JP2568699B2 - 免疫的検出方法 - Google Patents
免疫的検出方法Info
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- JP2568699B2 JP2568699B2 JP1182921A JP18292189A JP2568699B2 JP 2568699 B2 JP2568699 B2 JP 2568699B2 JP 1182921 A JP1182921 A JP 1182921A JP 18292189 A JP18292189 A JP 18292189A JP 2568699 B2 JP2568699 B2 JP 2568699B2
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Description
【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、主として臨床検査における病原体、あるい
は疾患マーカー等の検出、さらには広く産業上の極微量
検出に利用される免疫的検出方法及び装置に関する。
は疾患マーカー等の検出、さらには広く産業上の極微量
検出に利用される免疫的検出方法及び装置に関する。
従来の技術 天然に存在する、あるいは人工的に作製した抗体を用
いた免疫的測定方法は、高特異性及び高感度の点に特徴
を有し、極微量の目的物質を検出するために現在用いら
れている。被検出物質としては、例えば、病原体、ある
いは腫瘍、心筋梗塞、脳血栓等の疾患時に特異的に分泌
されるいわゆる疾患マーカーなどや、大気中から極微量
の物質を検出する目的などがある。
いた免疫的測定方法は、高特異性及び高感度の点に特徴
を有し、極微量の目的物質を検出するために現在用いら
れている。被検出物質としては、例えば、病原体、ある
いは腫瘍、心筋梗塞、脳血栓等の疾患時に特異的に分泌
されるいわゆる疾患マーカーなどや、大気中から極微量
の物質を検出する目的などがある。
近年このような目的で、例えば石川栄治、河合忠、宮
井潔著「酵素免疫測定法第３版」（医学書院1987年、31
〜54頁）に記載されているように多くの種類の免疫的測
定方法が開発されている。これらの方法は、酵素による
化学増幅が期待できるので高感度化が比較的容易と考え
られるが、測定時間が通常５時間、短くても20分間以上
を要するので、迅速測定を要する用途には適さないとい
う欠点があった。
井潔著「酵素免疫測定法第３版」（医学書院1987年、31
〜54頁）に記載されているように多くの種類の免疫的測
定方法が開発されている。これらの方法は、酵素による
化学増幅が期待できるので高感度化が比較的容易と考え
られるが、測定時間が通常５時間、短くても20分間以上
を要するので、迅速測定を要する用途には適さないとい
う欠点があった。
一方、迅速測定が可能な免疫的測定方法として、我々
はすでに抗体蛍光消光法を提案（特願昭63−75447な
ど）した。この方法は測定感度、特異性を犠牲にするこ
となく、迅速測定を可能とした。
はすでに抗体蛍光消光法を提案（特願昭63−75447な
ど）した。この方法は測定感度、特異性を犠牲にするこ
となく、迅速測定を可能とした。
発明が解決しようとする課題 ところで、本質的に長時間を要する酵素免疫測定法に
代わる迅速測定法としてすでに提案した抗体蛍光消光法
では、被検出物質が抗体と結合した際に抗体の持つ蛍光
強度を減少させるという、いわゆる蛍光消光性を利用し
た。したがってこの方法で検出可能な被検出物質は、蛍
光消光性を持つものに限られており、被検出物質の一般
化が課題となっていた。
代わる迅速測定法としてすでに提案した抗体蛍光消光法
では、被検出物質が抗体と結合した際に抗体の持つ蛍光
強度を減少させるという、いわゆる蛍光消光性を利用し
た。したがってこの方法で検出可能な被検出物質は、蛍
光消光性を持つものに限られており、被検出物質の一般
化が課題となっていた。
本発明は、このような従来技術の課題を解決すること
を目的とする。
を目的とする。
課題を解決するための手段 本発明は、抗体と結合することで当該抗体の持つ蛍光
強度を減少させる性質を持つ蛍光消光性物質を、蛍光消
光性を持たない被検出物質に化学的に結合した結合物
と、被検出物質に特異的な抗体をあらかじめ混合した溶
液に、被検出物質の溶液を加えた際におこる、上記抗体
に結合した結合物と被検知物質の一部置換にともなう蛍
光強度の増加を測定することによって、被検知物質を検
出することを特徴とする免疫的検出方法である。
強度を減少させる性質を持つ蛍光消光性物質を、蛍光消
光性を持たない被検出物質に化学的に結合した結合物
と、被検出物質に特異的な抗体をあらかじめ混合した溶
液に、被検出物質の溶液を加えた際におこる、上記抗体
に結合した結合物と被検知物質の一部置換にともなう蛍
光強度の増加を測定することによって、被検知物質を検
出することを特徴とする免疫的検出方法である。
更に、詳しくは、現在、代表的な蛍光消光性物質とし
てニトロベンゼン、ジニトロベンゼン、トリニトロベン
ゼンまたはそれらの誘導体があり、特にニトロベンゼン
スルホン酸ナトリウム、ジニトロベンゼンスルホン酸ナ
トリウム、トリニトロベンゼンスルホン酸ナトリウム
は、他の物質と穏和な条件下でアミノ基を介して結合可
能である。そこで、蛍光消光性を持たない被検出物質が
アミノ基を持つ場合はそのアミノ基を介して、アミノ基
を持たない場合はアミノ基導入試薬によりアミノ基を導
入した後に、ニトロベンゼンスルホン酸ナトリウム、ジ
ニトロベンゼンスルホン酸ナトリウム、トリニトロベン
ゼンスルホン酸ナトリウムの内いずれか一つと結合させ
た。被検出物質に特異的な抗体はこの結合物にも結合可
能であり、かつ結合した際に蛍光強度の減少を示した。
すなわち、この混合物は見かけ上蛍光消光性を持つ被検
出物質と同等に扱うことができる。この結合物と被検出
物質に特異的な抗体の混合溶液に、被検出物質を加える
と、平衡状態の変化にともなって抗体に結合していた結
合物の一部が被検出物質に置換される。置換される結合
物の量は、加えた被検出物質量と相関関係にある。この
置換にともなって、結合物の影響で減少していた抗体の
蛍光強度が復帰する。したがって、蛍光強度の増加を測
定することによって、被検出物質を検出または定量する
事が可能である。
てニトロベンゼン、ジニトロベンゼン、トリニトロベン
ゼンまたはそれらの誘導体があり、特にニトロベンゼン
スルホン酸ナトリウム、ジニトロベンゼンスルホン酸ナ
トリウム、トリニトロベンゼンスルホン酸ナトリウム
は、他の物質と穏和な条件下でアミノ基を介して結合可
能である。そこで、蛍光消光性を持たない被検出物質が
アミノ基を持つ場合はそのアミノ基を介して、アミノ基
を持たない場合はアミノ基導入試薬によりアミノ基を導
入した後に、ニトロベンゼンスルホン酸ナトリウム、ジ
ニトロベンゼンスルホン酸ナトリウム、トリニトロベン
ゼンスルホン酸ナトリウムの内いずれか一つと結合させ
た。被検出物質に特異的な抗体はこの結合物にも結合可
能であり、かつ結合した際に蛍光強度の減少を示した。
すなわち、この混合物は見かけ上蛍光消光性を持つ被検
出物質と同等に扱うことができる。この結合物と被検出
物質に特異的な抗体の混合溶液に、被検出物質を加える
と、平衡状態の変化にともなって抗体に結合していた結
合物の一部が被検出物質に置換される。置換される結合
物の量は、加えた被検出物質量と相関関係にある。この
置換にともなって、結合物の影響で減少していた抗体の
蛍光強度が復帰する。したがって、蛍光強度の増加を測
定することによって、被検出物質を検出または定量する
事が可能である。
作用 上記の手段をとることにより、蛍光消光性を持たない
被検出物質についても、従来の蛍光消光法と同等の感
度、特異性、速度を以て検出が可能となり、検出対象を
飛躍的に広げることができた。
被検出物質についても、従来の蛍光消光法と同等の感
度、特異性、速度を以て検出が可能となり、検出対象を
飛躍的に広げることができた。
実施例 以下に、本発明の実施例について図面を参照しながら
説明する。
説明する。
蛍光消光性を持たない被検出物質および蛍光消光性物
質として、各々メタンフェタミン（MA）、ジニトロベン
ゼンスルホン酸ナトリウム（DNBS）を選んだ。
質として、各々メタンフェタミン（MA）、ジニトロベン
ゼンスルホン酸ナトリウム（DNBS）を選んだ。
まず、MAとDNBSの結合物（MA−DNP）の作製法につい
て順を追って説明する。
て順を追って説明する。
（１）タマキ（Tamaki）らの報告（例えばタマキ、フク
ダ、キシダ、タカハシ、（Tamaki,Fukuda,Kishida and
Takahashi）,Jpn.J.Legal Med.,37（４）,417（198
3））に従って、MAにブチルアミノ基を導入した（MA−N
H2）。さらに得られたMA−NH2を0.1N HCl0.2mlに溶解し
た後、0.1M NaHCO3を加えて総量を10mlとした（約1m
M）。
ダ、キシダ、タカハシ、（Tamaki,Fukuda,Kishida and
Takahashi）,Jpn.J.Legal Med.,37（４）,417（198
3））に従って、MAにブチルアミノ基を導入した（MA−N
H2）。さらに得られたMA−NH2を0.1N HCl0.2mlに溶解し
た後、0.1M NaHCO3を加えて総量を10mlとした（約1m
M）。
（２）ジニトロベンゼンスルホン酸ナトリウム（DNBS）
2.7mgを、0.1M NaHCO3 10mlに溶解した（約1mM）。
2.7mgを、0.1M NaHCO3 10mlに溶解した（約1mM）。
（３）（１）のMA−NH2溶液と（２）のDNBS溶液を混合
し、攪はんしながら37℃で２時間インキュベートを行な
い、20mlのMA−DNP溶液を得た。
し、攪はんしながら37℃で２時間インキュベートを行な
い、20mlのMA−DNP溶液を得た。
以上の操作で、MA1分子あたり、DNB1分子が結合したM
A−DNPを得た。
A−DNPを得た。
次に、得られたMA−DNPを用いたMAの検出法について
説明する。第１図に測定装置構成の概要を示す。
説明する。第１図に測定装置構成の概要を示す。
（１）1gのMAが底部に入っている３口フラスコから、空
気１を取り出した。この空気１を約1mlのリン酸緩衝液
に通して、見かけ上103倍に濃縮したものを試料液２と
した。また、参照試料として上記操作を行なわないリン
酸緩衝液を用いた。
気１を取り出した。この空気１を約1mlのリン酸緩衝液
に通して、見かけ上103倍に濃縮したものを試料液２と
した。また、参照試料として上記操作を行なわないリン
酸緩衝液を用いた。
（２）試料液中に含まれるMA濃度をガスクロマトグラフ
ィーによって測定した。MA濃度は1x10-8Mであった。こ
の濃度は、ほぼガスクロマトグラフィーの検出限界に相
当する。また、測定には約20分を要した。
ィーによって測定した。MA濃度は1x10-8Mであった。こ
の濃度は、ほぼガスクロマトグラフィーの検出限界に相
当する。また、測定には約20分を要した。
（３）一方、公知の方法で作製した抗MAモノクローナル
抗体をリン酸緩衝液で希釈し、１×10-7M溶液を調整し
た。
抗体をリン酸緩衝液で希釈し、１×10-7M溶液を調整し
た。
（４）MA−DNPをリン酸緩衝液に溶解し10-7M溶液を調整
した。
した。
（５）（３）の抗MAモノクローナル抗体溶液と、（４）
のMA−DNP溶液を混合した。混合後、抗MAモノクローナ
ル抗体とMA−DNPは、抗原抗体反応によって速やかに結
合する。
のMA−DNP溶液を混合した。混合後、抗MAモノクローナ
ル抗体とMA−DNPは、抗原抗体反応によって速やかに結
合する。
（６）（１）の試料液2 200μｌと（５）の混合液3 20
μｌを、内径約0.3mmのフッ素樹脂性チューブによって
混合器４に導き混合した。次いで即座に、この混合液を
4ml/minの流速で蛍光測定用光学セル５に導き、蛍光速
度を測定した。蛍光強度測定は、励起光波長6,7 280nm
（バンドパス5nm）、蛍光測定波長340nm（バンドパス10
nm）で行なった。
μｌを、内径約0.3mmのフッ素樹脂性チューブによって
混合器４に導き混合した。次いで即座に、この混合液を
4ml/minの流速で蛍光測定用光学セル５に導き、蛍光速
度を測定した。蛍光強度測定は、励起光波長6,7 280nm
（バンドパス5nm）、蛍光測定波長340nm（バンドパス10
nm）で行なった。
まず、参照試料液を用いた場合について蛍光強度を測
定した。蛍光強度は約25であった（第２図、ａ部分）。
定した。蛍光強度は約25であった（第２図、ａ部分）。
つぎに実際の試料液を用いて蛍光強度を測定したとこ
ろ、蛍光強度は約45まで増加し、約５秒で平衡状態に達
した（第２図、ｂ部分）。
ろ、蛍光強度は約45まで増加し、約５秒で平衡状態に達
した（第２図、ｂ部分）。
（７）さらに、（１）の試料液をリン酸緩衝液で10倍、
100倍および1,000倍に希釈したものについて同様の測定
を行なった（第３図）。これらの結果より、約10-9g/ml
のMAが、１分以内で検出可能であった。
100倍および1,000倍に希釈したものについて同様の測定
を行なった（第３図）。これらの結果より、約10-9g/ml
のMAが、１分以内で検出可能であった。
なお、本実施例では蛍光消光性を持たない被検出物質
の例としてメタンフェタミン（MA）を示したが、本検出
法の主眼が被検出物質の一般化であることを考えれば、
広く他の物質、特に有機物についても検出可能であるこ
とは言うまでもない。
の例としてメタンフェタミン（MA）を示したが、本検出
法の主眼が被検出物質の一般化であることを考えれば、
広く他の物質、特に有機物についても検出可能であるこ
とは言うまでもない。
発明の効果 本発明によれば、従来抗体の蛍光消光現象を利用して
測定することのできなかった蛍光消光性を持たない物質
についても、これらを蛍光消光性の物質と結合すること
によって、従来の蛍光消光免疫測定法と同等の高感度、
高速度で、これらの蛍光消光性を持たない物質を検出で
きる。
測定することのできなかった蛍光消光性を持たない物質
についても、これらを蛍光消光性の物質と結合すること
によって、従来の蛍光消光免疫測定法と同等の高感度、
高速度で、これらの蛍光消光性を持たない物質を検出で
きる。
第１図は、本発明にかかる免疫的検出方法の一実施例に
おけるニトロ化合物の測定装置の構成の概略を示したブ
ロック図、第２図は、本発明を実施した際の抗体の蛍光
強度の時間的変化を示すグラフ、第３図は同実施例にお
いて、試料液中に含まれるメタンフェタミン（MA）の濃
度と、蛍光強度の関係を示すグラフである。 １……試料空気、２……試料溶液、３……抗体液、４…
…混合器、５……光学セル、６……励起光源、７……受
光素子。
おけるニトロ化合物の測定装置の構成の概略を示したブ
ロック図、第２図は、本発明を実施した際の抗体の蛍光
強度の時間的変化を示すグラフ、第３図は同実施例にお
いて、試料液中に含まれるメタンフェタミン（MA）の濃
度と、蛍光強度の関係を示すグラフである。 １……試料空気、２……試料溶液、３……抗体液、４…
…混合器、５……光学セル、６……励起光源、７……受
光素子。
Claims (9)
- 【請求項１】抗体と結合することで当該抗体の持つ蛍光
強度を減少させる性質を持つ蛍光消光性物質を、蛍光消
光性を持たない被検出物質に化学的に結合した結合物
と、被検出物質に特異的な抗体をあらかじめ混合した溶
液に、被検出物質の溶液を加えた際におこる、前記抗体
に結合した結合物と被検知物質の一部置換にともなう蛍
光強度の増加を測定することによって、被検知物質を検
出することを特徴とする免疫的検出方法。 - 【請求項２】結合物と前記被測定物質に特異的な抗体を
あらかじめ結合した溶液と、前記被測定物質の溶液を、
それぞれ別の細管を用いて光学的セル中に導き混合し、
蛍光強度を測定する事を特徴とする請求項１記載の免疫
的検出方法。 - 【請求項３】結合物と前記被測定物質に特異的な抗体を
あらかじめ混合した溶液と、前記被測定物質の溶液を、
それぞれ別の細管を用いて混合器に導き混合し、しかる
後に光学的セル中に導き蛍光強度を測定することを特徴
とする請求項１又は２記載の免疫的検出方法。 - 【請求項４】蛍光消光性物質がニトロトルエン、ジニト
ロトルエン、トリニトロトルエンまたはそれらの誘導体
であることを特徴とする請求項１、２又は３記載の免疫
的検出方法。 - 【請求項５】被検出物質の溶液が、被測定物質を空気中
から溶媒中に捕獲濃縮したものであることを特徴とする
請求項１〜４のいずれかの項に記載の免疫的検出方法。 - 【請求項６】被検出物質に特異的の抗体が、モノクロー
ナル抗体であることを特徴とする請求項１〜５のいずれ
かの項に記載の免疫的検出方法。 - 【請求項７】蛍光強度の測定において、励起光の波長が
200nm〜300nmであり、蛍光強度測定用波長が300nm〜400
nmであることを特徴とする請求項１〜６のいずれかの項
に記載の免疫的検出方法。 - 【請求項８】光学的セルがフローセル形式であることを
特徴とする請求項１〜７のいずれかの項に記載の免疫的
検出方法。 - 【請求項９】混合器が一六方バルブであることを特徴と
する請求項１および３〜８のいずれかの項に記載の免疫
的検出方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1182921A JP2568699B2 (ja) | 1989-07-14 | 1989-07-14 | 免疫的検出方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1182921A JP2568699B2 (ja) | 1989-07-14 | 1989-07-14 | 免疫的検出方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0346563A JPH0346563A (ja) | 1991-02-27 |
| JP2568699B2 true JP2568699B2 (ja) | 1997-01-08 |
Family
ID=16126709
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP1182921A Expired - Fee Related JP2568699B2 (ja) | 1989-07-14 | 1989-07-14 | 免疫的検出方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2568699B2 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2008153223A1 (ja) * | 2007-07-31 | 2008-12-18 | Osaka University | 核酸と被験物質との結合親和性を測定するための組成物及びその利用 |
-
1989
- 1989-07-14 JP JP1182921A patent/JP2568699B2/ja not_active Expired - Fee Related
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2008153223A1 (ja) * | 2007-07-31 | 2008-12-18 | Osaka University | 核酸と被験物質との結合親和性を測定するための組成物及びその利用 |
| US8741659B2 (en) | 2007-07-31 | 2014-06-03 | Osaka University | Composition for measuring the binding affinity between nucleic acid and test substance, and use thereof |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0346563A (ja) | 1991-02-27 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |