JP2526179B2 - 溶液中のペルオキシダ―ゼ安定化法 - Google Patents
溶液中のペルオキシダ―ゼ安定化法Info
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- JP2526179B2 JP2526179B2 JP3047737A JP4773791A JP2526179B2 JP 2526179 B2 JP2526179 B2 JP 2526179B2 JP 3047737 A JP3047737 A JP 3047737A JP 4773791 A JP4773791 A JP 4773791A JP 2526179 B2 JP2526179 B2 JP 2526179B2
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、酵素免疫測定法（以下
ＥＩＡと略す）などに用いることのできるペルオキシダ
ーゼ又はペルオキシダーゼと配位子との結合体の溶液状
態での安定化方法に関する。
ＥＩＡと略す）などに用いることのできるペルオキシダ
ーゼ又はペルオキシダーゼと配位子との結合体の溶液状
態での安定化方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】溶液状態でのペルオキシダーゼの安定化
方法としては特開昭６１−２３９８９０号においてパラ
ヒドロキシフェニルカルボン酸を用いる方法が記載され
ている。
方法としては特開昭６１−２３９８９０号においてパラ
ヒドロキシフェニルカルボン酸を用いる方法が記載され
ている。
【０００３】
【発明が解決しょうとする課題】しかしながら、パラヒ
ドロキシフェニルカルボン酸を用いた場合、少量の添加
で１〜３ヶ月という長期間酵素活性を失う事なく保存す
ることは困難であった。
ドロキシフェニルカルボン酸を用いた場合、少量の添加
で１〜３ヶ月という長期間酵素活性を失う事なく保存す
ることは困難であった。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、さらに安
定性のよいペルオキシダーゼもしくはペルオキシダーゼ
と配位子との結合体の安定化法を開発すべく鋭意検討し
た結果本発明に到達した。
定性のよいペルオキシダーゼもしくはペルオキシダーゼ
と配位子との結合体の安定化法を開発すべく鋭意検討し
た結果本発明に到達した。
【０００５】すなわち、本発明はペルオキシダーゼもし
くはペルオキシダーゼと配位子との結合体を含有する溶
液に、下記一般式化２（式中Ｘは水素原子、ナトリウム
原子、カリウム原子を表す）で表されるフェノール系化
合物と、必要により血清あるいは血清由来蛋白を添加す
ることを特徴とする溶液中のペルオキシダーゼもしくは
ペルオキシダーゼと配位子との結合体の安定化法に関す
るものである。
くはペルオキシダーゼと配位子との結合体を含有する溶
液に、下記一般式化２（式中Ｘは水素原子、ナトリウム
原子、カリウム原子を表す）で表されるフェノール系化
合物と、必要により血清あるいは血清由来蛋白を添加す
ることを特徴とする溶液中のペルオキシダーゼもしくは
ペルオキシダーゼと配位子との結合体の安定化法に関す
るものである。
【０００６】
【化２】
【０００７】この一般式で示される化合物としては４−
（メチルチオ）フェノール、およびこのナトリウムもし
くはカリウム塩である。
（メチルチオ）フェノール、およびこのナトリウムもし
くはカリウム塩である。
【０００８】該フェノール化合物の添加量としては、本
発明の溶液中１０−４〜１ｗ／ｖ％、好ましくは１０
−３〜０．５ｗ／ｖ％である。また、これらの化合物は
単独で添加することも、複数個組合わせて添加すること
も可能である。
発明の溶液中１０−４〜１ｗ／ｖ％、好ましくは１０
−３〜０．５ｗ／ｖ％である。また、これらの化合物は
単独で添加することも、複数個組合わせて添加すること
も可能である。
【０００９】本発明においてペルオキシダーゼとして
は、西洋ワサビ、牛乳、白血球、赤血球等から抽出され
たペルオキシダーゼが挙げられ、特に好ましくは西洋ワ
サビのペルオキシダーゼである。
は、西洋ワサビ、牛乳、白血球、赤血球等から抽出され
たペルオキシダーゼが挙げられ、特に好ましくは西洋ワ
サビのペルオキシダーゼである。
【００１０】また、ペルオキシダーゼは遊離のペルオキ
シダーゼでも、免疫活性物質に結合したペルオキシダー
ゼでも、また両者の混合物でもよい。
シダーゼでも、免疫活性物質に結合したペルオキシダー
ゼでも、また両者の混合物でもよい。
【００１１】この免疫活性物質は、特に限定されるもの
ではないが、例えばα−フェトプロテイン（ＡＦＰ）、
癌胎児性抗原（ＣＥＡ）などの腫瘍マーカー抗原、およ
びその抗体、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ＨＣＧ）、甲
状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、黄体形成ホルモン（Ｌ
Ｈ）などのホルモン抗原およびその抗体、あるいはサイ
ロキシン、トリヨードサイロニンなどのハプテンおよび
その抗体、もしくはプロテインＡ、アビジン、ビオチン
などが挙げられる。また、抗体としてはポリクローナル
抗体でもモノクローナル抗体のいずれでもよい。
ではないが、例えばα−フェトプロテイン（ＡＦＰ）、
癌胎児性抗原（ＣＥＡ）などの腫瘍マーカー抗原、およ
びその抗体、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ＨＣＧ）、甲
状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、黄体形成ホルモン（Ｌ
Ｈ）などのホルモン抗原およびその抗体、あるいはサイ
ロキシン、トリヨードサイロニンなどのハプテンおよび
その抗体、もしくはプロテインＡ、アビジン、ビオチン
などが挙げられる。また、抗体としてはポリクローナル
抗体でもモノクローナル抗体のいずれでもよい。
【００１２】ペルオキシダーゼと抗体あるいは抗原を結
合させる方法を例示すると種々の公知の方法、例えばグ
ルタルアルデヒドを用い、ペルオキシダーゼと抗体、抗
原のアミノ基の間で結合する方法［アブラメス等：イム
ノケミストリー、第６巻、４３ページ（１９６９年）］
あるいは、ペルオキシダーゼに含まれる糖鎖を過ヨウ素
酸で開裂させアルデヒド基を導入した後、抗体、抗原の
アミノ基との間にシッフ塩基を形成させ結合する方法
［ナカネ等：ジェー、ヒストケム、サイトケム、第２２
巻、１０８４ページ（１９７４年）］などがある。
合させる方法を例示すると種々の公知の方法、例えばグ
ルタルアルデヒドを用い、ペルオキシダーゼと抗体、抗
原のアミノ基の間で結合する方法［アブラメス等：イム
ノケミストリー、第６巻、４３ページ（１９６９年）］
あるいは、ペルオキシダーゼに含まれる糖鎖を過ヨウ素
酸で開裂させアルデヒド基を導入した後、抗体、抗原の
アミノ基との間にシッフ塩基を形成させ結合する方法
［ナカネ等：ジェー、ヒストケム、サイトケム、第２２
巻、１０８４ページ（１９７４年）］などがある。
【００１３】本発明の溶液に用いられる溶媒としてはリ
ン酸緩衝液、トリス緩衝液、バルビタール緩衝液、炭酸
緩衝液などの緩衝液が挙げられる、緩衝液の種類および
そのｐＨは特に限定されるものではなく、その目的、用
途に応じて最も適した緩衝液の種類、ｐＨを選択するこ
とが肝要である。
ン酸緩衝液、トリス緩衝液、バルビタール緩衝液、炭酸
緩衝液などの緩衝液が挙げられる、緩衝液の種類および
そのｐＨは特に限定されるものではなく、その目的、用
途に応じて最も適した緩衝液の種類、ｐＨを選択するこ
とが肝要である。
【００１４】本発明において血清あるいは血清由来蛋白
を添加したほうがより一層ペルオキシダーゼの安定化に
効果がある場合がある。この場合、かかる血清としては
家兎血清、人血清、馬血清、牛胎児血清、牛血清、マウ
ス血清、ラット血清などが挙げられ、また血清由来蛋白
としては牛血清アルブミン（以下ＢＳＡと略す）、家兎
血清アルブミンなどが挙げられる。血清または血清由来
蛋白の添加量は、血清の場合溶液中０．１〜５０ｗ／ｖ
％、血清由来蛋白の場合０．０１〜１０ｗ／ｖ％用いる
のが好ましい。
を添加したほうがより一層ペルオキシダーゼの安定化に
効果がある場合がある。この場合、かかる血清としては
家兎血清、人血清、馬血清、牛胎児血清、牛血清、マウ
ス血清、ラット血清などが挙げられ、また血清由来蛋白
としては牛血清アルブミン（以下ＢＳＡと略す）、家兎
血清アルブミンなどが挙げられる。血清または血清由来
蛋白の添加量は、血清の場合溶液中０．１〜５０ｗ／ｖ
％、血清由来蛋白の場合０．０１〜１０ｗ／ｖ％用いる
のが好ましい。
【００１５】その他、シュークロース、ラクトース、マ
ンニトールなどの糖類、酵素免疫測定法において非特異
的吸着を防止するのに用いられる界面活性剤等、カゼイ
ン、ゼラチンような血清成分の影響を防止する血清由来
でない蛋白質、またはチメロサールなどの防腐剤をそれ
ぞれの適量含有させてもよい。
ンニトールなどの糖類、酵素免疫測定法において非特異
的吸着を防止するのに用いられる界面活性剤等、カゼイ
ン、ゼラチンような血清成分の影響を防止する血清由来
でない蛋白質、またはチメロサールなどの防腐剤をそれ
ぞれの適量含有させてもよい。
【００１６】かくして得られた本発明による溶液はＥＩ
Ａ用キットなど、保存安定性を要求される用途向けに好
適である。
Ａ用キットなど、保存安定性を要求される用途向けに好
適である。
【００１７】
【実施例】以下、実施例により本発明をさらに説明する
が、本発明はこれに限定されるものではない。 実施例１ １．ペルオキシダーゼ標識抗原溶液の調製 ペルオキシダーゼ標識サイロキシン（Ｔ４）を０．２％
ＢＳＡ含有０．０２（モル／リットル）バルビタール緩
衝液（ｐＨ８．６）に溶解した。この溶液に４−（メチ
ルチオ）フェノールを０．１（ｗ／ｖ％）濃度になるよ
う添加した。また、このフェノール系化合物を添加しな
い上記溶液も同時に用意した。次いで各溶液を４℃にて
３ヶ月保存した。
が、本発明はこれに限定されるものではない。 実施例１ １．ペルオキシダーゼ標識抗原溶液の調製 ペルオキシダーゼ標識サイロキシン（Ｔ４）を０．２％
ＢＳＡ含有０．０２（モル／リットル）バルビタール緩
衝液（ｐＨ８．６）に溶解した。この溶液に４−（メチ
ルチオ）フェノールを０．１（ｗ／ｖ％）濃度になるよ
う添加した。また、このフェノール系化合物を添加しな
い上記溶液も同時に用意した。次いで各溶液を４℃にて
３ヶ月保存した。
【００１８】２．安定性の評価 アッセイ用試験管にＴ３、Ｔ４フリー血清２０μｌと上
記の溶液を５００μｌ加え、均一溶液とした。次いで抗
Ｔ４抗体（ウサギ）結合ガラスビーズを加え、３７℃で
６０分間インキュベートした。反応終了後、未反応物を
アスピレーターで除去し、さらに生理食塩水１ｍｌで３
回洗浄した。その後、０．３％ｏ−フェニレンジアミ
ン、０．０４％過酸化水素含有の基質溶液を加え、３７
℃で６０分間インキュベートした。１Ｎ硫酸５ｍｌで反
応を停止させた後、４９２ｎｍの吸光度を測定した。本
測定をペルオキシダーゼ標識Ｔ４抗原を溶解した直後か
ら１ヶ月毎に実施した。その結果を吸光度の低減の度合
に基づき検討開始時のペルオキシダーゼ活性を１００％
とし残存活性を百分率で表１に示した。
記の溶液を５００μｌ加え、均一溶液とした。次いで抗
Ｔ４抗体（ウサギ）結合ガラスビーズを加え、３７℃で
６０分間インキュベートした。反応終了後、未反応物を
アスピレーターで除去し、さらに生理食塩水１ｍｌで３
回洗浄した。その後、０．３％ｏ−フェニレンジアミ
ン、０．０４％過酸化水素含有の基質溶液を加え、３７
℃で６０分間インキュベートした。１Ｎ硫酸５ｍｌで反
応を停止させた後、４９２ｎｍの吸光度を測定した。本
測定をペルオキシダーゼ標識Ｔ４抗原を溶解した直後か
ら１ヶ月毎に実施した。その結果を吸光度の低減の度合
に基づき検討開始時のペルオキシダーゼ活性を１００％
とし残存活性を百分率で表１に示した。
【００１９】
【表１】
【００２０】実施例２ １．ペルオキシダーゼ標識抗体溶液の調製 ペルオキシダーゼ標識抗ＣＥＡモノクローナル抗体を
０．０２（モル／リットル）リン酸緩衝液（ｐＨ７．
２）に溶解した。この溶液に４−（メチルチオ）フェノ
ールを０．１（ｗ／ｖ％）濃度になるよう添加溶解し
た。また、このフェノール系化合物を添加しない上記溶
液も同時に用意した。次いで各溶液を４℃にて３ヶ月保
存した。
０．０２（モル／リットル）リン酸緩衝液（ｐＨ７．
２）に溶解した。この溶液に４−（メチルチオ）フェノ
ールを０．１（ｗ／ｖ％）濃度になるよう添加溶解し
た。また、このフェノール系化合物を添加しない上記溶
液も同時に用意した。次いで各溶液を４℃にて３ヶ月保
存した。
【００２１】２．安定性の評価 アッセイ用試験管にＣＥＡ６０ｎｇ／ｍｌ溶液１００μ
ｌと上記の溶液を５００μｌ加え、均一溶液とした後抗
ＣＥＡ抗体（ウサギ）結合ガラスビーズを加え、３７℃
で６０分間インキュベートした。反応終了後、未反応物
をアスピレーターで除去し、さらに生理食塩水１ｍｌで
３回洗浄した。その後、０．３％ｏ−フェニレンジアミ
ン、０．０４％過酸化水素含有の基質溶液を加え、３７
℃で６０分間インキュベートした。１Ｎ硫酸５ｍｌで反
応を停止させた後、４９２ｎｍの吸光度を測定した。本
測定をペルオキシダーゼ標識抗ＣＥＡモノクローナル抗
体を溶解した直後から１ヶ月毎に実施した。その結果を
吸光度の低減の程度に基づき検討開始時のペルオキシダ
ーゼ活性を１００％とし残存活性を百分率で表２に示し
た。
ｌと上記の溶液を５００μｌ加え、均一溶液とした後抗
ＣＥＡ抗体（ウサギ）結合ガラスビーズを加え、３７℃
で６０分間インキュベートした。反応終了後、未反応物
をアスピレーターで除去し、さらに生理食塩水１ｍｌで
３回洗浄した。その後、０．３％ｏ−フェニレンジアミ
ン、０．０４％過酸化水素含有の基質溶液を加え、３７
℃で６０分間インキュベートした。１Ｎ硫酸５ｍｌで反
応を停止させた後、４９２ｎｍの吸光度を測定した。本
測定をペルオキシダーゼ標識抗ＣＥＡモノクローナル抗
体を溶解した直後から１ヶ月毎に実施した。その結果を
吸光度の低減の程度に基づき検討開始時のペルオキシダ
ーゼ活性を１００％とし残存活性を百分率で表２に示し
た。
【００２２】
【表２】
【発明の効果】本発明により、遊離のペルオキシダーゼ
および／またはペルオキシダーゼ結合体の酵素活性を長
期間維持することが可能となった。従って、ＥＩＡ用キ
ットなど保存安定性を要求される用途向けに好適であ
る。
および／またはペルオキシダーゼ結合体の酵素活性を長
期間維持することが可能となった。従って、ＥＩＡ用キ
ットなど保存安定性を要求される用途向けに好適であ
る。
Claims (4)
- 【請求項１】 ペルオキシダーゼもしくはペルオキシ
ダーゼと配位子との結合体を含有する溶液に、＿＿下記
一般式化１（＿＿式中Ｘは水素原子、ナトリウム原子、
カリウム原子を表す）で表されるフェノール系化合物
と、必要により血清あるいは血清由来蛋白を添加するこ
とを特徴とする溶液中のペルオキシダーゼもしくはペル
オキシダーゼと配位子との結合体の安定化法。 【化１】 - 【請求項２】 添加される化合物が溶液中１０−４〜
１（ｗ／ｖ％）含有される請求項１に記載の方法。 - 【請求項３】 ペルオキシダーゼと配位子との結合体
がペルオキシダーゼと抗原又は抗体の結合物である請求
項１または２記載の方法。 - 【請求項４】 血清が家兎血清、人血清、馬血清、牛
胎児血清、牛血清、マウス血清、ラット血清であり、血
清由来蛋白が牛血清アルブミン、家兎血清アルブミンで
ある請求項１または２もしくは３に記載の方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3047737A JP2526179B2 (ja) | 1991-02-19 | 1991-02-19 | 溶液中のペルオキシダ―ゼ安定化法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3047737A JP2526179B2 (ja) | 1991-02-19 | 1991-02-19 | 溶液中のペルオキシダ―ゼ安定化法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH05130866A JPH05130866A (ja) | 1993-05-28 |
| JP2526179B2 true JP2526179B2 (ja) | 1996-08-21 |
Family
ID=12783661
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3047737A Expired - Fee Related JP2526179B2 (ja) | 1991-02-19 | 1991-02-19 | 溶液中のペルオキシダ―ゼ安定化法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2526179B2 (ja) |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2727112B2 (ja) * | 1988-04-26 | 1998-03-11 | コニカ株式会社 | 安定なペルオキシダーゼ組成物及び安定な抗体組成物 |
-
1991
- 1991-02-19 JP JP3047737A patent/JP2526179B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH05130866A (ja) | 1993-05-28 |
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