５μｍポアーサイズ）で除菌
後、２５℃で保存し、１ヶ月毎（３ケ月間）にアッセイ
方法（ｉｉ）に準じて各標識抗体溶液（カ）のアッセイ
吸光度を測定した。その結果を吸光度の低減の度合に基
づき検討開始時のペルオキシダーゼ活性を１００％とし
残存活性を百分率で算出し、評価結果を表７に示した。
【００４３】
【表７】
【００４４】表７の結果から、ｐＨを５．５、６．０、
６．５に調製したペルオキシダーゼ標識抗体溶液（カ）
は、ｐＨ５．０、７．０、７．５、８．０に比べ安定で
ある結果が得られた。
６．５に調製したペルオキシダーゼ標識抗体溶液（カ）
は、ｐＨ５．０、７．０、７．５、８．０に比べ安定で
ある結果が得られた。
【００４５】
【発明の効果】本発明により、遊離のペルオキシダーゼ
および／またはペルオキシダーゼ結合体溶液の酵素活性
を腐敗させることなく安定に長期間維持することが可能
となった。従って、ＥＩＡ用キットなど保存安定性を要
求される用途向けに好適である。
および／またはペルオキシダーゼ結合体溶液の酵素活性
を腐敗させることなく安定に長期間維持することが可能
となった。従って、ＥＩＡ用キットなど保存安定性を要
求される用途向けに好適である。
Claims (6)
- 【請求項１】 ペルオキシダーゼ（ａ１）もしくはペ
ルオキシダーゼと配位子との結合体（ａ２）からなる溶
液（Ａ）に、下記一般式（１）（式中Ｒは水素原子、炭
素数１〜４のアルキル基、ハロゲン原子、シアノ基、フ
ェニル基、アミノ基、ニトロ基もしくはモルホリノ基
で、−Ｓ−ＣＨ2−ＲがＯＸ基に対してオルト位または
パラ位に置換されている。Ｘは水素原子、ナトリウム原
子、カリウム原子を表す）で示されるフェノール系化合
物（Ｂ）とアジ化ナトリウム（Ｃ）とを共存させること
を特徴とする安定化されたペルオキシダーゼ溶液
（Ｉ）。 【化１】 - 【請求項２】 該フェノール系化合物（Ｂ）が溶液中
１０-4〜１重量／容量％、アジ化ナトリウムが１０-3〜
１重量／容量％含有される請求項１記載の溶液（Ｉ）。 - 【請求項３】 該配位子が抗原または抗体である請求
項１または２記載の溶液（Ｉ）。 - 【請求項４】 ｐＨが５．５〜６．５に保持された請
求項１〜３のいずれか記載の溶液（Ｉ）。 - 【請求項５】 ペルオキシダーゼ（ａ１）もしくはペ
ルオキシダーゼと配位子との結合体（ａ２）からなる溶
液（Ａ）のｐＨが５．５〜６．５であることを特徴とす
る安定化されたペルオキシダーゼ溶液（ＩＩ）。 - 【請求項６】 該配位子が抗原または抗体である請求
項５記載の溶液（ＩＩ）。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP30986593A JP2717924B2 (ja) | 1993-11-16 | 1993-11-16 | 安定化されたペルオキシダーゼ溶液 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP30986593A JP2717924B2 (ja) | 1993-11-16 | 1993-11-16 | 安定化されたペルオキシダーゼ溶液 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH07135975A JPH07135975A (ja) | 1995-05-30 |
| JP2717924B2 true JP2717924B2 (ja) | 1998-02-25 |
Family
ID=17998234
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP30986593A Expired - Fee Related JP2717924B2 (ja) | 1993-11-16 | 1993-11-16 | 安定化されたペルオキシダーゼ溶液 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2717924B2 (ja) |
-
1993
- 1993-11-16 JP JP30986593A patent/JP2717924B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH07135975A (ja) | 1995-05-30 |
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