JP2643775B2 - 異なった検出可能な物質を含む微粒子を用いた免疫検定における信号の強化方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は結合検定法（ｂｉｎｄｉ
ｎｇ ａｓｓａｙ）、特に２つ以上の検出可能な物質を
有する検出システムを用いた免疫検定法に関する。

【０００２】

【従来の技術】免疫検定の技術が直面する問題は、２つ
以上の被検体の同時検出の困難性、被検体を測定するた
めの検出可能な標識物に対する必要性、器械を用いるか
または用いずに標識物を良好に視覚的に測定するための
必要性、器械を使用する場合にはノイズより上の信号を
識別する必要性、そして感度向上のための必要性を含
む。

【０００３】感度を向上し検定において視覚的検知がで
きるようにするために、被検体、すなわち抗体、抗原ま
たはハプテンは染料または蛍光色素で標識化されてい
る。たとえば、米国特許第４，６９５，５５４号には嚢
または免疫検定に使用するための１つの染料を含むリポ
ソームが記載されている。

【０００４】米国特許第４，７０３，０１７号はその完
全な記載を参考として本明細書に入れるものであるが、
これは一つの着色顆粒標識物たとえば染料を含むリポソ
ームを用いた固相分析について記載している。

【０００５】米国特許第４，７４５，０７５号は、たと
えば非生存細菌細胞、アルギン酸塩粒子、セファロース
ビーズ、シリカ、アルミナ、白血球およびポリマーラテ
ックスのような不溶性着色粒子２つ以上を用いた凝集分
析について記載している。粒子は特異的リガンドの存在
にしたがって異なった着色凝集物を形成するために適合
させる。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】熟練した技術者にとっ
て公知のように、凝集分析たとえばワイル−フェリック
ス試験（Ｗｅｉｌ−Ｆｅｌｉｘ Ｔｅｓｔ）、ラテック
ス粒子試験（ＬａｔｅｘＰａｒｔｉｃｌｅ Ｔｅｓ
ｔ）、レシチンまたはフィブリノーゲンにより仲介され
る凝集等は固体支持体を使わない。凝集分析は、懸濁ま
たは凝集する凝集物の視覚的および顕微鏡的検出を用い
る。ここで１つの着色顆粒標識物または凝集関連色素を
信頼するものよりさらに高感度の検知法が必要となる。
信号を強化するための技術が固体支持体を利用する検定
において多色顆粒標識物の利用により発見された。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明は少なくとも１つ
の被検体を検定する方法である。被検体およびトレーサ
ーを検定条件下で支持体上でバインダーと接触させる。
トレーサーは少なくとも１つのリガンドと結合する少な
くとも１つの顆粒標識物を含み、該顆粒標識物は少なく
とも１つの検出可能な物質を含む。トレーサーは少なく
とも２つの検出可能な物質を含み、これは好ましくは染
料である。

【０００８】少なくとも２つの異なった検出可能な物質
は異なった態様でトレーサー中に存在してもよい。トレ
ーサーは少なくとも１つのリガンドを有する第一の顆粒
標識物であって第一の検出可能な物質を含むもの、およ
び第一の顆粒標識物においてリガンドと結合する第二の
リガンドを有する第二の顆粒標識物であって、第一の検
出可能な物質と異なる第二の検出可能な物質を含む第二
の顆粒標識物とを含むものであり、これを図１に示す。
トレーサーは、図２に示すように、少なくとも２つの異
なったリガンドを含み、各リガンドは各々の型のリガン
ドに対し異なった検出可能な物質を含む顆粒標識物で標
識化されてもよい。トレーサーは、図３に示すように、
少なくとも２つの異なった検出可能な物質を含む顆粒標
識物を有する１つのリガンドを含むようにしてもよい。

【０００９】標識物は、トレーサーがバインダーと結合
後またはトレーサーがバインダーと結合した少なくとも
１つの被検体と結合後に検出される。

【００１０】この検定の幾つかの利点は、向上した感
度、同時に２つ以上の被検体を検出できること、試薬間
の混同の排除および機器分析において同時に２つ以上の
波長を同時に検出することができるのでノイズを越えた
信号をより巧みに識別するようになることである。本発
明はまた多くの異なった型の検定に適するように作られ
うる検定器具を提供するものである。

【００１１】本発明のより深い理解のために、さらに別
の目的と合わせて、添付の図面を参考にしながら以下の
記載に言及するが、その範囲は特許請求の範囲で明らか
にされるであろう。

【００１２】図１は、第二の標識化リポソーム結合体と
結合する第一の標識化リポソーム結合体を有するトレー
サーを用いた検定の模式説明図であり；図２は、異なっ
たバインダーと結合する異なった標識化リポソーム結合
体を有するトレーサーを用いた検定の模式説明図であ
り；図３は、１つの顆粒標識物と２つの検出可能な物質
を有するリポソーム結合体を有するトレーサーを用いた
検定の模式説明図であり；図４は、０．５％ＳＤＳに溶
解したライトグリーン−ＳＲＢを含むリポソームの吸光
度スキャンを表わすグラフであり；図５は、０．５％Ｓ
ＤＳ中のライトグリーン−ＳＲＢ染料混合物の吸光度ス
キャンを表わすグラフであり；図６は、クロム アズロ
ール−ＳＲＢ−ライトグリーンを含む溶解リポソームの
吸光度スキャンを表わすグラフであり；図７は、ＰＢＳ
におけるクロム アズロール−ＳＲＢ−ライトグリーン
染料混合物の吸光度スキャンを表わすグラフであり；図
８は、ＳＤＳにおけるクロムアズロール−ＳＲＢ−ライ
トグリーン染料混合物の吸光度スキャンを表わすグラフ
である。

【００１３】バインダーとして使用される物質は、検定
されるべき被検体および特定の検定方法たとえば競合
法、サンドイッチ法であるかどうかを考慮して関連する
特定な検定の化学的性質に対し選択される。好ましく
は、バインダーの特定の一対の１つの構成員たとえば抗
原または抗体を含む特定結合種である。適当なバインダ
ーの選択は当業者の知識の範囲内である。

【００１４】使用されるバインダーのタイプは、検定さ
れるべき被検体および特定検定方法による。バインダー
は、血清を含む抗体、ポリクローナルまたはモノクロー
ナル抗体、抗原、結合されるべき物質に特異的なタンパ
ク質、または天然産生バインダーである。すなわち、た
とえば、抗原またはハプテンに対する競合型検定におい
て、バインダーは抗体であるかまたはトレーサーおよび
抗原またはハプテンに対し特異的である天然産生物質で
もよい。検定が抗体に対するものの場合、バインダーは
たとえば抗原であるかまたは検定されるべき抗体に対し
特異的である抗体でもよい。被検体が抗体であるサンド
イッチ型検定において、バインダーは抗体に対する抗原
であるか、またはある種の抗体のＦｃフラグメントと選
択的に結合するプロテインＡのようなタンパク質であ
る。被検体が抗原、たとえば２つ以上のエピトープまた
は決定部位を有するものである場合、サンドイッチ型検
定において、バインダーは抗体または検定されるべき抗
原に特異的な天然産生バインダーである。

【００１５】バインダーは検定において支持体形で使用
される。支持体は多孔性または非多孔性でよい。多孔性
および非多孔性支持体は当業者によく知られたものであ
る。同様に、固体支持体に対しバインダーをしっかりと
付着させる方法は当業者によく知られている。すなわ
ち、バインダーは、直接または間接的に共有結合または
非共有結合を介して付着される。好ましくは、バインダ
ーは固体支持体に吸着される。

【００１６】支持体は、検定においてバインダーに対す
る支持体として適することが知られている多種類の物質
を含む。限定するものではないが、代表的例としてはニ
トロセルロース、ポリマーたとえばナイロンまたはラテ
ックス、ガラス粒子等である。固体支持体は様々な形態
でよく、たとえばシート、管、カード、試験片、滴定板
等である。

【００１７】固体支持体は、検定条件下でトレーサーを
検出できうるような濃度（重量／単位面積）でバインダ
ーが支持体に支持されうるような表面積（物質の面積／
単位重量）を有するものである。検出可能とは、裸眼で
標識物が見られうるかまたは装置たとえば分光光度計ま
たは蛍光光度計を用いて検出することができるかのいず
れかであることを意味する。

【００１８】被検体はトレーサーを用いて検定において
検出される。好ましくは、トレーサーは顆粒標識物と結
合した特異的結合部分からなる。すなわち、トレーサー
を競合型抗体／抗原検定法において使用すべき場合、特
異的結合部分が被検体または適当なその類似物である。
検定がサンドイッチ型抗原／抗体検定法である場合、特
異的結合部分が被検体に特異的に結合する。当業者であ
ればトレーサーシステムがさらに増幅システムを含んで
もよいことは理解されるであろう。すなわち検定条件下
でトレーサーは直接というよりむしろ間接的に被検体と
結合するであろう。

【００１９】好ましいトレーサーは少なくとも１つのリ
ガンドと結合した少なくとも１つの顆粒標識物を有し、
該顆粒標識物は少なくとも１つの検出可能な物質を含
み、追跡システム全体は少なくとも２つの検出可能な物
質を含む。

【００２０】トレーサーとして使用するために標識化さ
れたリガンドの選択は検定すべき被検体および検定手法
に応じる。リガンドはバインダーにより結合されうる物
質である。リガンドは抗原（たとえば、タンパク質、多
糖類、核酸、ペプチドホルモン、ステロイド、薬剤、細
菌、ウィルス、腫瘍抗原、酵素、ビタミン）；ハプテ
ン；および抗体（ポリクローナルおよびモノクローナ
ル）を含む。限定するものではないが、本発明を使用し
て検定されうる抗原（またはこれらの相当する抗体）に
は、マラリア、ストレプトコッカス、インフルエンザ、
風疹、髄膜炎菌（Ｍｅｎｉｎｇｏｃｏｃｃｕｓ）、カン
ジダ、呼吸器系シンシチウムウィルス（ｓｙｎｃｙｔｉ
ａｌ ｖｉｒｕｓ）、ＨＩＶ、腫瘍マーカー、ジゴキシ
ン、テオフィリン、フェリチン、ＦＳＨ、ＬＨ、プロラ
クチン、テストステロン、プロゲステロン、ＨＣＧ、Ｔ
ＳＨ、Ｔ４、Ｔ３が含まれる。

【００２１】顆粒標識物は、直径約０．０１μｍ〜約１
０μｍの着色粒子である。着色粒子は固体または固体様
でよく、非固体の可溶性標識物たとえばラジオアイソト
ープおよび酵素と対照的である。固体様の顆粒標識物に
は小胞、マイクロカプセルおよび安定化コロイドが含ま
れる。

【００２２】好ましい顆粒標識物は、検定に使用すると
トレーサーが検出可能となる物質を含む嚢である。顆粒
標識物として使用される嚢は広い範囲の嚢のいずれか１
つであり、これには限定するものではないがリポソーム
（一重膜または多重膜）、ポリマーマイクロカプセル、
たとえばコアセルベーションまたは界面重合により作ら
れるもの、および安定化コロイド粒子が含まれる。

【００２３】リポソームは様々な脂質から調製すること
ができ、これにはリン脂質、糖脂質、ステロイド、比較
的長鎖のアルキルエステル；たとえば、アルキルホスフ
ェート、脂肪酸エステル；たとえばレシチン、脂肪アミ
ン等が含まれる。脂肪物質の混合物たとえば天然ステロ
イド、帯電両親媒性物質およびリン脂質の組合せを使用
してもよい。リン脂質の代表的例にはレシチン、スフィ
ンゴミエリンおよびジパルミトイルホスファチジルグリ
セロールが含まれる。代表的ステロイドにはコレステロ
ール、コレスタノール、ラノステロール等が含まれる。
代表的帯電両親媒性化合物は、一般に炭素原子数１２〜
３０を含む。モノ−またはジアルキルホスフェートエス
テルまたはアルキルアミン；たとえばジセチルホスフェ
ート、ステアリルアミン、ヘキサデシルアミン、ジラウ
リルホスフェート等が代表的なものである。

【００２４】顆粒標識物中に使用される好ましい検出可
能な物質は可視物質、さらに好ましくは染料である。染
料は分子の電子系を用いた光の相互反応のために色彩を
有する化学的化合物である。染料分子はいわゆる助色団
と呼ばれるイオン化基、たとえば−ＮＨ₂、−ＯＨを有
し、これを介して発色団が目標分子と結合することがで
きる。染料は陰イオンまたは陽イオン基を含まず、たと
えば４−（ジシアノメチレン）−２−メチル−６−（ｐ
−ジメチルアミノスチリル）−４Ｈ−ピランであるか、
または多環式環からなるもの、たとえばピレンでもよく
またはアルキル鎖を結合することにより接続した芳香族
環でよく、たとえば１，６−ジフェニル−１，３，５−
ヘキサトリエンである。不飽和の発色団基は色の原因と
なるものであり、たとえば−ＮＯ₂、−Ｎ＝Ｎ−および
＝ＣＯ、すなわちキノイド環、キサンテン、アジン、チ
アジン、アゾ、ニトログリセリン、トリアリールメタ
ン、アクリジンその他多数である。限定するものではな
いが、染料の例としてはスルホローダミンＢ（赤い蛍光
色を有するキサンチンアミノ染料、ライトグリーンＳＦ
イエロウィッシュ（陰イオントリフェニルメタン染
料）、クロムアズロールＳ（トリフェニルメタン染
料）、ブリリアントブルーＦＣＦ（ブルー酸トリフェニ
ルメタン染料）、およびナイル赤（脂溶性、溶媒オキサ
ゾン染料）が含まれる。染料は水溶性または親油性であ
る。

【００２５】染料濃度は染料の溶解特性にしたがって当
業者に公知の方法で調節されそして所望の検出および安
定性に対して最適にされる。

【００２６】免疫検定のための染料含有嚢の調製は米国
特許第４，６９５，５５４号に記載されており、この記
載の全部を参考のためにここに組込む。

【００２７】嚢に使用される染料が吸収染料であるとは
いえ、このような染料はまた蛍光特性をも有する。それ
ゆえ、本発明の範囲内において、染料は吸収特性による
よりむしろ蛍光により検出される。

【００２８】使用されうる他の検出可能な物質の代表的
例は、フェリチン、フィコエリトリンもしくは他のフィ
コビリプロティン；有機金属錯体たとえばフタロシアニ
ン、ポルフィリン、ランタニドキレート；真菌、藻もし
くは細菌性顔料または誘導体たとえば細菌性クロロフィ
ル；植物性物質または誘導体、等である。

【００２９】リポソーム嚢は着色物質の水溶液中で調製
されそして結果として物質をリポソームへ混入する。リ
ポソーム嚢は、溶液中で激しく撹拌し続いて未混入着色
物質を嚢の外側から除去することにより調製される。リ
ポソームの調製に関するさらなる詳細は米国特許第４，
３４２，８２６号およびＰＣＴ国際出願ＷＯ８０／０１
５１５号に説明されており、その両方ともここに編入す
る。

【００３０】検出可能な物質はまた当業者に公知の界面
化学を用いてリポソームの表面に付着するかまたは共有
結合しそして同様な方法で抗体は実施例１に記載のよう
にリポソームと結合する。リポソームはまた、二重層に
含まれる親脂性染料を用いて、該親脂性染料を他のフィ
ルム成分に溶かし該フィルムの調製時にこれが膨張して
リポソームを形成することにより調製される。

【００３１】特異的結合部分またはリガンドを顆粒標識
物と結合する手段は当業界で公知である。このような技
術には、吸着、共有結合、誘導化、活性化等がある。特
異的結合部分が嚢で標識化されるトレーサーの製造にお
いて、嚢は特異的結合部分で誘導化された成分から作ら
れ、これにより製造されると嚢が特異的結合部分で増感
される。別の方法において、着色物質を含む嚢を最初に
形成し、続いて当該技術で公知の手段により特異的結合
部分で嚢を増感してもよい。

【００３２】トレーサー形成において、嚢は、リガンド
の免疫活性を破壊しない適当な結合またはスペーサー化
合物を使用することにより、リガンドと結合してもよ
い。代わりに、嚢は当該技術で公知の手段によりリガン
ドと直接結合してもよい。また嚢は、嚢形成時に使用さ
れる物質の１つにリガンドを結合させるかまたはこれら
を形成後にリガンドを嚢に結合させることによっても増
感されうる。

【００３３】検定において、バインダーは被検体および
トレーサーの両方に対するバインダーであるか、または
被検体およびトレーサーのいずれか１つのみに対するバ
インダーであり、使用されるバインダーのタイプは被検
体を測定するために使用されるべき検定によるものであ
る。すなわち、たとえば検定がサンドイッチ型検定法で
ある場合、バインダーは被検体だけのバインダーであ
る。検定のこのタイプにおいて、トレーサーは被検体に
対し特異的であるので、トレーサーはバインダーと結合
する被検体に対し結合する。阻害型検定法または競合型
検定法において、バインダーはトレーサーと被検体の両
方に対し特異的である。検定法のこのタイプにおいて、
被検体の存在がトレーサーのバインダーへの結合を阻害
する。すなわち、たとえばトレーサーが固体支持体に結
合している場合、これは直接に支持体上でバインダーと
結合するかまたは固体支持体上でバインダーと結合する
被検体と結合する。

【００３４】異なった嚢または同じ嚢に２つ以上の染料
を封入することは免疫検定法を実施する際に標識化嚢の
有用性を向上することが発見された。

【００３５】ここで図面に言及すると、図１に示す一実
施態様において、第一のリポソームは抗原Ａに対する第
一の抗体と結合する。第一のリポソーム（１０）は第一
の染料（１１）を封入しそしてその表面に検出可能なマ
ーカー（１２）、たとえばハプテンまたは抗体それ自体
における決定因子（エピトープ）を有する。第一のリポ
ソームは抗原（１４）に対する抗体（１３）と結合す
る。第二のリポソーム（１５）は第一のリポソーム（１
０）におけるマーカー（１２）に対し特異的な第二の抗
体（１６）と結合する。第二のリポソームは第一の染料
と異なり好ましくはこれと相補的な第二の染料（１７）
を封入する。第一および第二のリポソームを検定におい
てトレーサー中に使用する場合、試薬が混同することな
く抗原Ａに対する信号が強化する。抗原Ａの検出の結
果、溶液のいずれかとは異なった色が得られる。

【００３６】図２の別の実施態様において、（２０）お
よび（２１）により表わされる２つの異なった抗原を、
異なった染料を封入するリポソームの混合物を用いて同
時に検出する。抗原（２０）に対する第一の抗体（２
２）を、第一の染料（２４）を封入するリポソーム（２
３）と結合する。抗原（２１）に対する第二の抗体（２
５）を第二の染料（２７）を封入するリポソーム（２
６）と結合する。抗原（２０）、抗原（２１）のいずれ
かの存在、または抗原（２０）および（２１）の両方の
存在を各場合に対する異なった色の発生により検出しう
る。この検定は１つの試薬混合物を用いてニトロセルロ
ースのような支持体上で実施されうる。染料を選択する
ことにより、ほとんどどれかの色を作ることができる。

【００３７】図３に示したさらに別の実施態様におい
て、その片割れ（３４）と結合する抗体、抗原またはハ
プテン（３０）を、２つの染料（３２）および（３３）
の最小量を封入するリポソーム（３１）と結合する。こ
れにより相互に補い合う染料を選択することによりいず
れかの所望の色のリポソームが提供される。機器分析に
おいて、被検体は２つ以上の波長で同時に測定すること
により検出され、その結果ノイズを越える信号がより明
確に識別される。さらに、単独で封入されている場合、
十分な吸光度を有さない染料から信号が発生するであろ
う。

【００３８】２つ以上の染料を使用すると多くの変化が
生まれる。相補的着色染料は可視スペクトルと交差する
吸光度に監視バランスをとることができ、その結果黒い
色味となる。これに代わり、第一の染料を封入する第一
のリポソームを用いて非特異的部位を飽和しそして色彩
のバックグラウンドを提供することもできる。特異的部
位で第二のバランス染料を封入する第二のリポソームの
結合の結果黒色となり、特異的部位および信号での対比
が向上する。

【００３９】

【実施例】

実施例１ トレーサー製剤 Ａ． リポソーム製剤 １． ２０００ｍｌの丸底回転蒸発フラスコへ次のもの
を加えた： ａ： １．０１８ｇコレステロール（シグマＣＨ−Ｐ
Ｌ） ｂ： １．８８ｇジステアロイルホスファチジルコリン
（アバンチ ポーラーリピッド（Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌ
ａｒ Ｌｉｐｉｄｓ）３８５０３６５） ｃ： ２０６ｍｇジステアロイル ホスファチジル グ
リセロール（アバンチポーラー リピッド） ｄ： ７５ｍｇ架橋剤（（Ｎ−マレイミド）カプロイル
−ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン；ベ
クトン ディキンソン アドバーンスド ダイアグノス
ティックス，メリーランド州，バルチモア） ｅ： １５０ｍｌクロロホルム（フィッシャー） ２． 渦巻き状に混合する。

【００４０】３． 以下の設定で回転蒸発器に入れる。

【００４１】水浴温度 ＝４０℃ 回転スピード ＝４ ４． フィルムが形成するまでゆっくり減圧を高める。

【００４２】５． ２００ミリバールまで圧力を減ら
す。３０分間中程度の速度で回転させる。

【００４３】６． 一晩凍結乾燥する。

【００４４】７． 回転蒸発器中で蒸留水１５０ｍｌを
加え、脂質フィルムが懸濁するまで減圧せずに６０℃で
回転する。

【００４５】８． 乾燥氷／メタノール浴中でシェル凍
結（ｓｈｅｌｌ ｆｒｅｅｚｅ）する。

【００４６】９． 凍結乾燥して乾燥粉末とする。

【００４７】Ｂ． リポソーム顆粒標識物−単一染料の
調製 １． 次の成分を含む着色溶液を調製する： ａ． スルホローダミンＢ（５ｍＭ酢酸ナトリウム−５
ｍＭ ＥＤＴＡ ｐＨ４．５中５．６％（重量／体
積））。

【００４８】ｂ． ライトグリーンＳＦイエロウィッシ
ュ（５ｍＭ酢酸ナトリウム−５ｍＭ ＥＤＴＡ ｐＨ
４．５中２０％（重量／体積））。

【００４９】２． 実施例１Ａで記載したようなリポソ
ーム粉末８０ｍｇ量の２つへ、着色溶液スルホローダミ
ンＢおよびライトグリーンＳＦイエロウィッシュ１０ｍ
ｌを別々に加えた。断続的に振とうしながら３０分間６
０℃にてリポソーム／染料懸濁液を温める。

【００５０】３． ２つの加温リポソーム製剤を、１．
０μｍ、０．４μｍ次いで０．２μｍのポリカーボネー
ト膜（ヌクレポア）に通して別々に押出す。

【００５１】４． １ｍＭ ＥＤＴＡおよび５０ｍＭ
ＮａＣｌを含む５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ
４．５）で平衡化したセファロース ６ ファストフロ
ー クロマトグラフィ カラム（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ
６ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈ
ｙ ｃｏｌｕｍｎｓ）（ファルマシア）においてリポソ
ーム懸濁液から着色していない物質を分離する。

【００５２】５． ２つの染料封入リポソーム製剤を工
程４で特定した緩衝液中にて別々に保存する。

【００５３】Ｃ． 特定結合種に対するリポソーム顆粒
標識物の結合：未処理顆粒標識物 １． ヤギ抗ビオチン（シグマ）０．８ｍｇをリン酸塩
緩衝化食塩水（ｐＨ７．４）に対し透析した。

【００５４】２． ３−（２−ピリジルジチオ）プロピ
オン酸 Ｎ−ヒドロキシサクシニミドエステル（ＳＰＤ
Ｐ）（シグマ）と、ＳＰＤＰ：抗体のモル比３：１にて
３０分間室温にて撹拌しながら反応させた。

【００５５】３． １／１０容量の１Ｍ酢酸ナトリウム
ｐＨ４．５を加え、約２０秒間撹拌した。

【００５６】４． １／１００容量の１Ｍジチオトレイ
トールを加え室温にて３０分間撹拌した。

【００５７】５． トリス緩衝液（５０ｍＭトリス、５
０ｍＭ酢酸ナトリウム、５０ｍＭＮａＣｌ、１ｍＭ Ｅ
ＤＴＡ、ｐＨ８．０）で平衡化したセファデックスＧ−
２５メディウムカラムに反応容量を通してジチオトレイ
トールを除いた。

【００５８】６． Ｏ．Ｄ．２８０をモニターしタンパ
ク質含有フラクションをプールした。

【００５９】７． Ｂにおいて上述のように調製したグ
リーンリポソーム４ｍｌのｐＨを１Ｍトリス、ｐＨ１０
で８．０まで調節した。抗体プールとリポソームを誘導
化抗体１ｍｇ：Ｐｉ４０μモルの結合比で混合した。

【００６０】８． 室温にて一晩反応させた。

【００６１】９． 結合した生成物を、３０ｍＭ３−
［Ｎ−モルホリノ］−２−ヒドロキシプロパンスルホン
酸（ＭＯＰＳＯ）−１０ｍＭ ＥＤＴＡ−０．２％アジ
化ナトリウム−０．０５％ジメチルスルホキシド（ＤＭ
ＳＯ）−１．８％グリセロール−ｐＨ６．８で緩衝化し
たセファロース ６ ファスト フロー クロマトグラ
フィ カラム（ファルマシア）中で分離した。

【００６２】１０． ボイドボリュームフラクションを
集めそしてプールした。

【００６３】１１． ４℃で貯蔵した。

【００６４】Ｄ． リポソーム顆粒標識物の特定の結合
種への結合：スルホローダミンＢ顆粒標識物 １． ストレプトコッカスＡ群に対するアフィニティ精
製ウサギ抗体０．６ｍｇ（ｎ−アセチルグルコサミン−
アガロースカラム）をリン酸塩緩衝化食塩水（１００ｍ
Ｍ、ｐＨ８）に対して透析した。

【００６５】２． ＳＰＤＰ（シグマＰ−３４１５）
と、モル比３：１（ＳＰＤＰ：抗体）で室温にて３０分
間撹拌しながら反応させた。

【００６６】３． １／１００容量の１Ｍジチオトレイ
トールを加え、６０秒間撹拌した。

【００６７】４． １／１０容量の１Ｍ酢酸ナトリウム
ｐＨ４．５を加え、３０分間撹拌した。

【００６８】５． トリス緩衝液（５０ｍＭトリス、５
０ｍＭ酢酸ナトリウム、５０ｍＭＮａＣｌ、１ｍＭ Ｅ
ＤＴＡ、ｐＨ８．０）で平衡化したセファデックスＧ２
５カラムに反応量を通過させることによりジチオトレイ
トールを除いた。

【００６９】６． ２８０ｎｍで吸光度を測定し、タン
パク質含有フラクションをプールした。

【００７０】７． スルホローダミン−含有リポソーム
（Ｂで上述した）のｐＨを１Ｍトリス（ｐＨ１０）で調
節した。抗体プールをリポソームとともに、リン２０μ
モルに対し誘導化抗体１ｍｇで混合した。

【００７１】８． 室温にて一晩反応させた。

【００７２】９． ＭＯＰＳＯ−グルコース緩衝液（３
０ｍＭ ＭＯＰＳＯ−１０ｍＭ ＥＤＴＡ−０．２％ア
ジ化ナトリウム−０．０５％ＤＭＳＯ−１．２％グリセ
ロール−１００ｍＭグルコース、ｐＨ６．８）で平衡化
したセファロース６ファストフロークロマトグラフィカ
ラムにおいて遊離抗体から結合した生成物を分離した。

【００７３】１０． ボイドボリュームフラクションを
集めプールした。

【００７４】１１． ４℃で貯蔵した。

【００７５】実施例２ 検定 実施例１Ｃで調製したトレーサー（ライトグリーンリポ
ソームと結合した抗ビオチン抗体）および実施例１Ｄで
調製したトレーサー（スルホローダミンＢリポソームと
結合した抗−ストレプトコッカスＡ群抗体）をビオチン
およびストレプトコッカスＡ群に対し試験した。ビオチ
ニル化抗体（２μｌ、０．１Ｍリン酸ナトリウム中の
０．１％混濁液２０μｇ／ｍｌ、ｐＨ７）を用いてビオ
チン抗原をニトロセルロース紙へ付着した。ストレプト
コッカスＡ群（２μｌ、加熱−殺菌、０．２％アジ化ナ
トリウム保存剤）を、抗−ストレプトコッカスＡ群抗体
を用いてニトロセルロース膜に付着させた。検定方法は
次のようであった：Ａ．１． 抗−ストレプトコッカス
Ａ群−スルホローダミンＢリポソームトレーサー（０．
８７μｍＰ／ｍｌ）３滴（ほぼ１５０μｌ）を加え、ス
トレプトコッカスＡ群の試験区域に流した。

【００７６】次いで試験区域を、洗浄緩衝液（１Ｍグア
ニジンＨＣｌ緩衝液、ｐＨ７）３滴を加えることにより
洗浄した。

【００７７】次いで試験区域において顕著なピンク色が
存在することを視覚的に観察することにより結果を読み
取った。強い陽性のピンク色信号が得られた。

【００７８】２． 抗−ビオチン−ライトグリーンリポ
ソームトレーサー（０．６μｍＰ／ｍｌ）３滴（ほぼ１
５０μｌ）を、０．８μｍパッドの表面上にビオチニル
化抗体で点々を付けた試験区域へ加え、吸着させた。

【００７９】次いで１ＭグアニジンＨＣｌ緩衝液で試験
区域を洗浄した。

【００８０】試験区域における顕著な緑色の存在を視覚
的に観察することにより結果を読んだ。強い陽性の緑色
信号が得られた。

【００８１】Ｂ． 混合したリポソーム 実施例１Ｄで調製した抗−ストレプトコッカスＡ群−ス
ルホローダミンＢリポソームトレーサーおよび実施例１
Ｃで調製した抗−ビオチン−ライトグリーンリポソーム
トレーサーの等量を混合した。混合物は青紫色になっ
た。

【００８２】リポソーム混合物を半分に分けた。半量
（１５０μｌ）を上記の実施例２（Ｂ）（１）に記載し
たように、ストレプトコッカスＡ群に対する検定に使用
した。ピンクの色だけが現われた。

【００８３】混合物の残りの半量（１５０μｌ）を上述
の実施例２（Ｂ）（２）に記載のようにビオチンに対す
る検定に使用した。グリーンの色だけが現われた。

【００８４】この実験により、個々の特性および色がリ
ポソーム混合物から引き出されて被検体間を区別するこ
とができることがわかる。

【００８５】実施例３ トレーサー製剤−混合染料 Ａ． 混合染料の調製 染料混合物を染料緩衝液（５ｍＭ酢酸Ｎａ、５ｍＭ Ｅ
ＤＴＡ、ｐＨ４．５）中で調製した。

【００８６】１． ２０％ライトグリーンＳＦイエロウ
ィッシュ−５．６％スルホローダミンＢの染料混合物
は、ライトグリーンＳＦイエロウィッシュ４ｇ、スルホ
ローダミンＢ１．１２ｇおよび１０×染料緩衝液２ｍｌ
を混合し、さらに蒸留水を加えて２０ｍｌの容量とし、
室温にて撹拌することにより調製された。ｐＨを４．５
に調節した。

【００８７】２． ６％クロムアズロール−０．１％ス
ルホローダミンＢ−１．６５％ライトグリーンＳＦイエ
ロウィッシュの染料混合物は、クロムアズロールＳ１．
２ｇ、スルホローダミンＢ０．０２ｇ、ライトグリーン
ＳＦイエロウィッシュ０．３３ｇおよび１０×染料緩衝
液２ｍｌを混合し、さらに蒸留水を加えて２０ｍｌの容
量とし、室温にて撹拌することにより調製された。ｐＨ
を４．５に調節した。

【００８８】蒸留水１００ｍｌで洗浄したファルコンボ
トルトップフィルターに染料混合物を通して別々に濾過
した。２０％ライトグリーン−５．６％ＳＲＢの浸透圧
は７５２ｍＯｓｍであった。６％クロムアズロール−
０．１％ＳＲＢ−１．６５％ライトグリーンの浸透圧は
４１８ｍＯｓｍであった。

【００８９】Ｂ． トレーサー製剤 １． 実施例１Ａで作った凍結リポソーム粉末の別々の
２つの部分８０ｍｇを別々の５０ｍｌコニカルチューブ
へ秤量して入れた。

【００９０】２． １つのリポソーム部分へ実施例３Ａ
（１）の染料混合物１０ｍｌを加え、リポソームの他の
部分へ実施例３Ａ（２）で調製した乾燥混合物１０ｍｌ
を加えた。

【００９１】３． 渦巻状にかき混ぜて溶解した。

【００９２】４． ６０゜で３０分間温めた。

【００９３】５． ２つのリポソーム製剤の各々を別々
に１．０μｍ、０．４μｍ次いで０．２μｍの膜（ヌク
レオポアＰＣ膜４７ｍｍ：それぞれ＃１１１１０，＃１
１１１０７および１１１１０６）に通して押出し、次い
で温めそして新しい０．２μｍフィルターに通して再度
押出した。

【００９４】６． セファロース ６ ファスト フロ
ー カラムに対する緩衝液を、カラム洗浄緩衝液の浸透
圧をグリセリンで調節して染料混合物の浸透圧にするこ
とにより調製した。

【００９５】ａ． ６％クロムの混合物について：約５
ｍｌのグリセロールをカラム洗浄緩衝液（ｐＨ４．５）
５００ｍｌへ加えて４００±５０ｍＯｍｓに調節した。

【００９６】ｂ． ライトグリーン−ＳＲＢ混合物につ
いて：グリセロール約８ｍｌをカラム洗浄緩衝液（ｐＨ
４．５）５００ｍｌへ加えて７００±５０ｍＯｍｓに調
節した。

【００９７】フェストフローカラムを各緩衝液で平衡化
した。

【００９８】７． 別々のリポソーム製剤をファストフ
ローセファロース６カラム中で遊離染料から分離した。

【００９９】８． この分離後、未結合リポソームを２
つの染料混合物に対する別々の群でプールした。

【０１００】 実施例４ 封入した混合染料のスペクトルスキャン 実施例３で調製されそしてライトグリーンＳＦイエロウ
ィッシュ−スルホローダミンＢ染料混合物を含有するリ
ポソームを０．５％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）
中で１：５０に希釈し、そして５８℃で３０分間加温し
た。

【０１０１】実施例３で調製されたライトグリーンＳＦ
イエロウィッシュ−スルホローダミンＢの染料混合物を
リン酸塩緩衝化食塩水（ＰＢＳ）、ｐＨ７．５および
０．５％ＳＤＳの中で１：８０００に希釈した。

【０１０２】実施例３で調製されそしてクロムアズロー
ル−スルホローダミンＢ染料混合物を含むリポソーム
を、０．５％ＳＤＳ中で１：１３．５に希釈しそして５
８゜で３０分間加温した。

【０１０３】実施例３で調製されたクロムアズロール−
スルホローダミンＢ染料の染料混合物を、ＰＢＳ、ｐＨ
７．５および０．５％ＳＤＳ中で１：１０００に希釈し
た。

【０１０４】各染料混合物および各溶解したリポソーム
製剤をベックマンＤＵ７を用いて３４０ｎｍ〜７００ｎ
ｍで走査した。結果を図４〜図８に示す。図４はライト
グリーン−ＳＲＢを含有する溶解したリポソームのスキ
ャンを示す。図５はライトグリーン−ＳＲＢ染料混合物
単独のスキャンを示す。図６はクロムアズロール−ＳＲ
Ｂ−ライトグリーンを含有する溶解したリポソームのス
キャンを示す。図７および図８は、それぞれＰＢＳおよ
び０．５％ＳＤＳ中のクロムアズロール−ＳＲＢ−ライ
トグリーン染料混合物のスキャンを示す。リポソーム製
剤に対する染料混合物単独のスキャンの相関関係により
染料混合物がリポソームに首尾よく封入されそして各染
料が染料の混合物中に別々に同定されることが示され
る。

【０１０５】ここには現在本発明の好ましい実施態様で
あると思われるものを記載したが、当業者であればこれ
に対し本発明の精神から逸脱することなく変更および修
正を加えてもよくそしてこのような変更および修正のす
べてを本発明の範囲内に属するものと主張することを意
図することが明らかであろう。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、第二の標識化リポソーム結合体と結合
する第一の標識化リポソーム結合体を有するトレーサー
を用いた検定の模式説明図である。

【図２】図２は、異なったバインダーと結合する異なっ
た標識化リポソーム結合体を有するトレーサーを用いた
検定の模式説明図である。

【図３】図３は、１つの顆粒標識物と２つの検出可能な
物質を有するリポソーム結合体を有するトレーサーを用
いた検定の模式説明図である。

【図４】図４は、０．５％ＳＤＳに溶解したライトグリ
ーン−ＳＲＢを含むリポソームの吸光度スキャンを表わ
すグラフである。

【図５】図５は、０．５％ＳＤＳ中のライトグリーン−
ＳＲＢ染料混合物の吸光度スキャンを表わすグラフであ
る。

【図６】図６は、クロム、アズロール−ＳＲＢ−ライト
グリーンを含む溶解リポソームの吸光度スキャンを表わ
すグラフである。

【図７】図７は、ＰＢＳにおけるクロムアズロール−Ｓ
ＲＢ−ライトグリーン染料混合物の吸光度を表わすグラ
フである。

【図８】図８は、ＳＤＳにおけるクロムアズロール−Ｓ
ＲＢ−ライトグリーン染料混合物の吸光度スキャンを表
わすグラフである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ジョアン・ホーラー・ハスキャンプ アメリカ合衆国メリーランド州21204, トウソン，サウスウィック・ドライブ 915 (72)発明者 エドワード・チャールズ・マクファーラ ンド アメリカ合衆国メリーランド州21234, ボルティモア，ウェンドオーヴァー・ロ ード 2605 (56)参考文献 特開 昭59−84162（ＪＰ，Ａ) 特開 昭60−35265（ＪＰ，Ａ) 特開 昭61−76958（ＪＰ，Ａ) 特開 昭63−45563（ＪＰ，Ａ) 国際公開91／12530（ＷＯ，Ａ１)

Claims (2)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 （１）サンプル中の少なくとも１つの被
   検体の量に比例してトレーサーがバインダーに結合する
   ようになるような条件下で、バインダーおよびトレーサ
   ーにサンプルを接触させるが、但し、 バインダーは固体支持体上に固定されており且つ少なく
   とも１つの被検体に特異的に結合するものであり、そし
   て トレーサーは第１顆粒標識物および第２顆粒標識物から
   なるが、但し、第１顆粒標識物は第１の検出可能な物質
   を含み且つ第１および第２リガンドをその上に固定して
   有し、第１リガンドはバインダーまたは少なくとも１つ
   の被検体に特異的に結合するものであり、そして第２顆
   粒標識物は第２の検出可能な物質を含み且つ第３リガン
   ドをその上に固定して有し、第３リガンドは第１顆粒標
   識物上で第２リガンドを特異的に結合するものであり、
   そして （２）サンプル中の少なくとも１つの被検体の量の尺度
   として第１および第２の検出可能な物質を検出する工程
   からなる、少なくとも１つの被検体を含む疑いのあるサ
   ンプルの検定方法。
2. 【請求項２】 第１顆粒標識物および第２顆粒標識物か
   らなるトレーサーであって、但し、第１顆粒標識物は第
   １の検出可能な物質を含み且つ第１および第２リガンド
   をその上に固定して有し、第１リガンドはバインダーま
   たは少なくとも１つの被検体に特異的に結合するもので
   あり、そして第２顆粒標識物は第２の検出可能な物質を
   含み且つ第３リガンドをその上に固定して有し、第３リ
   ガンドは第１顆粒標識物上で第２リガンドを特異的に結
   合するものであることを特徴とする該トレーサーからな
   る、請求項１記載の方法に有用な検定用組成物。