JP2679780B2 - 血小板凝集抑制剤およびその製造方法 - Google Patents

血小板凝集抑制剤およびその製造方法

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Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は新規の血小板凝集抑
制剤およびその製造方法に係り、より詳しくは、本発明
は韓国産蝮（Ａｇｋｉｓｔｒｏｄｏｎ ｈａｌｙｓ ｂ
ｒｅｖｉｃａｕｄｕｓ）の毒素から分離した血小板凝集
抑制ポリペプチドおよびその精製方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】血栓症（ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ）と止血
（ｈｅｍｏｓｔａｓｉｓ）に影響する各種ペプチドある
いは蛋白質が蛇毒に存在していることが知られている。
それらは、人体内において血小板の異常な過多凝集によ
る血栓が形成される場合には致命的な血栓症をもたらす
ことがある。各種蛇毒からかかる血小板凝集を抑制する
か促進させるペプチドあるいは蛋白質が分離され、それ
らの生化学的および生物学的特性が解明された。
【０００３】血小板凝集メカニズムを察してみると、血
小板の表面膜（ｓｕｒｆａｃｅ ｍｅｍｂｒａｎｅ）に
存在する糖蛋白質であるＧＰIIｂ− IIIａ複合体と連関
された血小板受容体にフィブリノーゲンが結合すること
により血小板凝集が起こるが、ＧＰIIｂ− IIIａ受容体
に対するフィブリノーゲンの結合部位においてＡｒｇ−
Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ＲＧＤ）アミノ酸配列が非常に重要で
あることが知られている（参照：Ｒｏｕｓｌａｈｔｉ
ａｎｄ Ｐｉｅｒｓｃｈｂａｃｈｅｒ，Ｓｃｉｅｎｃ
ｅ，２３８：４９１〜４９７（１９８７））。従って、
前記アミノ酸配列を含んでいるペプチドあるいは蛋白質
はＧＰIIｂ− IIIａ受容体にフィブリノーゲンが結合す
ることを競合的に阻害することによって血小板凝集を抑
制できる。
【０００４】最初に蛇毒から分離されたＧＰIIｂ− III
ａ受容体に対する抑制剤は主に５ないし９ｋＤａの小さ
い蛋白質であったが（参照：Ｈｕａｎｇ ｅｔ ａ
ｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６２：１６１５７
〜１６１６３（１９８７）），その後分子量の大きい各
種血小板凝集抑制剤が蛇毒から分離された。これらの抑
制剤はすべてシスティン（Ｃｙｓ）残基に豊み、Ａｒｇ
−Ｇｌｙ−Ａｓｐアミノ酸配列によってＧＰIIｂ− III
ａ受容体に結合する共通の特徴を有している。最近、キ
ストリン（Ｋｉｓｔｒｉｎ）（参照：Ａｄｌｅｒ ｅｔ
ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３５：４４５〜４４８
（１９９１）；Ａｄｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈ
ｅｍｉｓｔｒｙ，３２：２８２〜２８９（１９９
３）），フラボリジン（Ｆｌａｖｏｒｉｄｉｎ）（参
照：Ｋｌａｕｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ
ｌ．，２３２：８９７〜９０６（１９９３）；Ｓｅｎｎ
ａｎｄ Ｋｌａｕｓ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２３
２：９０７〜９２５（１９９３）），アルボラブリン
（Ａｌｂｏｌａｂｒｉｎ）（参照：Ｊａｓｅｊａ ｅｔ
ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２１８：８
５３〜８６０（１９９３））およびエキスタチン（Ｅｃ
ｈｉｓｔａｔｉｎ）（参照：Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，
Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３０：１１６２５〜１１６
３６（１９９１）；Ｃｏｏｋｅｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ．
Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２０２：３２３〜３２８（１９
９１）；Ｃｏｏｋｅ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ
Ｅｎｇ．，５：４７３〜４７７（１９９２）；Ｓａｕｄ
ｅｋ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３
０：７３６９〜７３７２（１９９１）；Ｄａｌｖｉｔ
ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２０
２：３１５〜３２１（１９９１））などの血小板凝集抑
制剤の構造がＮＭＲにより明らかにされており、これら
の抑制剤によるＧＰIIｂ− IIIａ受容体へのフィブリノ
ーゲン結合妨害が動物モデルを用いて解明された（参
照：Ｃｏｌｌｅｎ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，７
６：１０１〜１０８（１９８５）；Ｇｏｌｄ ｅｔ ａ
ｌ．，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，７７：６７０〜６７７
（１９８８）；Ｙａｓｕｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌ
ｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，８１：１２８４〜１２９１（１
９８８）；Ｃｏｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，
６８：７８３〜７８６（１９８６）；Ｈａｎｓｏｎｅｔ
ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，８１：１４
９〜１５８（１９８８））。
【０００５】一方、本発明者らは韓国の１４種の蛇から
血小板凝集抑制剤を探索しようと鋭意努力した結果、韓
国産蝮の毒素に効果的な血小板凝集抑制機能を有する新
規の低分子量のポリペプチドが存在していることを発見
し、本発明を完成した。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】本発明の主な課題は、
韓国産蝮の毒素に由来する新規な血小板凝集抑制ポリペ
プチドを提供することにある。
【０００７】さらに、本発明の他の目的は、韓国産蝮の
毒素から前記血小板凝集抑制ポリペプチドを製造する方
法を提供することにある。
【０００８】
【課題を解決するための手段】本発明者らは韓国産蝮か
ら血小板凝集抑制剤を分離するため、韓国産蝮の毒素を
採取した後、毒素をセリン系蛋白質分解酵素親和性カラ
ムに注入しカラム透過液を収得して、その透過液を陰イ
オン交換樹脂、ゲル濾過およびＨＰＬＣ逆相クロマトグ
ラフィーする一連の精製過程を行なった。このようにし
て精製された血小板凝集抑制ペプチド（以下、‘サルモ
シン（Ｓａｌｍｏｓｉｎ）’という）の分子量はほぼ
７，５００Ｄａであり、そのアミノ酸配列を決定して公
知の血小板凝集抑制ペプチドと比較した結果、新規の物
質であることが確認された。また、決定されたアミノ酸
配列を基にしてサルモシンの３次元構造をコンピュータ
モデリングを通じて分析した結果、公知の血小板凝集抑
制ペプチドであるエキスタチンとキストリンの雑種形態
に存在していることを確認した。
【０００９】さらに、サルモシンと公知の血小板凝集抑
制ペプチドとの血小板凝集抑制活性を比較した結果、本
発明のサルモシンが最も効果的に血小板凝集を抑制でき
ることがわかった。従って、本発明のサルモシンは血栓
症治療剤として用いることができる。
【００１０】本発明のペプチドのアミノ酸配列はＩＵＰ
ＡＣ−ＩＵＢ命名法に従い次の略語により記載されてい
る。
【００１１】
【発明の実施の形態】以下、実施例を通じてより詳細に
説明する。これら実施例は専ら本発明をより具体的に説
明するためのものであり、本発明の要旨に従い本発明の
範囲がこれら実施例によって制限されないことは当業界
において通常の知識を有する者にとっては自明であろ
う。
【００１２】実施例１：サルモシンの精製 韓国産蝮からサルモシンを精製するため、韓国産蝮から
採取した毒素１ｍｌを２０ｍＭトリス緩衝溶液（ｐＨ
７．５）で１０倍希釈した後、前記緩衝溶液で予め平衡
を保持させたベンズアミジン−セファロース（ｂｅｎｚ
ａｍｉｄｉｎｅ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ，Ｐｈａｒｍａｃ
ｉａ−ＬＫＢ，Ｓｗｅｄｅｎ）カラム（２．５×１０ｃ
ｍ）に３０ｍｌ／ｈｒの流速で注入した。前記カラムに
結合しない透過液を集めて、前記緩衝溶液で希釈した
後、流速６０ｍｌ／ｈｒでＤＥＡＥ−Ｔｏｙｏｐｅａｒ
ｌ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｓｗｅｄｅｎ）カラム（２．
５×５．０ｃｍ）に注入した。その後、蛋白質の溶出は
２５ｍＭ，５０ｍＭ，１００ｍＭおよび１Ｍ ＮａＣｌ
まで段階別濃度勾配を用いて行い、サルモシン活性を現
わす分画を集めて限外濾過装置（Ｕｌｔｒａｆｉｌｔｒ
ａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ，Ｍｏｄｅｌ ８２００，Ａ
ｍｉｃｏｎ，ＵＳＡ）で濃縮させた。前記濃縮液を流速
６０ｍｌ／ｈｒでＨＰＬＣ ＴＳＫ Ｇ２０００（Ｔｏ
ｙｏｓｏｄａ，ＪＡＰＡＮ）カラム（７．５×３００ｍ
ｍ）に注入し蛋白質を溶出させた。
【００１３】活性分画を集めて限外濾過装置（Ｕｌｔｒ
ａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ，Ｃｅｎｔｒｉ
ｐｒｅｐ−３，Ａｍｉｃｏｎ，ＵＳＡ）で濃縮した後、
０．１％（ｖ／ｖ）ＴＦＡ（ｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅ
ｔｉｃ ａｃｉｄ）溶液で平衡が既に保持されている逆
相Ｖｙｄａｃ Ｃ１８（Ｖｙｄａｃ，ＵＳＡ）カラム
（２．５×３００ｍｍ）に注入した。その後、前記ＴＦ
Ａ溶液で洗浄し、２０％（ｖ／ｖ）アセトニトリルでも
う一度洗浄した後、２０％ないし６０％（ｖ／ｖ）アセ
トニトリルの直線濃度勾配で蛋白質を溶出させたとこ
ろ、保持時間３１．８分においてサルモシンが溶出され
た。
【００１４】前記の精製過程においてサルモシン活性は
ＥＬＩＳＡ方法で測定した。すなわち、フィブリノーゲ
ンを４℃で終夜９６ウェルプレートに付着させた後、各
ウェルに血小板から分離精製したＧＰIIｂ− IIIａ受容
体およびサルモシンの活性分画を添加して２時間の間常
温で反応させた。その後、各ウェルを洗浄溶液（０．１
５Ｍ塩化ナトリウム，０．０５％ツイーン（Ｔｗｅｅ
ｎ）−２０および０．０２％アジ化ナトリウムを含む２
０ｍＭトリス緩衝溶液、ｐＨ７．５）で３回洗浄し、人
間のＧＰ IIIａに対するマウス抗体（ｍｏｕｓｅ ａｎ
ｔｉ−ｈｕｍａｎＧＰ IIIａ ａｎｔｉｂｏｄｙ，Ｔａ
ｇｏｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌｓ，Ｂｉｏｓｏｕｒｃ
ｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，ＵＳＡ）を添加して
１時間の間反応させて前記マウス抗体を１次結合させ
た。再び洗浄溶液で３回洗浄し、ヤギ抗マウスＩｇＧ−
ＨＲＰ（ｇｏａｔ ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ−Ｈ
ＲＰ（ｈｏｒｓｅ ｒａｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄａｓ
ｅ），Ｔａｇｏｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌｓ，Ｂｉｏ
ｓｏｕｒｃｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，ＵＳＡ）
を添加し１時間反応させて２次結合させた。その後、洗
浄溶液で３回洗浄し、発色基質であるｏ−フェニレンジ
アミンを反応させて現われた発色を４９０ｎｍにおいて
吸光度で測定した。
【００１５】実施例２：サルモシンの純度決定 実施例１において精製されたサルモシンの純度を確認す
るため、まずサルモシンを１００％ ＴＣＡ（ｔｒｉｃ
ｈｌｏｒｏａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ）で沈殿させ、沈殿
蛋白質を展開緩衝溶液（４％ ＳＤＳ，２０％グリセリ
ンおよび１０％メルカプトエタノールを含む０．１２５
Ｍトリス緩衝溶液，ｐＨ６．８）と１：１（ｗ／ｖ）に
混合して溶解させた後、１００℃において５分間加熱し
た。その後、１８％トリス−グリシンゲル（Ｎｏｖｅ
ｘ，ＵＳＡ）を用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥに付し、蛋白質
バンドを硝酸銀で染色して確認した（図１参照）。図１
において、第１レーンは実施例１において精製されたサ
ルモシン、第２レーンは分子量マーカをそれぞれ電気泳
動した結果を示す。図１に示されるように、本発明のサ
ルモシンは純粋に分離されたことがわかる。
【００１６】実施例３：サルモシンのアミノ酸配列分析 サルモシンのアミノ酸配列を分析するため、サルモシン
をＣＮＢｒで切断し、その切片のアミノ酸配列を自動ア
ミノ酸配列分析幾を用いて決定した。その結果を公知の
血小板凝集抑制ペプチドと比較して図２に示した。図２
において、アンダーラインを引いたアミノ酸は、公知の
ハリシン（Ｈａｌｙｓｉｎ）（参照：Ｈｕａｎｇ ｅｔ
ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，
４２：１２０９〜１２１９（１９９１ａ））と本発明の
サルモシンとを比較した際に、互いに異なるアミノ酸を
示す。ハリシンと比較した理由は、ハリシンが分離され
た日本産蝮（Ａｇｋｉｓｔｒｏｄｏｎ ｈａｌｙｓ）と
本発明のサルモシンが分離された蛇の種が互いに同一で
あるためである。図２に示されるように、サルモシンは
公知の血小板凝集抑制ペプチドとは異なる新規の物質で
あることが確認された。
【００１７】実施例４：サルモシンの分子量測定 サルモシンの分子量を質量分析幾（Ｍａｔｒｉｘ−ａｓ
ｓｉｓｔｅｄ Ｌａｓｅｒ Ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ Ｉ
ｏｎｉｚａｔｉｏｎ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔ
ｅｒ；Ｋｒａｔｏｓ Ｋｏｍｐａｃｔ Ｍｏｌｄ II，
ＫｒａｔｏｓＡｎａｌｙｔｉｃａｌ，Ｍａｎｃｈｅｓｔ
ｅｒ，Ｕ．Ｋ．）を用いて測定した結果、その分子量は
７，４７３．６Ｄａであることが確認された（図３参
照）。
【００１８】実施例５：サルモシンの３次元構造分析 実施例３において決定したサルモシンのアミノ酸配列を
基にして、サルモシンの３次元構造をコンピュータモデ
リングにより分析した。モデリングシステムとしてハー
ドウェアはＩｎｄｉｇｏ２−ＸＺ（Ｓｉｌｉｃｏｎ Ｇ
ｒａｐｈｉｃＣｏｒｐ．，ＵＳＡ）を用い、モデリング
プログラムはＩｎｓｉｇｈｔ II／Ｄｉｓｃｏｖｅｒと
Ｈｏｍｏｌｏｇｙ（Ｂｉｏｓｙｍ．Ｃｏｒｐ．，ＵＳ
Ａ）を用いた。サルモシンの３次元構造を分析した結
果、公知の血小板凝集抑制ペプチドであるエキスタチン
とキストリンの雑種形態に相当することがわかった。
【００１９】実施例６：血小板凝集抑制活性の比較 サルモシンと公知の血小板凝集抑制ペプチドとの活性を
比較するため、血小板が豊富なヒト血漿（血漿１μｌ
当り３×１０5 個の血小板の存在）２２５μｌとＰＢＳ
に溶解した血小板凝集抑制ペプチド溶液（０．１μｇ／
ｍｌ）２５μｌを混合して５分間２５℃の条件において
Ａｇｇｒｅｇｏｍｅｔｅｒ（Ｃｈｒｏｍｏ−Ｌｏｇ Ｃ
ｏｒｐ．，ＵＳＡ）で反応させた後、凝集剤としてＡＤ
Ｐを添加し濁度を測定するヒト血小板の凝集分析法と、
実施例１に記載されたＥＬＩＳＡ方法で、サルモシン
と公知の血小板凝集抑制ペプチド、例えばキストリン、
トリグラミン−γ（参照：Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８７：２４７１（１９８９））
およびエキスタチンの血小板凝集抑制活性を測定した。
その結果を下記表１に示す。
【００２０】
【表１】 血小板凝集抑制活性の比較 ──────────────────────────────────── ＩＣ50（ｎＭ） ─────────────────────── 血小板凝集抑制ペプチド ＥＬＩＳＡ方法 ヒト血小板の凝集分析法 ──────────────────────────────────── キストリン ２．７ １２８ トリグラミン−γ ２．２ ２４０ エキスタチン ２．７ ５６０ サルモシン ０．７ ５０ ＧＲＧＤＳＰ* ３００ ２３０，０００ ──────────────────────────────────── *：Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏのアミノ酸で構成され た合成ペプチド。 前記表１に示されるように、本発明のサルモシンが最も
効果的に血小板の凝集を抑制することがわかった。
【００２１】
【発明の効果】以上説明したように、本発明は韓国産蝮
の毒素から分離した新規の血小板凝集抑制ペプチド（サ
ルモシン）およびその製造方法を提供する。サルモシン
と公知の血小板凝集抑制ペプチドとの血小板凝集抑制活
性を比較した結果、本発明のサルモシンが最も効果的に
血小板凝集を抑制することがわかった。従って、本発明
のサルモシンは血栓症治療剤として用いることができ
る。
【図面の簡単な説明】
【図１】韓国産蝮（Ａｇｋｉｓｔｒｏｄｏｎ ｈａｌｙ
ｓ ｂｒｅｖｉｃａｕｄｕｓ）の毒素から精製された血
小板凝集抑制ペプチドをＳＤＳ−ＰＡＧＥに付した際の
電気泳動パターンの結果を示す写真である。
【図２】本発明において精製された血小板凝集抑制ペプ
チドのアミノ酸配列を公知の血小板凝集抑制ペプチドの
アミノ酸配列と比較した図である。
【図３】本発明の血小板凝集抑制ペプチドの分子量を質
量分析幾で決定した結果を示す質量スペクトルを示す図
である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 リー ソージュン 大韓民国、ソウル、ドンジャクク、サダ ン ３ドン、ダエリン・アパート ２− 602 (72)発明者 キム ドゥーシク 大韓民国、ソウル、セオダエモーンク、 ヨンヘードン 84−３ (72)発明者 キム ハクダイ 大韓民国、キュンギド、ヨンギンクン、 コースンミュン、ポジュンリ 455 (72)発明者 ユン ユンダエ 大韓民国、ソウル、ソンパク、チャンシ ルドン、アジアン・アパート 16−1202 (72)発明者 ヨーン ジェオンヒェオク 大韓民国、キュンギド、スンナン、スジ ェオンク、タエピュン １ドン 7116− 25 (72)発明者 モーン ホンモ 大韓民国、キュンギド、スンナン、プン ダンク、セオヒュンドン、ヒョージャ ビレッジ、ヒュンダイ・アパート 112 −902

Claims (2)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 韓国産蝮（Ａｇｋｉｓｔｒｏｄｏｎ ｈ
    ａｌｙｓ ｂｒｅｖｉｃａｕｄｕｓ）の毒素に由来する
    下記のアミノ酸配列で特定される血小板凝集抑制ペプチ
    ド（サルモシン（Ｓａｌｍｏｓｉｎ））： ＥＡＧＥＥ ＣＤＣＧＳ ＰＧＮＰＣ ＣＤＡＡＴ ＣＫＬＲＱ ＧＡＱＣＡ ＥＧＬＣＣ ＤＱＣＲＦ ＭＫＥＧＴ ＩＣＲＲＡ ＲＧＤＤＬ ＤＤＹＣＮ ＧＩＳＡＧ ＣＰＲＮＰ ＦＨＡ （７３）
  2. 【請求項２】 （ａ）韓国産蝮から採取した毒素をセリ
    ン系蛋白質分解酵素親和性カラムに注入しカラム透過液
    を収得する工程； （ｂ）前記において収得した透過液を陰イオン交換樹脂
    クロマトグラフィーする工程； （ｃ）前記において収得した活性分画をゲル濾過クロマ
    トグラフィーする工程；および、 （ｄ）前記において収得した活性分画をＨＰＬＣ逆相ク
    ロマトグラフィーする工程を含む韓国産蝮の毒素から請
    求項１の血小板凝集抑制ペプチド（サルモシン）を製造
    する方法。
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