JPH07114712B2 - 過酸化物分解性物質測定用指示薬および試薬キット - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は酵素免疫測定法、生化学
測定法等の分野に利用され、ペルオキシダーゼなどの過
酸化物分解性物質を測定する目的で使用されるベンジジ
ン系発色剤含有指示薬及びこの指示薬を含む試薬キット
に関する。

【０００２】

【従来の技術】従来、酵素免疫測定法等の分野において
は、水性媒体中に過酸化水素等の過酸化物及びベンジジ
ン系発色剤を溶解させた指示薬が知られている。この指
示薬は、過酸化物分解性物質やこの物質で標識された物
質等を測定対象として使用するものであり、この過酸化
物分解性物質の測定を、この物質と過酸化物との反応に
伴うベンジジン系発色剤の発色により行うものである。

【０００３】この指示薬に用いられるベンジジン系発色
剤は、更に以前より用いられているオルトフェニレンジ
アミン等の発色剤と異なり、低毒性のものもあり、高感
度であるという利点があるが、水には僅かしか溶解せ
ず、低温での保存安定性に問題があった。そのため、従
来メタノール、１−メチル−２−ピロリドン等の有機溶
剤を含む水溶液に、ベンジジン系発色剤を高濃度溶解さ
せ、使用前に緩衝液等で適当な濃度に希釈して使用され
ていた（例えば、特開昭６３−１９９２７０、特開昭６
２−５００８８２、特開昭５６−７６０４８、特開昭４
９−１３３０９２号公報）。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】しかしながら、従来の
有機溶剤を多く含むベンジジン系指示薬はこの指示薬を
調製する前の有機溶剤が高濃度の時は比較的安定である
のに対し、使用濃度に希釈して指示薬とした後は不安定
で、発色剤が析出する、ペルオキシダーゼ等の過酸化物
分解性物質不存在にも拘らず発色する（ブランク値が上
昇する）、発色度が低下する等の問題があり、使用濃度
で長期間保存出来ないことから、使用直前に調製するこ
とが必要であった。これらのことは、酵素免疫測定等の
分析手段としてその有用性を著しく制限するものであ
る。本発明はベンジジン系発色剤を測定用指示薬として
使用する際、感度が優れ、保存安定性の良好な水性媒体
を提供することを目的とするものである。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明者らは上記目的を
達成すべく鋭意検討した結果、ベンジジン系発色剤の可
溶化剤として、特定の化合物を用いることにより、指示
薬として長期保存でき、また、低濃度の過酸化物分解性
物質が正確に測定できる指示薬が得られることを見いだ
し、本発明に到達した。即ち、本発明は下記〈１〉及び
〈２〉により構成される。 〈１〉水性媒体中に過酸化物（Ａ）及びベンジジン系発
色剤（Ｂ）を溶解させてなり、過酸化物分解性物質
（Ｃ）の測定を（Ａ）と（Ｃ）との反応に伴う（Ｂ）の
発色により行うことができる指示薬において、更に下記
一般式（１）〜（４）で表される化合物から選ばれる少
なくとも１種の可溶化剤（Ｄ）を含有することを特徴と
する過酸化物分解性物質測定用指示薬。 （式中、Ｒ₁はそれぞれ独立に炭素数２〜４のアルキレ
ン基、Ｒ₂は炭素数１〜４のアルキル基、 Ｒ₃は水素又
は炭素数１〜４のアルキル基、 Ｒ₄は炭素数１〜４のア
ルキレン基、Ｒ₅はそれぞれ独立に水素または炭素数１
〜４のアルキル基、ｍは２〜２０の整数、ｎは１〜２０
の整数、Ｘ＋Ｙ＋Ｚは１〜２０の整数である） 〈２〉過酸化物分解性物質（Ｃ）もしくは（Ｃ）で標識
された化合物を構成品として含む試薬キットにおいて、
少なくとも上記〈１〉に記載の指示薬もしくはこの指示
薬の各成分を共に構成品とすることを特徴とする試薬キ
ット。

【０００６】本発明において、過酸化物（Ａ）として
は、例えば、過酸化水素、無機過酸化物（過ホウ酸ナト
リウム、過ホウ酸カリウム等）、有機過酸化物（クメン
パーオキシド、ｔ−ブチルパーオキシド、ジイソプロピ
ルベンゼンパーオキシド、２，５−ジメチルヘキサン−
２，５−パーオキシド等）が挙げられる。これらのうち
好ましいものは過酸化水素である。

【０００７】本発明において、ベンジジン系発色剤
（Ｂ）としては、例えば、ベンジジン、核置換ベンジジ
ン、Ｎ−，Ｎ’−置換ベンジジン及びこれらの塩酸塩等
の従来公知の各種ベンジジン系発色剤が挙げられる。
（Ｂ）の具体例としては、ベンジジン、ベンジジン・２
ＨＣｌ、Ｏ−トリジン、Ｏ−トリジン・２ＨＣｌ、Ｏ−
ジアニシジン、３，３’，５，５’−テトラ（低級アル
キル）ベンジジン、３，３’，５，５’−テトラ（低級
アルキル）ベンジジン・２ＨＣｌ・２Ｈ₂Ｏ、２，７−
ジアミノフルオレン及びこれらの混合物が挙げられる。
ここで用いる用語「低級アルキル」はメチル、エチル、
ｎ−プロピル及びイソプロピル、並びに種々のブチル、
ペンチル及びヘキシル異性体を初めとする炭素数１〜６
のアルキル基を意味する。これらのうち好ましいものは
３，３’，５，５’−テトラ（低級アルキル）ベンジジ
ンで、特に好ましいものは、３，３’，５，５’−テト
ラメチルベンジジンである。これらのベンジジン系発色
剤（Ｂ）の調製は、塩の形のものはそのまま水性媒体中
に添加することができ、塩の形でないものは少量の有機
溶剤に溶解して水性媒体中に添加するとよい。

【０００８】本発明において、過酸化物分解性物質
（Ｃ）としては、例えば、ペルオキシダーゼ（西洋ワサ
ビ、牛乳、白血球から抽出したペルオキシダーゼ）また
はカタラーゼ等の酵素類、該酵素と同様の作用を現わす
ヘモグロビン、チトクローム−Ｃ及びそれらの誘導体、
紫外線、有機及び無機金属塩が挙げられる。これらのう
ち好ましいものは、ペルオキシダーゼであり、特に好ま
しいものは、西洋ワサビから抽出したペルオキシダーゼ
である。

【０００９】本発明において、可溶化剤（Ｄ）として
は、下記一般式 （式中、Ｒ₁はそれぞれ独立に炭素数２〜４のアルキレ
ン基、Ｒ₂は炭素数１〜４のアルキル基、 Ｒ₃は水素又
は炭素数１〜４のアルキル基、 Ｒ₄は炭素数１〜４のア
ルキレン基、Ｒ₅はそれぞれ独立に水素または炭素数１
〜４のアルキル基、ｍは２〜２０の整数、ｎは１〜２０
の整数、Ｘ＋Ｙ＋Ｚは１〜２０の整数である）からなる
群より選ばれる１種以上の化合物が挙げられる。

【００１０】本発明において、可溶化剤（Ｄ）のうち一
般式（１）で表される化合物としては、 ジエチレング
リコール、トリエチレングリコール、テトラエチレング
リコール、ポリエチレングリコール２００〜８００（重
量平均分子量２００〜８００のオキシエチレン付加重合
物）、ジプロピレングリコール、トリプロピレングリコ
ール、ポリプロピレングリコール２００〜８００（重量
平均分子量２００〜８００のオキシプロピレン付加重合
物）、ポリオキシエチレン・ポリオキシプロピレン共重
合物等が挙げられる。これらのうち好ましいものは、ト
リエチレングリコール、テトラエチレングリコール、ポ
リエチレングリコール２００〜８００である。

【００１１】（Ｄ）のうち一般式（２）で表される化合
物としては、上記のエチレングリコール類もしくはプロ
ピレングリコール類の、モノもしくはジアルキル（例、
メチル、エチル、プロピル、ブチル）エーテル、ｎ−ブ
タノールのエチレンオキシド及びプロピレンオキシド共
重合物等が挙げられる。これらのうち好ましいものは、
エチレングリコールもしくはジエチレングリコールもし
くはトリエチレングリコールの、モノもしくはジメチル
エーテルである。

【００１２】（Ｄ）のうち一般式（３）で表される化合
物としては、グリセリンのエチレンオキシド付加重合
物、グリセリンのプロピレンオキシド付加重合物及びグ
リセリンのエチレンオキシド及びプロピレンオキシド付
加共重合物が挙げられる。これらのうち好ましいもの
は、グリセリンのエチレンオキシド付加重合物及びグリ
セリンのエチレンオキシド及びプロピレンオキシド付加
共重合物である。

【００１３】また、（Ｄ）のうち一般式（４）で表され
る化合物としては、２−メチル−２，４−ペンタンジオ
ール、２，４−ジメチル−２，４−ペンタンジオール、
２，５−ジメチル−２，５−ヘキサンジオールが挙げら
れる。これらのうち好ましいものは、２−メチル−２，
４−ペンタンジオールである。

【００１４】本発明の指示薬を構成する各成分の含有量
について説明する。本発明の指示薬中の過酸化物
（Ａ）、ベンジジン系発色剤（Ｂ）及び該可溶化剤
（Ｄ）の各濃度は、測定方法及び発色反応を進めるため
の条件によって最適濃度が設定されなくてはならない。
また、これら（Ａ）、（Ｂ）及び（Ｄ）の相互の濃度の
バランスも考慮するとよい。これらの前提はあるが、本
発明の指示薬中の各成分の含有量のうち、該過酸化物
（Ａ）は通常０．００５〜５．０ｍｇ／ｍｌ、好ましく
は０．０５〜０．２ｍｇ／ｍｌである。該発色剤（Ｂ）
は、通常０．０１〜１０．０ｍｇ／ｍｌ、好ましくは
０．０３〜２．０ｍｇ／ｍｌである。該可溶化剤（Ｄ）
は通常５．０〜８００ｍｇ／ｍｌ、好ましくは５０．０
〜５００ｍｇ／ｍｌである。

【００１５】本発明の指示薬を用いた過酸化物分解性物
質（Ｃ）の測定は、酸性サイド（ｐＨ２．５〜６．５）
で行われることが好ましく、特にｐＨ３．０〜５．５で
測定すると安定で良好な発色度が得られる。発色反応の
場として用いられる緩衝液は前記のｐＨを満足させるも
のであればどのような種類の緩衝液を用いることも可能
であるが、フタル酸水素カリウム／水酸化ナトリウム緩
衝液、クエン酸二ナトリウム／塩酸緩衝液、クエン酸二
水素カリウム／水酸化ナトリウム緩衝液、コハク酸／四
ホウ酸ナトリウム緩衝液、クエン酸水素カリウム／四ホ
ウ酸ナトリウム緩衝液、リン酸水素ナトリウム／クエン
酸緩衝液、酢酸ナトリウム／塩酸緩衝液、酢酸／酢酸ナ
トリウム緩衝液等が挙げられる。この際、好ましい緩衝
液濃度は０．１〜１００ｍＭ、特に１〜５０ｍＭであ
る。

【００１６】本発明の指示薬の調製方法としては、
（Ｄ）に（Ｂ）を直接添加してもよく、予め他の溶剤等
に（Ｂ）を高濃度に溶解させたものを添加してもよい。
これらに上記緩衝液、過酸化物（Ａ）及び過酸化物分解
性物質（Ｃ）を添加し、本発明の指示薬を得るが、特に
これに限定されるものではない。

【００１７】発色反応を行う際の温度は（Ｃ）の反応に
最も適した温度（ペルオキシダーゼ等の酵素の場合、通
常２０〜５０℃）で実施することが好ましい。

【００１８】測定の対象となる過酸化物分解性物質
（Ｃ）は遊離の状態でも、（Ｃ）により免疫活性物質な
どの結合性物質（例えば抗原、抗体、一本鎖核酸、ハプ
テン、プロテインＡ、アビジン及びビオチン）が標識さ
れた状態でもよく、この標識物質が更に他の物質と結合
後の複合体の状態であってもよい。

【００１９】本発明の試薬キットは、過酸化物分解性物
質（Ｃ）もしくは（Ｃ）で標識された物質とともに、少
なくとも本発明の指示薬もしくは本発明の指示薬の各構
成成分を構成品とするものである。ここで標識する物質
としては、上記に例示したような免疫活性物質などの結
合性物質を用いることができる。本発明の指示薬は、保
存安定性がよいため、この様に、本発明の試薬キットの
構成品とすることができ、そうすれば、従来のように指
示薬の各成分を使用の都度配合しなくともよい利点があ
る。また、本発明の指示薬の各成分の状態で本発明のキ
ットの構成品とすることもでき、使用時の配合は必要で
あるが、それでも、配合後の安定性が増加する等の利点
がある。

【００２０】以下、酵素免疫測定に利用される例とし
て、「酵素標識抗体」及び「本発明の指示薬」を構成品
として含むキットの例を挙げる。試験管、ガラスビー
ズ、プラスチックビーズ、マイクロパーティクル、ナイ
ロン膜、濾紙等の固相担体に抗体を予め結合させてお
く。これに試料を加え、測定対象物質である抗原と最初
の反応を行い、“担体結合抗体−抗原”の複合体を形成
する。未反応物を除去し、次に、先の複合体に親和性の
ある「酵素標識抗体」を加え、二番目の反応を行い、
“担体結合抗体−抗原−酵素標識抗体”なる複合体を形
成する。再度未反応物を除去し、最終的に担体に結合し
た酵素と本発明の指示薬と反応させ吸光度を測定する。
この吸光度は試料中の測定対象物質の量に比例するの
で、既知濃度の標準物質を測定して作成した検量線から
試料中の測定対象物質量を求めることができる。

【００２１】本発明の試薬キットは、例えば、酵素免疫
反応を利用し、α-フェトプロテイン（ＡＦＰ）、癌胎
児性蛋白（ＣＥＡ）、フェリチン等の腫瘍マーカー、甲
状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、黄体形成ホルモン（Ｌ
Ｈ）、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、インシュリン等の
ホルモン、コルチゾール、トリヨードサイロニン（Ｔ
3）、サイロキシン（Ｔ4）等のハプテンホルモン、ジゴ
キシン、テオフィリン等の薬物、細菌、ウイルス等の感
染性物質、肝炎抗体等に利用することができるが、必ず
しもこれに限定されるものではない。

【００２２】また、酵素免疫測定以外の検査試薬とし
て、「本発明の指示薬」を構成品として含むヘモグロビ
ン定量試薬キットの例を挙げる。「本発明の指示薬」、
過酸化ストロンチウムを混合する。その後、ヘモグロビ
ンを含む試料を添加して、一定時間反応する。吸光度を
ブランクを対照として測定する。既知濃度のヘモグロビ
ンを測定して作成した検量線から、試料中のヘモグロビ
ンの濃度を求める。

【００２３】

【実施例】以下実施例により本発明を更に説明するが、
本発明はこれに限定されるものではない。また、本発明
の指示薬は必要に応じて、種々の添加剤（例えば、キレ
ート剤のような安定剤、腐敗を防ぐ殺菌剤及び防腐剤、
界面活性剤、着色剤、消泡剤等）を添加することも可能
である。

【００２４】実施例１ 1) 指示薬［１］〜［１５］の調製 以下の組成のものを下記表１のように調製し、それぞれ
指示薬［１］〜［１５］を得た。 ３０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ５．１） 可溶化剤 ５％過酸化水素水 ３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン溶液
（３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン(同仁
化学製)をアセトンに溶解して２００ｍｇ／ｍｌに調製
したもの）

【００２５】

【表１】

【００２６】2) 比較の指示薬［比１］及び［比２］の
調製 可溶化剤としてメタノール又は１−メチル−２−ピロリ
ドンを用いた以外は上記と同様の方法でそれぞれ比較の
指示薬［比１］及び［比２］を得た。下記表２に示す。

【００２７】

【表２】

【００２８】3) ３，３’，５，５’−テトラメチルベ
ンジジンに対する可溶化剤の効果 指示薬の調製後の安定性（溶解性）を比較するため、指
示薬［１］〜［１５］及び［比１］、［比２］を調製直
後より１週間、１ケ月及び１年、４℃で保存し、結晶析
出の有無を調べた結果を下記表３に示す。

【００２９】

【表３】

【００３０】実施例２ 1) ペルオキシダーゼ溶液（ＰＯＤ溶液と略す）の調製 １％牛血清アルブミン、０．８５％ＮａＣｌ、ｐＨ７．
２、０．０２Ｍリン酸緩衝液（以下ＰＢＳと略す）１ｍ
ｌに、ペルオキシダーゼ（以下ＰＯＤと略す。東洋紡
製）０．５ｍｇを溶解し、さらに、ＰＢＳで５００倍に
希釈してＰＯＤ溶液（１μｇ／ｍｌ）を得た。

【００３１】2) 指示薬のブランク試験 実施例１出調製した指示薬［３］、［６］、［１４］及
び［比１］、［比２］の６５０ｎｍの吸光度を分光光度
計（島津製作所製、ＵＶ−１６０Ａ）を用いて、水を対
照にして測定した。更に、同様の指示薬を４℃及び２５
℃において、１、３、６ケ月間それぞれ保存したものに
ついても、同様に水を対照にしてブランクを測定した。
結果を下記表４に示す。

【００３２】

【表４】

【００３３】実施例３ 1) 指示薬の発色度試験 実施例１で調製した指示薬［３］、［６］、［１４］及
び［比１］、［比２］各３００μｌに、ＰＯＤ溶液を５
０μｌ添加し、３７℃、１５分間反応させた。その後、
分光光度計を用いて、６５０ｎｍの発色度を測定した。
更に、４℃及び２５℃において、１、３、６ケ月間それ
ぞれ保存した同様の指示薬についてもＰＯＤ溶液を反応
させ、ＰＯＤ溶液の代わりに水を添加して反応させた液
を対照として吸光度を測定した。その結果を下記表５に
併せて示す。

【００３４】

【表５】

【００３５】

【発明の効果】本発明の指示薬は次のような顕著な効果
を奏する。 （１）本発明の指示薬は保存安定性が良好なので、試薬
キットの構成品とすることができる。従来の指示薬は、
調製後不安定で、発色剤が析出する、ペルオキシダーゼ
等の過酸化物分解性物質不存在下にも拘らず、発色する
（ブランク値が上昇する）、発色度が低下するため、使
用直前に調製しなければならない等の問題があったのを
解決するものである。 （２）表面張力が低下し、機器測定による精度が上昇す
る。

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 水性媒体中に過酸化物（Ａ）及びベンジ
   ジン系発色剤（Ｂ）を溶解させてなり、過酸化物分解性
   物質（Ｃ）の測定を（Ａ）と（Ｃ）との反応に伴う
   （Ｂ）の発色により行うことができる指示薬において、
   更に下記一般式（１）〜（４）で表される化合物から選
   ばれる少なくとも１種の可溶化剤（Ｄ）を含有すること
   を特徴とする過酸化物分解性物質測定用指示薬。 （式中、Ｒ₁はそれぞれ独立に炭素数２〜４のアルキレ
   ン基、Ｒ₂は炭素数１〜４のアルキル基、 Ｒ₃は水素又
   は炭素数１〜４のアルキル基、 Ｒ₄は炭素数１〜４のア
   ルキレン基、Ｒ₅はそれぞれ独立に水素または炭素数１
   〜４のアルキル基、ｍは２〜２０の整数、ｎは１〜２０
   の整数、Ｘ＋Ｙ＋Ｚは１〜２０の整数である）
2. 【請求項２】 （Ｄ）の含有量が５〜８００ｍｇ／ｍｌ
   である請求項１記載の指示薬。
3. 【請求項３】 （Ｂ）が３，３’，５，５’−テトラメ
   チルベンジジンである請求項１又は２記載の指示薬。
4. 【請求項４】 （Ｂ）の含有量が０．０１〜１０．０mg
   /mlである請求項１〜３のいずれか記載の指示薬。
5. 【請求項５】 （Ｃ）がペルオキシダーゼである請求項
   １〜４のいずれか記載の指示薬。
6. 【請求項６】 過酸化物分解性物質（Ｃ）もしくは
   （Ｃ）で標識された物質を構成品として含む試薬キット
   において、少なくとも請求項１〜５のいずれか記載の指
   示薬もしくはこの指示薬の各成分を共に構成品とするこ
   とを特徴とする試薬キット。