DE69329318T2

DE69329318T2 - Immunotestverfahren unter Verwendung von Mikropartikel enthaltenden, unterschiedlichen, nachweisbaren Substanzen

Info

Publication number: DE69329318T2
Application number: DE69329318T
Authority: DE
Inventors: Joanne Haller Hasskamp; Edward Charles Mcfarland; Thomas Joseph Mercolino
Original assignee: Becton Dickinson and Co
Current assignee: Becton Dickinson and Co
Priority date: 1992-07-02
Filing date: 1993-06-30
Publication date: 2001-04-26
Anticipated expiration: 2013-07-01
Also published as: JPH07287016A; CA2099433C; JP2643775B2; AU668171B2; AU4144093A; DE69329318D1; US5369036A; EP0577092B1; CA2099433A1; EP0577092A2; EP0577092A3; JPH09184841A

Description

Hintergrund der Erfindung

1. Gebiet der Erfindung

Diese Erfindung bezieht sich auf Bindungsassays, insbesondere Immunoassays, unter Verwendung eines Nachweissystems mit mehr als einer nachweisbaren Substanz.

2. Kurzbeschreibung des Standes der Technik

Zu den Problemen bei der Technik der Immunoassays gehört die Schwierigkeit des gleichzeitigen Nachweises von mehr als einem Analyten, die Notwendigkeit von nachweisbaren Markierungen zum Messen von Analyten, die Notwendigkeit einer guten visuellen Bestimmung der Markierung mit oder ohne Instrumente, die Notwendigkeit der Diskriminierung des Signals oberhalb des Rauschens, wenn Instrumente verwendet werden, und die Notwendigkeit einer erhöhten Empfindlichkeit.
Um die Empfindlichkeit zu erhöhen und einen visuellen Nachweis in Assays zu ermöglichen, werden Analyten, d. h. Antikörper, Antigene oder Haptene, mit Farbstoffen oder Fluorochromen markiert. Zum Beispiel beschreibt das US-Patent Nr. 4,695,554 Beutel oder Liposomen, die einen einzigen Farbstoff enthalten, zur Verwendung in Immunoassays.
Das US-Patent Nr. 4,703,017 beschreibt einen Festphasenassay unter Verwendung einer einzigen farbigen teilchenförmigen Markierung, wie eines Liposoms, das einen Farbstoff enthält.
Das US-Patent Nr. 4,745,075 beschreibt Agglutinierungsassays unter Verwendung von zwei oder mehr unlöslichen farbigen Teilchen, wie abgetöteten Bakterienzellen, Alginatteilchen, Sepharosekügelchen, Siliciumoxid, Aluminiumoxid, Erythrocyten und Polymerlatices. Die Teilchen werden so angepasst, dass sie in Abhängigkeit von der Anwesenheit spezifischer Liganden unterschiedliche farbige Agglutinate bilden.
Wie der Fachmann weiß, werden bei Agglutinierungsassays, z. B. im Weil- Felix-Test, im Latexteilchentest oder bei Agglutinierungen, die von Lektinen oder von Fibrinogen vermittelt sind, keine festen Träger verwendet. Bei Agglutinierungsassays wird ein visueller und mikroskopischer Nachweis von Aggregaten verwendet, die suspendiert oder aggregiert sind.
Es besteht ein Bedürfnis nach einem Assay, der empfindlicher ist als ein Assay, der auf einer einzigen farbigen teilchenförmigen Markierung oder einer mit einer Farbe verbundenen Agglutinierung beruht. Eine Technik für die Signalverstärkung wurde jetzt gefunden durch die Verwendung mehrfarbiger teilchenförmiger Markierungen in einem Assay, bei dem ein fester Träger verwendet wird.

Kurzbeschreibung der Erfindung

Die Erfindung stellt bereit:
(1) ein Verfahren zur Analyse einer Probe, von der angenommen wird, dass sie wenigstens einen Analyten enthält, umfassend das In-Kontakt-Bringen wenigstens einer bindenden Verbindung, die auf einem festen Träger immobilisiert ist, unter Assaybedingungen mit wenigstens einem Analyten und einem Tracersystem,
wobei die bindende Verbindung eine bindende Verbindung sowohl für den Analyten als auch das Tracersystem ist oder eine bindende Verbindung entweder nur für den Analyten oder nur für das Tracersystem ist,
wobei das Tracersystem wenigstens eine teilchenförmige Markierung aufweist, die mit wenigstens einem Liganden gekoppelt ist, wobei die teilchenförmige Markierung wenigstens eine nachweisbare Substanz enthält und wobei der Ligand eine Substanz ist, die befähigt ist, durch eine bindende Verbindung gebunden zu werden, wobei das gesamte Tracersystem wenigstens zwei nachweisbare Substanzen einschließt; und
das Nachweisen dieser Substanzen, nachdem der Tracer an die bindende Verbindung gebunden ist oder wenigstens ein Analyt an die bindende Verbindung gebunden ist.
(2) ein bevorzugtes Verfahren gemäß (1), wobei das Tracersystem umfasst:
eine erste teilchenförmige Markierung, die ein erstes Liposom ist, welches eine erste nachweisbare Substanz einschließt, die ein erster sichtbarer Farbstoff ist, wobei das erste Liposom einen ersten und zweiten Liganden aufweist, die daran immobilisiert sind, wobei der erste Ligand spezifisch entweder an die bindende Verbindung oder den wenigstens einen Analyten bindet, und
eine zweite teilchenförmige Markierung, die ein zweites Liposom ist, welches eine zweite nachweisbare Substanz einschließt, die ein zweiter sichtbarer Farbstoff ist, wobei das zweite Liposom einen dritten Liganden aufweist, der daran immobilisiert ist, wobei der dritte Ligand spezifisch an den zweiten Liganden auf dem ersten Liposom unter derartigen Bedingungen bindet, dass das Tracersystem im Verhältnis zur Menge des wenigstens einen Analyten in der Probe an diese bindende Verbindung gebunden wird; und
wobei der erste sichtbare Farbstoff und der zweite sichtbare Farbstoff als Maß für die Menge des wenigstens einen Analyten in der Probe nachgewiesen werden;
(3) ein bevorzugtes Verfahren gemäß (1), wobei das Verfahren für die gleichzeitige Bestimmung von wenigstens zwei Analyten bestimmt ist, umfassend:
1) das In-Kontakt-Bringen der Probe mit einer ersten bindenden Verbindung und einer zweiten bindenden Verbindung und dem Tracersystem, wobei die erste bindende Verbindung und die zweite bindende Verbindung auf dem festen Träger immobilisiert sind, und
wobei die erste bindende Verbindung spezifisch an einen ersten Analyten bindet und die zweite bindende Verbindung spezifisch an einen zweiten Analyten bindet und wobei das Tracersystem umfasst:
eine erste teilchenförmige Markierung, die ein erstes Liposom ist, welches eine erste nachweisbare Substanz einschließt, die ein erster sichtbarer Farbstoff ist, und das einen ersten Liganden aufweist, der daran immobilisiert ist, wobei der erste Li gand spezifisch entweder an die erste bindende Verbindung oder den ersten Analyten bindet, und
eine zweite teilchenförmige Markierung, die ein zweites Liposom ist, welches eine zweite nachweisbare Substanz einschließt, die ein zweiter sichtbarer Farbstoff ist, und das einen zweiten Liganden aufweist, der daran immobilisiert ist, wobei der zweite Ligand spezifisch entweder an die zweite bindende Verbindung oder den zweiten Analyten bindet, und zwar unter derartigen Bedingungen, dass das Tracersystem in einem Verhältnis zur Menge des ersten und zweiten Analyten in der Probe an die erste bindende Verbindung und die zweite bindende Verbindung gebunden wird; und
2) das Nachweisen des ersten sichtbaren Farbstoffs und des zweiten sichtbaren Farbstoffs als Maß für die Menge des ersten und des zweiten Analyten in der Probe;
(4) ein bevorzugtes Verfahren gemäß (1), wobei die bindende Verbindung spezifisch an den wenigstens einen Analyten bindet und wobei das Tracersystem die teilchenförmige Markierung umfasst, wobei die teilchenförmige Markierung ein Liposom ist, welches wenigstens zwei nachweisbare Substanzen einschließt, bei denen es sich wenigstens um einen ersten sichtbaren Farbstoff und einen zweiten sichtbaren Farbstoff handelt, und wobei das Liposom den Liganden aufweist, der daran immobilisiert ist, wobei der Ligand spezifisch entweder an die bindende Verbindung oder den wenigstens einen Analyten bindet, und zwar unter solchen Bedingungen, dass das Tracersystem im Verhältnis zu der Menge des wenigstens einen Analyten in der Probe an die bindende Verbindung gebunden wird; und wobei der erste sichtbare Farbstoff und der zweite sichtbare Farbstoff als Maß für die Menge des wenigstens einen Analyten in der Probe nachgewiesen werden; und
(5) eine Assay-Zusammensetzung zur Verwendung bei den Verfahren, wie sie oben in (2) bis (4) definiert sind.
Bei dem Assay der Erfindung werden der Analyt und das Tracersystem unter Assaybedingungen mit einer bindenden Verbindung auf einem Träger in Kontakt gebracht. Das Tracersystem umfasst wenigstens eine teilchenförmige Markierung, die mit wenigstens einem Liganden verbunden ist, wobei die teilchenförmige Markierung wenigstens eine nachweisbare Substanz einschließt. Das Gesamt-Tracingsystem schließt wenigstens zwei nachweisbare Substanzen ein, bei denen es sich vorzugsweise um Farbstoffe handelt.
In dem Tracersystem sind wenigstens zwei verschiedene nachweisbare Substanzen in unterschiedlicher Weise vorhanden. Das Tracersystem kann folgendes einschließen:
- eine erste teilchenförmige Markierung mit wenigstens einem Liganden, wobei die erste teilchenförmige Markierung eine erste nachweisbare Substanz einschließt, und eine zweite teilchenförmige Markierung mit einem zweiten Liganden, der an einen Liganden an der ersten teilchenförmigen Markierung bindet, wobei die zweite teilchenförmige Markierung eine zweite nachweisbare Substanz einschließt, die von der ersten nachweisbaren Substanz verschieden ist, wie es in Fig. 1 gezeigt ist;
- wenigstens zwei verschiedene Liganden, wobei jeder Ligand mit einer teilchenförmigen Markierung markiert ist, die für jeden Ligan dentyp eine andere nachweisbare Substanz enthält, wie es in Fig. 2 gezeigt ist; oder
- einen Liganden mit einer teilchenförmigen Markierung, die wenigstens zwei verschiedene nachweisbare Substanzen enthält, wie es in Fig. 3 gezeigt ist.
Die Markierungen werden nachgewiesen, nachdem das Tracersystem an die bindende Verbindung gebunden hat, oder das Tracersystem wird an wenigstens einen Analyten gebunden, der an die bindende Verbindung gebunden ist.
Einige Vorteile dieses Assays sind eine erhöhte Empfindlichkeit, die Fähigkeit, mehr als einen Analyten gleichzeitig nachzuweisen, die Vermeidung einer Verwechslung von Reagentien und die Fähigkeit, bei der instrumentellen Analyse mehr als eine Wellenlänge gleichzeitig nachzuweisen, was eine bessere Diskriminierung des Signals oberhalb des Rauschens erlaubt. Die Erfindung stellt auch ein Assaywerkzeug bereit, das für viele verschiedene Typen von Assays maßgeschneidert werden kann.

Kurzbeschreibung der Figuren

Fig. 1 ist eine schematische Darstellung eines Assays unter Verwendung eines Tracersystems mit einem ersten markierten Liposomkonjugat, das an ein zweites markiertes Liposomkonjugat bindet;
Fig. 2 ist eine schematische Darstellung eines Assays unter Verwendung eines Tracersystems mit unterschiedlichen markierten Liposomkonjugaten, die an unterschiedliche bindende Verbindungen binden;
Fig. 3 ist eine schematische Darstellung eines Assays unter Verwendung eines Tracersystems mit einem Liposomkonjugat mit einer teilchenförmigen Markierung und zwei nachweisbaren Substanzen;
Fig. 4 ist eine Graphik, die einen Extinktionsscan von Liposomen darstellt, die Lichtgrün-SRB enthalten und in 0,5% SDS lysiert wurden;
Fig. 5 ist eine Graphik, die einen Extinktionsscan eines Lichtgrün-SRB- Farbstoffgemischs in 0,5% SDS darstellt;
Fig. 6 ist eine Graphik, die einen Extinktionsscan von lysierten Liposomen darstellt, die Chromazurol-SRB-Lichtgrün enthielten;
Fig. 7 ist eine Graphik, die einen Extinktionsscan eines Chromazurol- SRB-Lichtgrün-Farbstoffgemischs in PBS darstellt;
Fig. 8 ist eine Graphik, die einen Extinktionsscan eines Chromazurol- SRB-Lichtgrün-Farbstoffgemischs in SDS darstellt.

Ausführliche Beschreibung der Erfindung

Das als bindende Verbindung verwendete Material wird je nach der besonderen daran beteiligten Assaychemie im Hinblick auf den zu bestimmenden Analyten und das spezielle Assayverfahren, z. B. kompetitiver Assay, Sandwichassay, ausgewählt. Vorzugsweise ist die bindende Verbindung eine spezifische Bindungsspezies, die einen Partner eines spezifischen Paars, z. B. ein Antigen oder einen Antikörper, umfasst. Die Auswahl einer geeigneten bindenden Verbindung gehört zum Können des Fachmanns.
Der Typ der zu verwendenden bindenden Verbindung hängt von dem zu bestimmenden Analyten und dem speziellen Assayverfahren ab. Die bindende Verbindung kann ein Antikörper einschließlich Serum, polyklonaler oder monoklonaler Antikörper, ein Antigen, ein für das zu bindende Material spezifisches Protein oder eine natürlich vorkommende bindende Verbindung sein. So kann zum Beispiel bei einem Assay des kompetitiven Typs für ein Antigen oder Hapten die bindende Verbindung ein Antikörper oder eine für den Tracer und das Antigen oder Hapten spezifische natürlich vorkommende Substanz sein. Wenn der Assay ein Assay für einen Antikörper ist, kann die bindende Verbindung zum Beispiel ein Antigen oder ein für den zu bestimmenden Antikörper spezifischer Antikörper sein. Bei einem Assay des Sandwichtyps, wobei der Analyt ein Antikörper ist, kann die bindende Verbindung ein Antigen für den Antikörper oder ein Protein wie Protein A, das selektiv Fc-Fragmente bestimmter Antikörper bindet, sein. Wenn bei einem Sandwichassay der Analyt ein Antigen ist, das z. B. mehr als ein Epitop oder mehr als eine Determinante aufweist, kann die bindende Verbindung ein Antikörper oder eine für das zu bestimmende Antigen spezifische, natürlich vorkommende bindende Verbindung sein.
Eine bindende Verbindung wird in einem Assay auf einem Träger verwendet. Der Träger kann porös oder nichtporös sein. Poröse und nichtporöse Träger sind dem Fachmann wohlbekannt. In ähnlicher Weise sind auch die Verfahren zur sicheren Befestigung einer bindenden Verbindung an einem festen Träger dem Fachmann wohlbekannt. Die bindende Verbindung kann also über eine kovalente oder nichtkovalente Bindung direkt oder indirekt befestigt werden. Vorzugsweise wird die bindende Verbindung an einem festen Träger adsorbiert.
Zu den Trägern gehört eine Vielzahl von Materialien, die als geeignete Träger für eine bindende Verbindung in einem Assay bekannt sind. Nicht- einschränkende repräsentative Beispiele dafür sind Nitrocellulose, Polyme re, wie Nylon oder Latex, Glasteilchen. Der feste Träger kann in einer Vielzahl von Formen vorliegen, einschließlich Folien, Röhrchen, Karten, Teststreifen, Mikrotiterplatten.
Der feste Träger hat eine solche spezifische Oberfläche (Fläche/Gewichtseinheit des Materials), dass die bindende Verbindung auf dem Träger in einer solchen Konzentration (Gewicht/Flächeneinheit) vorliegen kann, dass der Tracer unter Assaybedingungen nachweisbar ist. "Nachweisbar" bedeutet entweder, dass die Markierung mit dem bloßen Auge zu sehen ist, oder, dass sie mit einer Apparatur, wie einem Spektrophotometer oder Fluorometer, nachgewiesen werden kann.
Ein Analyt wird in einem Assay unter Verwendung eines Tracersystems nachgewiesen. Vorzugsweise besteht das Tracersystem aus einem spezifisch bindenden Teil, der an eine teilchenförmige Markierung gekoppelt ist. Wenn das Tracersystem also in einem kompetitiven Antikörper/Antigen-Assay verwendet werden soll, wäre der spezifisch bindende Teil der Analyt oder ein geeignetes Analogon davon. Wenn der Assay ein Sandwich-Antikörper/Antigen-Assay ist, würde der spezifisch bindende Teil den Analyten spezifisch binden. Der Fachmann wird sich auch darüber im Klaren sein, dass das Tracersystem weiterhin Amplifikationssysteme umfassen kann. Unter Assaybedingungen kann das Tracersystem also auch indirekt anstatt direkt an den Analyten binden.
Das Tracersystem weist wenigstens eine teilchenförmige Markierung auf, die an wenigstens einen Liganden gekoppelt ist, wobei die teilchenförmige Markierung wenigstens eine nachweisbare Substanz enthält, während das gesamte Tracersystem wenigstens zwei nachweisbare Substanzen umfasst.
Die Wahl des zur Verwendung in einem Tracersystem zu markierenden Liganden hängt von dem zu bestimmenden Analyten und dem Assayverfahren ab. Der Ligand ist eine Substanz, die von einer bindenden Verbindung gebunden werden kann. Zu den Liganden gehören Antigene (z. B. Proteine, Polysaccharide, Nucleinsäuren, Peptidhormone, Steroide, Wirkstoffe, Bakterien, Viren, Tumorantigene, Enzyme, Vitamine), Haptene und Antikörper (polyklonal und monoklonal). Beispiele für Antigene (oder ihre entsprechenden Antikörper), die unter Verwendung der vorliegenden Erfindung bestimmt werden können, sind Malaria, Streptokokken, Influenza, Rubella, Meningococcus, Candida, RSV (respiratory syncytial virus), HIV, Tumormarker, Digoxin, Theophyllin, Ferritin, FSH, LH, Prolactin, Testosteron, Progesteron, HCG, TSH, T4, T3.
Die teilchenförmige Markierung ist ein farbiges Teilchen mit einem Durchmesser von 0,01 um bis 10 um. Das farbige Teilchen kann fest oder quasifest sein, im Gegensatz zu nichtfesten löslichen Markierungen, wie Radioisotopen und Enzymen. Zu den quasifesten teilchenförmigen Markierungen gehören Vesikel, Mikrokapseln und stabilisierte kolloidale Teilchen.
Eine bevorzugte teilchenförmige Markierung ist ein Beutel, der eine Substanz enthält, wodurch der Tracer bei Verwendung in dem Assay nachweisbar ist. Der Beutel, der als teilchenförmige Markierung verwendet wird, umfasst eine Vielzahl von Beuteln einschließlich unter anderem Liposomen (einwandig oder multilamellar), Polymermikrokapseln, zum Beispiel solche, die durch Koazervierung oder Grenzflächenpolymerisation hergestellt werden, und stabilisierte kolloidale Teilchen.
Liposomen können aus einer Vielzahl von Lipiden hergestellt werden, einschließlich Phospholipiden, Glycolipiden, Steroiden, relativ langkettigen Alkylestern, z. B. Alkylphosphaten, Fettsäureestern, z. B. Lecithin und Fettaminen.
Es kann auch ein Gemisch von Fettmaterialien eingesetzt werden, wie eine Kombination aus einem neutralen Steroid, einem geladenen Amphiphil und einem Phospholipid. Typische Beispiele für Phospholipide sind Lecithin, Sphingomyelin und Dipalmitoylphosphatidylglycerin. Zu den repräsentativen Steroiden gehören Cholesterin, Cholestanol und Lanosterol.
Repräsentative geladene amphiphile Verbindungen enthalten im allgemeinen 12 bis 30 Kohlenstoffatome. Mono- oder Dialkylphosphorsäureester oder Alkylamine, z. B. Dicetylphosphat, Stearylamin, Hexadecylamin und Dilaurylphosphat sind repräsentativ.
Die bevorzugte nachweisbare Substanz, die in der teilchenförmigen Markierung verwendet wird, ist eine sichtbare Substanz, besonders bevorzugt ein Farbstoff. Farbstoffe sind chemische Verbindungen, die aufgrund der Wechselwirkung von Licht mit dem Elektronensystem des Moleküls eine Farbe aufweisen. Farbstoffmoleküle können ionisierbare Gruppen aufweisen, die Auxochrome genannt werden, z. B. -NH&sub2;, -OH, und durch die das Chromophor an ein Targetmolekül binden kann. Farbstoffe können anionische oder kationische Gruppen enthalten, wie 4-(Dicyanmethylen)-2-methyl-6-(p-dimethylaminostyryl)-4H-pyran, oder sie können aus polycyclischen Ringen bestehen, wie Pyren, oder sie können aus aromatischen Ringen bestehen, die durch konjugierende Alkylketten miteinander verbunden sind, wie 1,6-Diphenyl-1,3,5-hexatrien. Ungesättigte chromophore Gruppen können für die Farbe verantwortlich sein, z. B. -NO&sub2;, -N=N- und =CO, d. h. chinoide Ringe, Xanthene, Azine, Thiazine, Azoverbindungen, Nitroverbindungen, Triarylmethane, Acridine und viele andere. Beispiele für die Farbstoffe sind Sulforhodamin B (ein Xanthin- Aminofarbstoff mit einem roten Fluorochrom), Lichtgrün-SF-Gelblich (ein anionischer Triphenylmethanfarbstoff), Chromazurol S (ein Triphenylmethanfarbstoff), Brillantblau FCF (ein blauer saurer Triphenylmethan farbstoff) und Nilrot (ein fettlöslicher Lösungsmittel-Oxazon-Farbstoff). Die Farbstoffe können wasserlöslich oder lipophil sein.
Die Farbstoffkonzentration wird gemäß den Löslichkeitseigenschaften des Farbstoffs mit Verfahren, die dem Fachmann wohlbekannt sind, eingestellt und hinsichtlich des gewünschten Nachweises sowie hinsichtlich der Stabilität optimiert.
Die Herstellung von Beuteln, die Farbstoff für einen Immunoassay enthalten, ist im US-Patent Nr. 4,695,554 beschrieben.
Obwohl der in dem Beutel verwendete Farbstoff ein absorbierender Farbstoff ist, können solche Farbstoffe auch fluoreszierende Eigenschaften haben. Daher können die Farbstoffe innerhalb des Umfangs der Erfindung auch anhand von Fluoreszenz- anstelle von Absorptionseigenschaften nachgewiesen werden.
Repräsentative Beispiele für andere nachweisbare Substanzen, die eingesetzt werden können, sind Ferritin, Phycoerythrine oder andere Phycobiliproteine, metallorganische Komplexe, z. B. Phthalocyanine, Porphyrine oder Lanthanidchelate, Pilz-, Algen- oder Bakterienpigmente oder Derivate davon, wie Bakterienchlorophylle, sowie Pflanzenmaterialien oder Derivate davon.
Die Liposomenbeutel können in einer wässrigen Lösung einer farbigen Substanz hergestellt werden, und als Ergebnis wird die Substanz in das Liposom eingebaut. Die Liposomenbeutel können durch kräftiges Rühren in der Lösung und anschließende Entfernung von nicht eingebauter farbiger Substanz aus dem Außenraum des Beutels hergestellt werden. Weitere Einzelheiten in bezug auf die Herstellung von Liposomen sind im US-Patent Nr. 4,342,826 und in WO 80/01515 dargelegt.
Nachweisbare Substanzen können auch auf der Oberfläche des Liposoms befestigt oder kovalent verknüpft werden, wobei man eine Oberflächenchemie verwendet, die dem Fachmann bekannt ist und der Methode ähnlich ist, mit der Antikörper an Liposomen gekuppelt werden, wie es in Beispiel 1 beschrieben ist. Liposomen können auch unter Verwendung eines lipophilen, in einer Doppelschicht enthaltenen Farbstoffs hergestellt werden, indem man den lipophilen Farbstoff bei der Herstellung des Films, der zur Herstellung der Liposomen gequollen wird, zusammen mit den anderen Filmkomponenten auflöst.
Verfahren zur Kupplung des spezifisch bindenden Teils oder des Liganden mit einer teilchenförmigen Markierung sind in der Technik wohlbekannt. Zu diesen Techniken gehören Absorption, kovalente Bindung, Derivatisierung und Aktivierung. Bei der Herstellung eines Tracersystems, bei dem der spezifisch bindende Teil mit einem Beutel markiert ist, kann der Beutel aus einer Komponente hergestellt sein, die mit dem spezifisch bindenden Teil derivatisiert ist, wodurch der Beutel bei der Herstellung mit einem spezifisch bindenden Teil sensibilisiert wird. Bei einem anderen Verfahren kann anfangs der Beutel einschließlich einer farbigen Substanz gebildet werden, und anschließend kann der Beutel mit Verfahren, die in der Technik bekannt sind, mit dem spezifisch bindenden Teil sensibilisiert werden.
Bei der Bildung eines Tracersystems kann ein Beutel unter Verwendung einer geeigneten Kupplungs- oder Spacerverbindung, die die Immunreaktivität des Liganden nicht zerstört, an einen Liganden gekuppelt werden. Alternativ dazu können die Beutel nach in der Technik bekannten Verfahren auch direkt an den Liganden gekuppelt werden. Die Beutel können auch mit dem Liganden sensibilisiert werden, indem man entweder den Liganden an eines der bei der Bildung der Beutel zu verwendenden Materialien kuppelt oder indem man den Liganden an die Beutel kuppelt, nachdem sie gebildet worden sind.
In Assays ist die bindende Verbindung sowohl für den Analyten als auch für das Tracersystem eine bindende Verbindung, oder eine bindende Verbindung ist entweder nur für den Analyten oder nur für das Tracersystem eine bindende Verbindung, wobei der Typ der eingesetzten bindenden Verbindung von dem Assay abhängt, das zur Bestimmung des Analyten verwendet werden soll. Wenn der Assay also zum Beispiel ein Sandwichassay ist, ist die bindende Verbindung nur für den Analyten eine bindende Verbindung. Bei diesem Typ von Assay ist der Tracer für den Analyten spezifisch, so dass das Tracersystem an den Analyten gebunden ist, der an die bindende Verbindung bindet. Bei einem Inhibitionsassay oder kompetitiven Assay ist die bindende Verbindung sowohl für das Tracersystem als auch für den Analyten spezifisch. Bei diesem Typ von Assay hemmt die Anwesenheit von Analyt die Bindung des Tracersystems an die bindende Verbindung. Wenn das Tracersystem also zum Beispiel an den festen Träger gebunden ist, ist es entweder direkt an die bindende Verbindung auf dem Träger gebunden, oder es ist an Analyten gebunden, der an die bindende Verbindung auf dem festen Träger gebunden ist.
Es wurde gefunden, dass die Verkapselung von mehr als einem Farbstoff in verschiedenen Beuteln oder in demselben Beutel die Eignung markierter Beutel zur Durchführung von Immunoassays erhöht.
Wir beziehen uns nun auf die Figuren. In einer in Fig. 1 gezeigten Ausführungsform ist ein erstes Liposom mit einem ersten Antikörper an Antigen A konjugiert. Das erste Liposom (10) enthält einen eingekapselten ersten Farbstoff (11) und trägt einen nachweisbaren Marker (12) auf der Oberfläche, zum Beispiel ein Hapten oder Determinanten (Epitope) des Antikörpers selbst. Das erste Liposom ist mit einem Antikörper (13) an ein Antigen (14) konjugiert. Ein zweites Liposom (15) ist mit einem zweiten Antikörper (16) konjugiert, der spezifisch für den Marker (12) auf dem ersten Liposom (10) ist. Das zweite Liposom enthält einen eingekapselten zweiten Farbstoff (17), der von dem ersten Farbstoff verschieden und vorzugsweise zu diesem komplementär ist. Wenn das erste und das zweite Liposom in einem Tracer bei einem Assay verwendet werden, gibt es eine Verstärkung des Signals für Antigen A ohne Verwechslung zwischen Reagentien. Der Nachweis von Antigen A führt zu einer anderen Farbe als bei einer der beiden Lösungen.
In einer anderen Ausführungsform, die in Fig. 2 gezeigt ist, werden zwei verschiedene Antigene, die durch (20) und (21) dargestellt werden, gleichzeitig nachgewiesen, wobei man ein Gemisch von Liposomen verwendet, in denen verschiedene Farbstoffe eingekapselt sind. Ein erster Antikörper (22) gegen das Antigen (20) ist mit einem Liposom (23) konjugiert, in dem ein erster Farbstoff (24) eingekapselt ist. Ein zweiter Antikörper (25) gegen das Antigen (21) ist mit einem Liposom (26) konjugiert, in dem ein zweiter Farbstoff (27) eingekapselt ist. Die Anwesenheit entweder von Antigen (20), Antigen (21) oder die Anwesenheit beider Antigene (20) und (21) kann anhand der Bildung einer unterschiedlichen Farbe für jeden Fall nachgewiesen werden. Der Assay kann auf einem Träger, wie Nitrocellulose, durchgeführt werden, wobei man ein einziges Reagentiengemisch verwendet. Durch eine geeignete Wahl der Farbstoffe kann im wesentlichen jede beliebige Farbe erzeugt werden.
In noch einer anderen Ausführungsform, die in Fig. 3 gezeigt ist, ist ein Antikörper, Antigen oder Hapten (30), der bzw. das an sein Gegenstück (34) bindet, mit einem Liposom (31) konjugiert, in dem mindestens zwei Farbstoffe (32) und (33) eingekapselt sind. Dies ermöglicht die Bereitstellung von Liposomen jeder gewünschten Farbe durch die Wahl von Farb stoffen, die einander ergänzen. Bei der instrumentellen Analyse kann ein Analyt durch die gleichzeitige Messung bei mehr als einer Wellenlänge nachgewiesen werden, was zu einer stärkeren Diskriminierung des Signals oberhalb des Rauschens führt. Außerdem wird ein ausreichendes Signal von Farbstoffen erzeugt, die keine ausreichende Extinktion aufwiesen, wenn man sie einzeln verkapseln würde.
Die Verwendung von mehr als einem Farbstoff erlaubt viele Variationen. Komplementärfarbige Farbstoffe können in bezug auf die Extinktion über das sichtbare Spektrum hinweg in ein ausgewogenes Verhältnis zueinander gebracht werden, was zu einem schwarzen Farbton führt. Alternativ dazu kann auch ein erstes Liposom, in dem ein erster Farbstoff eingekapselt ist, sowohl verwendet werden, um unspezifische Zentren abzusättigen, als auch, um einen farbigen Hintergrund zu liefern. Die Bindung eines zweiten Liposoms, in dem ein zweiter Farbstoff als Gegengewicht an spezifischen Zentren eingekapselt ist, kann zu einer schwarzen Farbe führen, so dass der Kontrast an spezifischen Zentren und das Signal erhöht werden.

Beispiel 1

Herstellung des Tracers

A. Liposomenherstellung

1. In einen 2000-ml-Rundkolben an einem Rotationsverdampfer gibt man:
a: 1,018 g Cholesterin (Sigma CH-PL)
b: 1,88 g Distearoylphosphatidylcholin (Avanti Polar Lipids 3850365)
c: 206 mg Distearoylphosphatidylglycerin (Avanti Polar Lipids)
d: (75 mg Vernetzungsmittel ((N-Maleinimido)caproyldistearoylphosphatidylethanolamin; Becton Dickinson Advanced Diagnostics, Baltimore, MD)
e: 150 ml Chloroform (Fisher)
2. Verwirbeln zum Mischen.
3. Rotationsverdampfer anschalten mit den folgenden Einstellungen:
Wasserbadtemperatur = 40ºC
Rotationsgeschwindigkeit = 4
4. Vakuum langsam erhöhen, bis sich ein Film bildet.
5. Druck auf 200 mbar reduzieren. 30 Minuten lang mit mittlerer Geschwindigkeit rotieren lassen.
6. über Nacht lyophilisieren.
7. 150 ml destilliertes Wasser in den Rotationsverdampfer geben und bei 60ºC ohne Vakuum rotieren lassen, bis der Lipidfilm in Suspension vorliegt.
8. Rollschichtgefrieren in einem Trockeneis/Methanol-Bad.
9. Lyophifisieren zu einem trockenen Pulver.
8. Herstellung von Liposomen als teilchenförmige Markierungen - einfacher Farbstoff
1. Farbige Lösung herstellen von:
a. Sulforhodamin B (5,6% (w/v) in 5 mM Natriumacetat - 5 mM EDTA, pH 4,5).
b. Lichtgrün-SF-Gelblich (20% (w/v) in 5 mM Natriumacetat - 5 mM EDTA, pH 4,5).
2. Zu zwei 80-mg-Mengen Liposomenpulver, wie es in Beispiel 1A beschrieben ist, gibt man getrennt 10 ml farbige Lösungen von Sulforhodamin B bzw. Lichtgrün-SF-Gelblich. Man erwärme die Liposomen/Farbstoff-Suspension 30 Minuten lang auf 60ºC, wobei ab und zu geschüttelt wird.
3. Man extrudiere die beiden warmen Liposomenpräparate getrennt durch 1,0-um-, 0,4-um- und dann 0,2-um-Polycarbonatmembranen (Nucleopore).
4. Man trenne freies farbiges Material auf Fast-Flow-Chromatographiesäulen mit Sepharose® 6 (Pharmacia), die in 50 mM Natriumacetatpuffer, pH 4,5, mit 1 mM EDTA und 50 mM NaCl äquilibriert wurden, von den Liposomensuspensionen ab.
5. Man lagere die beiden Liposomenpräparate mit eingekapselten Farbstoffen getrennt in dem in Schritt 4 angegebenen Puffer auf.
C. Kupplung von Liposomen als teilchenförmige Markierungen an spezifisch bindende Spezies: Grüne teilchenförmige Markierung
1. 0,8 mg Ziegen-Anti-Biotin (Sigma) wurde gegen phosphatgepufferte Kochsalzlösung (pH 7,4) dialysiert.
2. Umsetzen mit 3-(2-Pyridyldithio)propionsäure-N-hydroxysuccinimidester (SPDP) (Sigma) in einem Stoffmengenverhältnis von SPDP: Antikörper von 3 : 1 während 30 Minuten bei Raumtemperatur unter Rühren.
3. Man füge 1/10 Volumen 1 M Natriumacetat, pH 4,5, hinzu und rühre 20 Sekunden lang.
4. Man füge 1/100 Volumen 1 M Dithiothreit hinzu und rühre 30 Minuten lang bei Raumtemperatur.
5. Man entferne Dithiothreit durch Leiten des Reaktionsvolumens über eine mittlere Säule mit Sephadex® G-25, die mit Tris-Puffer (50 mM Tris, 50 mM Natriumacetat, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA, pH 8,0) äquilibriert wurde.
6. Man überwache die O. D. bei 280 nm und vereinige Fraktionen, die Protein enthalten.
7. Man stelle den pH-Wert von 4 ml der oben in B hergestellten grünen Liposomen mit 1 M Tris, pH 10, auf 8,0 ein. Man mische die vereinigten Antikörper mit den Liposomen in einem Kupplungsverhältnis von 1 mg derivatisierter Antikörper: 40 umol Pi.
8. Man lasse über Nacht bei Raumtemperatur reagieren.
9. Man trenne gekoppeltes Produkt auf einer Fast-Flow-Chromatographiesäule mit Sepharose® 6 (Pharmacia) ab, die in 30 mM 3-[N-Morpholino]-2-hydroxypropansulfonsäure (MOPSO), 10 mM EDTA, 0,2% Natriumazid, 0,05% Dimethylsulfoxid (DMSO), 1,8% Glycerin, pH 6,8, äquilibriert wurde.
10. Hohlraumvolumenfraktion auffangen und vereinigen.
11. Bei 4ºC aufbewahren.
D. Kupplung von Liposomen als teilchenförmige Markierungen an spezifisch bindende Spezies: teilchenförmige Markierung mit Sulforhodamin B
1. 0,6 mg affinitätsgereinigter Kaninchen-Antikörper gegen Gruppe-A-Streptococcus (N-Acetylglucosaminagarose-Säule) wird gegen phosphatgepufferte Kochsalzlösung (100 mM, pH 8) dialysiert.
2. Umsetzen mit SPDP (Sigma P-3415) in einem Stoffmengenverhältnis von 3 : 1 (SPDP: Antikörper) während 30 Minuten bei Raumtemperatur unter Rühren.
3. Man füge 1/100 Volumen 1 M Dithiothreit hinzu und rühre 60 Sekunden lang.
4. Man füge 1/10 Volumen 1 M Natriumacetat, pH 4,5, hinzu und rühre 30 Minuten lang.
5. Man entferne Dithiothreit durch Leiten des Reaktionsvolumens über eine Säule mit Sephadex® G-25, die mit Tris-Puffer (50 mM Tris, 50 mM Natriumacetat, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA, pH 8,0) äquilibriert wurde.
6. Man überwache die Extinktion bei 280 nm und vereinige Fraktionen, die Protein enthalten.
7. Man stelle den pH-Wert von Sulforhodamin-haltigen Liposomen (oben in B beschrieben) mit 1 M Tris, pH 10, auf 8,0 ein. Man mische die vereinigten Antikörper mit den Liposomen in einer Menge von 1 mg derivatisiertem Antikörper pro 20 umol Phosphor.
8. Man lasse über Nacht bei Raumtemperatur reagieren.
9. Man trenne gekoppeltes Produkt auf einer Fast-Flow-Chromatographiesäule mit Sepharose® 6 (Pharmacia), die mit MOPSO- Glucose-Puffer (30 mM MOPSO, 10 mM EDTA, 0,2% Natriumazid, 0,05% DMSO, 1,2% Glycerin, 100 mM Glucose, pH 6,8, äquilibriert wurde, von freiem Antikörper ab.
10. Hohlraumvolumenfraktionen auffangen und vereinigen.
11. Bei 4ºC aufbewahren.

Beispiel 2

Assays

Das Tracersystem, das in Beispiel 1C (Anti-Biotin-Antikörper, mit Lichtgrün- Liposom konjugiert) und Beispiel 1D (Anti-Gruppe-A-Streptococcus- Antikörper, mit Sulforhodamin-B-Liposom konjugiert) hergestellt wurde, wurde gegen die Antigene Biotin und Gruppe-A-Streptococcus getestet. Das Biotin-Antigen wurde mittels biotinyliertem Antikörper (2 ul, 20 ug/ml in 0,1% Blotto in 0,1 M Natriumphosphat, pH 7) auf Nitrocellulosepapier befestigt. Gruppe-A-Streptococcus (2 ul, durch Erhitzen abgetötet, mit 0,2% Natriumazid als Konservierungsmittel) wurde mittels Anti-Gruppe-A- Streptococcus-Antikörper auf der Nitrocellulosemembran befestigt.
Das Assayverfahren war wie folgt:
A. 1. Drei Tropfen (ungefähr 150 ul) der Lösung, die Anti-Gruppe-A- Streptococcus-Sulforhodamin-B-Liposomen-Tracer (0,87 umP/ml) enthielt, wurden auf den Testbereich für Gruppe-A-Streptococcus gegeben und hindurchfließen gelassen.
Dann wurde der Testbereich durch Zugabe von drei Tropfen Waschpuffer (1 M Guanidin-HCl-Puffer, pH 7) gewaschen.
Die Ergebnisse wurden dann abgelesen, indem man die Anwesenheit einer deutlichen rosa Farbe auf dem Testbereich visuell beobachtete. Es resultierte ein starkes positives rosafarbenes Signal.
2. Drei Tropfen (ungefähr 150 ul) Anti-Biotin-Lichtgrün-Liposomen-Tracer (0,6 umP/ml) wurden zu dem Testbereich gegeben; der mit biotinyliertem Antikörper auf ein 0,8-um-Feld aufgetüpfelt wurde, und man ließ aufsaugen.
Dann wurde der Testbereich mit 1 M Guanidin-HCl-Puffer gewaschen.
Die Ergebnisse wurden abgelesen, indem man die Anwesenheit einer deutlichen grünen Farbe auf dem Testbereich visuell beobachtete. Es resultierte ein starkes positives grünes Signal.

B. Gemischte Liposomen

Gleiche Mengen des in Beispiel 1D hergestellten Anti-Gruppe-A-Streptococcus-Sulforhodamin-B-Liposom-Tracersystems und des in Beispiel 1C hergestellten Anti-Biotin-Lichtgrün-Liposom-Tracersystems wurden miteinander gemischt. Das Gemisch erschien bläulich-violett.
Das Liposomengemisch wurde in zwei Hälften aufgeteilt. Die Hälfte des Volumens (150 ul) wurde in einem Assay für Gruppe-A-Streptococcus verwendet, wie es oben in Beispiel 2(B)(1) beschrieben ist. Es entwickelt sich nur ein rosafarbenes Signal.
Die andere Hälfte des Gemischs (150 ul) wurde in einem Assay für Biotin verwendet, wie es oben in Beispiel 2(B)(2) beschrieben ist. Es entwickelte sich nur ein grünes Signal.
Dieses Experiment zeigte, dass individuelle Spezifitäten und Farben aus einem Liposomengemisch herausgezogen werden können, um zwischen Analyten zu differenzieren.

Beispiel 3

Tracerherstellung - gemischte Farbstoffe

A. Herstellung von gemischten Farbstoffen

Farbstoffgemische wurden in Farbstoffpuffer (5 mM Na-acetat, 5 mM EDTA, pH 4,5) hergestellt.
1. Ein Farbstoffgemisch aus 20% Lichtgrün-SF-Gelblich und 5,6% Sulforhodamin B wurde hergestellt, indem man 4 g Lichtgrün-SF-Gelblich, 1,12 g Sulforhodamin B und 2 ml 10x-Farbstoffpuffer unter Zugabe von destilliertem Wasser bis zu einem Volumen von 20 ml mischte und bei Raumtemperatur rührte. Der pH-Wert wurde auf 4,5 eingestellt.
2. Ein Farbstoffgemisch aus 6% Chromazurol, 0,1% Sulforhodamin B und 1,65% Lichtgrün-SF-Gelblich wurde hergestellt, indem man 1,2 g Chromazurol S, 0,02 g Sulforhodamin B, 0,33 g Lichtgrün-SF-Gelblich und 2 ml 10x-Farbstoffpuffer unter Zugabe von destilliertem Wasser bis zu einem Volumen von 20 ml mischte und bei Raumtemperatur rührte. Der pH-Wert wurde auf 4,5 eingestellt.
Die Farbstoffgemische wurden getrennt durch Falcon-Bottle-Top-Filter filtriert, die mit 100 ml destilliertem Wasser gewaschen worden waren. Die Osmolalität des Gemischs von 20% Lichtgrün und 5,6% SRB betrug 752 mOsm. Die Osmolalität des Gemischs von 6% Chromazurol, 0,1% SRB und 1,65% Lichtgrün betrug 418 mOsm.

B. Herstellung des Tracersystems

1. Zwei getrennte 80-mg-Portionen des in Beispiel 1A hergestellten gefrorenen Liposomenpulvers wurden in getrennte konische 50-ml-Röhrchen ausgewogen.
2. Zu einer Liposomenportion wurden 10 ml des Farbstoffgemischs von Beispiel 3A(1) gegeben, und zu der anderen Liposomenportion wurden 10 ml des in Beispiel 3A(2) hergestellten Farbstoffgemischs gegeben.
3. Verwirbeln zum Auflösen.
4. 30 min lang auf 60ºC erwärmen.
5. Jedes der beiden Liposomenpräparate wurde getrennt durch 1,0-um, 0,4-um- und dann 0,2-um-Membranen (Nucleopore-PC-Membranen 47 mm: #11110, #111107 bzw. #111106) extrudiert, dann erwärmt und durch ein frisches 0,2-um-Filter erneut extrudiert.
6. Puffer für die Fast-Flow-Säulen mit Sepharose® 6 wurden hergestellt, indem man die Osmolalität des Säulenwaschpuffers mit Glycerin auf die Osmolalität der Farbstoffgemische einstellte.
a. Für das Gemisch mit 6% Chrom:
Etwa 5 ml Glycerin zu 500 ml Säulenwaschpuffer (pH 4,5) gegeben, um auf 400 ± 50 mOsm einzustellen.
b. Für das Lichtgrün-SRB-Gemisch:
Etwa 8 ml Glycerin zu 500 ml Säulenwaschpuffer (pH 4, 5) gegeben, um auf 700 ± 50 mOsm einzustellen.
Eine Fast-Flow-Säule wurde mit jedem Puffer äquilibriert.
7. Die getrennten Liposomenpräparate wurden auf den Fast-Flow- Sepharose®-6-Säulen von freiem Farbstoff getrennt.
8. Nach dieser Abtrennung wurden ungekoppelte Liposomen in getrennten Gruppen für die beiden Farbstoffgemische vereinigt.

Beispiel 4

Spektraler Scan eingekapselter gemischter Farbstoffe

Liposomen, die in Beispiel 3 hergestellt wurden und die ein Farbstoffgemisch aus Lichtgrün-SF-Gelblich und Sulforhodamin B enthielten, wurden in 0,5% Natriumdodecylsulfat (SDS) auf 1 : 50 verdünnt und 30 Minuten lang auf 58ºC erwärmt.
Das in Beispiel 3 hergestellte Farbstoffgemisch aus Lichtgrün-SF-Gelblich und Sulforhodamin B wurde in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS), pH 7,5, und in 0,5% SDS auf 1 : 8000 verdünnt.
Liposomen, die in Beispiel 3 hergestellt wurden und die ein Farbstoffgemisch aus Chromazurol und Sulforhodamin B enthielten, wurden in 0,5% SDS auf 1 : 13,5 verdünnt und 30 Minuten lang auf 58ºC erwärmt.
Das in Beispiel 3 hergestellte Farbstoffgemisch aus Chromazurol und Sulforhodamin B wurde in PBS, pH 7,5, und in 0,5% SDS auf 1 : 1000 verdünnt.
Jedes Farbstoffgemisch und jedes lysierte Liposomenpräparat wurde mit einem Beckman DU7 von 340 nm bis 700 nm gescannt. Die Ergebnisse sind in den Fig. 4-8 gezeigt. Fig. 4 zeigt den Scan der lysierten Liposomen, die Lichtgrün-SRB enthielten. Fig. 5 zeigt den Scan des Lichtgrün-SRB- Farbstoffgemischs allein. Fig. 6 zeigt den Scan der lysierten Liposomen, die Chromazurol-SRB-Lichtgrün enthielten. Die Fig. 7 und 8 zeigen Scans des Chromazurol-SRB-Lichtgrün-Farbstoffgemischs in PBS bzw. in 0,5% SDS. Die Entsprechung der Scans von Farbstoffgemischen allein mit Liposomenpräparaten zeigt, dass die Farbstoffgemische erfolgreich durch die Liposomen eingekapselt wurden und dass in einem Farbstoffgemisch jeder Farbstoff getrennt identifiziert werden kann.

Claims

1. Verfahren zur Analyse einer Probe, von der angenommen wird, dass sie wenigstens einen Analyten enthält, umfassend

das In-Kontakt-Bringen wenigstens einer bindenden Verbindung, die auf einem festen Träger immobilisiert ist, unter Assay-Bedingungen mit wenigstens einem Analyten und einem Tracer-System,

wobei die bindende Verbindung eine bindende Verbindung sowohl für den Analyten als auch für das Tracer-System ist oder eine bindende Verbindung entweder nur für den Analyten oder nur für das Tracer-System ist,

wobei das Tracer-System wenigstens eine teilchenförmige Markierung aufweist, die mit wenigstens einem Liganden gekoppelt ist, wobei die teilchenförmige Markierung wenigstens eine nachweisbare Substanz enthält und wobei der Ligand eine Substanz ist, die befähigt ist, durch eine bindende Verbindung gebunden zu werden, wobei das gesamte Tracer-System wenigstens zwei nachweisbare Substanzen einschließt; und

das Nachweisen dieser Substanzen, nachdem der Tracer an die bindende Verbindung gebunden ist oder wenigstens ein Analyt an die bindende Verbindung gebunden ist.

2. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei der Analyt und das Tracer- System nacheinander mit der bindenden Verbindung in Kontakt gebracht werden oder wobei der Analyt und das Tracer-System gleichzeitig mit der bindenden Verbindung in Kontakt gebracht werden.

3. Verfahren gemäß den Ansprüchen 1 oder 2, wobei der Analyt ein Ligand des Tracer-Systems ist oder wobei der Analyt an das Tracer- System, welches an die bindende Verbindung bindet, bindet.

4. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei der Analyt aus Antikörpern, Antigenen und Haptenen ausgewählt ist.

5. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die nachweisbare Substanz ein Farbstoff ist und wobei die teilchenförmige Markierung einen Beutel umfasst.

6. Verfahren gemäß Anspruch 5, wobei der Beutel ein Liposom, eine Mikrokapsel oder ein stabilisiertes, kolloidales Teilchen ist.

7. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die bindende Verbindung spezifisch an den wenigstens einen Analyten bindet und wobei das Tracer-System umfasst:

eine erste teilchenförmige Markierung, die ein erstes Liposom (10) ist, welches eine erste nachweisbare Substanz einschließt, die ein erster sichtbarer Farbstoff (11) ist, wobei das erste Liposom einen ersten (13) und zweiten (12) Liganden aufweist, die daran immobilisiert sind, wobei der erste Ligand spezifisch entweder an die bindende Verbindung (14) oder den wenigstens einen Analyten bindet, und

eine zweite teilchenförmige Markierung, die ein zweites Liposom (15) ist, welches eine zweite nachweisbare Substanz einschließt, die ein zweiter sichtbarer Farbstoff (17) ist, wobei das zweite Liposom einen dritten Liganden aufweist, der daran immobilisiert ist, wobei der dritte Ligand (16) spezifisch an den zweiten Liganden (12) auf dem ersten Liposom bindet, und zwar unter derartigen Bedingungen, dass das Tracer-System im Verhältnis zur Menge des wenigstens einen Analyten in der Probe an diese bindende Verbindung gebunden wird; und

wobei der erste sichtbare Farbstoff und der zweite sichtbare Farbstoff als Maß für die Menge des wenigstens einen Analyten in der Probe nachgewiesen werden.

8. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei das Verfahren für die gleichzeitige Analyse von wenigstens zwei Analyten bestimmt ist, umfassend:

1) das In-Kontakt-Bringen der Probe mit einer ersten bindenden Verbindung (20) und einer zweiten bindenden Verbindung (21) und dem Tracer-System, wobei die erste bindende Verbindung und die zweite bindende Verbindung auf dem festen Träger immobilisiert sind, und

wobei die erste bindende Verbindung spezifisch an einen ersten Analyten bindet und die zweite bindende Verbindung spezifisch an einen zweiten Analyten bindet und wobei das Tracer-System umfasst:

eine erste teilchenförmige Markierung, die ein erstes Liposom (23) ist, welches eine erste nachweisbare Substanz ein schließt, die ein erster sichtbarer Farbstoff (24) ist, und das einen ersten Liganden (22) aufweist, der daran immobilisiert ist, wobei der erste Ligand spezifisch entweder an die erste bindende Verbindung (20) oder den ersten Analyten bindet, und

eine zweite teilchenförmige Markierung, die ein zweites Liposom (26) ist, welches eine zweite nachweisbare Substanz einschließt, die ein zweiter sichtbarer Farbstoff (27) ist, und das einen zweiten Liganden (25) aufweist, der daran immobilisiert ist; wobei der zweite Ligand spezifisch entweder an die zweite bindende Verbindung (21) oder den zweiten Analyten bindet, und zwar unter derartigen Bedingungen, dass das Tracer-System in einem Verhältnis zur Menge des ersten und zweiten Analyten in der Probe an die erste bindende Verbindung und die zweite bindende Verbindung gebunden wird; und

2) das Nachweisen des ersten sichtbaren Farbstoffs und des zweiten sichtbaren Farbstoffs als Maß für die Menge des ersten und des zweiten Analyten in der Probe.

9. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die bindende Verbindung spezifisch an den wenigstens einen Analyten bindet und wobei das Tracer-System die teilchenförmige Markierung umfasst, wobei die teilchenförmige Markierung ein Liposom (31) ist, welches wenigstens zwei nachweisbare Substanzen einschließt, die wenigstens ein erster sichtbarer Farbstoff (32) und ein zweiter sichtbarer Farbstoff (33) sind, und wobei das Liposom den Liganden (30) aufweist, der daran immobilisiert ist, wobei der Ligand spezifisch entweder an die bindende Verbindung (34) oder den wenigstens einen Analyten bin det, und zwar unter solchen Bedingungen, dass das Tracer-System im Verhältnis zu der Menge des wenigstens einen Analyten in der Probe an die bindende Verbindung gebunden wird; und wobei der erste sichtbare Farbstoff und der zweite sichtbare Farbstoff als Maß für die Menge des wenigstens einen Analyten in der Probe nachgewiesen werden.

10. Assay-Zusammensetzung zur Verwendung im Verfahren gemäß Anspruch 7, umfassend ein Tracer-System, wobei das Tracer- System umfasst:

ein erstes Liposom (10), welches einen ersten sichtbaren Farbstoff (11) einschließt und einen ersten (13) und einen zweiten (12) Liganden aufweist, die auf demselben immobilisiert sind, wobei der erste Ligand spezifisch entweder an die bindende Verbindung (14) oder den wenigstens einen Analyten bindet, und ein zweites Liposom (15), welches einen zweiten sichtbaren Farbstoff (17) einschließt und das einen dritten Liganden (16) aufweist, der daran immobilisiert ist, wobei der dritte Ligand spezifisch an den zweiten Liganden (12) des ersten Liposoms bindet.

11. Assay-Zusammensetzung zur Verwendung im Verfahren gemäß Anspruch 8, umfassend ein Tracer-System, wobei das Tracer- System umfasst:

ein erstes Liposom (23), welches einen ersten sichtbaren Farbstoff (24) einschließt und das einen ersten Liganden (22) aufweist, der daran immobilisiert ist, wobei der erste Ligand spezifisch entweder an die erste bindende Verbindung (20) oder den wenigstens einen Analyten bindet,

ein zweites Liposom (26), welches einen zweiten sichtbaren Farbstoff (27) einschließt und das einen zweiten Liganden (25) aufweist, der daran immobilisiert ist, wobei der zweite Ligand spezifisch entweder an die zweite bindende Verbindung (21) oder den zweiten Analyten bindet.

12. Assay-Zusammensetzung zur Verwendung im Verfahren gemäß Anspruch 9, umfassend ein Tracer-System, wobei das Tracer- System umfasst:

ein Liposom (31), welches einen ersten sichtbaren Farbstoff (32) und einen zweiten sichtbaren Farbstoff (33) einschließt und das einen Liganden (30) aufweist, der daran immobilisiert ist, wobei der Ligand spezifisch entweder an die bindende Verbindung (34) oder den wenigstens einen Analyten bindet.