JP3174543B2 - 僅少分析物用直読式ラテラルフローアッセイの方法及びそのキット - Google Patents
僅少分析物用直読式ラテラルフローアッセイの方法及びそのキットInfo
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- JP3174543B2 JP3174543B2 JP27805997A JP27805997A JP3174543B2 JP 3174543 B2 JP3174543 B2 JP 3174543B2 JP 27805997 A JP27805997 A JP 27805997A JP 27805997 A JP27805997 A JP 27805997A JP 3174543 B2 JP3174543 B2 JP 3174543B2
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Description
るための新規ラテラルフローアッセイ及び方法、並びに
そのキットに関する。本発明ではアッセイ(分析試験)
から結果を直接読み取ることができる。本発明の装置及
び方法を使用して医学的診断用僅少物質を検出すること
ができる。
セイは多数あるものの、現在存在する市販の製品は「典
型的な」競合阻害結果を生じ、これは、分析物濃度が上
昇するにつれてシグナルが低減することを意味する。し
かし、本アッセイは、本明細書で説明する方法及び装置
により、分析物濃度が上昇するにつれて増強するシグナ
ルを提供する。更に、現在存在する市販の製品には、ユ
ーザーが結果をカラーチャートと比較する必要がある読
取り帯域が組み込まれている。本発明では、不連続な分
析物濃度で現れる複数の読取り,補助ラインを提供する
アッセイを説明する。
競合阻害アッセイ結果の直接表示を提供可能なアッセイ
(分析試験)及び方法を提供する。本発明は、僅少分析
物を検出するためのラテラルフローアッセイ及び方法に
関する。特に、このアッセイは一般に競合阻害アッセイ
である。このアッセイの結果は、アッセイ装置から直接
読むことができる。この装置は、様々な種類の医学的診
断用試験で有用な僅少分析物の検出に使用することを企
図する。
検出するための方法及び装置(あるいはキット)に関す
る。本発明の好ましい態様では、特定の分析物を含有す
ると推測される試料(すなわち、抽出物又は溶液)を、
分析物とともに特定の結合対を構成する抗分析物抗体の
製剤に加える。この混合物に、分析物又は分析物類縁体
で被覆された有色粒子等のトレーサーを含有する試薬を
加える。分析物又は分析物類縁体は、有色粒子に直接結
び付いていてもよく、キャリヤー分子を介して結び付い
ていてもよい。有色粒子は、第2の特定の結合対の一部
分である補助標識も含む。この標識は、例えば、ビオチ
ンであってもよい。試料、抗分析物抗体溶液及び有色粒
子含有試薬の混合物を、下記の特定の3領域を含む固体
支持体(例えば、ニトロセルロース膜等)を含むラテラ
ルフロー装置に塗布する。 1.試料添加領域、 2.捕捉領域上に固定された分析物又は分析物類縁体を
含む捕捉領域、 3.1つ以上の帯域を含む読取り領域であって、読取り
領域の各帯域は下記の1つ以上を含む。 固定された分析物抗体、有色粒子上の標識に相補的な固
定化された結合パートナー(例えば、抗ビオチンやアビ
ジン)、及び固定化分析物あるいは分析物類縁体。
の1分画は、分析物又は分析物類縁体を含む有色粒子等
のトレーサーに結合する。粒子の小集団のみが捕捉領域
を超えて移動する。最小数の有色粒子が、読取り領域の
帯域の材料まで移動して結合するのに利用される。試料
が、本アッセイで測定すべき特定の分析物を含む場合、
若干の抗体が分析物に結合し、それより少ない抗体が有
色粒子を含む分析物又は分析物類縁体に結合するのに利
用される。有色粒子のより大きい集団が捕捉領域を超え
て移動し、読取り領域の1つ以上の帯域に結合する。試
料に含まれる分析物の量がますます増加するにつれて、
より多量の非結合分析物粒子が、読み取り領域のより多
くの帯域に自由に結合し、その結果、より強いシグナ
ル、換言すれば補助ライン又はシンボルがアッセイ装置
に出現することになる。それゆえ、計器を備えた様式で
も、最も重要な、計器を備えていない様式でも、結果を
測定することができる。
タミン類)、エストロゲンやプロゲステロン等のホルモ
ン類、乱用性医薬品、ペプチド類等の医学的診断用僅少
分析物、並びにPCBやアフラトキシン等の環境的重要
性及び農業的重要性のある僅少分析物を検出することが
できる。その他の重要性のある僅少分析物としては、例
えば家庭毒素や治療薬等、痕跡量の金属や毒物等がある
が、この限りではない。
1に示す。固体支持体は、例えば、ニトロセルロース膜
であってもよく、試料添加領域8、固定された分析物又
は分析物類縁体を有する捕捉領域2、及びこの態様で
は、3帯域を含む読取り領域3を有する。しかし、本発
明による読取り領域は、所望の結果を提供するために少
なくとも1つ以上の帯域を含み、要望に応じて、4つ以
上の帯域又は3つ未満の帯域を含んでもよいことを理解
すべきである。図1に記載の態様で、帯域4はその上に
固定された無関係な分析物抗体を有するコントロール帯
域であって、この分析物抗体は、測定すべき第1分析物
とは異なる第2の無関係な分析物に対する抗分析物抗体
であり、この無関係な分析物は、例えば、トレーサーに
結びついており、このトレーサーは有色粒子であっても
よい。溶液/試料を領域8に塗布する前に、無関係な分
析物及びトレーサーを本装置に塗布すべき溶液/試料に
加える。読取り領域の他の帯域5及び6は、その上に固
定された、有色粒子上の標識に相補的な結合パートナー
を有する。この相補的な結合パートナーは、例えば、ニ
ュートラビジンであってもよい。領域7は、アッセイが
終わる固体支持体(又は、例えば、ニトロセルロース膜
のストリップ)の遠位端を示す。
す。この態様では、図1の固体支持体又はストリップ1
は、ハウジング(例えば、プラスチックハウジング等)
10に挿入される。ハウジング10は、装置の先端に位
置する穴11、図1に表示されている読取り領域3及び
帯域4、5及び6の区画を含む読取り「窓」12を有す
る枠を具有する。ハウジング10のフレームは、固体支
持体を覆うプラスチックハウジングの遠位端に矩形の
「窓」16も有し、これはアッセイの結果を見るのに使
用される。ユーザーが窓16のトレーサー又はマーカー
を見ることによってアッセイの終わりを読むことができ
るように、異なるトレーサー又はマーカーを試料に加え
ることができる。図2に記載の装置の態様で、試料添加
領域の区画は穴11を通して見ることができ、読取り領
域の区画は窓12を通して見ることができ、帯域4、5
及び6を示す。しかし、捕捉領域2は肉眼で見えない。
捕捉領域はハウジング10の下の穴11と窓12の間で
ある。アッセイに使用される固体支持体は一般にセルロ
ースエステルであり、ニトロセルロースは格別すぐれた
結果を与える。用語「ニトロセルロース」は、セルロー
スの硝酸エステルを指し、ニトロセルロースのみであっ
ても、硝酸及び他の酸、特に炭素原子を1〜7個有する
脂肪族カルボン酸の混合エステルであってもよく、酢酸
が好ましいことを理解すべきである。このような、硝酸
単独又は硝酸と酢酸等の他の酸との混合物でエステル化
されたセルロースから作製される固体支持体は多くの場
合、ニトロセルロース紙と呼ばれる。
のに好ましい材料であるが、上述の通り、ナイロンを含
め、ある結合剤をある濃度で維持するのに十分な表面積
を有する他の材料を、このような固体支持体を製造する
のに使用することが可能であるが、この限りではないこ
とを理解すべきである。アッセイに使用される固体支持
体は好ましくはシート型であり、シート型の基質は一般
にカード、試験ストリップ又はディップスティック等の
形をとる。しかし、他の型も本発明の意図及び範囲の内
である。
であってもよい。好ましい有色粒子は嚢(のう)であっ
て、この嚢は色素又は他の有色物質をマーカーとして含
み、アッセイで使用したとき、これによって嚢が破壊し
て有色物質が放出されることなく、トレーサーを見るこ
とができる。嚢は、無傷の赤血球、赤血球影、リポソー
ム(小嚢と呼ばれることもある単壁、又は多層状)、例
えばコアセルベーションや界面重合等によって作製され
るポリマーマイクロカプセルを含め、広く様々な嚢の任
意の1つであってもよいが、この限りではない。ポリマ
ーマイクロカプセルは、マイクロカプセルが形成される
溶液にマーカーも含まれ、それによってポリマーマイク
ロカプセル内部にマーカーが含まれること以外は、技術
上周知の手順によって製造される。このようなマイクロ
カプセルの調製は、例えば、参照により本願明細書に組
み込まれるJan E. Vandegger編、Microencapsulation P
rocess and Applications (Plenum Press 1974) に開示
されている。
質、糖脂質、ステロイド、例えばリン酸アルキル等の比
較的長鎖のアルキルエステル、例えば、レシチン等の脂
肪酸エステル、脂肪族アミン等を含め、広く様々な脂質
から作製することができる。中性ステロイド、帯電両親
媒性化合物及びリン脂質の組合せ等、脂肪族材料の混合
物を使用することも可能である。リン脂質の例として
は、レシチン、スフィンゴミエリン、ジパルミトイルホ
スファチジルコリン等がある。ステロイド類としては、
コレステロール、コレスタノール、アネステロール等が
ある。帯電両親媒性化合物は一般に炭素原子を12〜3
0個含んでもよく、例えば、リン酸ジセチル,ステアリ
ルアミン,ヘキサデシルアミン,リン酸ジラウリル等、
モノアルキルリン酸エステル又はジアルキルリン酸エス
テル、あるいはアルキルアミンを含んでもよい。
で作製され、それによって嚢はその内部にマーカーを含
む。リポソーム嚢は、溶液中で勢いよく攪拌し、続いて
嚢外部からマーカーを除去することによって容易に作製
される。リポソームの調製については、参照により本願
明細書に組み込まれる米国特許第4,342,826
号、PCT国際公開第WO 80/01515号、米国
特許第4,539,376号及び米国特許第4,52
2,803号を参照されたい。有色粒子を含むトレーサ
ーは、疎水性色素又は顔料の水性分散、あるいはこのよ
うな色素や顔料で被覆されたポリマー核の水性分散を使
用して作製することもできる。参照により本明細書に組
み込まれる米国特許第4,373,932号には、この
ようなトレーサーについて更に詳細に記載されている。
しては、フェリチン、フィコエリトリン又は他のフィコ
ビリ蛋白、沈殿した又は不溶性の金属又は合金、菌類色
素、藻類色素、細菌色素、あるいは細菌クロロフィル等
の誘導体、植物原材料や誘導体などがあるが、この限り
ではない。目で見える有色粒子は、球形の有色ポリエチ
レン粒子(すなわちビーズ)等の目で見えるポリマー粒
子であってもよい。それゆえ、特定の僅少分析物の場
合、本発明の方法は、次の通りであってもよい。抗分析
物抗体を、分析物又は分析物類縁体を表面上に含む有色
粒子等のトレーサー、並びにやはり表面上の第2の分子
(ビオチン等)及び分析物を含む試料と混合する。抗分
析物抗体と粒子上の分析物又は分析物類縁体との間で複
合体を形成する間、試料中に存在する分析物が多いほ
ど、複合体と結合していない有色粒子が多い(すなわ
ち、これが非結合分画である。)。次に、捕捉領域の分
析物ラインが沈着するニトロセルロースのストリップ等
の固体支持体、及び読取り領域の1つの以上の帯域から
なる本発明のラテラルフロー装置に、この混合物を塗布
する。
て流れることができないため、支持体の先端に残る。
「非結合」粒子はストリップを流れる。それらに結合し
た抗分析物を有する粒子は分析物のラインに捕らえられ
る。残りの粒子はアビジン(又はニュートラビジン若し
くはストレパビジン)に捕らえられる。「非結合」粒子
が多いほど、アビジンラインは濃くなる。複数のアビジ
ンラインが存在する場合、試料中の分析物の濃度の測定
値としてラインをカウントすることができる。上述の通
り、分析物はポリ塩化ビフェニル(PCB)、乱用性医
薬品、ステロイド系ホルモン等、任意の小さい分子群で
あってもよい。分析物より低アフィニティで抗分析物抗
体に結合する分析物の類縁体が存在する場合、粒子に結
合する抗体よりむしろ、試料中の分析物及び抗分析物抗
体との相互作用を最大にするために、粒子表面に類縁体
を置くことも可能である。
が複合体に結合し、かつ/あるいは固体支持体上の捕捉
領域中の分析物ラインによって捕らえられる。このライ
ンが隠れている(すなわち、図2のプラスチックハウジ
ング下)場合、読取り領域及びその中の帯域のシグナル
は読み取られない。試料中の分析物が増加すると、形成
される複合体は少なく、より多くの粒子が「非結合」で
あり、陽性の示度を示すことになる。ビオチン等の結合
剤を使用して「非結合」粒子の捕捉を行う利点は、ビオ
チンがアビジン等の分子に極めて高いアフィニティで結
合し、かつ結合が非常に迅速に生じることである。この
アッセイでは、測定する分析物は小さい分子であるた
め、粒子表面及び/又は固体支持体の捕捉領域の分析物
ラインに結び付けるためのキャリヤーに分析物を化学的
に付着させることも可能である。次の実施例は、本発明
を例証するためのものであり、いずれにしても、本発明
を何ら限定するものではない。
(Conj1)を調製した。 2. EDC(1−エチル−3(3ジメチルアミノプロ
ピル)カルボジイミドによって、この複合体をカルボキ
シブルーラテックスに結合させた。N−ヒドロキシスク
シンイミドビオチンとの反応により、ラテックス懸濁液
をビオチンで標識した。 3. プロテインAアガロースクロマトグラフィーで、
血清から抗PCB抗体を精製した。 4. コントロール系用に、精製抗hCG抗体の溶液を
調製した。 5. コントロール系用に、hCGをカルボキシブルー
ラテックスに結合させた。 6. アッセイ終了色素指示薬用に、エリトシンBの1
%溶液を調製した。
ップを切り取った。 2. Conj1のライン1本をニトロセルロース膜
(捕捉領域)に塗布した。 3. 抗hCG抗体溶液のライン1本をニトロセルロー
ス膜(読取り領域内のコントロール帯域)に塗布した。 4. ニュートラビジンと混合したConj1のライン
2本をニトロセルロース膜(読取り領域内の2つの帯
域)に塗布した。 5. アッセイ終了指示薬用に、1%エリトシンB溶液
のライン1本を、ストリップの遠位端付近に塗布した。 6. このストリップを45℃で60分間乾燥させ、試
料末端に発泡パッドを取り付けた。 7. 試料領域に穴があり、読取り領域(コントロール
帯域及び他の帯域を含む)に窓があり、ストリップの遠
位端にアッセイ終了マーカーを読むための窓があるハウ
ジングに、このストリップを挿入した。 8. エタノール抽出物20μLをピペットで試験管に
取った。 9. 水性緩衝液中の抗PCB抗体50μLをピペット
で試験管に取って混合した。 10. hCGラテックス粒子とConj−1ビオチン
ラテックス粒子の懸濁液10μLをピペットで試験管に
取り、混合して室温で5分間インキュベートした。 11. 懸濁液すべてを(ハウジング内の)ストリップ
の試料領域に加えた。
た後、次のように結果を読み取った: A.複数ライン視覚読取り(図3に表示)。 i コントロールライン1本が見える:0ppmのP
CB(図3aに表示)。 ii コントロールライン1本と読取りライン1本(強
度がコントロールラインと同等以上):5ppmのPC
B(図3cに表示)。コントロールよりも強度が低い第
2の読取りラインが存在する。 iii コントロールライン1本と読取りライン2本(強
度がコントロールラインと同等以上):50ppmのP
CB(図3eに表示)。図3bは、0〜5ppmの分析
物の結果を示し、図3dは、5〜50ppmの分析物の
結果を示す。 B.単一ライン視覚読取り(このバージョンは、読取り
領域内に単一読取り帯域(ライン)を有する)。 i コントロールライン1本が見える:0ppmのP
CB ii 読取りラインの強度を強度チャートと比較した。 C.計器を備えた単一ライン視覚読取り(このバージョ
ンは読取り領域内に単一読取り帯域(ライン)を有し、
読取り領域内にコントロールラインがある場合とない場
合がある)。 i 読取りラインの反射率を反射分光光度計で測定し
た。 PCBの濃度(0、0.5、3、5、10及び22pp
m)を読み取った。各ストリップの読取りライン1から
得た吸光度をシグマスキャンイメージで試験した。各ス
トリップのピクセル値を測定し、PCB(ppm)の対
数値に対してプロットした。データを下記表1に示す。
log (PCB)及びY=ピクセル値の直線回帰で、r=
0.99が得られた。
イ(分析試験)から僅少物質についての結果を直接読み
取ることができ、例えば、本発明を使用して医学的診断
用僅少物質を検出することができる。また、本発明は、
分析物濃度が上昇するにつれて増強するシグナルを提供
でき、不連続な分析物濃度で現れる複数の読取り等が可
能なアッセイを提供できる。
mの分析物、c)>5ppmの分析物、d)>5かつ<
50ppmの分析物、e)50ppmの分析物、を用い
た、PCBの直読式ラテラルフローアッセイの結果を示
す略図である。
強度と対数[PCB]で示したグラフ図である。
Claims (10)
- 【請求項1】 試料中の分析物の有無又は量を測定する
方法であって、 a)固体支持体は(i) 試料添加領域と、(ii)
捕捉領域と、(iii) 少なくとも1つの帯域
を有する読取り領域とを含む3領域を有し、前記捕捉領
域はその上に固定された分析物又は分析物類縁体を有
し、前記読取り領域の前記少なくとも1つの帯域はその
上に固定された、トレーサー上の標識に相補的な結合パ
ートナーを有し、更に、前記試料添加領域は前記固体支
持体の先端にあることを特徴とする、固体支持体を提供
することと、 b)前記試料は、抗分析物抗体又は抗分析物類縁体抗体
及びトレーサーを含有する製剤と混合されており、前記
トレーサーは分析物又は分析物類縁体及び前記相補的結
合パートナーに結合することができる標識で被覆される
ことを特徴とする、試料添加領域を、分析物を含有する
と推測される試料と接触させることと、 c)前記試料と溶液の混合物を、試料添加領域から捕捉
領域まで、読取り領域を通って、固体支持体の遠位端ま
で、固体支持体の流路をに沿って流すことと、 d)読取り領域の1つ以上の帯域のトレーサーの有無又
は量を、試料中の分析物の量の関数として検出するこ
と、とを含む方法。 - 【請求項2】 前記トレーサーは第1トレーサーであ
り、前記読取り領域は少なくとも2つの帯域を有し、第
1帯域は第2の無関係な分析物に対する抗分析物抗体を
有するコントロール帯域であり、第2のトレーサーに結
び付けられた前記第2の無関係な分析物は、コントロー
ルのために試料に加えられ、更に前記第2の帯域は請求
項1記載の帯域であり、任意の補助帯域は第2の帯域と
同じであることを特徴とする、請求項1記載の方法。 - 【請求項3】 前記固体支持体は前記固体支持体用ハウ
ジングを更に含み、前記ハウジングは固体支持体全体を
囲み、かつ覆う枠を含み、前記枠は固体支持体の先端の
試料添加領域全域で開口する穴、支持体の読取り領域を
見るための枠内の第1窓、及び支持体の遠位端を見るた
めの枠内の第2窓を有することを特徴とし、 更に、前記試料混合物は、ハウジング枠内の前記穴を通
して前記混合物を注ぐことによって前記試料添加領域と
接触することを特徴とする、請求項1記載の方法。 - 【請求項4】 固体支持体を覆うハウジングの枠内の第
2窓を見ることによってアッセイの終わりを検出するた
めに、別のトレーサーを混合物に加えることを特徴とす
る、請求項1記載の方法。 - 【請求項5】 前記固体支持体は前記固体支持体用ハウ
ジングを更に含み、前記ハウジングは支持体全体を囲
み、かつ覆う枠を含み、前記枠は固体支持体の先端の試
料添加領域全域で開口する穴、支持体の読取り領域を見
るための枠内の第1窓、及び支持体の遠位端を見るため
の枠内の第2窓を有することを特徴とし、 更に、前記試料混合物は、ハウジングの枠内の前記穴を
通して前記混合物を注ぐことによって前記試料添加領域
と接触することを特徴とする、請求項2記載の方法。 - 【請求項6】 固体支持体を覆うハウジングの枠内の第
2窓を見ることによってアッセイの終わりを検出するた
めに、第3のトレーサーを混合物に加えることを特徴と
する、請求項2記載の方法。 - 【請求項7】 試料中の分析物の有無又は量を測定する
ためのキットであって、流路及び連続して、 (i) 試料添加領域と、 (ii) 捕捉領域と、 (iii) 少なくとも1つの帯域を有する読取り領域
と、を含む3領域を有し、前記捕捉領域はその上に固定
された分析物又は分析物類縁体を有し、前記少なくとも
1つの帯域は、その上に固定された、トレーサー上の標
識に相補的な結合パートナーを有し、更に、前記試料添
加領域は前記固体支持体の先端であることを特徴とする
固体支持体と、 前記試料に加えられる製剤であって、前記製剤は抗分析
物抗体又は分析物類縁体抗体及び前記トレーサーを含
み、前記トレーサーは分析物又は分析物類縁体及び前記
標識で被覆される製剤を含むキット。 - 【請求項8】 前記読取り領域は少なくとも2つの帯域
を有し、第1帯域はコントロール分析物である第2の無
関係な分析物に対する抗体を有するコントロール帯域で
あり、更に、前記第2の帯域は、その上に固定された、
前記トレーサー上の前記標識に相補的な結合パートナー
を有し、あらゆる補助帯域は第2帯域と同じであり、キ
ットは試料に加えられる補助製剤並びに請求項19に記
載の製剤を更に含み、前記補助製剤は前記第2の無関係
な分析物を含み、前記第2の分析物は第2のトレーサー
に結び付けられることを特徴とする、請求項7記載のキ
ット。 - 【請求項9】 前記支持体は前記固体支持体用ハウジン
グを更に含み、前記ハウジングは固体支持体全体を囲
み、かつ覆う枠を含み、前記枠は固体支持体の先端の試
料添加領域全域で開口する穴、支持体の読取り領域を見
るための枠内の第1窓、及び支持体の遠位端を見るため
の枠内の第2窓を有することを特徴とする、請求項7記
載のキット。 - 【請求項10】 前記固体前記支持体は前記固体支持体
用ハウジングを更に含み、前記ハウジングは固体支持体
全体を囲み、かつ覆う枠を含み、前記枠は固体支持体の
先端の試料添加領域全域で開口する穴、支持体の読取り
領域を見るための枠内の第1窓、及び支持体の遠位端を
見るための枠内の第2窓を有することを特徴とする、請
求項8記載のキット。
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